2015-FlAíviaPortoCarreiroAraAjoBezerra-SUPLEMENTO

•

Humanas / Sociais

Aprendendo com conteúdos

15/03/2023

E aí, curtiu este material?

Ajude a incentivar outros estudantes a melhorar o conteúdo

Gostou desse material? Compartilhe! 🧡

Trabalho de Conclusão de Curso - TCC

95.928 Materiais compartilhados

Baixe o app para aproveitar ainda mais

Leia os materiais offline, sem usar a internet. Além de vários outros recursos!

Prévia do material em texto

Biblioteca de perfis moleculares de Bactérias
aeróbias formadoras de endósporos obtidos por
espectrometria de massa MALDI-TOF,
com sistema de Qualidade
Suplemento

Flávia Porto Carreiro Araújo Bezerra
Orientadora: Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
Co-orientador: Prof. dr. Luciano Paulino da Silva

Brasília, junho de 2015.

Universidade de Brasília
Instituto de Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana

Parte I
Procedimentos Operacionais Padrão e
Registros de Procedimentos

Revisão Nº Data Emissor Aprovação
00 27/10/2014 Flávia Porto Carreiro A. Bezerra Marlene Teixeira De-Souza
01

I. Definições
Sala limpa é um termo técnico que designa um ambiente fechado, desinfetado, cuja
planta e estrutura física permitem o controle do fluxo de ar e a limitação do número de
partículas em suspensão. A sala limpa do LaBafes é a capela de segurança biológica (CSB)
que se encontra na sala I1-25/5, identificada como sala do “Fluxo laminar”(Figura 1A). A CSB
do LaBafes (Figura 1B) é Veco, Modelo: VLFS 12M (Classe II tipo B2), que possui fluxo laminar
e circula o ar filtrado na sala de trabalho onde está instalada. Ambas, a capela e a sala,
devem ser tratadas como compartimentos limpos de acesso limitado e utilizadas dentro de
critérios de biossegurança.

Figura 1. Visão externa e interna da sala I1-25/5. (A) CSB. (B) A sala I1-
25/5, identificada com a placa “Fluxo laminar”, é um ambiente de acesso
controlado reservado à execução de procedimentos estéreis. O
interruptor das luzes UV localiza-se ao lado da porta e uma lâmpada
externa se acende quando as lâmpadas UV estão ligadas no interior da
sala (setas azuis).

MT 01 - Utilização e manutenção das salas limpas
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
2
A CSB é também um ambiente de contenção biológica, onde são realizados
procedimentos estéreis e/ou com potencial de contaminação. Para tanto a CSB possui um
sistema de injeção, direcionamento e exaustão de ar. Ao acionar o funcionamento do
sistema de circulação, o ar externo é injetado pelo teto do compartimento através de um
filtro HEPA (do inglês: High Efficiency Particulate Air) e sugado na base, ao fundo da capela,
através dos furos na placa metálica (Figura 2A) formando um fluxo unidirecional. A corrente
de ar também é sugada através da placa perfurada (Figura 2B) na entrada, abaixo do vidro
de proteção. Este último efeito forma um fluxo laminar de ar (Figura 3) entre o operador e o
interior da cabine que isola os dois ambientes, evitando a entrada e saída de partículas. O ar
exaurido é devolvido ao ambiente após filtragem. Desta forma a CSB protege o operador, o
material e a sala de trabalho, desde que não ocorra perturbação dos fluxos de ar.

Figura 2. Interior da Capela de seguranca biológica. A corrente de ar,
que se forma no interior da capela quando acionado o sistema de
circulação de ar, sai do teto e é sugada através dos orifícios nas placas
metálicas ao fundo do piso (A) e abaixo na entrada, abaixo do vidro de
proteção (B). As partes identificadas na imagem, paredes posterior,
lateral e piso, serão referidas ao longo do texto. Na parede posterior
há uma tomada de força (C) com duas entradas para utilização de
equipamentos elétricos, como o esterilizador de alças de platina.

Figura 3. Fluxo laminar. Em um fluxo laminar (A) há um
mínimo de agitação das diversas camadas de fluido, que
se deslocam em planos paralelos, sem se misturar. Neste
tipo de fluxo o vetor velocidade é aproximadamente
constante em cada ponto do fluido e não se cruzam, tal
como descrito para o fluxo turbulento (B).

A CSB é dotada de lâmpadas ultravioleta (UV) para esterilização das superfícies
internas e iluminação de trabalho (luz branca). O revestimento interno é de tinta à base de
epóxi (piso) e fórmica (paredes). A CSB se destina à execução de procedimentos estéreis ou
com potencial de disseminação biológica. Denominamos aqui procedimento estéril aquele
que é executado em ambiente esterilizado, com utensílios esterilizados e se caracteriza pela
exigência de não contaminar amostras de trabalho. Tanto a CSB, quanto a sala onde está
instalada, devem ser tratadas como compartimentos limpos de acesso limitado e utilizadas
dentro dos critérios de Biossegurança estabelecidos neste procedimento.
Uma sala limpa só é considerada como tal, se estiver contida em outra sala limpa com
um grau de limpeza igual ou um pouco menor. Portanto, para garantir a eficácia do sistema
de contenção e o ambiente estéril dentro da CSB, as condições de desinfecção e segurança
devem ser observadas dentro e fora da capela, começando pelo ambiente laboratorial e
aumentando-se o grau de exigência de controle da qualidade ambiental da sala limpa que
contem a CSB.
Alguns aspectos técnicos mantém a condição de esterilidade no ambiente interno da
CSB: i) os filtros possuem a capacidade de retenção de partículas tão pequenas quanto
células vegetativas e esporos, mas são sensíveis à umidade; ii) a radiação UV tem baixa
penetrabilidade e só é eficaz na esterilização de superfícies limpas e do ar. O volume de ar
dentro do compartimento varia entre os modelos de cabines e, portanto, o tempo de
renovação completa do ar poluído por ar filtrado também. Para a CSB da sala I1-25/5, o
http://pt.wikipedia.org/wiki/Plano_(geometria)
http://pt.wikipedia.org/wiki/Velocidade
MT 01 - Utilização e manutenção das salas limpas
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
4
tempo de 30 min é suficiente para estabilização do fluxo laminar e ação eficaz da luz UV na
esterilização das superfícies e do ar.
O termo sistema de esterilização será utilizado frequentemente nos POPs que se
seguem e se refere ao sistema de circulação de ar – ou fluxo laminar – acionado junto com
as lâmpadas UV acesas.
A esterilidade dentro da CSB é corrompida se as correntes de ar forem perturbadas
ou se for introduzido material contaminado durante o procedimento. Atenção especial deve
ser dada às:
 mangas de jalecos;
 caixas de armazenamento de amostras em refrigeradores;
 superfícies externas de frascos e microtubos usados contendo amostras
biológicas;
 frascos e microtubos de armazenamento em geladeira e bancadas em geral.
A contaminação microbiológica de material e amostras de trabalho pode ocorrer por
células vegetativas ou esporos e consiste no principal problema em se tratando da análise
espectrométrica de estirpes desconhecidas. Denomina-se contaminação cruzada, à
contaminação de uma amostra por outra durante a manipulação. A contaminação cruzada
ocorre facilmente quando se trabalha com estirpes diferentes, ao mesmo tempo, dentro da
CSB.
A contaminação cruzada entre amostras de esporos secos e suspensões de esporos
merece especial atenção. Este tipo de contaminação produz viés experimental na análise
espectrométrica e só é perceptível, após crescimento das colônias, se estas apresentam
morfologias bem distintas, o que nem sempre ocorre entre linhagens de Bafes. Como
agravante, as colônias destinadas à MALDI-TOF MS são utilizadasno início do crescimento,
antes de se tornarem visíveis as características morfológicas típicas de colônias isoladas. Não
é possível detectar este tipo de contaminação na análise espectrométrica, a não ser que os
microrganismos em questão já estejam inseridos na base de dados.
A presença de contaminantes microbiológicos diminui o fator de reprodutibilidade das
colônias analisadas, acarreta a obtenção de um conjunto dúbio de espectros e, por
conseqüência, o espectro mestre calculado será ineficaz na identificação de novas amostras.

MT 01 - Utilização e manutenção das salas limpas
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
5
II. Objetivos
Orientar procedimentos básicos em ambiente estéril e a correta utilização e
manutenção da CSB e sala onde está instalada. Dar suporte às ações de treinamento de
pessoal.
Este POP é imprescindível para garantir a qualidade dos experimentos realizados pela
equipe, prevenir contaminação de amostras e atender critérios de Biossegurança para
laboratórios de Microbiologia.
III. Material
A. Material de limpeza e desinfecção
 Detergente/desengordurante multiuso
 Álcool comercial 96° GL
 Álcool desinfetante (etanol 70% - V/V)
 Hipoclorito de sódio comercial 2% (p/p)
 Luvas de borracha para limpeza geral
 Luvas de procedimento para limpeza do interior da capela
 EPI: jaleco, máscara e touca Papel toalha resistente à água
 Papel toalha resistente à água
 Pano de limpeza esterilizado
 Balde, rodo e pano de chão (exclusivos)
B. Material básico para procedimento estéril
 Alças de platina
 Esterilizador de alças de platina
 Alças de transferência descartáveis
 Alças de Drigalski descartáveis
 Placas de Petri descartáveis
 Placas de Petri contendo meio sólido apropriado
 Abridor de tubos eppendorf (esterilizado)
 Estante suporte para microtubos (esterilizada)
 Estante suporte para pipetas (desinfetada)
 Tiras de Parafilm M
 Frasco lixeira (vidro de boca larga esterilizado)
 Papel toalha
 Luvas de procedimento
 Luvas de procedimento estéreis
MT 01 - Utilização e manutenção das salas limpas
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
6
Portar luvas de tamanho adequado: luvas grandes diminuem o tato e causam
acidentes.

IV. Procedimentos estéreis
Como dito, a proteção do ambiente interno da CSB pelo sistema de fluxo de ar é
falível, se as correntes de ar forem perturbadas ou se forem introduzidos materiais
contaminados. Em razão do direcionamento da corrente de ar para baixo, qualquer partícula
em suspensão acima de um recipiente aberto será arrastada para dentro do recipiente,
portanto, os movimentos de trabalho na CSB devem ser treinados e aperfeiçoados conforme
instruções a seguir.
A. Boas práticas de trabalho na CSB
1. Fazer movimentos lentos.
2. Eliminar correntes de ar no ambiente externo (sala da CSB).
É vedado o uso de ventiladores em laboratórios de segurança!
3. Não colocar mãos, braços e mangas de jalecos sujos dentro da capela.
4. Aguardar pelo menos 30 min com o sistema de circulação de ar e luzes UV ligados
antes de introduzir o material esterilizado.
5. Utilizar apenas material esterilizado na capela.
6. Após introdução do material de trabalho, aguardar mais 30 min com o sistema de
esterilização ligado (luzes UV acesas e sistema de circulação de ar acionado – vide
item Definição) antes de iniciar o procedimento e, somente após este tempo, inserir
as amostras biológicas na capela.
7. Durante o procedimento na capela, nunca passar as mãos ou qualquer material sobre
amostras abertas, placas de cultivo, frascos de meio de cultura e outros recipientes
estéreis abertos.
Em razão do direcionamento vertical do fluxo, qualquer partícula que esteja
em suspensão no ar acima de um recipiente aberto será arrastada para dentro
deste.
Esta falha de procedimento é causa certa de contaminação.
8. Manter as janelas do LaBafes permanentemente fechadas para evitar a entrada de
insetos voadores e partículas contaminadas.
MT 01 - Utilização e manutenção das salas limpas
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
7
9. Ocorrendo entrada de insetos dentro do compartimento da CSB durante a
manipulação de amostras ou procedimento prévio de esterilização, retomar o
experimento desde o início, a partir da desinfecção da capela.
Sob qualquer suspeita de contaminação, reiniciar o procedimento estéril a
partir dos primeiros passos e segregar as amostras contaminadas.
10. A interrupção da energia elétrica compromete a condição de esterilidade da CSB
durante o procedimento, pois o equipamento não se encontra ligado a uma fonte de
alimentação ininterrupta de energia (nobreak).
Ocorrendo interrupção do fluxo de ar, considerar contaminadas todas as
amostras abertas. Tratando-se de placas meio sólido em preparação (abertas), o
lote deve ser descartado.

B. Manipulação de microtubos na CSB
As amostras de microrganismos da CBafes são armazenadas em microtubos do tipo
eppendorf (em uso) ou criotubos (estoque). O manuseio inadequado dos microtubos é a
principal fonte de contaminação. Este requer habilidade com ambas as mãos e treinamento
orientado por um operador experiente e em conformidade com este procedimento).
Criotubos são utilizados principalmente para o armazenamento de esporos secos,
contidos em tiras de papel de filtro, e suspensões estoque de esporos; possuem tampas
rosqueadas e vedação eficiente por anel de borracha, sendo indicados para armazenamento
seguro por tempo prolongado. A abertura e fechamento de criotubos requer treinamento e
habilidade para desenroscar as tampas com apenas uma mão, sem fazer movimentos sobre
a amostra aberta ou tocar as bordas da tampa ou do tubo.
Os microtubos do tipo eppendorf possuem tampas de fechamento por pressão e
encaixe, e são utilizados para armazenamento de suspensões de trabalho, amostras
utilizadas com frequência e substâncias químicas líquidas ou sólidas (pós) em micro
quantidades.
1. Em procedimentos estéreis os tubos eppendorf devem ser abertos com abridores
esterilizados para evitar o toque nas bordas da tampa ou do tubo.
2. Não abrir tubos eppendorf com apenas uma das mãos, em se tratando de amostras
biológicas: deve-se segurar o tubo com uma mão e suspender a tampa por trás com
os dedos da outra mão, com firmeza e cuidado para não tocar as bordas ou cruzar o
espaço aéreo acima da amostra aberta.
MT 01 - Utilização e manutenção das salas limpas
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
8
Abridores de tubos eppendorf são ótimos auxiliares em procedimentos estéreis,
pois o formato permite a abertura do microtubo sem esforço e sem tocar a borda
do tubo ou da tampa.
3. Ao escolher uma estante de apoio para microtubos, observar se estes realmente se
encaixam nos orifícios do suporte; se podem ser colocados e retirados com
facilidade.
4. Distribuir os microtubos na estante deixando espaços vazios entre um tubo e outro,
de forma a facilitar o manuseio.
Evitar condições em que seja necessário aplicar força durante a manipulação
de amostras; isto pode gerar movimentos bruscos, derramamento de conteúdo e
respingos que contaminam as luvas ou outro material próximo.
5. A abertura de vários microtubos em uma estante ao mesmo tempo, como, por
exemplo, para distribuição de água, pode ser necessária, mas deve-se trabalhar de
forma a não fazer movimentos sobre amostras abertas, abrindo as amostras a partir
da fileira maisdistante e iniciando o fechando a partir da fileira mais próxima.
Deixar espaçamento de pelo menos um microtubo entre as fileiras. O
treinamento individual é imprescindível.
6. A manipulação de esporos secos exige cuidados especiais:
Não deixar outras amostras ou qualquer material atrás do microtubo que
está sendo manuseado!
Observar que o sentido do fluxo de ar é de cima para baixo e para trás.
Manipular uma amostra por vez e fechar os microtubos imediatamente
evitando exposição desnecessária ao ambiente.
Havendo suspeita de contaminação, realizar o procedimento MT 06 - Controle
de qualidade microbiológico (A, B ou C) para as suspensões e cultivos sob
suspeita.

E. Procedimento geral
Os cuidados de manutenção e as operações descritas a seguir são necessários para
proteção do ambiente, das amostras e do operador. Este POP se aplica a todos os
procedimentos estéreis descritos neste manual. Antes de iniciar qualquer procedimento na
CSB, observe as condições de higiene e desinfecção do espaço:
1. A capela foi limpa adequadamente pelo usuário anterior?
MT 01 - Utilização e manutenção das salas limpas
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
9
2. O sistema de ventilação da capela estava em funcionamento por pelo menos 30 min?
3. As luzes UV da CSB e da sala estavam acesas a, pelo menos, 30 min?
4. A lixeira da sala está vazia e limpa?
5. A sala está limpa e organizada?
Se estas condições estiverem satisfeitas, o trabalho pode ser iniciado a partir do
próximo item:

6. Fazer a assepsia das mãos e antissepsia com etanol 70% antes de iniciar qualquer
trabalho na sala ou na CSB (MT 02 – Procedimentos básicos).
7. Com o sistema de circulação desligado, suspender o vidro de proteção e limpar a CSB
com detergente/desengordurante não abrasivo, começando pela parte alta das
paredes, superfície das lâmpadas e descendo.
Cuidado para não tocar os contatos elétricos das lâmpadas!
8. Umedecer o papel toalha com o produto de limpeza e esfregar as superfícies internas
da capela, começando pela parte posterior do piso (Figura 2) a frente com
movimentos em forma de oito deitado ( ).
Não utilizar pano ou qualquer outro material não descartável para limpeza
interna da CSB! Risco de disseminação de esporos e células vegetativas para
outros ambientes.
9. Repetir a limpeza com etanol 70% e papel toalha.
Não aspergir produtos de limpeza dentro da capela! A umidade danifica o
filtro de ar (HEPA).
10. Ligar o sistema de esterilização ligado, apagar a luz branca da sala, sair, fechar a porta
e ligar a lâmpada UV no interruptor externo que fica na parede ao lado da porta
(Figura 1A). Aguardar pelo menos 30 min antes de iniciar qualquer procedimento na
CSB.
11. Após 30 min, desligar as lâmpadas UV da sala e capela, mantendo o sistema de
circulação de ar ligado.
Desligar o sistema de circulação de ar após a retirada de todo o material da
capela.
12. Lavar as mãos, fazer a antissepsia com etanol 70% e organizar na capela todos os
utensílios esterilizados.
13. Limpar e pulverizar sacos plásticos de material estéril comercial com etanol 70% no
momento de introduzi-los na cabine.
MT 01 - Utilização e manutenção das salas limpas
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
10
14. Abrir parcialmente os invólucros do material autoclavado, próximo à fronteira do
fluxo laminar, e inserir os utensílios retendo o papel.
Não introduzir papéis de embalagem dentro da CSB, exceto embalagens de
material estéril comercial e após assepsia: as embalagens comerciais de produtos
esterilizados são de papel encerado ou plastificado, menos porosos e de fácil
desinfecção por etanol 70%.
15. Pôr a lixeira de capela em um dos cantos, próximo à abertura da CSB (Figura 4A).
16. Se for utilizar o esterilizador de alças de platina, posicionar o mesmo próximo à
tomada de força da cabine a, pelo menos, 25 cm das paredes (Figura 4A e B).
Observar a posição mais ergonômica para não precisar movimentar o aparelho após
o aquecimento.
Sempre segurar o esterilizador pela base. Este pode ter sido utilizado
anteriormente e ainda estar quente!

BA
25 cm

Figura 4. Visão interna da Capela de segurança biológica. (A) Vista lateral mostrando o
posicionamento do esterilizador elétrico a 25 cm da parede posterior e pote de vidro
utilizado como lixeira de CSB. (B) CSB com sistema de esterilização ligado contendo alguns
instrumentos de trabalho. Observar a posição do esterilizador e a placa de aço inoxidável
para suporte da alça de platina, evitando contado com o piso durante o procedimento.

17. Ligar novamente a lâmpada UV da CSB, sair, ligar a lâmpada UV da sala e aguardar 30
min.
18. Após 30 min, desligar as lâmpadas UV da capela e da sala e acender as lâmpadas
brancas (de trabalho).
19. Lavar as mãos e separar as amostras biológicas que serão utilizadas em uma estante
para microtubos esterilizada.
20. Devolver as amostras restantes ao local de armazenamento.
21. Depositar as amostras biológicas na bancada de apoio da sala da CSB.
MT 01 - Utilização e manutenção das salas limpas
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
11
22. Certificar-se que todo o material está organizado na CSB e na bancada de apoio,
incluindo a caneta marcadora.
23. Vestir um jaleco limpo e dobrar as pontas das mangas.
24. Arregaçar as mangas até os cotovelos, fazer a assepsia das mãos e antebraços e
antissepsia com etanol 70% (MT 02 – Procedimentos básicos).
25. Calçar as luvas de procedimento e depositar as amostras biológicas na CSB, porém
distante da fonte de calor (Figura 4A).
26. Considerando o piso da CSB como área de trabalho (Figura 5), dividir mentalmente
esta superfície em campos, por exemplo: campo limpo à esquerda, campo sujo à
direita e campo principal de trabalho ao centro na região mais próxima ao operador.
Sendo assim:
 No campo limpo (Figura 5A), organizar placas de Petri novas, placas de Petri
contendo meio fresco, frascos contendo água purificada, Erlenmeyers
contendo meio de cultura estéril, tubos eppendorf novos, luvas estéreis
excedentes e outros instrumentos esterilizados.
 No campo sujo (Figura 5B), posicionar a lixeira próxima à fronteira, fitas de
Parafilm M e material usado.
 No campo principal (Figura 5C), organizar as amostras biológicas, estante de
pipetas, estantes de microtubos e instrumentos em geral.

C
Campo
principal/central
B
Campo
sujo
A
Campo
limpo

Figura 5. Interior da CSB. A divisão mental do piso em campos de trabalho
facilita o movimento e manuseio de amostras e instrumentos evitando o contato
entre material estéril e material usado. As amostras de trabalho devem ficar,
preferencialmente, no campo central.

27. Ligar o esterilizador de alças de platina.
MT 01 - Utilização e manutenção das salas limpas
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
12
O aparelho estará pronto para uso quando o tubo interno estiver
incandescente.
28. Luvas de procedimento estéreis excedentes devem ser colocadas na mesa de apoio.
29. Durante o procedimento, não cruzar a linha central do campo de trabalho com as
mãos. Isto significa que: tudo que estiver à esquerda será manuseado com a mão
esquerda e, se preciso, passado para a mão direita e vice-versa.
30. As mãos ou braços também não devem passar por cima de frascos abertos contendo
materiais/soluções estéreis ou amostras biológicas.
Esses movimentos precisam ser observados e treinados, sempre no intuito deminimizar riscos de contaminação de amostras e do operador.
31. Utilizar estantes limpas e autoclavadas como suporte para tampas de frascos e placas
de Petri abertas.
Nunca colocar as tampas dos frascos emborcadas diretamente sobre o piso
da capela e nem material esterilizado, como alças de transferência, luvas e alças
de Drigalski. O piso sempre deve ser considerado uma superfície potencialmente
contaminada.
32. As placas de Petri possuem um formato que reduz a entrada de partículas no interior,
mas há troca de gases com o ambiente externo e a contaminação é possível.
Não abrir amostras biológicas fora da CSB e reduzir ao máximo o tempo de
exposição das amostras ao ambiente da capela.
33. Utilizar a lixeira de CSB somente para descarte do material usado dentro da capela.
34. Retirar a lixeira após término do trabalho e colocar no local destinado ao material
contaminado para desinfecção.
A lixeira individual deve ser autoclavada conforme procedimento de
desinfecção (MT 02) antes de ser lavada e esterilizada para reutilização.
35. Desligar o esterilizador assim que encerrar o uso para reduzir o calor no interior da
CSB e ambiente externo.
A utilização de alças de transferência descartáveis é preferível, pois o calor
gerado pelo esterilizador revoluciona os fluxos de ar dentro da capela diminuindo
sua eficácia e segurança.
36. Ao final do trabalho, recolher todo o material e limpar a capela com etanol 70%
conforme descrito anteriormente.
37. No caso de derramamento de substâncias ou amostras no piso, utilizar um
desengordurante e papel toalha antes da desinfecção com etanol 70%.
38. Limpar a bancada de apoio com etanol 70% e papel toalha.
MT 01 - Utilização e manutenção das salas limpas
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
13
39. Acionar o sistema de esterilização por 30 min.
40. Se outro usuário for trabalhar imediatamente após, deixar o sistema de esterilização
ligado.
41. Apagar as luzes da sala, sair, fechar a porta e acender as lâmpadas UV da sala no
interruptor externo.
Nunca adentrar a sala com as lâmpadas UV acesas e nem colocar as mãos
dentro da capela com a UV ligada! A radiacao UV é mutagênica.
42. Descartar o papel utilizado para limpeza interna da CSB na lixeira grande da sala.
A lixeira da sala da CSB não se destina ao descarte de material utilizado no
interior da capela de segurança. Deve ser trocada frequentemente evitando-se o
transbordamento de lixo na sala.
43. Esvaziar a lixeira da sala no local determinado quando a metade da capacidade for
ultrapassada.

VI. Boas práticas de utilização da sala da CSB
1. A porta da sala da CSB deve ser mantida fechada para minimizar a entrada de poeira
e as luzes UV sempre ligadas, antes e após a utilização da capela.
Não entrar desnecessariamente na sala limpa!
2. Tomar medidas para minimizar correntes de ar, as quais carreiam poeira para dentro
da sala e interferem no direcionamento do fluxo de ar dentro da CSB.
Nunca ligar ventiladores dentro da sala ou em direção à porta! O uso de
ventiladores em laboratórios de segurança é proibido.
3. material guardado na sala da CSB é de uso exclusivo em procedimentos estéreis.
Não introduzir caixas de papelão na sala da CSB!
4. As caixas de luvas de procedimento são uma exceção, porém estas devem ser limpas
externamente com papel toalha e álcool desinfetante.
5. O piso, a porta, paredes, luminárias, prateleiras, bancada de apoio e superfície
externa da cabine, devem ser limpos semanalmente com desengordurantes
instantâneos e álcool desinfetante.
6. O piso deve ser lavado semanalmente, secado com um pano limpo de uso específico
e solução de hipoclorito de sódio comercial diluída a 1% (V/V).
7. Todos os procedimentos de limpeza, no laboratório, devem ser realizados
umedecendo-se as superfícies para evitar suspensão de partículas.
MT 01 - Utilização e manutenção das salas limpas
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
14
Não é permitida a utilização de vassouras, espanadores e panos secos com
finalidade de limpeza, em laboratórios de microbiologia!

VI. Referências
ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Segurança do paciente em serviços de saúde.
Limpeza e desinfecção de superfícies. Brasília (2010)
DOS SANTOS, V. D. F., RIBEIRO, A. B., PALMA, C. S.. Limpeza e desinfecção da cabine de segurança
biológica classe II B2: a realidade dos serviços de oncologia de Curitiba.
Ministério da Saúde, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC Nº 17, de 16 de abril
de 2010. Dispõe sobre as Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos.
MOLINARO, E. T., CAPUTO, L. F. G., AMENDOEIRA, M. R. R.. Conceitos e métodos para formação de
profissionais de saúde. Escola Politécnica de Saúde Joaquim Venâncio, Fundação Oswaldo Cruz
Vol. 1 (2009)
ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Farmacopéia Brasileira, 5ª Ed., Vol. 1, Cap. 5.5 -
Métodos Biológicos, Ensaios Biológicos E Microbiológicos. Brasília (2010).

Flávia Porto Carreiro A. Bezerra Marlene Teixeira De-Souza
Matrícula nº 13/0061191 Orientadora

Revisão Nº Data Emissor Aprovação
00 25/10/2014 Flávia Porto Carreiro A. Bezerra Marlene Teixeira De-Souza
01

I. Organização
Nos itens de III a VII, este documento orienta os seguintes procedimentos
laboratoriais:
III. Procedimentos de autoclavagem
A. Esterilização de material limpo
B. Desinfecção de material reutilizável
C. Esterilização de resíduos biológicos para descarte
D. Autoclavagem
IV. Procedimentos de esterilização por flambagem (calor seco)
A. Alças de platina
B. Alças de Drigalski
C. Pinças anatômicas
V. Procedimento de filtração
A. Material
B. Coleta de água ultrapura
C. Filtração
VI. Preparação do álcool desinfetante
A. Material
B. Diluição do etanol 96 °GL
VII. Assepsia das mãos e antebraços
VIII. Referências

MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
16
II. Definições
Procedimentos básicos são aqueles que acompanham todas as atividades
laboratoriais. Estes procedimentos de aplicam a todas as operações de preparação de
amostras microbiológicas para fins espectrométricos sejam estes, análise identificatória ou
aquisição de perfis de massa para a biblioteca filoproteômica. Relacionados aos
procedimentos básicos, os conceitos de limpeza, desinfecção, assepsia e antissepsia
precisam ser bem compreendidos.
De maneira geral, a limpeza é um processo que reduz a carga microbiana pela
remoção de sujidades visíveis e detritos através de ação mecânica. A lavagem é uma forma
de limpeza que aproveita da afinidade dos detritos por substâncias surfactantes –
detergentes – que permitem sua dissolução na água de lavagem.
Desinfecção é um processo de eliminação da maioria dos microrganismos de
superfícies ou objetos inanimados utilizando agentes físicos ou químicos ou por remoção
mecânica. Após desinfecção, o número de microrganismos viáveis deve tender a zero.
Alguns métodos de desinfecção também são esterilizantes.
As soluções desinfetantes utilizadas no LaBafes para limpeza de superfícies são: etanol
70% e hipoclorito de sódio em concentrações variadas. O hipoclorito de sódio é um
composto inorgânico liberador de cloro ativo, degradável em temperaturas maiores que 25°C e sob luz solar, volátil e corrosivo para metais, podendo causar irritabilidade nos olhos e
mucosas. É um agente bactericida eficaz, viricida, fungicida e esporicida, dependendo da
concentração de uso que, para desinfecção, varia entre 0,02% a 1,0%. A apresentação
comercial, líquida, com teor de cloro ativo entre 2,0% e 2,5% (p/p), foi adotada pela
praticidade, ação rápida e baixo custo. É indicado para desinfecção de superfícies plásticas,
fórmicas e outras, resistentes à ação do cloro ativado. É mais eficaz após remoção de
sujidades, como crostas de material orgânico, mas pode ser aplicado para redução da carga
microbiana em superfícies resistentes, antes da limpeza, como pisos, plásticos e superfícies
de fórmica.
O etanol diluído em água destilada com concentrações entre 60% a 90% (V/V), é um
agente desinfetante bactericida, viricida, fungicida e com ação otimizada na concentração de
70%. Não é esterilizante, pois não apresenta ação contra esporos bacterianos. Pode ser
usado para limpeza superficial e desinfecção de materiais e superfícies. É eficaz como
MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
17
antisséptico, mas causa ressecamento da pele. Não é um bom removedor de sujidades,
portanto, não substitui o processo de lavagem com detergente ou a utilização de
desengordurantes.
O álcool comercial (96 °GL) possui ação desengordurante e pode ser utilizado para
limpeza rápida de superfícies que sejam resistentes ao produto. Deve-se observar que o
etanol é inflamável, explosivo, volátil, opacifica superfícies acrílicas e resseca plásticos e
borrachas.
A antissepsia é o processo de diminuição de carga microbiana em tecidos vivos
superficiais, mediado por agentes químicos denominados antissépticos, capazes de
inviabilizar células vegetativas, mas não esporos. Por atuar em tecidos vivos, os antissépticos
devem ser suficientemente atóxicos para serem aplicados, por esta razão, não são
esterilizantes.
A esterilização é um processo capaz de eliminar todas as formas de vida microbiana,
incluindo esporos bacterianos, por ação de um agente físico ou químico. A esterilização de
superfícies deve ser realizada após limpeza e desinfecção, seguida por exposição por tempo
adequado a um agente químico ou luz UV.
A esterilização em autoclave é um método físico caracterizado pela ação do calor
úmido sob pressão (vapor) em temperaturas superiores ao ponto de ebulição da água e
tempo adequado, suprimindo a viabilidade de células vegetativas e esporos presentes no
material. No LaBafes, este procedimento se aplica a três situações: i) esterilização de
material limpo, ii) esterilização de material reutilizável e iii) tratamento de culturas
bacterianas, e outros resíduos biológicos, para o descarte seguro.
A esterilização de material limpo como vidrarias e instrumentos é realizada somente
após lavagem meticulosa desse material. A limpeza é imprescindível para que o calor úmido
aja eficientemente sobre as superfícies, permitindo a condição de esterilidade do material
após a autoclavagem. Os meios de cultura e soluções não termolábeis empregadas na
manipulação de microrganismos, também, são submetidos à autoclavagem antes de serem
distribuídos nas placas de Petri. Por ser eficaz contra esporos, este é o método de
esterilização mais utilizado no LaBafes.
A radiação ultravioleta (UV) é aplicada somente na capela de segurança biológica
(CSB) para esterilização das superfícies e do ar, antes e após o uso (MT 01 - Utilização e
manutenção das salas limpas).
MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
18
A esterilização por calor seco é um método de que carboniza resíduos orgânicos
aderidos ao utensílio de trabalho. É capaz de eliminar qualquer tipo de contaminação
biológica. Pode ser realizada em esterilizador elétrico ou por flambagem, em bico de
Bunsen, com o instrumento seco (metal) ou após imersão em álcool (vidro). É aplicável à
esterilização de superfícies de utensílios de metal ou vidro, como pinças anatômicas de aço
inoxidável e alças de platina ou Drigalski. A utilização de fogo nos laboratórios de pesquisa
ainda não pôde ser completamente abolida; algumas reações químicas e técnicas
colorimétricas requerem a utilização de bicos de Bunsen, assim como a flambagem de pinças
metálicas. Porém, estes são procedimentos de bancada e nunca devem ser realizados na CSB
por questões de segurança e interferência no direcionamento do fluxo de ar.
A filtração é um processo de remoção de partículas em suspensão, utilizada para a
esterilização de água ultrapura e soluções de baixa viscosidade. Durante a utilização, a água
ultrapura (no LaBafes obtida por sistema Milli-Q) pode ser contaminada quando exposta ao
ar. No processo de preparação de amostras para a espectrometria de massa, na etapa de
preparo das suspensões de esporos (MT 03 - Preparo de suspensões estoque), a água
ultrapura deve ser filtrada em membranas com porosidade de 0,22 m, adaptáveis a
seringas hipodérmicas.
A palavra assepsia designa um conjunto de medidas que visam manter um ser vivo ou
um meio inerte isento de bactérias. No contexto do LaBafes, a assepsia envolve a limpeza e
tratamento das mãos e antebraços, no sentido de reduzir a carga microbiana, pois essas
partes do corpo entrarão em contato com superfícies esterilizadas de utensílios e com o ar
da CSB durante o manuseio das amostras microbiológicas. Este procedimento é obrigatório e
fundamental para minimizar a contaminação microbiológica de ambientes, equipamentos,
utensílios, amostras e do próprio operador. A assepsia dos antebraços e mãos deve ser
realizada antes e após o manuseio de amostras biológicas, ou material potencialmente
contaminado, ainda que o operador esteja utilizando equipamentos de proteção individual
(EPIs). A assepsia deve ser realizada, também, antes do início e após a rotina laboratorial.
É importante enfatizar que a presença de lesões cutâneas é um impedimento ao
trabalho em laboratórios. Pessoas acometidas com doenças respiratórias infecciosas, ou
não, ou outras infecções contaminantes, também não devem comparecer ao laboratório até
completo restabelecimento.
MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
19
Estas são medidas importantes de proteção e contenção que não devem ser
negligenciadas.

II. Objetivos
Prevenir a disseminação de contaminantes microbiológicos em ambientes e materiais
diversos. Preservar a integridade das amostras favorecendo a reprodutibilidade dos
espectros e qualidade dos ensaios laboratoriais. Reforçar ações de biosseguridade e
biossegurança laboratoriais.
Outros procedimentos básicos podem ser consultados no Manual do LaBafes, Manuais
de Biossegurança ou, manual de Técnicas Básicas em Biologia Molecular, disponíveis neste
Laboratório.

III. Procedimentos de autoclavagem
A. Esterilização de material limpo
Refere-se a soluções de trabalho autoclaváveis, vidrarias e instrumentos gerais de
bancada, novos ou limpos: vidraria, tubos plásticos ou de vidro, ponteiras, soluções, meios
de cultivo etc. Observe que alguns instrumentos não são resistentes à autoclavagem.
1. Selecionar o material que será autoclavado.
Em se tratando de utensílios reutilizáveis, certificar-se que tenham sido
devidamente lavados, enxaguados em água corrente e, em seguida, com água
destilada.
2. Embalar o material limpo separadamente em papel pardo (Kraft) e lacrar os pacotes
com fita crepe.
3. Identificar os pacotes com nome do operador e data.4. Abrir a autoclave e verificar se foi limpa e se contém água destilada nova. Em caso
negativo, drenar a água e limpar como explicado nos itens 5 a 9.
5. Retirar o cesto de aço inoxidável da autoclave e lavar com esponja e detergente.
6. Enxaguar o cesto com água potável e depois generosamente com água destilada.
7. Limpar a autoclave por dentro com papel toalha e etanol para desengordurar as
superfícies internas.
MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
20
Não utilizar desinfetantes, desengordurantes comerciais, hipoclorito de sódio
ou outros produtos de limpeza que possam deixar resíduos químicos dentro do
equipamento.
8. Enxaguar as paredes do equipamento com água destilada.
9. Completar o nível até a cruzeta com água destilada.
Nunca utilizar água corrente na autoclave!
10. Recolocar o cesto e organizar o material dentro, de forma a não ultrapassar a borda.
11. Continuar o procedimento de esterilização a partir do item D - Autoclavagem.
12. Após a retirada do material, fechar imediatamente os frascos contendo líquidos.
Durante o resfriamento, o ar ambiente é sugado para dentro do frasco por
diferenças de pressão, recontaminando o conteúdo que foi esterilizado.
13. Organizar os utensílios na estufa de secagem (60 °C) minimizando o espaço ocupado
e evitando empilhamentos que possam causar acidentes ao abrir a porta.

B. Desinfecção de material reutilizável
Este item refere-se à desinfecção de material utilizado e potencialmente contaminado
para reutilização.
Neste caso, a autoclavagem deve ser feita antes do procedimento de lavagem
para evitar a disseminação de contaminantes nas águas de lavagem e material
de limpeza.
1. Acondicionar o material que será autoclavado em recipientes abertos de metal ou
vidro temperado ou plástico termo resistente.
2. Completar a água da autoclave até 1 cm acima do nível da cruzeta.
3. Colocar os recipientes contendo material contaminado no cesto da autoclave,
cuidando para não ultrapassar o nível da borda do cesto.
4. Continuar o procedimento no item D – Autoclavagem.
5. Após a retirada da autoclave, transferir o material para a sala de lavagem.
6. O material reutilizável deve, então, ser lavado e enxaguado adequadamente e
embalado para procedimento de esterilização conforme o item A – Esterilização de
material limpo.

MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
21
C. Esterilização de resíduos biológicos para descarte
Resíduos laboratoriais contaminados ou potencialmente contaminados por material
biológico não podem ser descartados antes da esterilização.
Neste caso, todo tipo de material contaminado deve ser submetido ao
processo de autoclavagem, não importando sensibilidade à temperatura.

1. Colocar o material em recipientes de alumínio, aço inoxidável ou vidro temperado.
2. Completar o nível da água destilada até 1 cm acima da cruzeta.
3. Colocar os recipientes contendo material contaminado no cesto cuidando para não
ultrapassar o nível da borda do cesto.
4. Continuar o procedimento conforme item D – Autoclavagem.
5. Após término do ciclo de autoclavagem, retirar o material colocando-o em uma
bandeja de metal.
Utilizar luvas antitérmicas!
6. Descartar tudo na lixeira de material descontaminado da sala de lavagem principal do
laboratório.

D. Autoclavagem
Após o adequado acondicionamento do material no cesto de autoclavagem como
descrito nos procedimentos de A – C, prosseguir conforme orientação abaixo:
1. Abaixar a tampa do equipamento e encaixar as travas.
2. Apertar gradualmente os parafusos em posições diametralmente opostas, dois a
dois, aplicando força semelhante em todos.
Este cuidado é importante para não empenar a tampa e preservar a
segurança do equipamento.
3. Certificar-se que a válvula de saída de ar esteja bem aberta.
4. Girar o botão de temperatura até posição max (máxima).
5. Aguardar o aquecimento da água e esgotamento de vapor pela válvula.
Aguardar a saída de vapor por cerca de 5 min e fechar a válvula de saída.
6. Aguardar a temperatura atingir 121 °C, como registrado no termomanômetro, e girar
o botão de temperatura para a posição med (média).
MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
22
7. Deixar por, pelo menos, 20 min para procedimentos de esterilização e 60 min para
procedimentos de descontaminação de material a ser descartado.
8. Após o tempo estabelecido, girar o botão de temperatura até a posição desligado.
9. Aguardar a diminuição da temperatura para menos de 100 °C e abrir lentamente a
válvula de ar, para que a pressão interna diminua lentamente até zero (cessar
completamente a saída de vapor).
Não afrouxar os parafusos da tampa antes de esgotar o vapor!
10. Afrouxar gradualmente os parafusos da tampa dois a dois (localizados em posições
opostas).
11. Posicionando-se ao lado da autoclave, levantar a tampa cuidando para não deixar o
rosto, mãos ou braços sobre a abertura.
Risco de queimaduras por exposição ao vapor!
12. Portando luvas de antitérmicas, transferir o material autoclavado para uma bandeja
e retornar ao procedimento A, B ou C, conforme ao tipo de material em esterilização.

IV. Procedimento de esterilização por calor seco
Este procedimento é diferente para cada tipo de instrumento. Como explicado
anteriormente, pode ser realizado em esterilizador elétrico ou bico de Bunsen, com o
instrumento seco ou após imersão em álcool, como explicado a seguir.

A. Alça de platina
Deve-se preferir a utilização de alças de transferência de material plástico esterilizado
industrialmente para os procedimentos na CSB. Contudo, sendo necessário utilizar alças de
platina, estas devem ser esterilizadas em esterilizador elétrico, conforme instruções a seguir.
1. Ao iniciar o procedimento na CSB, ligar o esterilizador e aguardar cerca de 20 min até
que o tubo interno esteja totalmente incandescente.
2. Pôr a alça em contato direto com a parede interna do tubo e aguardar alguns
segundos até que fique incandescente.
3. Retirar a alça e deixar resfriar durante alguns segundos antes de coletar a amostra
biológica.
4. Transferir a amostra e esterilizar, imediatamente, a ponta da alça para evitar
contaminação de outros materiais dentro da capela.
MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
23
5. Esterilizar a alça novamente antes de coletar nova amostra.
Não utilizar bico de Bunsen dentro da CSB ou sala limpa!

B. Alça de Drigalski
A esterilização de alças de Drigalski deve ser feita pelo método tradicional de
flambagem em bico de Bunsen. Por serem de vidro, o esterilizador elétrico não é adequado a
este procedimento. Porém, alças de Drigalski de material plástico e esterilizadas estão
disponíveis comercialmente e a utilização destas dispensa a esterilização por flambagem.
Certificar-se que não existam correntes de ar, provocadas por ar condicionado
ou janelas abertas, que possam arrastar o vapor de álcool até a chama.
1. Posicionar o recipiente contendo as alças de Drigalski sobre a bancada, longe de
reagentes inflamáveis.
2. Posicionar um frasco de vidro ou aço inoxidável, de boca larga, contendo cerca de 4
cm de etanol comercial 96° GL próximo às alças.
3. Ligar o bico de Bunsen posicionado a uma distância de, pelo menos, 1 m do
recipiente contendo o álcool.
4. Mergulhar a alça no etanol e colocarem contato com a chama do bico de Bunsen.
5. Esperar alguns segundos até que o material arrefeça antes de tocar a amostra
biológica.
6. Repetir o procedimento de flambagem antes de depositar a alça no suporte.
7. Repetir o procedimento para cada amostra.

C. Pinças anatômicas
As pinças anatômicas de aço inoxidável utilizadas em quase todos os procedimentos
estéreis, não devem ser esterilizadas no esterilizador elétrico. Em parte devido à liga de aço
ser destemperada pela exposição a altas temperaturas. Como o mercado nacional não
disponibiliza pinças anatômicas descartáveis esterilizadas, estes instrumentos devem ser
flambados com etanol, lavados e esterilizados em autoclave antes da próxima utilização. O
tratamento das pinças usadas deve ser realizado de forma segura conforme instruções
abaixo.
MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
24
1. Após a conclusão do trabalho na CSB, colocar uma placa de Petri de aço inoxidável
sobre a bancada da pia. Uma das partes com a abertura voltada para baixo e outra
para cima, conforme a figura 1.

Figura 1. Procedimento seguro de flambagem das
pinças de aço inoxidável. Note a tampa da placa
de aço inoxidável emborcada para baixo para
proteger a bancada do aquecimento e a pisseta
contendo etanol para umedecer as pinças e o
fundo da placa.

2. Eliminar todas as correntes de ar, fechando janelas e desligando o ar condicionado.
3. Certificar-se que não existam frascos contendo líquidos inflamáveis na bancada ou
próximo a esta.
4. Transferir as pinças usadas que estão na CSB para as placas de aço inoxidável
arranjadas na bancada.
Cuidado para não tocar as partes potencialmente contaminadas.
5. Utilizar a pisseta para pulverizar as pinças com etanol 96° GL, evitando espirrar na
pia, adicionando apenas o suficiente para umedecer todo o fundo da placa.
6. Afastar a pisseta contendo etanol e acender o fogo.
7. Deixar flambar até que o fogo se apague e aguardar o resfriamento.
8. Lavar as pinças e a placa, esfregando a parte serrilhada das pinças com a escova.
9. Autoclavar conforme item III, parte A - Autoclavagem de material limpo.

MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
25
V. Procedimento de filtração
Como dito anteriormente, o procedimento de filtração é utilizado para esterilização da
água ultrapura no momento do preparo da suspensão de esporos estoque. Para isto são
utilizadas membranas filtrantes de celulose com porosidade de 0,22 µm, adaptáveis a
seringas hipodérmicas. O procedimento é estéril, e deve ser realizado antes da introdução
de amostras biológicas na CSB (MT 03 - Preparo de suspensões estoque).
Não autoclavar a água ultrapura Tipo I; isto altera as características físico-
químicas desejadas.
A. Material
 Amostras secas de esporos ou suspensões a diluir
 1 sistema de utrapurificação de água (Tipo 1 – por exemplo, sistema Milli-Q)
 1 frasco de vidro esterilizado
Utilizar frasco de vidro autoclavável específico para laboratórios.
 1 seringa hipodérmica de 5-10 mL estéril
 1 membrana filtrante de 0,22 µm estéril
 1 estante para microtubos autoclavada
 1 pinça anatômica esterilizada
 1 caneta de marcação permanente

B. Coleta da água ultrapura tipo 1
As instruções a seguir se referem ao sistema de purificação de água Cascada LS mk2-
Water Purification System (Pall Corporation), instalado no laboratório de Biofísica do
Instituto de Biologia da UnB, onde é coletada a água ultrapura utilizada para os
experimentos do LaBafes. O acionamento do sistema de coleta de água é similar para outros
modelos e as instruções encontram-se afixadas no próprio equipamento. É recomendado ler
as instruções de uso antes de acionar o sistema de coleta de água em qualquer equipamento
purificador.
1. Utilizar, para a coleta, um frasco de vidro de pequeno volume e esterilizado.
Só abrir o frasco no momento da coleta!
MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
26
2. Imediatamente antes da coleta, enxaguar o frasco e a tampa com água Milli-Q.
3. Observar se o reservatório de água do equipamento de purificação está preenchido
acima do nível mínimo indicado.
4. Acionar o botão standby e aguardar o visor indicar 18,2 .
5. Retirar a tampa de proteção do bico do purificador e posicionar o frasco de coleta
próximo ao bico sem tocar.
6. Acionar o botão de ação.
7. Coletar a água e desligar o botão de ação.
8. Tampar imediatamente o frasco.
9. Tampar o bico do purificador.
10. Acionar novamente o modo standby.

C. Filtração
1. Transferir todo o material, com as embalagens externas previamente higienizadas,
para a CSB (MT 01 - Utilização e manutenção das salas limpas).
2. Usar estante de apoio para os utensílios estéreis.
3. Posicionar a estante com os microtubos que irá trabalhar no campo central.
4. Abrir o invólucro e apoiar a seringa na estante.
5. Abrir a embalagem da membrana filtrante.
Preservar a embalagem da membrana filtrante para apoiar a mesma no
momento de reabastecer a seringa.
Atenção para não tocar o bico de saída do filtro!
6. Encher a seringa com água ultrapura.
7. Encaixar o filtro firmemente na ponta da seringa.
8. Abrir o primeiro microtubo e filtrar a água diretamente neste até a marca do volume
desejado.
9. Tampar imediatamente e recolocar na estante.
10. Ao encher o próximo microtubo, desprezar a primeira gota de água que fica suspensa
na borda da seringa.
11. Para reabastecer a seringa, retirar a membrana filtrante e depositar na própria
embalagem, evitando contato com qualquer outra superfície.
12. Reabastecer a seringa e repetir o procedimento.
MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
27
VI. Preparação do álcool desinfetante
A. Material
Para um litro de etanol 70% (V/V):
 1 proveta de 1 L
 1 béquer de 1 L
 300 mL de água destilada
 730 mL de etanol 96 °GL
 1 caneta de marcação permanente de ponta grossa
 fita crepe

B. Diluição do etanol 96 °GL
Considerando que a concentração inicial do etanol comercial (96 °GL) corresponde a
96% e, sendo Vi o volume inicial; Ci a concentração inicial; Vf a concentração final e Cf a
concentração final, o volume necessário de etanol para preparar um litro de etanol 70%
será:
Vi . Ci = Vf . Cf
Vi = Vf . Cf/Ci
Vi = 70/96 . 1000 mL
Vi = 729,1 mL

Aproximando o resultado para a precisão da bureta que é de ±2 mL, pode-se
considerar o volume inicial de etanol comercial igual a 730 mL.
1. Medir 730 mL de etanol na proveta.
2. Completar o volume com água destilada para 1.000 mL.
3. Homogeneizar a mistura e distribuir nas pissetas das bancadas.

VII. Assepsia e antissepsia das mãos e antebraços
1. Antes de iniciar o trabalho, retirar anéis, pulseiras, relógio, colares e qualquer adorno
que possa conferir risco de acidentes no laboratório (cair, enganchar), dificultar a
MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
28
limpeza e antissepsia da pele ou favorecer processos inflamatórios, como brincos e
anéis apertados. As unhas devem estar sempre aparadas rente à pele e limpas.
Não é permitida a utilização de adornos como anéis, pulseiras, relógio e
colares em laboratórios de Microbiologia.
2. A figura 1 apresenta, em onzepassos, a higienização das mãos com objetivo de
remover microrganismos que colonizam as camadas superficiais da pele, assim como
suor, oleosidade, células mortas e sujidades que propiciam a permanência e
proliferação de microrganismos.
3. A utilização de escovas macias para limpeza das unhas e esponjas com soluções
antissépticas para limpeza da pele, não é apresentada nas imagens, mas deve ser
adotada como medida extra de segurança para procedimentos estéreis em CSB.
4. Soluções antissépticas com grau cosmético são menos agressivas para a pele que o
etanol 70% e podem apresentar características de proteção ao tecido. A assepsia e
antissepsia frequentes das mãos podem provocar escaras e a utilização de óleos
reparadores e cremes hidratantes ao final do expediente é recomendada.
Entretando, durante as atividades laboratoriais, as mãos devem ser limpas
sem a utilização posterior de cremes cosméticos.
5. Para procedimentos de rotina, não estéreis, é suficiente lavar as mãos até os pulsos
antes e depois. Antes de sair do laboratório, ao final do período, também.
6. Antes de procedimentos limpos na CSB, lavar os antebraços até a altura dos
cotovelos, deixando a água de enxague escorrer no sentido da ponta dos dedos para
os cotovelos (Figura 2).
Utilizar papel-toalha para fechar as torneiras ou lavar a torneira e aplicar
etanol 70% antes de enxaguar as mãos.
7. Para descontaminação com etanol 70% (glicerinado ou não) espalhar nas mãos e
antebraços e friccionar com os mesmos movimentos utilizados para a lavagem.
8. Para evitar ressecamento e dermatites, não higienizar as mãos com água e sabão
imediatamente depois de usar uma preparação alcoólica.
9. Depois de desinfetar as mãos com preparação alcoólica, deixar que sequem
completamente (sem utilização de papel-toalha) e, para procedimentos na CSB,
deixar que as mãos e antebraços sequem dentro da capela.
MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
29

MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
30

Figura 1. Higienização de mãos. Procedimento
simples de higienização de mãos em onze
passos, com duração de 40-60 segundos. Fonte:
http://www.anvisa.gov.br/hotsite/higienizacao_mao
s/manual_integra.pdf. Acesso livre.
MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
31

Figura 2. Enxague das mãos e braços. Fonte: Anvisa. Acesso livre em:
http://www.anvisa.gov.br/hotsite/higienizacao_maos/manual_integra.pdf.

VIII. Referências
AZEVEDO, M. O.; FELIPE, M. S. S.; BRIGÍDO, M. M.; MARANHÃO, A. Q.; DE-SOUZA,
MARLENE TEIXEIRA. Técnicas Básicas em Biologia Molecular. 1. ed. Universidade de
Brasília, v. 1. 211p. Brasília (2003).
ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Acessado em Brasília, 27 de maio de
2014.
<http://www.anvisa.gov.br/hotsite/higienizacao_maos/conteudo/c_tecnicas.htm#2>
ANVISA, Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Segurança do paciente em serviços de
saúde. Limpeza e desinfecção de superfícies. (2010)
Brasil. Ministério da Saúde. MOLINARO, E.; CAPUTO L.; AMENDOEIRA, R.. Conceitos e
métodos para formação de profissionais em laboratórios de saúde. Instituto Oswaldo
Cruz - IOC, Escola Politécnica de Saúde Joaquim Venâncio/ Fundação Oswaldo Cruz. RJ
(2009)
Dos Santos, A. A. M.; Verotti, M. P.; Sanmartin , J. A.; Mesiano, E. R. A. B.. Importância do
álcool no controle de infecções em serviços de saúde. Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/controle_alcool.pdf>
http://www.anvisa.gov.br/hotsite/higienizacao_maos/manual_integra.pdf
MT 02 - Procedimentos básicos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
32
INMETRO/MICT Portaria Nº 75 de 14/04/1993. Acondicionamento e comercialização de
água sanitária e cloro em pó. Disponível em:
<http://www.inmetro.gov.br/consumidor/produtos/agua_sanitaria2.asp?i>
RESOLUÇÃO ANVISA - RE N° 2.606, DE 11 DE AGOSTO DE 2006. Dispõe sobre as diretrizes
para elaboração, validação e implantação de protocolos de reprocessamento de
produtos médicos e dá outras providências.

Flávia Porto Carreiro A. Bezerra Marlene Teixeira De-Souza
Matrícula nº 13/0061191 Orientadora

MT 03 – Preparo de suspensões estoque de esporos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
33
Procedimento Operacional Padrão – POP
MT 03 – Preparo de suspensões estoque de esporos

Revisão N º Data Emissor Aprovação
00 25/10/2014 Flávia Porto Carreiro A. Bezerra Marlene Teixeira De-Souza
01

I. Definição
O acervo da CBafes contém estirpes de diversas origens, porém, somente as estirpes
ambientais de Bafes – SDFs (solo do DF) – são utilizadas para a construção da biblioteca de
perfis moleculares. Essas estirpes se encontram na forma de esporos secos, aderidos a tiras
de papel de filtro acondicionadas em criotubos de 2 mL (Figura 1). Os microtubos são
devidamente identificados com o código da estirpe. Este código é composto pelas letras SDF
(abreviação de solo do Distrito Federal) seguidas por um número de quatro dígitos que
representa a sequência em que foram adicionadas à coleção.

A B

Figura 1. Estirpes da CBafes. Criotubos contendo
alíquotas de esporos secos, lacrados com Parafilm
M e identificados com o código da estirpe. A)
Alíquota da estirpe SDF0033. (B) Alíquota da estirpe
SDF0030.

Atualmente a CBafes contém as estirpes SDF0001 à SDF0154. Alguns números estão
desdobrados em A e B, por exemplo: SDF0040-A e SDF0040-B. Por questão de praticidade e
melhor visualização, os números escritos nas tampas dos microtubos contêm apenas os
algarismos significativos (Figura 2A). Para reforçar a segurança na preservação da
identidade, os microtubos são também identificados na lateral (Figura 1A e B e figura 2B).
MT 03 – Preparo de suspensões estoque de esporos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
34
A CBafes contém quatro ou cinco alíquotas de cada estirpe SDF.. Estas alíquotas são
identificadas por dois números separados por uma barra. O número após a barra indica o
número de alíquotas que foram preparadas para a estirpe e número anterior discrimina a
alíquota. Por exemplo, para a SDF0040-A, foram produzidas 5 alíquotas, acondicionadas em
5 microtubos e identificadas como: 1/5; 2/5; 3/5; 4/5 e 5/5 (Figura 2B).

A B

Figura 2. Microtubos de armazenamento da CBafes. (A) Os microtubos numerados contêm
esporos de estirpes SDF aderidos tiras de papel de filtro. Nesta caixa estão armazenadas as
estirpes SDF0001 a 0029. (B) A CBafes contém quatro ou cinco alíquotas de cada estirpe. A
inscrição lateral nos microtubos identifica a alíquota – primeiro número, e a quantidade de
alíquotas depositada na CBafes – numero após a barra.

Suspensões estoque de esporos, ou, simplesmente, suspensões estoque, são
suspensões primárias, preparadas pela transferência de uma tira de papel filtro de uma das
alíquotas de esporos secos da CBafes para um microtubo estéril contendo água ultrapura
filtrada. Das suspensões estoque são retiradas as alíquotas de trabalho (suspensões de
trabalho) para as análises de MALDI-TOF MS e para os demais membros do nosso grupo de
pesquisa, com finalidades diversas (MT 04 – Aliquotagem de suspensõesestoque de
esporos).
O armazenamento das suspensões estoque foi padronizado em criotubos de base
larga. A Figura 3 apresenta os tipos de microtubos utilizados nos procedimentos referentes a
este manual e a padronização adotada para armazenamento de esporos secos, suspensões
estoque e suspensões de trabalho.

Figura 3. Tipos de microtubos de armazenamento. (A) Criotubo com tampa rosqueda, anel
de vedação de borracha e argola de fixação da tampa, contendo tiras de papel filtro para
armazenamento de esporos secos. (B) Criotubo de base larga, tampa rosqueada e anel de
vedação, utilizado para preparo e armazenamento das suspensões estoque de esporos. (C)
Microtubo tipo eppendorf, utilizado para acondicionamento de suspensões de trabalho. (D)
Estante para criotubos de base larga.

II. Objetivos
Descrever o manuseio das estirpes da CBafes para a inoculação dos esporos em meios
de cultura sólido na forma de suspensões. Garantir a segurança do processo e a integridade
das amostras de trabalho e do estoque principal da CBafes.

III. Material
O material abaixo foi estimado para trabalhar com 15 estirpes por vez. As quantidades
devem ser adquadas para trabalhar com um número maior de amostras. A listagem de
material está organizada em duas partes e desta forma, conforme procedimento (item IV).
1ª parte: procedimento seco
 2 pares de luvas de procedimento estéreis
 1 caneta de marcação permanente ponta fina (desinfetada)
 1 suporte para criotubos de base larga
 (N + 3) criotubos de 2.000 µL
 N pinças anatômicas esterilizadas
 Tiras de Parafilm M
 2 lixeiras de CSB
Uma das lixeiras deve ser utilizada somente para deposição das pinças usadas.
MT 03 – Preparo de suspensões estoque de esporos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
36
 N amostras de esporos de linhagens SDFs

2ª parte: procedimento de hidratação
 N alíquotas secas de esporos (1ª parte)
 3 microtubos de 2.000 µL
 2 pares de luvas de procedimento estéreis
 1 caneta de marcação permanente de ponta fina (desinfetada)
 1 suporte para criotubos de base larga
 50 mL de água ultrapura
 1 seringa hipodérmica (5 ou 10 mL)
 2 membranas filtrantes de 0,22 µm
 3 pinças anatômicas esterilizadas
 Fitas de Parafilm M
 1 lixeira de CSB
 1 estante de apoio

IV. Procedimento
O procedimento de preparação das suspensões estoque pode ser um tanto demorado,
principalmente as etapas de troca de Parafilm M e identificação dos microtubos. O
respectivo formulário de registro de procedimento – RP 03 – foi elaborado para registrar o
preparo de 15 amostras por vez. Sendo necessário trabalhar com um número maior de
amostras, deve-se para minimizar o risco de contaminação executando o procedimento em
duas etapas, como explicado a seguir.
A sequência de trabalho foi divida em duas etapas: Procedimento seco e
Procedimento de hidratação.
1ª parte - Procedimento seco: explica passo a passo a transferência dos papéis de
filtro contendo esporos para os criotubos de base larga e armazenamento à temperatura
ambiente em local protegido de luz e umidade.
2ª parte - Procedimento de hidratação: explica a parte do procedimento que envolve
a distribuição de 1.800 µL de água ultrapura nos criotubos, já contendo as alíquotas de
MT 03 – Preparo de suspensões estoque de esporos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
37
esporos, para a preparação de suspensões e o armazenamento a 4 – 8 °C. Durante esta 2ª
parte do procedimento, 3 microtubos estéreis novos devem ser separados para receberem
somente água ultrapura filtrada. As alíquotas de água serão testadas quanto à presença de
contaminantes ao longo do período de armazenamento das suspensões estoque, conforme
explicado no item V – Controle de qualidade microbiológico (CQM).
Os subtítulos a seguir indicam qual parte do procedimento está sendo descrita na
sequência posterior. O operador deve ignorar a divisão se estiver realizando o procedimento
completo e, deve se orientar somente pela sequência indicada para a parte que está
executando, no caso de procedimento parcial.

1ª e 2ª PARTES
1. Em uma cópia do RP 03, registrar a numeração das amostras que irá trabalhar.
2. Limpar a CSB e mesa de apoio conforme procedimento MT 01 (Utilização e
manutenção das salas limpas).
3. Ligar o sistema de esterilização por, no mínimo, 30 min.
4. Desligar as luzes UV da sala e da CSB e organizar o material, exceto as amostras
biológicas.
5. Deixar o pulverizador de etanol 70% na bancada de apoio.
6. Ligar de novo as luzes UV da sala e da CSB por 30 min.
7. Lavar as mãos e separar as amostras biológicas que irá utilizar.
8. Apagar as luzes UV da sala e da CSB, e colocar as amostras sobre a bancada de apoio.
9. Vestir um jaleco limpo, fazer a assepsia das mãos e antebraços e a antissepsia com
etanol 70%, e deixar secarem dentro da capela.
1ª PARTE
10. Com auxílio de uma pinça anatômica estéril, retirar um criotubo do frasco e uma
tampa.
11. Rosquear a tampa no criotubo e depositar na estante.
12. Repetir o procedimento para os outros criotubos que for utilizar.
Preparar alguns excedentes para o caso de perdas durante a manipulação.
13. Com a caneta marcadora, identificar todos os criotubos com o número da estirpe SDF
sobre a tampa.
MT 03 – Preparo de suspensões estoque de esporos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
38
Omitir os zeros não significativos.
14. Na lateral, registrar o número da estirpe SDF, além do nome do operador, data e
volume de água adicionado (se for procedimento completo).
Manter os microtubos fechados sempre que possível evitando exposição
desnecessária ao ar.
Nunca tocar a borda ou parte interna das tampas!
Nunca apoiar tampas ou microtubos diretamente sobre o piso da capela!
Descartar qualquer material estéril que tocar o piso.
15. Posicionar as amostras de esporos no campo de trabalho centro-direito.
16. Calçar as luvas para manipulação das amostras biológicas.
17. Com auxílio de outra pinça, retirar a proteção de Parafilm M de todas as amostras,
sem deixar resíduos.
18. Abrir o criotubo da primeira estirpe, contendo tiras de papel de filtro saturadas com
esporos. Retirar uma tira de papel com o auxílio de uma nova pinça esterilizada.
19. Segurar a pinça contendo o papel enquanto encaixa a tampa do criotubo e recoloca
na estante com a outra mão.
20. Com a mão livre, retirar da estante o microtubo que irá receber a amostra, levantar a
tampa e transferir a tira de papel.
Sempre retirar os microtubos da estante!
21. Depositar a pinça na lixeira específica e fechar a amostra adequadamente.
22. Repetir o procedimento para cada amostra de esporo seco.
23. Ao final guardar as amostras à temperatura ambiente protegidas de calor e umidade.
2ª PARTE
24. Após a assepsia das mãos, colocar na CSB as alíquotas de esporos secas retiradas
durante a 1ª parte do procedimento.
25. Calçar as luvas para manipular as amostras biológicas.
26. Registrar na lateral dos criotubos, a data e volume de água que irá adicionar.
27. Identificar os 3 criotubos que receberão alíquotas de água ultrapura filtrada para o
CQM da água escrevendo na tampa: CQM1, CQM2 e CQM3.
28. Na lateral dos criotubos de CQM, registrar nome do operador, data e volume de água
que será adicionado.
MT 03 – Preparo de suspensõesestoque de esporos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
39
29. Proceder à filtragem da água diretamente nos criotubos conforme MT 02 –
Procedimentos básicos.
30. Fechar imediatamente os criotubos após transferência da água filtrada.
Manter os criotubos fechados sempre que possível evitando exposição
desnecessária ao ar.
Nunca tocar a borda ou parte interna das tampas!
Nunca colocar as tampas ou microtubos no piso da capela!
Descartar qualquer material estéril que tocar o piso.
31. Ao final, vedar todas as amostras com Parafilm M, guardar na caixa porta
microtubos e estocar em geladeira, inclusive as amostras de água do CQM.
1ª e 2ª PARTES
32. Retirar o restante do material da CSB.
33. Limpar a CSB conforme procedimento MT 01 e organizar a sala.
34. Preencher o registro de procedimento (RP 03) e assinar.
35. Arquivar o RP 03 na pasta Registros de procedimentos.

V. Controle de qualidade microbiológico
Um primeiro controle de qualidade da água deve ser realizado tão logo possível,
conforme MT 06–A – Controle de qualidade microbiológico (Teste A – CQM da água com
ensaio de crescimento). O resultado deverá ser registrado no próprio RP 03, que possui um
campo apropriado.
Um segundo CQM da água pode ser realizado a qualquer momento no período de
armazenamento da suspensão, para testar a segurança das condições de armazenamento.
Por este motivo, as alíquotas de água do CQM devem ser guardadas junto com o lote de
suspensões representado por elas.
Caso o primeiro CQM da água retorne resultado positivo para contaminação, será
necessário repetir a análise para confirmação, conforme orientação a seguir:
Realizar a análise confirmatória de contaminação conforme MT 06-A e registrar o
resultado em um formulário RP 06-A. Anexar o formulário ao respectivo RP 03 do lote de
suspensões estoque produzido com a água em teste.
MT 03 – Preparo de suspensões estoque de esporos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
40
Se ainda restarem dúvidas, ou a necessidade de investigar o tipo de contaminação,
proceder o CQM por microscopia conforme MT 06-C – Controle de qualidade microbiológico
(Teste C – MCF para investigação de tipos morfológicos). Registrar o resultado no formulário
RP 06-C e anexar este ao respectivo RP 03.
Amostras contaminadas devem ser imediatamente segregadas e substituídas por
novas suspensões estoque preparadas a partir dos esporos depositados na CBafes.

VI. Registro do procedimento
Este procedimento deve ser registrado no RP 03, indicando se foi realizado por
completo ou parcialmente e qual parte foi executada.
Algumas estirpes da CBafes foram divididas e armazenadas em 4 alíquotas,
identificadas como 1/4; 2/4; 3/4 e 4/4. Outras estirpes foram divididas em 5 alíquotas,
identificadas como 1/5, 2/5, 3/5, 4/5 e 5/5. No campo Alíquota (n/4 ou n/5), existem 5
colunas numeradas de 1 a 5. Estes valores correspondem ao número anterior à barra, que
identifica a alíquota. Sendo assim, alíquotas com o mesmo número anterior devem ser
registradas na mesma coluna. Por exemplo: o operador preparou uma suspensão estoque de
esporos da estirpe SDF0040A, utilizando a alíquota 3/5. Então, na primeira coluna do
formulário deverá escrever 0040A e, na coluna 3, mesma linha, deverá registrar 3/5.
Na coluna Observação, justificar quando houver desvio de procedimento. É
considerado desvio de procedimento qualquer desvio ao procedimento padrão. Alguns
desvios de procedimento são considerados seguros ou inevitáveis, e estão previstos nos
POPs.
Também na coluna Observação, relatar suspeitas de contaminação durante o
procedimento.
Registrar a retirada e devolução de microtubos de esporos secos da CBafes na planilha
Inventário da CBafes.

Flávia Porto Carreiro A. Bezerra Marlene Teixeira De-Souza
Matrícula nº 13/0061191 Orientadora

RP 03 – Preparo de suspensões estoque de esporos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
41
Registro de Procedimento – RP
RP 03 – Preparo de suspensões estoque de esporos
Responsável: Data:

Procedimento completo Procedimento seco Procedimento de hidratação

SDF
Alíquota
(n/4 ou n/5)
Desvio de
procedimento?
(sim ou não)
Suspeita de
contaminação?
(sim ou não)
Observação
1 2 3 4 5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Informe sim ou não
A CSB foi limpa por você imediatamente antes do uso?
Fez assepsia e antissepsia das mãos e antebraços antes de iniciar o procedimento na CSB?
Faltou algum material durante o procedimento? Qual? _______________________________
O trabalho na CSB foi interrompido por algum motivo?
Faltou energia elétrica ou o sistema de fluxo laminar foi desligado durante o procedimento?
Reservou amostras de água para o CQM?
Vedou todas as amostras com Parafilm M?
Todas as alíquotas originais da CBafes foram devolvidas ao estoque principal?
Registrou a devolução das alíquotas no arquivo Inventário da CBafes?

CQM (PP 06-A e B)
Teste B - Inspeção visual:  Negativo  Positivo
Teste A - Análise da água:
IDENTIFICAÇÃO DA AMOSTRA DE ÁGUA: _________________________________________________
INÍCIO - data/hora:_______________________CONFERÊNCIA - data/hora: ___________________
Nº de horas de observação: ___________ RESULTADO:  Negativo  Positivo
RESPONSÁVEL: ___________________________________________________________________
MT 04 - Aliquotagem de suspensões estoque de esporos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
42
Procedimento Operacional Padrão – POP
MT 04 – Aliquotagem de suspensões estoque de esporos
Revisão N º Data Emissor Aprovação
00 25/10/2014 Flávia Porto Carreiro A. Bezerra Marlene T. De-Souza
01

I. Definição
A aliquotagem das suspensões estoque de esporos é efetuada para obtenção das
suspensões de trabalho preparadas conforme procedimento MT 03 – Preparo de
suspensões estoque de esporos. A aliquotagem de suspensões estoque é realizada para
disponibilizar alíquotas individuais de trabalho aos membros da equipe de pesquisa do
LaBafes com finalidades diversas, além da própria análise espectrométrica.

II. Objetivo
Garantir a uniformidade dos resultados de crescimento, em experimentos diversos,
pela padronização do procedimento de obtenção das suspensões de trabalho, como reforço
ao controle de qualidade microbiológico.
Preservar as suspensões estoque, minimizando o risco de contaminação por repetidas
manipulações e exposições ao ambiente.

III. Material
 Suspensões estoque
Trabalhar com 20 estirpes no máximo.
 1 estante para criotubos de base larga (MT 03)
 3 pares de luvas de procedimento estéreis
 2 canetas de marcação permanente de ponta fina (limpas)
 1 estante para micropipetas
 1 micropipeta automática P200
MT 04 - Aliquotagem de suspensões estoque de esporos
Laboratório de Bactérias aeróbias formadoras de endósporos - LaBafes
Profa. dra. Marlene Teixeira De-Souza
UnB/IB/Departamento de Biologia Celular
43
 1 caixa de ponteiras amarelas com filtro (esterilizadas)
 (nº alíquotas/40) suportes para tubos eppendorf
Utilizar metade da capacidade da estante ou menos.
Este cuidado facilita o manuseio dos tubos eppendorf e previne acidentes (MT
01 – Utilização e manutenção das salas limpas).
 Tubos eppendorf