Microrganismo e processos microbiológicos como indicadores da qualidade dos solos

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Microrganismos e processos microbiológicos como
indicadores da qualidade dos solos
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Diversidade microbiana e biodegradação de hidrocarbonetos de petróleo em solos da Ilha da Trindade submetidos à
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Marcos Totola
Universidade Federal de Viçosa (UFV)
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Guilherme M Chaer
Brazilian Agricultural Research Corporation (EMBRAPA)
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(1) Professor do Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Viçosa – UFV.
CEP 36571-000. E-mail: totola@mail.ufv.br
(2) MS Microbiologia Agrícola, Universidade Federal de Viçosa – UFV. CEP 36571-000.
E-mail:gchaer@mail.ufv.br
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Introdução ................................................................................................................................ 196
Indicadores microbiológicos .................................................................................................. 199
Biomassa microbiana e quociente microbiano (qMIC) ............................................................ 202
Taxa de respiração basal do solo e quociente metabólico (qCO2) ....................................... 206
Mineralização de nitrogênio ...................................................................................................... 209
Nitrificação .................................................................................................................................. 210
Enzimas do solo ......................................................................................................................... 213
Diversidade Microbiana e Qualidade do Solo ...................................................................... 215
Taxa de reassociação do DNA .................................................................................................. 223
Análise do conteúdo de guanina mais citosina ....................................................................... 223
Técnicas baseadas na análise do rDNA .................................................................................. 226
DGGE - eletroforese em gel com gradiente desnaturante e TGGE - eletroforese em gel com
 gradiente térmico ...................................................................................................................... 226
RFLP - polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição e ARDRA - análise de res-
trição do rDNA amplificado ....................................................................................................... 229
T-RFLP - polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição terminal ..................... 229
Análise do perfil de lipídios ....................................................................................................... 231
Diversidade catabólica ............................................................................................................... 237
Avaliação e Interpretação dos Indicadores de Qualidade .................................................. 248
Índices de qualidade do solo ..................................................................................................... 249
Ferramentas multivariadas ........................................................................................................ 259
Considerações Finais ............................................................................................................. 263
Agradecimentos ...................................................................................................................... 264
Literatura Citada...................................................................................................................... 264
TOP-632-02
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O interesse pelo tema Qualidade dos Solos tem sido estimulado pela
recente conscientização de que o solo é um recurso vital tanto para a
produção de alimentos e fibras quanto para o funcionamento global dos
ecossistemas (Doran et al., 1996), bem como pela constatação de que
processos de degradação têm afetado uma porção considerável dos solos
atualmente em uso. Inventários sobre a capacidade produtiva dos solos
indicam a degradação induzida pelo homem de quase 40 % de todas as
terras cultivadas do mundo (Oldeman, 1994). O processo de degradação
do solo causada por atividades antrópicas não é recente. Bunney (1990),
em seu artigo “Prehistoric Farming Caused Devastating Soil Erosion”, mostra
evidências da degradação do solo já no início da história da humanidade.
Olson (1981) relata, com base em investigações arqueológicas, que
civilizações ancestrais pereceram em razão da degradação ambiental e
ecológica derivadas da exploração abusiva do solo. Só recentemente, no
entanto, os processos de degradação têm chamado a atenção do homem
em níveis globais, dada a escala com que vêm ocorrendo, sendo
considerado uma das quatro maiores preocupações ecológicas, rivalizando
somente com a mudança global do clima, com a depleção da camada de
ozônio e com declínios na biodiversidade (Doran, 1997).
O manejo adequado dos solos, que contribua para aumentar ou
conservar a sua qualidade, não somente irá aumentar a produtividade das
culturas, como também contribuirá para manter a boa qualidade ambiental.
Qualidade do solo tem sido definida como “a capacidade de um tipo
específico de solo funcionar, dentro dos limites do ecossistema manejado
ou natural, como sustento para a produtividade de plantas e de animais, de
manter ou de aumentar a qualidade da água e do ar e de promover a saúde
humana” (Doran & Parkin, 1994). Entender e conhecer a qualidade do solo
possibilita manejá-lo de maneira que ele funcione de forma ótima no
presente e que não seja degradado para uso futuro. Pelo monitoramento
das mudanças na qualidade do solo, pode-se determinar se um conjunto
de práticas é sustentável.
A avaliação acurada e consistente da qualidade do solo requer um
método sistemático para se medir e interpretar as propriedades que sirvam
adequadamente como indicadores (Granatstein & Bezdicek, 1992). Apesar
de esses métodos existirem para monitorar e avaliar a qualidade do ar e da
água, nenhum método isoladamente foi aceito de forma ampla para se
avaliar a qualidade do solo (Glover et al., 2000). O solo é um ambiente
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complexo, onde interagem inúmeros processos químicos, físicos e
biológicos, os quais estão constantemente em fluxo e são de natureza
heterogênea e, freqüentemente, de difícil medição. Combinando esses
fatores de complexidade do ambiente solo com a definição de qualidade do
solo, que reconhece as suas múltiplas funções, pode-se compreender que
a mensuração da qualidade desse sistema é extremamente difícil (Kelting
et al., 1999). Uma forma que tem sido proposta para superar essa dificuldade
é a de se definir explicitamente as funções do solo e identificar os atributos
do solo associados a cada função. Finalmente, deve-se selecionar um
conjunto mínimo de indicadores de qualidade para medição de cada atributo
(Doran & Parkin, 1994; Karlen & Stott, 1994; Larson & Pierce, 1994).
O solo tem como função o suporte aos processos da vida, ou seja, prover
o suporte físico e os nutrientes para as plantas, promover a retenção e o
movimento da água, suportar as cadeias alimentares e as funções
reguladoras do ambiente, incluindo a ciclagem de nutrientes, a diversidade
de macro e microrganismos, a remediação de poluentes e a imobilização
de metais pesados (Bezdicek, 1996). A figura 1 mostra o relacionamento
das funções do solo, com respeito à produção vegetal (Larson & Pierce,
1994), com os atributos do solo, que podem ser resumidos nas suas
qualidades físicas, químicas e biológicas. De certa forma, a capacidade
do solo de desenvolver todas as funções listadas está direta ou
indiretamente ligada, e em graus de importância diferenciados, à qualidade
apresentada por todos os atributos. Por exemplo, a função do solo de
armazenar, suprir e ciclar nutrientes está diretamente relacionada a atributos
biológicos, como a ciclagem de nutrientes, a atributos químicos, como a
capacidade de troca catiônica, e a atributos físicos, como a proporção de
areia, de silte e de argila.
Os atributos do solo não podem ser medidos diretamente. Assim, devem
ser selecionados os indicadores (Figura 1), os quais são substitutos
mensuráveis dos atributos do solo. Um indicador pode ser simplesmente
uma variável mensurável, a exemplo da temperatura do solo; um processo,
como a taxa de mineralização de N (kg ha-1 ano-1); ou uma construção
complexa de variáveis múltiplas, como um índice, o qual inclui inúmeras
medidas do solo (densidade, uniformidade de agregados, matéria orgânica
e outros) (Burger & Kelting, 1999).
Segundo Stenberg (1999), nenhum indicador individualmente irá
descrever e quantificar todos os aspectos da qualidade do solo. Nem mesmo
uma única função do solo poderia ser avaliada, visto que todos os atributos
do solo têm que ser colocados em relação um com o outro. Os critérios
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para a seleção de indicadores de qualidade do solo relacionam-se
principalmente com a sua utilidade em definir os processos do ecossistema,
integrando propriedades físicas, químicas e biológicas, além da sua
sensibilidade ao manejo e às variações climáticas (Doran et al., 1996).
Stenberg (1999) sintetizou em cinco os critérios para a seleção de
indicadores para monitorar a qualidade do solo:
(i) Devem integrar propriedades e processos químicos, físicos e biológicos
e representar as propriedades ou funções do solo que são mais difíceis
de se medir diretamente (sobreposição de indicadores pode ser
necessária para assegurar uma interpretação mais robusta).
(ii) A relevância ecológica e a variação natural dos indicadores devem ser
bem conhecidas.
(iii) Devem ser sensíveis a variações em longo prazo no manejo e no clima,
mas resistentes a flutuações em curto prazo devidas a mudanças
climáticas ou ao desenvolvimento da cultura.
(iv) Devem possibilitar sua medição acurada e precisa por meio de ampla
variação de tipos e condições de solo.
(v) Devem ser de determinação simples e de baixo custo, para permitir que
grande número de análises possa ser realizado.
Figura 1. Funções do solo, atributos a elas relacionados e indicadores de
qualidade do solo para a produção vegetal.
Receber,
armazenar e
suprir água
Armazenar,
suprir e ciclar
nutrientes
Promover
as trocas
gasosas
Promover
a atividade
biológica
Funções do
Solo
Atributos da
Qualidade do Solo
Indicadores de
Qualidade do Solo
Qualidade
química
• Biodiversidade
• Ativ. enzimas do solo
• C e N da biomassa
• Quociente metabólico
• Tx. mineralização de N
Promover o
crescimento
das raízes
Qualidade
física
Qualidade
biológica
• Teor de P, N
• MOS
• P-orgânico
• CTC
• pH
• Temperatura
• Densidade
• Porosidade
• Agregação
• Retenção H2O
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Um dos obstáculos que devem ser transpostos para avaliar a qualidade do
solo é a interpretação dos indicadores de qualidade, ou seja, saber quando é
que os valores obtidos indicam um bom solo. Atualmente, existe na literatura
grande quantidade de informação acerca dos indicadores de caráter químico
e físico, o que permite, com certo grau de confiabilidade, definir faixas de
valores adequados para essas características em diversos tipos de solos e
culturas.O mesmo não ocorre com relação aos indicadores microbiológicos,
cuja base de informações ainda é pouco consistente para permitir uma
interpretação adequada e para definir valores ótimos em diferentes situações,
apesar de o crescente número de trabalhos indicar que a fração microbiana
do solo possui muitas das características desejáveis em um indicador de
qualidade do solo. A escassez de informações e a dificuldade de utilizar
indicadores microbiológicos como critério para se definir a qualidade dos
solos se devem, principalmente, ao fato de os testes microbiológicos não serem
incluídos em análises de solo de rotina e à falta de padronização de métodos
desde a amostragem, a estocagem e o pré-tratamento das amostras até os
procedimentos analíticos e a apresentação dos resultados (Stenberg, 1999).
A qualidade “ideal” para um solo também não é conhecida, e o ideal irá
diferir entre os vários tipos de solo e para cada cultura que está ou será
estabelecida. Logo, é necessária a determinação de referenciais que
possam servir de base para a interpretação e comparação. O critério de
referência pode ser um sítio específico, que represente uma área com tipo
de solo e condições climáticas similares, ou pode ser temporal, quando o
valor referencial é obtido na amostragem inicial. A qualidade do solo é
então monitorada por sucessivas amostragens feitas no mesmo local. Tem
sido sugerido adotar como critério de referência as condições prevalecentes
em solos que suportam uma vegetação nativa e que tenham sofrido mínimos
distúrbios antropogênicos (Dick, 1994; Doran et al., 1994; Trasar-Cepeda
et al., 1998; Wick et al.,1998; Islam & Weil, 2000; Leirós et al., 2000; Pascual
et al., 2000). Nesse caso, há uma larga aplicabilidade como medida de
qualidade do solo com respeito à sustentabilidade, pois as propriedades
físicas, químicas e biológicas de solos que suportam uma vegetação nativa
evoluíram para um estado de equilíbrio que assegura uma viabilidade de
longo prazo do ecossistema circunvizinho (Doran et al., 1994).
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A avaliação das características biológicas do solo se adequa à maioria
dos critérios para a seleção de um indicador de qualidade do solo (Doran &
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Zeiss, 2000), apesar de este componente ter sido ignorado, em inúmeros
estudos, como um importante aspecto da funcionalidade do ecossistema
(Kennedy & Smith, 1995). Entretanto, características microbianas do solo
estão sendo cada vez mais avaliadas como indicadores sensíveis da sua
qualidade (Staben et al., 1997; Trasar-Cepeda et al., 1998; Wick et al., 1998;
Stamatiadis et al., 1999a,b; Debosz et al., 1999; Glover et al., 2000; Murage
et al., 2000; Islan & Weil, 2000; Leirós et al., 2000), dado o relacionamento
entre atividade e diversidade microbianas, qualidade do solo e da vegetação
e sustentabilidade do ecossistema (Doran et al., 1994).
Dentre as várias justificativas para o uso de microrganismos e processos
microbiológicos como indicadores de qualidade do solo, destacam-se a sua
capacidade de responder rapidamente a mudanças no ambiente do solo
derivadas de alterações no manejo e o fato de que a atividade microbiana
do solo reflete a influência conjunta de todos os fatores que regulam a
degradação da matéria orgânica e a transformação dos nutrientes (Kennedy
& Papendick, 1995; Stenberg, 1999). Os microrganismos constituem ainda
grande e dinâmica fonte e depósito de nutrientes em todos os ecossistemas
e participam ativamente em processos benéficos como a estruturação do
solo, a fixação biológica de N, a solubilização de nutrientes para as plantas,
a redução de patógenos e pragas de plantas, a degradação de compostos
persistentes aplicados ao solo, em associações micorrízicas e em outras
propriedades do solo que afetam o crescimento vegetal (Quadro 1) (Kennedy
& Papendick, 1995; Kennedy & Smith, 1995). Dessa forma, um solo de alta
qualidade possui atividade biológica intensa e contém populações
microbianas balanceadas, sendo vários os indicadores microbiológicos que
podem fornecer uma estimativa da qualidade do solo.
Para que os microrganismos do solo possam ser incorporados aos
estudos que visam determinar a qualidade dos solos, é preciso que se
considere quais as informações mais relevantes e quais as metodologias
disponíveis para obter as informações desejadas, bem como o nível de
resolução com que se deseja ou é possível trabalhar. Segundo Stenberg
(1999), os estudos dos microrganismos do solo podem ser feitos em pelo
menos cinco níveis diferentes. O primeiro nível é a observação dos
organismos em nível individual. Isso pode ser feito com microscopia ou
microeletrodos para a caracterização da atividade microbiana em nível
individual ou de uma microcolônia. Os problemas são obviamente
metodológicos e a microescala apresenta-se muito pequena para ser prática
para avaliação da qualidade do solo. O segundo nível considera as
populações em nível de espécie, em que a dinâmica de espécies definidas
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pode ser estudada por meio de sondas genéticas ou de técnicas usando
anticorpos. O terceiro nível também considera as populações, mas em
nível funcional, e pode incluir grupos específicos de microrganismos.
Estudos neste nível podem ser feitos com a mesmas técnicas utilizadas no
nível 2, mas com o uso de sondas e anticorpos, de forma a terem como
alvos uma gama maior de espécies dentro do grupo funcional. Outra forma
é medir as taxas potenciais da atividade de populações microbianas
específicas. O quarto nível se preocupa com a comunidade microbiana
Quadro 1. Processos benéficos derivados da atividade de microrganismos
no solo
Processo Agente/Causa Conseqüências
Decomposição de resíduos de
plantas e material orgânico
Produção de enzimas intra e
extracelulares
Síntese de húmus
Mineralização de N, P e S
Aumento na disponibilidade
de P, Mn, Fe, Zn e Cu para as
plantas
Fungos micorrízicos
Populações de
microrganismos
decompositores
Produção de agentes
quelantes orgânicos
Reações de oxidação e
redução
 Solubilização de fosfatos
Maior produtividade primária
Aumento dos fluxos de
matéria e de energia no
ecossistema
Fixação biológica de N Bactérias fixadoras de vida
livre e cianobactérias
Microrganismos associativos
Microrganismos simbióticos
com leguminosas e não-
leguminosas
Aumento da disponibilidade
de N para as plantas
Promoção do crescimento
de plantas
Bactérias PGPR e fungos
micorrízicos
Produção de hormônios de
crescimento de plantas
Proteção contra patógenos
de raiz
Aumento na eficiência de
absorção e no uso de
nutrientes
Maior produtividade primária
Aumento dos fluxos de
matéria e de energia no
ecossistema
Controle biológico de doenças
de plantas, nematóides, insetos
e plantas invasoras
Predação e parasitismo de
nematóides e insetos por
fungos e bactérias
Competição direta e indireta
por nutrientes na rizosfera
Produção de antibióticos
Equilíbrio entre populações
de macro e microrganismos
em um dado ecossistema
Biodegradação de pesticidas
sintéticos e outros
contaminantes
Cometabolismo,
destoxificação, consórcios
microbianos
Redução da persistência de
compostos tóxicos no
ambiente
Aumento na tolerância de
plantas
ao défice hídrico
Associações micorrízicas Manutenção da cobertura
vegetal sob condições
hídricas adversas
Agregação do solo Produção de mucigel por
bactérias e hifas de fungos e
actinomicetos que atuam na
ligação das partículas de
solo
Redução da erosão
Melhor infiltração de água no
solo
Melhor aeração do solo
Fonte: Modificado de Kennedy & Papendick (1995).
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como um todo, estudando a diversidade genética e fisiológica. A biomassa
microbiana total ou a atividade de enzimas que participam dos principais
processos microbianos do solo poderiam também ser incluídas aqui como
medidas quantitativas da comunidade total. O quinto estáno nível do
ecossistema. Ele pode ser descrito por meio de dados obtidos em todos
os outros níveis. Assim, estudos neste nível requerem avaliação integrada
dos dados, incluindo os fatores químicos e físicos do solo.
Em geral, nos estudos que focam a qualidade do solo são avaliadas
características microbiológicas que podem ser enquadradas do nível 3 ao
5. Há ênfase na relação entre os microrganismos e a ciclagem de nutrientes,
sendo comum a avaliação da atividade microbiana, a quantificação da
biomassa de microrganismos e a medição de várias enzimas do solo
envolvidas na ciclagem de nutrientes-chaves (C, N, P e S). Também é
comum a avaliação da atividade de populações específicas ou grupos
funcionais de microrganismos envolvidos na ciclagem e nas transformações
do N. Estudos que avaliam a relação entre a qualidade do solo e a
diversidade de microrganismos são cada vez mais freqüentes, conseqüência
do grande avanço das ferramentas e dos métodos de avaliação. No entanto,
apesar do grande potencial para a utilização da análise da diversidade
microbiana como indicadora de mudanças na qualidade do solo, o seu uso
ainda é limitado, principalmente pelo fato de que as técnicas ainda são
trabalhosas e de custo relativamente elevado para serem utilizadas em
análises de rotina.
A seguir, são descritas algumas propriedades biológicas do solo,
enfatizando as de natureza microbiológica, que têm sido propostas por
diversos autores como mais sensíveis a mudanças quando os solos são
submetidos a diferentes tipos de manejo e, portanto, seriam mais adequadas
como indicadores de qualidade. Algumas metodologias de avaliação desse
conjunto de indicadores serão também comentadas, incluindo uma
abordagem das técnicas mais recentes direcionadas ao estudo da
diversidade genética e funcional das comunidades microbianas dos solos.
Biomassa microbiana e quociente microbiano (qMIC)
A biomassa microbiana (BM) é considerada a parte viva da matéria
orgânica do solo e inclui bactérias, actinomicetos, fungos, protozoários,
algas e microfauna. Constitui parte da fração da matéria orgânica ativa do
solo, contendo, em média, de 2 a 5 % do C orgânico (CO) (Jenkinson &
Ladd, 1981) e de 1 a 5 % do N total do solo (Smith & Paul, 1990).
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A BM é um dos componentes que controlam funções-chaves no solo,
como a decomposição e o acúmulo de matéria orgânica, ou transformações
envolvendo os nutrientes minerais. Representa ainda uma reserva
considerável de nutrientes, os quais são continuamente desviados para os
ciclos de crescimento dos diferentes organismos que compõem o
ecossistema. Conseqüentemente, solos que mantêm alto conteúdo de BM
são capazes não somente de estocar mais nutrientes, mas também de
ciclar mais nutrientes através do sistema (Stenberg, 1999). Ademais, o
fato de muitos microrganismos utilizarem a fração disponível da matéria
orgânica os faz sensíveis a mudanças na sua qualidade. A BM tem sido,
assim, proposta como um indicador do estado e das mudanças da matéria
orgânica total do solo.
A manutenção da matéria orgânica do solo é desejável para a
sustentabilidade do uso da terra, em razão dos múltiplos benefícios sobre
o status de nutrientes, sobre a capacidade de retenção de água e sobre a
estrutura do solo. Entretanto, mudanças graduais e pequenas na matéria
orgânica do solo podem ser difíceis de monitorar e detectar no curto prazo
(Sparling, 1992). A BM, a qual possui, comparativamente, uma taxa de
giro (formação e decomposição) rápida (1 a 2 anos) (Jenkinson & Ladd,
1981), tem sido sugerida como uma medida mais sensível de aumento ou
decréscimo na quantidade total da matéria orgânica do solo. Powlson et al.
(1987), avaliando o efeito da queima ou da incorporação da palhada de
cevada ao solo durante 18 anos sobre o CO e sobre a BM, constataram
que a incorporação anual de palhada aumentou, em média, o CO do solo
em somente 5 % e o N total em 10 %, ao passo que o mesmo tratamento
provocou aumento de 40 e 47 % no C e no N da BM, respectivamente
(Quadro 2), demonstrando a maior sensibilidade da BM a alterações no
solo decorrentes do manejo. Assim, mudanças significativas na BM podem
ser detectadas muito antes que alterações na matéria orgânica possam
ser percebidas, possibilitando a adoção de medidas de correção antes que
a perda da qualidade do solo seja mais severa.
A relação entre o C microbiano (CM) e o CO ((CM/CO) 100), também
denominada quociente microbiano (qMIC), fornece uma medida da
qualidade da matéria orgânica. Segundo Wardle (1994), em circunstâncias
em que a biomassa encontra-se sob algum fator de estresse (deficiência
de um nutriente, acidez, etc.), a capacidade de utilização do C é diminuída.
Nesse caso, a relação CM:CO diminui (< qMIC). Ao contrário, com a adição
de matéria orgânica de boa qualidade ou com a mudança do fator limitante
para uma condição favorável, a BM pode aumentar rapidamente (> qMIC),
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Quadro 2. Efeito da incorporação de palhada de cevada sobre o carbono
orgânico total, nitrogênio total, carbono da biomassa microbiana e
nitrogênio da biomassa microbiana
mesmo se os teores de CO permanecerem inalterados (Powlson et al.,
1987). Durante o desenvolvimento do solo, essa relação, inicialmente, é
submetida a mudanças rápidas e, com o passar do tempo, converge para
um valor de “equilíbrio” (Insam & Domsch, 1988, citados por Wardle, 1994).
Se este valor for conhecido, a determinação dessa relação pode fornecer
uma indicação sobre o quanto um solo está distante de seu “estado de
equilíbrio”.
As mudanças no qMIC podem refletir também os acréscimos de matéria
orgânica ao solo, a eficiência de conversão do CO do solo para CM, as
perdas de C do solo e a estabilização do CO pelas frações minerais do
solo (Sparling, 1992). Anderson & Domsch (1989) estudaram o
relacionamento entre C da biomassa (CM) e C orgânico do solo (CO), ou
qMIC, de comunidades microbianas de solos submetidos a monoculturas
ou rotação de culturas por períodos superiores a 10 anos, em regiões
temperadas da Europa Central. Os solos sob monocultura permanente
apresentaram valores médios de qMIC de 2,3 %, os quais diferiram
significativamente dos solos sob rotação de culturas, que apresentaram
valores médios de 2,9 %. A mudança quantitativa da BM de solos
submetidos a diferentes regimes de manejo foi atribuída à maior quantidade
e diversidade de resíduos deixados nas áreas sob rotação. Esses autores
*Indica diferença significativa (5 %) entre os tratamentos com queima e incorporação den-
tro da mesma área.
Fonte: Adaptado de Powlson et al. (1987).
Área Tratamento C orgânicototal N total CBM NBM
dag kg-1 t ha-1 dag kg-1 kg ha-1 mg kg-1 kg ha-1 mg kg-1 kg ha-1
Queima 2,46 59,3 0,115 2772 55 132 10,5 25
Studsgaard Incorporação 2,57 61,9 0,127 3061 80 192 15,8 40
% de aumento 5 10 45* 50*
Queima 1,16 28,7 0,119 2945 110 273 18,8 46
Rφnhave Incorporação 1,22 30,2 0,129 3193 151 374 27,3 68
% de aumento 5 8 37* 46*
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hipotetizaram que, se a disponibilidade de C for uma das variáveis que
direcionam a relação CM:CO, a maior diversidade química da matéria
orgânica produzida nas áreas com rotação de culturas poderia favorecer
ao longo do tempo os organismos que são dotados de um metabolismo
mais econômico. Assim, menos C de um substrato orgânico é canalizado
para o metabolismo energético e mais C é fixado nas células microbianas,
afetando, desse modo, a relação CM:CO.
A BM pode ser medida por diferentes métodos, como a observação e
contagem direta de células microbianas em microscópio, e análises químicas
do teor de substâncias que apresentam correlação com determinadas
populações, como ácido murâmico (Miller & Casida, 1970) para bactérias e
quitina (Frankland et al., 1978) ou ergosterol (Newell, 1988) parafungos.
Análises de processos bioquímicos e de outros componentes das células
microbianas também têm sido propostas para a determinação da biomassa,
como a amonificação de arginina (Alef et al., 1988) e a quantificação de
ATP (Jenkinson & Ladd, 1981). Entretanto, os métodos mais comumente
utilizados na determinação da BM do solo são o da fumigação e incubação
(FI) (Jenkinson & Powlson, 1976), o da respiração induzida pelo substrato
(RIS) (Anderson & Domsch, 1978) e o da fumigação e extração (FE) (Vance
et al., 1987). O método da FI emprega a fumigação do solo com clorofórmio
para matar as células microbianas, seguindo-se a incubação para medição
do CO2 liberado, o qual se originou da decomposição da biomassa morta.
O método da RIS é baseado na medição de CO2 emitido após a adição de
glicose ao solo, durante um período de uma a três horas. A biomassa é,
então, estimada por curvas de calibração entre as medidas de CO2 e a
biomassa total, pelo método FI. Com base nesse método, Van de Werf &
Verstraete (1986) propuseram a avaliação da BM ativa por relacionamentos
biocinéticos e estequiométricos. No método da fumigação e extração, o C
da BM é determinado pela diferença do teor de C extraído com solução de
K2SO4 0,5 mol L-1 de amostras fumigadas e não-fumigadas com clorofórmio.
O C extraído é quantificado pela oxidação da matéria orgânica com
dicromato de potássio. Recentemente, Islam & Weil (1998) modificaram o
método de Vance et al. (1987), substituindo a fumigação com clorofórmio
pelo tratamento das amostras de solo com radiação de microondas
(Figura 2). Apesar da menor eficiência deste tratamento quanto à extração
do C da BM, o método apresentou alta correlação com os resultados obtidos
pelo da fumigação com clorofórmio. O tratamento das amostras com
radiação de microondas apresenta a vantagem de ser mais prático e rápido,
além de não haver a necessidade da utilização do clorofórmio, que se
constitui em uma substância potencialmente perigosa.
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Taxa de respiração basal do solo e quociente metabólico
(qCO2)
A taxa de respiração basal do solo consiste na medida da produção de
CO2 resultante da atividade metabólica no solo de microrganismos, de raízes
vivas e de macrorganismos como minhocas, nematóides e insetos (Parkin
et al., 1996). A atividade dos organismos no solo é considerada um atributo
positivo para a qualidade do solo, sendo a respiração do solo um indicador
sensível da decomposição de resíduos, do giro metabólico do carbono
orgânico do solo (COS) e de distúrbios no ecossistema (Paul et al., 1999),
mas a interpretação de seus valores deve ser realizada com cautela. Uma
alta taxa de respiração, indicativo de alta atividade biológica, pode ser uma
característica desejável se se considera que ela é um sinal de rápida
decomposição de resíduos orgânicos em nutrientes disponíveis para as
plantas. Entretanto, a decomposição da matéria orgânica estável, ou seja,
da fração húmica do solo, é desfavorável para muitos processos químicos
e físicos, como a agregação, a capacidade de troca de cátions e a
capacidade de retenção de água. Uma alta atividade respiratória pode
Figura 2. Esquema da determinação do carbono da biomassa microbiana pelo
método da irradiação e extração utilizando microondas (Vance et al., 1987,
modificado por Islam & Weil, 1998). CMR – Capacidade máxima de
retenção de água do solo.
Leitura da
abs (590 nm)
A m o s tr a i r ra d i a d a (I)
Solo +
H2O
70% CMR
F i l t r a g e m
A m o s tr a n ã o - i r r a d ia d a
Solo + H2O
70% CMR
Irradiação
com
microondas
Extrator de C-org
K2SO4 0,5 mol L
-1
I
N
Irradiação
com
microondas
I
N
Extrato
+
H2SO4
+
K2CrO4
I
N
Cálculo
(Abs I – Abs NI)
CO
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resultar tanto de um grande “pool” de substratos de C lábeis, onde a
decomposição da matéria orgânica é intensa (uma floresta tropical, por
exemplo), como da rápida oxidação de um pequeno “pool” decorrente, por
exemplo, da quebra de agregados do solo promovida pela aração, a qual
expõe material orgânico que outrora se encontrava protegido da ação de
várias populações microbianas com atividade aeróbica, ou como resultado
da incorporação momentânea de resíduos culturais pela aração. Desse
modo, altas taxas de respiração podem indicar tanto um distúrbio ecológico
(como a incorporação de resíduos) como um alto nível de produtividade do
ecossistema (Islam & Weil, 2000).
Uma variável de interpretação aparentemente mais adequada é a taxa
de respiração por unidade de BM, ou quociente metabólico (qCO2). Essa
variável ecofisiológica da atividade específica foi proposta por Anderson &
Domsch (1985) como uma adaptação da teoria do “desenvolvimento
bioenergético dos ecossistemas” (Odum, 1969) e prediz que, à medida que
determinada BM se torna mais eficiente na utilização dos recursos do
ecossistema, menos C é perdido como CO2 pela respiração e maior
proporção de C é incorporada aos tecidos microbianos. Assim, uma BM
“eficiente” (< qCO2) tem menor taxa de respiração em relação a uma mesma
BM “ineficiente” (> qCO2). Dessa forma, tanto fatores de “estresse” (aqueles
envolvendo “estado de equilíbrio” ou condições desfavoráveis, como metais
pesados, limitações de nutrientes, baixo pH) como fatores de perturbação
(aqueles envolvendo fluxo rápido de condições ambientais, ou seja, cultivo,
queimada, etc.) induzem à redução da eficiência microbiana (Wardle, 1994).
Em geral, um baixo quociente metabólico indica economia na utilização de
energia e supostamente reflete um ambiente mais estável ou mais próximo
do seu estado de equilíbrio; ao contrário, valores elevados são indicativos
de ecossistemas submetidos a alguma condição de estresse ou de distúrbio.
Freqüentemente, solos com alto quociente metabólico são dominados por
organismos colonizadores de crescimento rápido (Sakamoto & Obo, 1994).
Islam & Weil (2000) estudaram os efeitos do uso do solo sobre vários
indicadores de qualidade em ecossistemas de florestas tropicais em
Bangladesh. Foram analisadas amostras de solos retiradas de áreas de
floresta natural, reflorestada com Acacia auriculiformis (idade de 7 anos),
pastagem de 20 anos e de uma área cultivada durante 20 anos com diversas
culturas. Dentre as características analisadas, os valores encontrados para
o C da BM, a respiração basal e o qCO2 mostraram uma relação que ilustra
o problema de se considerar somente os dados de respiração em estudos
de determinação da qualidade do solo (Quadro 3). Quando se avaliou
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somente a taxa de respiração basal do solo, não foram detectadas diferenças
entre a floresta natural e a área cultivada, o que indicaria atividade
microbiana semelhante nos dois solos. No entanto, quando se considerou
a taxa de respiração por unidade de biomassa, ou qCO2, o valor obtido
para o solo de floresta natural foi sensivelmente menor, o que demonstra
um solo mais estável e equilibrado, de acordo com a teoria de Odum (1969).
A respiração pode ser avaliada pela medição da liberação de CO2 ou
pelo consumo de O2. É comum o uso de técnicas simples, como a incubação
do solo em frascos hermeticamente fechados durante um período de até
uma semana, em que o CO2 liberado é capturado em solução de NaOH, a qual
é posteriormente titulada com HCl (Isermeyer, 1952). Atualmente, tem
havido grande avanço no desenvolvimento de respirômetros que fazem a
leitura contínua da produção de CO2 por meio de detetores de infravermelho
e permitem a análise de um grande número de amostras, com maior
facilidade e rapidez (Heinemeyer et al., 1989) (http://www.sluholding.se/
NordgrenInnovation/index.htm; http://www.sablesys.com). Outros
instrumentos medem a atividade respiratória pela redução da pressão
interna em frascos de incubação hermeticamente fechados, cuja leitura é
feita por sensores manométricos que transmitem os dadospor meio de
ondas de infravermelho (http://www.aqualytic.de; http://www.wtw.com). É
de grande importância que, em qualquer método utilizado, as medidas sejam
feitas sob condições padronizadas quanto à umidade do solo e à temperatura
de incubação, a fim de permitir a reprodutibilidade e comparação dos
resultados.
Quadro 3. Efeito do uso do solo sobre suas propriedades biológicas em
ecossistemas de Bangladesh
Fonte: Islam & Weil (2000).
Uso do solo CBM Respiração basal qCO2
mg kg-1 de C mg kg-1 d-1 de C-CO2 mg mg
-1 d-1 de C-CO2 do CBM
Floresta natural 259 6,2 0,024
Área reflorestada 338 8,5 0,025
Pastagem 394 8,8 0,023
Cultivo 156 6,2 0,039
LSD (p< 0,05) 85 ns 0,012
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Mineralização de nitrogênio
O conhecimento dos fatores que controlam as taxas de ciclagem de N
no solo é importante, em razão dos efeitos desses processos na estrutura
e função do ecossistema, como também na qualidade ambiental. A maior
parte do N assimilado pelas plantas é derivada dos reservatórios de N-
inorgânico, NH4
+ e NO3
-, que resultam dos processos de mineralização e
nitrificação (Hart et al., 1994). Como o N é freqüentemente o nutriente
mais limitante para as plantas, juntamente com o P, qualquer diferença nas
taxas de mineralização, de imobilização e de nitrificação pode ter profundo
efeito sobre a produtividade primária e sobre a qualidade do solo.
A mineralização de N, ou simplesmente amonificação, consiste na
liberação de amônio a partir da degradação de materiais orgânicos. Pode
ser efetuada por várias enzimas extracelulares e inespecíficas produzidas
por grande diversidade de organismos aeróbios e anaeróbios. Esse
processo é geralmente avaliado por meio da incubação do solo sob
condições aeróbias ou anaeróbias. Como ocorrem simultaneamente
mineralização e imobilização, determina-se a mineralização líquida de N, a
qual reflete o potencial de mineralização do N no solo. A técnica de
incubação aeróbia (Hart et al., 1994) consiste na medida do N inorgânico
produzido durante a incubação do solo sob condições ótimas de umidade,
temperatura e aeração por 28 dias. As concentrações de nitrato e de amônio
são determinadas em subamostras de solo antes e após a incubação. A
taxa líquida de mineralização é calculada pela subtração da concentração
inicial de N inorgânico da concentração final. A taxa de nitrificação também
pode ser determinada por este método, por meio da subtração da
concentração inicial de NO3
- da concentração final.
Na técnica de incubação anaeróbia (Bundy & Meisinger, 1994), a
mineralização do N é estimada a partir do NH4
+ produzido durante a
incubação do solo saturado com água, durante sete dias. Esta técnica
apresenta diversas vantagens comparada com o método aeróbio, o que a
torna mais adequada para testar a qualidade do solo. Entre essas vantagens
incluem-se a sua simplicidade e facilidade de adaptação a rotinas de
laboratório, a necessidade de um pequeno período de incubação (sete dias),
a pouca ou nenhuma influência do pré-tratamento das amostras sobre os
resultados do teste, a eliminação de preocupações relacionadas à
manutenção do conteúdo ótimo de água durante a incubação e a
necessidade mínima de materiais e equipamentos (Bundy & Meisinger,
1994). Além disso, como a nitrificação é inibida pela anaerobiose, somente
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é necessária a determinação do NH4
+, e as perdas de gases que poderiam
ocorrer pela desnitrificação também são evitadas (Stenberg, 1999).
Nitrificação
A nitrificação é um processo realizado por bactérias quimiolitotróficas
aeróbias estritas, durante o qual o amônio é transformado em nitrato em
duas etapas: a oxidação do amônio a nitrito e a oxidação deste a nitrato.
Somente algumas espécies de bactér ias per tencentes à família
Nitrobacteriaceae têm a capacidade de realizar a nitrificação, o que torna
esse processo sensível a perturbações. Assim, esta avaliação apresenta
o potencial de servir como bom indicador de distúrbios inibitórios, já que a
redundância com outros grupos fisiológicos é mínima e, também, por não
ser diretamente dependente da matéria orgânica, fato que permite enfatizar
outros aspectos da qualidade do solo (Stenberg, 1999).
A intensidade de nitrificação em solos é variável, mas o processo parece
ser pouco expressivo em solos com valores de pH menores que 4,0
(Alexander, 1977; Persson & Wirén, 1995). Apesar de o crescimento de
culturas puras de bactér ias nitr if icantes em meio líquido ocorrer
predominantemente em pH variando de neutro a alcalino, a nitrificação tem
sido constatada em solos ácidos em pesquisas desde 1962 (Prosser, 1989),
chegando a ser detectada em solos florestais com pH 3,2 (Federer, 1983).
O processo de nitr if icação tende a ser menos expressivo em
comunidades microbianas mais evoluídas e equilibradas. Ao contrário, o
processo tende a ser intensificado em condições de desequilíbrio, desde
que se disponha de fonte de N-NH4
+. Rice & Pancholy (1972) observaram
aumento dos teores de N-NH4
+ e decréscimo do teor de NO3
- ao longo dos
estádios sucessionais em áreas com diferentes tipos de vegetação. As
populações de microrganismos nitr i f icantes também diminuíram
significativamente com o avanço da sucessão. Os autores formularam a
hipótese de que a atividade de nitrificantes parece ser de algum modo
influenciada negativamente por substância(s) exsudada(s) pela vegetação
presente em comunidades clímax, principalmente taninos (Rice & Pancholy,
1973), ou outras substâncias potencialmente inibidoras de Nitrosomonas,
como os compostos fenólicos e flavonóides (Rice & Pancholy, 1974) e os
monoterpenos (Paavolainen et al., 1998). Outra hipótese seria a de que
interações negativas com outras populações microbianas existentes na
rizosfera, favorecidas pelo ambiente estável ou pela maior disponibilidade
de nutrientes, possam promover redução das populações de nitrificantes
(Robertson, 1982).
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A inibição da nitrificação traz implicações importantes na assimilação
do N nos ecossistemas. Dois passos bioquímicos que requerem energia
considerável - a redução do nitrato a nitrito e de nitrito a amônio - são eliminados.
A inibição da nitrificação resulta, assim, em conservação de energia.
Quando são consideradas a conservação do N, a conservação de energia
e a habilidade de muitas espécies vegetais em usar o amônio mais
eficientemente que o nitrato, não é surpreendente que a sucessão caminhe
no sentido de inibir a nitrificação (Rice & Pancholy, 1972).
Lazari (2001) estudou a nitrificação e outros processos bioquímicos e
microbiológicos em solos de Minas Gerais com eucalipto de diferentes
idades. A autora observou que as taxas de amonificação e de nitrificação
líquidas aumentaram com o avanço da idade da vegetação, sendo os
maiores valores detectados na área com vegetação nativa e numa área
sob eucalipto aos três anos de idade, que recebeu cultivo mínimo
(Quadro 4). O teor de nitrato, por sua vez, apresentou relação inversa com
a idade das árvores. A taxa de nitrificação potencial também foi mais
elevada em áreas de plantios de eucalipto mais jovens, com idade até
três anos, diminuindo nas áreas mais velhas. A taxa de nitrificação líquida
igualou-se à de amonificação em três das áreas estudadas, a saber: a área
contendo eucalipto aos três anos, a área contendo um pomar de matrizes
e uma área com vegetação nativa, indicando que a nitrificação estava sendo
limitada pela disponibilidade de substrato. Na área com eucalipto aos
três anos, em que se adotou o cultivo mínimo para implantação do
povoamento, a taxa de nitrificação potencial, que é tida como uma estimativa
do tamanho da população de nitrificantes, foi consideravelmente maior que
a taxa de nitrificação líquida. Taxas de nitrificação potencial semelhantes
ou maioresque esta foram encontradas nas áreas com plantio de eucalipto
com idade até 12 meses. No entanto, nessas áreas, verificaram-se baixas
taxas de amonificação e menores taxas de nitrificação líquida, em contraste
com a alta nitrificação potencial. Aparentemente, as populações de
nitrificantes estavam sendo inibidas por outro fator que não a disponibilidade
de substrato, a exemplo do pH, que, nessas áreas, se encontrava em torno
de 4,5, os menores valores dentre as áreas estudadas. A nitrificação
potencial diminuiu com o avanço da idade do plantio, indicando redução
nas populações de microrganismos nitrificantes. As áreas com plantios de
eucalipto com idade de cinco e sete anos apresentaram acidez menos
acentuada do que aquela encontrada nas áreas mais jovens e,
aparentemente, a redução da nitrificação não foi causada pela escassez
de substrato, já que a taxa de amonificação líquida foi superior à taxa de
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nitrificação líquida. Nessas áreas, portanto, a limitação imposta à nitrificação
pode ser de natureza aleloquímica (Silva et al., 1994). Os plantios de
eucalipto apresentam queda de serapilheira em torno de 5,5 t ha-1 ano-1,
após os cinco anos de idade, a qual se mantém constante até a idade de
nove anos (Neves, 2000). A hipótese de que um inibidor secretado pela
vegetação atue sobre os microrganismos nitrificantes em áreas onde a
queda de serapilheira é representativa não deve ser descartada. O eucalipto
é reconhecidamente rico em tanino, que se distribui nas folhas, nos frutos,
nas sementes e, em maior concentração, no cerne e na casca (Mori, 2000),
e o tanino é um inibidor potencial do processo de nitrificação (Rice &
Pancholy, 1973).
Dentre os diversos métodos de determinação da nitrificação, a incubação
aeróbia do solo em laboratório (descrita anteriormente) é a mais comumente
utilizada. Segundo Hart et al. (1994), a principal desvantagem desta técnica
é a de que as taxas de nitrificação líquida são muito sensíveis a mudanças
no teor de água e de concentração de NH4
+. A nitrificação potencial
determinada pelo método da agitação de uma pasta de solo (Belser, 1979)
pode ser considerada a de mais fácil interpretação e reprodutibilidade (Hart
et al., 1994). Este método consiste na incubação de uma amostra do solo
com uma solução diluída de fosfato de amônio sob agitação constante e na
medição do NO3
- acumulado durante um período relativamente curto
Quadro 4. Taxas de amonificação e de nitrificação líquidas e de nitrificação
potencial em amostras de solo de povoamentos de eucalipto com
diferentes idades e de uma área com vegetação nativa adjacente
(1) n.d. = não determinado. Médias seguidas pela mesma letra, na coluna, não diferem
entre si pelo teste Tukey a 5 %).
Fonte: Lazari (2001).
Área Idade Nitrificação líquida Amonificação Nitrificação potencial
ano mg kg-1 d-1
de N-NO3
-
 no solo
mg kg-1 d-1
de N-NH4
+
 no solo
mg kg-1 d-1
de N-NO3
-
 no solo
1 0,25 0,001 d 0,185 e 1,789
2 0,5 0,018 d 0,177 e 0,894
3 1 0,097 cd 0,236 de 0,999
4 3 0,462 b 0,462 bc 1,022
5 5 0,414 b 0,504 b 0,629
6 7 0,303 bc 0,763 a 0,668
7 15 0,346 b 0,346 cd n.d.(1)
8 nativa 0,680 a 0,680 a n.d.
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(usualmente ≤ 24 h). A imobilização de nitrato pelos microrganismos é inibida
pelas altas concentrações de NH4
+, e a desnitrificação é inibida pela agitação,
que mantém a mistura aerada. Como o processo de consumo de NO3
- é
eliminado, as taxas líquidas se equivalem às taxas brutas de nitrificação
(Hart et al., 1994). As informações obtidas por este método são aplicáveis
às condições de campo, uma vez que, dado o curto período de incubação,
são pouco prováveis mudanças nas populações de nitrificantes. Também,
limitações de umidade e de substrato são eliminadas e, assim, a medida
da taxa de nitrificação se aproxima daquela da taxa de nitrificação máxima
(Vmax) possível a determinada temperatura de incubação (Hart et al., 1994).
Enzimas do solo
As enzimas do solo têm sido sugeridas como potenciais indicadores
biológicos da qualidade do solo, tendo em vista o seu relacionamento com
a atividade biológica (Tabatabai, 1994), a facilidade de determinação e a resposta
rápida às mudanças no manejo do solo (Dick, 1994). Enzimas catalisam
todas as reações bioquímicas e são partes integrais da ciclagem de nutrientes
no solo. Todos os organismos vivos no solo, como microrganismos, raízes
de plantas e fauna, contribuem com grande variedade de enzimas. Elas estão
usualmente associadas com a proliferação de células viáveis, mas podem
ser excretadas de uma célula viva ou liberadas na solução do solo a partir
de células mortas (Tabatabai, 1994). As enzimas livres formam complexos
com colóides húmicos e podem ser estabilizadas na superfície de partículas
de argila ou de matéria orgânica (Boyd & Mortland, 1990), mantendo-se aí
ativas por tempos variáveis.
A escolha das enzimas a serem analisadas baseia-se na sua
sensibilidade ao manejo do solo, na sua importância na ciclagem de
nutrientes e na decomposição da matéria orgânica e na simplicidade da
análise. As enzimas mais comumente analisadas são aquelas ligadas aos
ciclos da matéria orgânica e dos macronutrientes C, N, S e P, a saber:
β-glicosidase, invertase e galactosidases, as quais desempenham papel
fundamental na liberação de açúcares de baixa massa molecular, que são
importantes fontes de energia para os microrganismos; as celulases,
responsáveis pela hidrólise da celulose, molécula orgânica mais abundante
na natureza; as ureases, amidases e proteases, as quais participam do
ciclo do N, contribuindo para a liberação de N-inorgânico; a arilsulfatase, a
qual libera SO4
- para as plantas; e as fosfatases ácidas e alcalinas,
responsáveis pela hidrólise de ligações P-éster da matéria orgânica, com
subseqüente liberação de P inorgânico. Visser & Parkinson (1992) sugeriram
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a análise da atividade das desidrogenases como indicadora do estado
metabólico da BM, dado o seu relacionamento direto com a atividade de
oxidação da matéria orgânica.
Os procedimentos para a determinação dessas enzimas são
relativamente simples quando comparados com os procedimentos analíticos
realizados para a quantificação de nutrientes em uma análise de solo de rotina.
Em geral, prescrevem o emprego de uma solução tamponada contendo o
substrato da enzima para ser misturada ao solo, sendo a mistura incubada
sob condições padronizadas para a enzima por um determinado período e
o produto formado e quantificado por método colorimétrico (Quadro 5).
Quadro 5. Principais enzimas envolvidas na ciclagem do carbono, do
nitrogênio, do enxofre e do fósforo no solo e algumas características
dos métodos utilizados em suas determinações
Enzimas
Substrato
usado na
determinação
Incubação Detecção Referência
β-Glicosidases p-nitrofenil-β-
D-glicosídeo
1 h/37°C Determinação do p-nitrofenol
liberado por colorimetria
(mmol kg-1 h-1 p-nitrofenol)
Eivazi & Tabatabai
(1988)
Invertase Sacarose 3 h/50°C Quantificação dos açúcares
redutores liberados por
colorimetria (mg kg-1 h-1)
Schinner & Von Mersi
(1990)
Celulases Sal sódico de
carboximetil
celulose
24 h/50°C Idem invertase Schinner & Von Mersi
(1990)
Ureases Uréia 2 h/37°C Quantificação do amônio liberado
por colorimetria (mmol kg-1 h-1
NH4
+) (Kempers & Zweers, 1986)
Kandeler & Gerber
(1988)
Amidases Formamida 2 h/37°C Quantificação do amônio liberado
por destilação a vapor
(mmol kg-1 h-1 NH4
+)
Frankenberger
& Tabatabai
(1980)
Proteases Caseinato de
sódio
2 h/50°C Quantificação dos aminoácidos
liberados
(mg kg-1 h-1 tirosina)
Ladd & Butler
(1972)
Arilsulfatases p-nitrofenil
sulfato
1 h/37°C Idem β-Glicosidases Tabatabai & Bremner
(1970)
Fosfatases p-nitrofenil
fosfato
1 h/37°C Idem β-Glicosidases Eivazi & Tabatabai
(1977)
Desidrogenase Cloreto de
2,3,5-
trifeniltetrazólio(TTC)
24 h/37°C Determinação colorimétrica do
2,3,5-trifenil formazan (TFP)
produzido pela redução do TTC
(µmol kg-1 h-1 TFP)
Visser & Parkinson
(1992)
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O uso intensivo de muitos ecossistemas tem contribuído para a redução
da diversidade de espécies, que corresponde aos diversos níveis de
organização biológica. Processos relacionados com a degradação
ambiental incluem derrubada de vegetação nativa, agricultura e pecuária
intensivas, mineração, entre outros. Apesar de haver preocupação geral
da sociedade com relação ao tema biodiversidade, o foco das atenções
tem se voltado predominantemente para os recursos animais e vegetais.
Pouca preocupação tem sido dispensada à porção menos evidente, porém
não menos importante, da biodiversidade: os microrganismos (OTA, 1987;
Wilson, 1988; Kennedy & Smith, 1995). Associadas a isso, dificuldades
nos procedimentos necessários ao estudo das populações microbianas
contribuem para a escassez de informações acerca da dinâmica de
populações e da diversidade microbiana, a tal ponto que apenas cerca de
13 % das espécies microbianas possivelmente existentes são conhecidas.
As comunidades microbianas que ocorrem nos solos são constituídas
por várias espécies, que ocupam os diferentes nichos disponíveis. Essas
comunidades são geralmente constituídas por poucas espécies contendo
muitos indivíduos e por muitas espécies com poucos indivíduos. Embora
as populações dominantes sejam as maiores responsáveis pelos fluxos de
matéria e de energia na comunidade, as espécies menos abundantes são
as que mais contribuem para a diversidade biológica (Atlas & Bartha, 1997).
Uma elevada diversidade de espécies contribui para o uso mais eficiente
dos recursos disponíveis. Interações interpopulacionais equilibradas
também contribuem para maior eficiência no uso desses recursos,
especialmente quando envolve relações sintróficas, ou seja, quando uma
população contribui para suprir a demanda nutricional de outra população
e vice-versa(3). Desse modo, comunidades microbianas caracterizadas por
alta diversidade necessitam de pouca energia para sustentar a biomassa
ali presente, o que se reflete na baixa produtividade primária por unidade
de biomassa. Alta diversidade está geralmente associada à elevada
estabilidade da comunidade, onde cada população desempenha papel
(3) O conceito de Sintrofia é mais complexo do que o aqui apresentado, podendo envolver, por
exemplo, a contribuição mútua de duas ou mais populações para aumentar a disponibilidade
de um recurso escasso ou para reduzir um fator inibitório por meio de uma ação conjunta.
Para maior detalhamento, sugerimos consultar literatura mais específica sobre interações
entre populações microbianas (e.g. Atlas & Bartha, 1997).
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funcional que determina a manutenção normal dos fluxos de matéria e de
energia em cada nível trófico de um ecossistema particular. Em ambientes
sujeitos a flutuações, como o solo, o estabelecimento de uma condição
ambiental desfavorável poderia resultar na inibição de algumas populações
que desempenham papéis vitais dentro da comunidade. Nesse caso, a
existência de populações que desempenham um mesmo papel funcional,
mas que possuem diferentes exigências em relação aos fatores físicos,
químicos e biológicos, ou seja, a redundância funcional, assegura que essas
funções vitais sejam desempenhadas independentemente de variações no
ambiente.
Conceitualmente, diversidade é a variedade de espécies em um
ecossistema, assim como a variabilidade genética dentro de uma mesma
espécie. A diversidade biológica, ou biodiversidade, pode ser também
definida como a riqueza da porção viva do ecossistema que se reflete na
variedade de espécies e nas intrincadas inter-relações dos processos
biológicos que ocorrem nos vários biomas.
A real dimensão da diversidade microbiana dos solos é ainda hoje
desconhecida. Entretanto, o emprego de técnicas moleculares tem revelado
que o número de espécies microbianas presentes no solo é muito superior
ao que se conhece dos estudos baseados em técnicas de cultivo (Holben
& Tiedje, 1988; Torsvik et al., 1990). Estima-se que o número total de
espécies de todas as formas de vida na Terra seja algo entre 10 e 25 milhões,
das quais apenas cerca de 1,4 milhão foram identificadas (Hawksworth,
1991a,b; Wilson, 1988). O número total de espécies microbianas é estimado
em torno de 1,7 milhão, tendo sido identificadas até o momento 117 mil
espécies (Hawksworth, 1991b). Um número significativo de espécies
permanece desconhecido, o que representa um vasto potencial de atributos
e de informações genéticas valiosos ainda por serem descobertos.
A biodiversidade do solo refere-se a uma variedade de grupos
taxonômicos, incluindo bactérias, fungos, protozoários, nematóides,
minhocas e artrópodes (van Bruggen & Semenov, 2000). A diversidade
microbiana do solo é normalmente analisada em nível de espécie ou
diversidade genética mais do que em nível de diversidade estrutural e
funcional (Holben & Harris, 1995; van Bruggen & Semenov, 2000).
Entretanto, estas duas últimas medidas podem ser mais relevantes para a
qualidade do solo (Visser & Parkinson, 1992). Essa afirmação é baseada
na pressuposição de que existe redundância funcional em um solo saudável
(Beare et al., 1995), de forma que o ecossistema do solo irá se recuperar
de um fator de estresse mesmo que parte da comunidade microbiana seja
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eliminada (van Bruggen & Semenov, 2000). Além do “pool” microbiano
ativo, existe um “pool” de reserva de microrganismos quiescentes, mais
diverso que o “pool” ativo, o qual pode responder a um distúrbio, como a
adição de substâncias estranhas ao solo (Zvyagintsev et al., 1984). Esse
“pool” microbiano diversificado é que mantém a homeostase do solo. Quanto
maiores a redundância funcional e a diversidade, mais rápido o ecossistema
pode retornar às condições iniciais após ter sido exposto a estresse ou
distúrbio, ou seja, maior a sua resiliência (van Bruggen & Semenov, 2000;
Degens et al., 2001).
Essa resposta a um distúrbio no solo desencadeia uma sucessão de
bactérias, de fungos e da cadeia alimentar associada, processo que
geralmente leva a decréscimo inicial e posteriormente a aumento na
biodiversidade. A extensão e duração de mudanças sucessionais irão
depender da intensidade e da duração do distúrbio. Em resposta a uma
perturbação de duração e de intensidade pequenas na comunidade
microbiana de um solo saudável, ela rapidamente retornará às condições
iniciais. Estresses crônicos e de longa duração resultarão em sucessão
longa, levando a um novo equilíbrio dinâmico entre os componentes do
ecossistema (van Bruggen & Semenov, 2000). Dessa forma, a habilidade
de um ecossistema de suportar distúrbios extremos pode depender em
parte da diversidade. Assim, é importante monitorar a diversidade como
um indicador de mudança em resposta aos usos do solo (Kennedy & Smith,
1995).
As diferentes práticas agrícolas afetam fortemente o ambiente do solo,
causando distúrbios na sua comunidade microbiana, que podem, por sua
vez, influenciar os processos do solo. Como exemplo, os distúrbios físicos
causados no solo pela aração e pelo manejo de resíduos são fatores cruciais
determinantes da atividade da biota do solo e da diversidade de espécies
no agroecossistema. A aração usualmente causa distúrbio de pelo menos
15-25 cm na superfície do solo e transforma os horizontes superficiais
estrat i f icados deste em uma zona homogênea com respeito às
características físicas e à distribuição de resíduos. A perda de um habitat
de solo estratificado causa decréscimo na densidade de espécies (Altieri,
1999). Os efeitos do uso do solo sobre a diversidade microbiana têm sido
demonstradossistematicamente para alguns grupos de microrganismos, a
exemplo dos fungos micorrízicos. Em solos de regiões tropicais, a remoção
da vegetação nativa para introdução de florestas plantadas, para o cultivo
de subsistência ou para o cultivo comercial altera a composição de espécies
vegetais, a matéria orgânica, os nutrientes, a estrutura e a comunidade
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microbiana do solo, incluindo as espécies de fungos micorrízicos (Adejuwon
et al., 1987; Entry et al., 2002). A comunidade vegetal, geralmente constituída
de grande número de espécies em diferentes estádios de desenvolvimento,
é substituída por uma única espécie, e todos os indivíduos apresentam o
mesmo grau de desenvolvimento. Isso representa uma alteração drástica,
que afeta a abundância e a composição de espécies de fungos micorrízicos
no local. Outros fatores ligados à atividade antropogênica que levam a
alterações na comunidade de fungos micorrízicos são a fertilização, a
introdução de metais pesados e de xenobióticos e a compactação do solo
(revisto por Entry et al., 2002), a irrigação (Ortega-Larrocea et al., 2001), o
aumento da concentração de CO2 na atmosfera (revisto por Staddon &
Alastair, 1998), a aração (McGonigle & Miller, 1993), entre outros. Essas
reduções na biodiversidade do solo são negativas, pois a ciclagem de
nutrientes e o próprio balanço entre matéria orgânica, organismos do solo
e diversidade de plantas são componentes necessários de um solo
ecologicamente balanceado (Hendrix et al., 1990).
O monitoramento da diversidade biológica em um ecossistema pode
servir como critério para detectar alterações ambientais. Essa informação
pode também contribuir para o estabelecimento de uma relação mais
confiável entre diversidade e sustentabilidade, na medida em que se possa
definir qual o mínimo de diversidade capaz de ainda permitir o
funcionamento dos ciclos dentro do ecossistema.
O uso de índices de diversidade contribui para melhor compreensão do
funcionamento de uma comunidade complexa. É preciso que se considere,
porém, que a diversidade é função de dois componentes igualmente
importantes, o número de espécies que compõem a comunidade e o número
de indivíduos em cada população (Margalef, 1958). Os índices de
diversidade de espécies, quando aplicados ao estudo de comunidades
microbianas, requerem a avaliação de grande número de microrganismos
(Atlas, 1984). Em trabalhos dessa natureza, a determinação das espécies
microbianas, ou unidades taxonômicas, é geralmente baseada na taxonomia
numérica (Kaneko et al., 1977; Holder-Franklin et al., 1981; Bascomb &
Colwell, 1993). Nesse caso, um grande número de características,
geralmente fenotípicas, é determinado. Análises de agrupamento são então
efetuadas de modo a permitir o estabelecimento de similaridades entre os
organismos isolados.
A riqueza de espécies, um dos componentes dos índices de diversidade,
representa o número total de espécies (S) constituintes da comunidade.
As equações de Margalef (1958) e de Menhinick (1964) assumem uma
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relação entre o número de espécies (S) e o número total de indivíduos (n)
(Quadro 1). Uma maneira de se assegurar que essa relação seja mantida
é se trabalhar com amostras de tamanho igual, ou se trabalhar com o
procedimento de rarefação, pelo qual se compara o número de espécies
observadas com aquele calculado por um modelo computacional (Hurlbert,
1971). Esse procedimento tem sido utilizado no estudo de comunidades
microbianas (Mills & Wassel, 1980). O outro componente dos índices de
diversidade de espécies, a eqüitabilidade de espécies, corresponde à
distribuição de indivíduos dentro do que são consideradas populações (ni)
(Quadro 6).
Quadro 6. Riqueza, eqüitabilidade e índices de diversidade de espécies
S = número total de espécies na comunidade; ni = número de indivíduos na i-ésima popu-
lação; n = número total de indivíduos na comunidade.
Riqueza
RMargalef
RMenhinick
Eqüitabilidade
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O índice de eqüitabilidade mais amplamente utilizado é a razão do índice
de Shannon (Shannon & Weaver, 1949). O valor máximo de H’ é alcançado
quando somente um indivíduo ocupa o que se considera como espécie ou
população (Pielou, 1977). Outras equações para determinação da
eqüitabilidade têm sido propostas (Heip, 1974; Sheldon, 1969), mas
possuem a desvantagem de serem fortemente influenciadas pela riqueza
da amostra (Kennedy & Smith, 1995). A equação de Hill para cálculo da
eqüitabilidade (Hill, 1973) representa a razão entre os dois índices de
diversidade de Hill. O valor se aproxima da unidade em situações em que
uma espécie é dominante. A equação modificada de Hill (Hillmod) difere
da anterior na medida em que, quando pequeno número de espécies domina
a comunidade, o valor aproxima-se de zero. As duas equações propostas
por Hill são as que menos influência sofrem da riqueza de espécies
componentes da comunidade.
Os índices de diversidade, por representarem um valor numérico único
resultante de dois componentes, riqueza e eqüitabilidade de espécies,
devem ser analisados com cautela ao serem usados para comparar duas
ou mais comunidades. Assim, duas comunidades com igual índice de
diversidade podem ser bastante diferentes quanto aos dois componentes
da diversidade, podendo uma delas apresentar alta riqueza e baixa
eqüitabilidade e a outra baixa riqueza e alta eqüitabilidade. É fundamental
que em trabalhos dessa natureza sejam consideradas essas três
informações: riqueza, eqüitabilidade e diversidade.
O índice de diversidade de Simpson (1949) foi o primeiro a ser utilizado
em trabalhos de ecologia. Esse índice considera a probabilidade de dois
indivíduos pertencerem à mesma espécie; no caso dessa probabilidade
ser alta, a diversidade é baixa. O índice de Shannon-Weaver (1949) baseia-
se na incerteza de se predizer a qual espécie um indivíduo deverá pertencer.
É o índice de diversidade mais amplamente utilizado. Contudo, é sensível
ao tamanho das amostras, especialmente quando se trabalha com amostras
pequenas, e não considera espécies mais raras na comunidade (DeJong,
1975). Hill (1973) desenvolveu algumas equações de índices de diversidade
que também são pouco sensíveis a espécies pouco abundantes, ou raras
(Quadro 6). A primeira delas (Hill-1) utiliza o logaritmo natural do índice de
Shannon-Weaver e reflete o número de espécies abundantes. A segunda
equação de Hill (Hill-2) é o inverso da equação de Simpson, a qual considera
as espécies mais dominantes.
Uma das principais dificuldades de aplicar os índices de diversidade ao
estudo de comunidades microbianas refere-se à necessidade de recuperar
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os indivíduos das diferentes populações em meios de cultura, a fim de que
as características fenotípicas possam ser potencializadas pelo aumento
do número de células, permitindo a identificação. No entanto, os
microrganismos são muito diversos e procedimentos favoráveis à
recuperação de algumas populações são inapropriados para outras (Atlas
& Bartha, 1997). Por exemplo, a incubação de amostras na presença de
oxigênio impossibilita a detecção de anaeróbios estritos. A presença de
compostos orgânicos no meio de isolamento favorece o crescimento de
microrganismos heterotróficos mais competitivos, mas dificulta a observação
dos autotróficos ou dos heterotróficos de crescimento mais lento, ou
fastidiosos. É importanteque se considere a grande diversidade de micro-
habitats presentes em solos. As combinações de fatores que influenciam a
composição de espécies microbianas são incomensuráveis e jamais será
possível reproduzi-las integralmente nos estudos que visam ao estudo da
diversidade microbiana nesse tipo de ambiente.
Estudos que se propõem a inventariar a diversidade microbiana utilizam
princípios muito diversos, os quais dependem do sistema a ser estudado e
do tipo de informação que se deseja obter. O estudo da diversidade
microbiana, especialmente do solo, apresenta problemas específicos,
relacionados à dimensão microbiana e à variabilidade da matriz que constitui
seu habitat. Determinantes fundamentais da diversidade biológica têm sido
extensivamente pesquisados em ecossistemas aquáticos e na porção
terrestre acima da superfície (Giller et al., 1997; Trevors, 1998), mas são
fundamentalmente desconhecidos para as comunidades microbianas do
solo. Ao contrário dos estudos com comunidades de plantas e de animais,
não se tem conseguido efetuar um inventário da diversidade microbiana
sem os erros e vícios associados aos métodos bioquímicos, moleculares e
os dependentes do isolamento e cultivo de populações individuais (Zak et
al., 1994; Trevors, 1998). Além disso, a compreensão da diversidade
funcional das comunidades microbianas a partir das informações acerca
de sua estrutura não tem sido possível (Giller et al., 1997; Degens, 1999),
ao contrário do que ocorre com organismos superiores (Körner, 1993; Gitay
& Noble, 1997). Essa limitação decorre principalmente do fato de que muitas
populações microbianas podem estar presentes no solo sem estarem
necessariamente num estado metabolicamente ativo (Meikle et al., 1995;
Trevors, 1998).
Recentemente, avanços impor tantes têm sido obt idos no
desenvolvimento de métodos direcionados ao estudo de comunidades
microbianas do solo. Os principais trabalhos avaliam a diversidade
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microbiana por meio do estudo dos perfis de ácidos graxos (Vestal & White,
1989; Tunlid & White, 1992; Frostegård et al., 1996) ou da heterogeneidade
do DNA (Torsvik et al., 1990; Ritz & Griffiths, 1994; Tiedje et al., 1999)
extraído de amostras de solo.
Os principais processos microbianos ligados ao funcionamento dos
ecossistemas terrestres resultam de crescimento e morte microbianos, ou
da atividade de enzimas presentes na matriz do solo. Uma vez determinada
a magnitude desses processos-chave, os métodos de estudos da
composição da comunidade podem ser empregados ao longo do tempo e
espaço para se compreender a ligação das populações com os processos
fundamentais (Tiedje et al., 1999). Dada a fragilidade dos métodos baseados
no cultivo de microrganismos para fins de estudo da diversidade microbiana
dos solos, o desenvolvimento de técnicas moleculares tem sido de
fundamental importância para se resolver a estrutura das comunidades
microbianas do solo. Muitos desses novos métodos têm possibilitado
estudar não só características funcionais, mas também a própria diversidade
genética.
A diversidade genética de uma comunidade microbiana pode ser avaliada
pela determinação da heterogeneidade do DNA extraído do ambiente. O
DNA, obtido das populações presentes, representa o conjunto de
informações genéticas daquela comunidade. A forma mais usual de obter
amostras de DNA da comunidade é proceder à lise direta das células, ou
após a separação das células da matriz que compõe o habitat das
populações (Ogram et al., 1988; Fuhrman et al., 1988; Krsek & Wellington,
1999; Tiedje et al., 1999; Pennanen et al., 2001). O DNA extraído passa
por vár ias etapas de puri f icação, que envolvem o uso de
polivinilpolipirrolidona para remoção do material húmico, precipitação,
cromatografia em coluna ou ultracentrifugação em gradiente de cloreto de
césio. Recentemente, algumas firmas têm comercializado kits para
purificação de DNA do solo de alta qualidade (pronto para reação da
polimerase em cadeia (PCR)) em menos de 30 min, permitindo a obtenção
de DNA genômico de bactérias, fungos, plantas e animais do solo. Uma outra
vantagem desse sistema de extração é que não se trabalha com solventes
tóxicos, como fenol ou clorofórmio. O DNA resultante varia entre 6 e 25 kb,
podendo-se obter, para uma só amostra de solo, entre 1 e 50 µg de DNA,
dependendo do material e do número de microrganismos na amostra.
Após a extração e purificação, as amostras de DNA podem ser
analisadas por diversos processos, visando determinar o perfil genético
das comunidades microbianas. Alguns dos principais métodos empregados
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no estudo da diversidade genética das comunidades microbianas do solo
são descritos a seguir. Adicionalmente, métodos atualmente utilizados no
estudo da diversidade funcional ou metabólica das comunidades
microbianas do solo são também brevemente abordados.
Taxa de reassociação do DNA
Um dos métodos de estudo da diversidade de comunidades microbianas
emprega o aumento da temperatura, que leva à separação das cadeias de
DNA, seguido do resfriamento e do acompanhamento da taxa de
reassociação da amostra a 260 nm.
A taxa de reassociação do DNA é uma medida de sua heterogeneidade
(Wetmur & Davidson, 1968; Britten et al., 1974). Quanto maior a similaridade
do DNA da amostra, menor é a diversidade e mais rápida é a reassociação.
A concentração inicial de DNA na alíquota submetida ao aquecimento,
multiplicada pelo tempo necessário para que metade das moléculas volte a
se reassociar, constitui um índice denominado Cot½, o qual é usado para
se determinar a heterogeneidade do DNA de uma comunidade. Com base
nesse valor determinado para uma comunidade desconhecida e em um
valor médio de Cot½ determinado para bactérias conhecidas, pode-se
estimar o número de genomas diferentes na amostra.
Torswik et al. (1990) empregaram esse método para estudar a diversidade
do DNA extraído diretamente de amostras de solo. O valor de Cot½ do
DNA representativo da comunidade bacteriana total foi de aproximadamente
4.600, o que equivale a cerca de 4.000 genomas diferentes (Figura 3). Esse
número foi cerca de 200 vezes superior ao obtido pelo processo de cultivo,
indicando que a maioria das populações presentes no solo, ou seja, cerca
de 99 %, não se mostrou capaz de crescer nas condições de cultivo
utilizadas, sendo justamente essas as que mais contribuem com a
diversidade. Esse foi um dos trabalhos pioneiros a enfatizar a fragilidade
das técnicas dependentes do cultivo de microrganismos para estudos de
diversidade microbiana no solo.
Análise do conteúdo de guanina mais citosina
A análise de distribuição do conteúdo de Guanina mais Citosina (G + C)
é empregada quando se deseja apenas uma análise mais grosseira do
perfil da comunidade microbiana. A técnica se baseia no fato de que o
conteúdo de G + C do DNA de procariotos varia entre 24 e 76 % e que
grupos taxonômicos específicos abrangem microrganismos cujo conteúdo
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Figura 3. Reassociação do DNA de uma comunidade bacteriana do solo
(gráfico Cot). A reassociação do DNA de Escherichia coli foi incluída
para comparação. A abscissa fornece o log da concentração inicial de
DNA fita única (mol L-1 de nucleotídeos) multiplicada pelo tempo em
segundos. A ordenada fornece a porcentagem de reassociação do DNA.
de G + C varia menos que 3-5 % (Goodfellow & O’Donnell, 1993; Vandamme
et al., 1996). Geralmente, as técnicas empregadas em microbiologia
possuem uma resolução de média a fina, no sentido de que geralmente
trabalham em nível de gênero e de espécie ou isolado. Segundo Tiedje et
al. (1999), uma técnica que possibilite um nível de resolução mais grosseiro
é de grande utilidade prática, especialmente para análises de comunidades.
Outras vantagens do método são que ele se presta a todo o DNA extraído
do solo, não sofre as