uso-de-lipoproteinas-de-baixa-densidade--extraidas-da-gema-de-ovo--para-a--criopreservacao-de-semen-de-bufalos

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MAYARA FERREIRA BRITO 
 
 
 
 
 
Criopreservação do sêmen de búfalos (Bubalus bubalis) em 
diluidores contendo lipoproteínas de baixa densidade, em 
substituição a gema de ovo 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada à Universidade 
Federal de Minas Gerais, como requisito 
parcial para obtenção do grau de Mestre em 
Ciência Animal. 
 
 
Área: Reprodução Animal 
Orientador: Prof. Marc Henry 
 
Co-Orientadora: Profa. Maria Isabel Vaz de 
Melo 
 
 
 
 
 
 
 
 
Belo Horizonte 
UFMG – Escola de Veterinária 
2014 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Àqueles que estiveram sempre presentes, 
cada um a sua maneira, Elba, Brito, Ludmila e 
Wellerson (minha família!) dedico mais esta 
conquista! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
À minha família que me forneceu as bases e a estabilidade necessárias para que eu 
pudesse me dedicar exclusivamente ao ofício da pesquisa; 
Ao meu bem, Cairo, que se tornou peça fundamental da minha história; 
Aos órgãos de pesquisa CNPq, INCT pecuária e CAPES pelo oferecimento de bolsa 
auxílio e financiamentos de projetos; 
Aos professores do setor de Reprodução Animal, por todos os conhecimentos ofertados 
e pelos exemplos profissionais; 
Ao meu orientador e, além de tudo apoiador, Marc Henry, pelos aprendizados 
proporcionados e pelo exemplo de dedicação à conquista de seus ideiais; 
À minha co-orientadora e amiga Profa. Maria Isabel, por toda a paciência, pelo 
compartilhamento dos conhecimentos e por toda a ajuda oferecida; 
À nossa equipe de trabalho (!!!!) sem os quais eu não teria chegado a lugar algum: 
Beatriz (pé e mão direita e esquerda!), Guilherme, Rafael, Isabela, Jaci e Ana Maria; 
Ao Marcelino, que mais que ninguém nos ensina todos os dias como é mais leve e 
produtivo se trabalhar com um sorriso no rosto e com disposição; 
A todos os demais funcionários da fazenda Modelo de Pedro Leopoldo, que de uma 
forma ou outra foram imprescindíveis para a realização desse projeto; 
Aos integrantes do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e LANAGRO, 
pela concessão do espaço físico e equipamentos para realização da extração de 
lipoproteínas; 
Ao consultor estatístico Danilo; 
E a todos os amigos, antigos ou novas conquistas, que torceram, rezaram e me ajudaram 
a estar inteira para conseguir chegar ao fim de mais essa etapa. 
Meu sincero e enorme MUITO OBRIGADA! 
 
 
 
 
SUMÁRIO: 
 
1- INTRODUÇÃO 08 
1.1- Objetivo geral 09 
1.2- Objetivos específicos 09 
2- REVISÃO DE LITERATURA 10 
2.1- Bases da criopreservação de gametas masculinos 10 
2.2- As lipoproteínas de baixa densidade e sua aplicação para a criopreservação 11 
2.2.1- Caracterização das lipoproteínas de baixa densidade 11 
2.2.2- Novos protocolos para extração das lipoproteínas da gema de ovo 13 
2.2.3- Mecanismos de ação das LDL para criopreservação de espermatozoides 14 
2.2.4- Emprego das LDL no congelamento de espermatozoides de mamíferos 17 
2.3- Características bioquímicas do sêmen bubalino 19 
2.4- Utilização do sêmen bubalino criopreservado 20 
2.4.1- Preparo dos animais para a coleta 20 
2.4.2- Características físicas do sêmen 21 
2.4.3- Fatores que afetam o congelamento do sêmen de búfalos 22 
2.5- Avaliação laboratorial do sêmen 27 
2.5.1- Avaliação computadorizada da motilidade espermática 27 
2.5.2- Teste de termorresistência 28 
2.5.3- Avaliação de integridade das estruturas do espermatozoide 29 
3- MATERIAL E MÉTODOS 31 
3.1- Extração e obtenção das lipoproteínas de baixa densidade da gema do ovo 31 
3.2- Animais e local do experimento 31 
3.3- Delineamento experimental 32 
3.3.1- Pré-experimento 32 
3.3.2- Experimento 1 33 
3.3.3- Experimento 2 34 
3.4- Análises pré-resfriamento 34 
3.5- Processamento do sêmen para congelamento 35 
3.6- Avaliações espermáticas pós-descongelamento 35 
3.7- Análise estatística 36 
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO 38 
4.1- Pré-experimento – Teste para diluidor base 38 
4.2- Experimento 1 – Teste Diluidor comercial® 42 
4.3- Experimento 2 – Teste Tes-Tris 47 
4.4- Considerações gerais sobre os experimentos 50 
5- CONCLUSÕES 52 
REFERÊNCIAS 53 
ANEXOS 61 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS: 
Tabela 1- Características pós-descongelamento do sêmen de búfalos congelados em 
diferentes diluidores, em trabalhos publicados de 1996-2013. 
24 
Tabela 2- Composição química do diluidor Tris-ácido cítrico 33 
Tabela 3- Composição química do diluidor Tes-Tris 33 
Tabela 4- Preparo de diluidores experimentais a partir do diluidor comercial 34 
Tabela 5- Preparo de diluidores experimentais a partir do Tes-Tris 34 
Tabela 6- Características do sêmen fresco dos búfalos utilizados no Pré-experimento 38 
Tabela 7- Valores de VCL, VSL, VAP, LIN e BCF dos espermatozoides de búfalos 
congelados em diluidores comercial, Tes-Tris e Tris-ácido cítrico, durante incubação a 
37°C de 0 a 120 minutos, avaliados a cada 30 minutos 
41 
Tabela 8- Médias (± DP) dos espermatozoides com membranas íntegras ou não 
íntegras, pelo Teste Hiposmótico e por Sondas Fluorescentes (CFDA/Pi) após o 
descongelamento. 
42 
Tabela 9- Características do sêmen fresco dos búfalos utilizados no experimento 1. 42 
Tabela 10- Médias (± DP) dos parâmetros analisados pelo CASA, para 
espermatozoides bubalinos pré-resfriamento, diluídos em diferentes concentrações de 
lipoproteínas de baixa densidade com diluidor comercial base. 
43 
Tabela 11- VCL, VSL, VAP, LIN e BCF dos espermatozoides de búfalos congelados 
em diluidores Tes-Tris, e Tes-Tris base contendo 2, 4, 8 ou 14% de LDL, durante 
incubação a 37°C de 0 a 120 minutos, avaliados a cada 30 minutos. 
45 
Tabela 12- Médias (± DP) dos espermatozoides reativos, com membrana plasmática 
funcionalmente íntegra, e espermatozoides não reativos, com membrana plasmática 
não funcional, após o descongelamento, empregando diluidores contendo gema de ovo 
ou diferentes concentrações de LDL, em diluidor comercial base. 
46 
Tabela 13- Médias (± DP) dos espermatozoides com membranas íntegras (Íntegro), 
com membrana acrossomal íntegra e pós-acrossomal lesionada (Semi) e com 
membranas lesionadas (Lesado), após o descongelamento, empregando diluidores 
contendo gema de ovo ou diferentes concentrações de LDL, em diluidor comercial 
base. 
46 
Tabela 14- Características do sêmen fresco dos búfalos utilizados no Experimento 2. 47 
Tabela 15- Características do sêmen pré-resfriamento dos búfalos utilizados no 
Experimento 2, para testar o diluidor Tes-Tris base em associação com as lipoproteínas 
da gema de ovo. 
47 
Tabela 16- Valores de VCL, VSL, VAP, LIN e BCF dos espermatozoides de búfalos 
congelados em diluidors Tes-Tris, e Tes-Tris base contendo 2, 4, 8 ou 14% de LDL, 
durante incubação a 37°C de 0 a 120 minutos, avaliados a cada 30 minutos. 
49 
Tabela 17- Médias (± DP) dos espermatozoides com membranas íntegras ou não 
íntegras, pelo Teste Hiposmótico e por Sondas Fluorescentes (CFDA/Pi) após o 
descongelamento, empregando diluidores contendo gema de ovo ou diferentes 
50 
concentrações de LDL, em diluidor Tes-Tris base. 
LISTA DE FIGURAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1- Representação esquemática das duas frações da gema de ovo obtida após 
centrifugação. (Fonte: Anton et al., 2009) 
12 
Figura 2- Representação esquemática da molécula de lipoproteínas de baixa 
densidade. (Fonte: http://www.dislipidemias.com.ar) 
13 
Figura 3. Demonstração dos parâmetros de motilidade fornecidos pelo CASA, em 
relação a um espermatozóide em um dado tempo. (Fonte: Corral-Baqués et al., 2009). 
28 
Figura 4- Gráfico da motilidade total dos espermatozoides de búfalos congelados em 
diluidors Diluidor comercial®, Tes-Tris e Tris-ácido cítrico, durante incubação a 37°C 
de 0 a 120 minutos, avaliados a cada 30 minutos. Letras diferentes indicam diferença 
estatística entre os tratamentos (P<0,05).39 
Figura 5- Motilidade total dos espermatozoides de búfalos congelados em diluidors 
Diluidor comercial® base, durante incubação a 37°C de 0 a 120 min, avaliados a cada 
30 minutos. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os tratamentos 
(P<0,05). 
44 
Figura 6- Gráfico da motilidade total dos espermatozoides de búfalos congelados em 
diluidors Tes-Tris base, durante incubação a 37°C de 0 a 120 min, avaliados a cada 30 
minutos. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os tratamentos (P<0,05). 
48 
 
http://www.dislipidemias.com.ar/
RESUMO 
 
O objetivo geral deste trabalho foi comparar o efeito de diferentes diluidores, constituídos por 
gema de ovo de galinha ou lipoproteínas de baixa densidade extraídos da gema de ovo, durante 
o processo de criopreservação do sêmen de touros búfalos da raça Murrah, a fim de definir qual 
fornece maior efeito protetor às características espermáticas. Esse trabalho foi dividido em três 
fases: pré-experimento, Experimento 1 e Experimento 2. O objetivo do Pré-experimento foi 
comparar três diluidores, sendo um comercial, que possuem a gema de ovo como componente 
comum. Nos Experimentos 1 e 2 comparou-se diferentes concentrações de LDL na 
criopreservaçào do sêmen bubalino quando adicionada aos diluidores escolhidos no pré-
experimento. Ejaculados de seis búfalos Murrah foram divididos e diluídos de acordo com a 
fase do trabalho: Pré-experimento – Diluidor comercial, Tes-Tris e Tris-ácido cítrico; 
Experimento 1 – Diluidor comercial completo, Diluidor comercial + 2%LDL, Diluidor 
comercial + 4%LDL, Diluidor comercial + 8%LDL, Diluidor comercial + 14%LDL; 
Experimento 2- Tes-Tris, Tes-Tris + 2%LDL, Tes-Tris + 4%LDL, Tes-Tris + 8%LDL, Tes-Tris 
+ 14%LDL. As amostras do experimentos 1 e 2 foram analisadas pelo CASA no pré-
resfriamento. Em todas as fases as amostras descongeladas foram submetidas ao teste de 
termoresistência, assistido pelo CASA, teste hiposmótico e teste de integridade de membranas 
por sondas fluorescentes (CFDA/Pi). As médias dos resultados obtidos nos três testes foram 
comparadas pelo Teste de Tukey (P<0,05). No Pré-experimento as motilidades pós-
descongelamento foram semelhantes 40,97%±14,21; 37,13%±10,12; 32,81%±11,78 
respectivamente para diluidor comercial, Tes-Tris e Tris-ácido cítrico. A partir da leitura de 30 
minutos os diluidores comercial e Tes-Tris mostraram superioridade quanto à motilidade, em 
relação ao Tris-ácido cítrico. Os valores de VCL, VSL, VAP, LIN e BCF foram maiores para o 
diluidor comercial, e semelhantes para Tes-Tris e Tris-ácido cítrico. Não houve diferença entre 
tratamentos quanto à integridade de membranas. No Experimento 1 o diluidor comercial foi 
superior para motilidade, VCL, VSL, VAP, LIN e BCF nos períodos pré-diluição, pós-
descongelamento e durante todo o TTR. A concentração de 2% de LDL teve pior efeito para 
preservar a integridade de membranas que o diluidor comercial completo. No Experimento 2 o 
Tes-Tris foi inferior a 2 e 4%LDL quanto a motilidade no pré-resfriamento. No pós-
descongelamento, quanto à motilidade o Tes-Tris foi superior (56,53%±9,73) às diferentes 
concentrações de LDL (47,16%±11,06; 45,64%±7,46; 45,71%± 6,56; 43,33%±5,97, para 2, 4, 8 
e 14%LDL). Porém durante o TTR as motilidades foram semelhantes. O Tes-Tris controle foi 
inferior a todas as concentrações de LDL para VCL, VSL, VAP, LIN e BCF, no pré-
resfriamento, pós-descongelamento e durante todo o TTR. Não houve diferença entre 
tratamentos quanto à integridade de membranas. O diluidor comercial foi mais adequado para o 
congelamento de sêmen de búfalos. As concentrações de 2, 4 e 8% de LDL, em diluidor base 
Tes-Tris, foram mais eficazes que o diluidor Tes-Tris com 20% de gema de ovo para o 
congelamento de sêmen de búfalos. 
Palavras-chave: sêmen, búfalos, Diluidor comercial, Tes-Tris, Tris-ácido cítrico, LDL 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
The aim of this study was analyze the effect of different extenders, consisting of egg yolk 
chicken or low density lipoproteins extracted from egg yolk, during the process of sperm 
cryopreservation of buffalo bulls in order to define which provides greater protective effect on 
sperm characteristics. This work was divided into three phases: Pre - experiment , Experiment 1 
and Experiment 2 . The purpose of the Pre-experiment was to compare three extenders, 
including a commercial, that have the egg yolk as a common component. In Experiments 1 and 
2 compared different concentrations of LDL in semen extenders chosen at pre - experiment. 
Ejaculates from six Murrah buffaloes were divided and diluted according to the stage: Pre- 
experiment - Diluidor comercial, Tes- Tris , Tris- citric acid; Experiment 1 – Full commercial 
extender , commercial extender + 2 % LDL, commercial extender + 4%LDL, commercial 
extender + 8 % LDL, commercial extender + 14 % LDL; Experiment 2 - Tes- Tris , Tes- Tris + 
2 % LDL, Tes- Tris + 4 %LDL , Tes- Tris + 8%LDL , Tes- Tris + 14% LDL . The samples of 
experiments 1 and 2 were analyzed by CASA in pre-cooling . At all stages thawed samples were 
submitted to the thermotolerance test , assisted by CASA , hypoosmotic test and integrity of 
membranes by fluorescent probes ( CFDA / Pi ). The average results of these three tests were 
compared by Tukey test (P < 0.05 ) . In Pre - experiment post -thaw motility were similar, 40.97 
± 14.21 , 37.13 ± 10.12 , 32.81 ± 11.78 respectively for commercial extender, Tes- Tris , Tris - 
citric acid. From reading the 30 minutes commercial extender and Tes- Tris extenders showed 
superiority for motility, compared to Tris - citric acid. The values of VCL , VSL , VAP , LIN 
and BCF were higher for full commercial extender, and similar to Tes-Tris and Tris -citric acid. 
There was no difference between treatments regarding the integrity of membranes. In 
Experiment 1 the full commercial extender was superior to the motility, VCL , VSL , VAP , 
LIN and BCF in pre – dilution, post-thawing periods and throughout the TTR . The 2%LDL 
concentration had lower effect to preserve the integrity of the membranes to full commercial 
extender. In Experiment 2 the Tes- Tris was less than 2 and 4% LDL for motility in pre-cooling. 
In the post - thaw motility the Tes- Tris was higher (56.53 ± 9.73 ) to all LDL concentrations ( 
47.16 ± 11.06 , 45.64 ± 7.46 , 45.71 ± 6 , 56; 43.33 ± 5.97 for 2 , 4, 8 and 14% LDL) . However, 
during the TTR motilities were similar between all extenders. The Tes- Tris was lower at all 
concentrations of LDL for VCL , VSL , VAP , LIN and BCF at pre -cooling, post-thaw and 
throughout the TTR . There was no difference between treatments regarding the integrity of 
membranes. The extender full commercial extender was more suitable for the freezing of 
buffalo semen. The concentrations of 2, 4 and 8% of LDL, in basic medium Tes- Tris, were 
more effective than Tes- Tris extender containing 20% of egg yolk for freezing sperm buffalo. 
Keywords: semen, buffaloes, commercial extender, Tes- Tris, Tris- citric acid, LDL. 
 
8 
 
1- INTRODUÇÃO 
A população mundial estimada de búfalo do 
Rio (Bubalus bubalis) é de 
aproximadamente 198,9 milhões de 
cabeças, das quais cerca de 97% estão na 
Ásia, e o restante se localizando 
principalmente no Mediterrâneo e América 
Latina (FAO, 2012). O rebanho brasileiro 
está estimado em torno de 1,26 milhão de 
bubalinos (FAO, 2012), sendo que 64% se 
encontram no estado do Pará. Entre 2010 e 
2011 o rebanho bubalino foi o que 
apresentou maior crescimento no Brasil, 
sendo de 7,8% contra 1,6% do rebanho 
bovino (EBC, 2012; IBGE, 2012). 
O número de adeptos à bubalinocultura 
cresce de forma rápida, o que se deve, em 
grande parte as características peculiares 
dos produtos derivados do leite e carne de 
búfalos. O leite de búfala contém maior teor 
de proteínas, vitaminas A, D e B2, além de 
lipídeos, porém com menor teor de 
colesterol (ABCB,2013), o que, entre 
outras vantagens, contribui para um maior 
rendimento na indústria de laticínios. A 
carne de búfalo por sua vez é considerada, 
quando comparada a carne bovina, tendo 
40% menos colesterol, doze vezes menos 
gorduras totais, 55% menos calorias, 11% a 
mais de proteínas e 10 % a mais de 
minerais (ABCB, 2013). 
Acompanhando esse crescimento, as 
biotecnologias desenvolvidas com o 
objetivo de aumentar a produtividade do 
rebanho são cada vez mais requeridas pelo 
campo. Dessa forma as práticas já adotadas 
em rebanhos bovinos, como a inseminação 
artificial, passam a ser empregadas também 
como forma de melhorar a qualidade dos 
rebanhos bubalinos. Para o sucesso da 
tecnologia de inseminação artificial, é 
necessário que o sêmen utilizado tenha 
máxima capacidade fertilizante, 
independente se empregado fresco, 
resfriado, ou congelado. 
Sabe-se que os processos de resfriamento e 
congelamento do sêmen causam sérios 
danos ao espermatozoide e por isso, para 
minimizar esses efeitos, é necessário que se 
apliquem protocolos e meios diluidores 
adequados (Watson, 2000). Esses 
protocolos irão variar de acordo com as 
características intrínsecas do sêmen da 
espécie em questão, pois existem variações 
de perfil de lipídeos, concentrações de sais, 
entre outros, no plasma seminal e 
membranas espermáticas que 
proporcionarão exigências diferentes entre 
as espécies. 
Durante um longo período, e de certa forma 
ainda hoje, o sucesso da fertilização 
artificial em bubalinos foi comprometido 
pelos protocolos aplicados, uma vez que 
esses eram os mesmos aplicados aos 
bovinos (Vale, 2011). As características do 
sêmen da espécie são diferentes, e por isso 
protocolos específicos devem ser testados, 
visando maiores resultados quanto às taxas 
de fertilidade a campo. 
Outro fato relacionado à tecnologia de 
congelamento de sêmen é o emprego de 
produtos de origem animal em meios 
extensores, para garantir uma melhor 
proteção dos espermatozoides ao choque 
frio. Porém esses produtos podem estar 
relacionados ao transporte de patógenos, 
sobretudo vírus e bactérias (Bousseau et al., 
1998). Por isso, tem-se buscado encontrar 
alternativas viáveis para a gema de ovo, 
como produtos de origem vegetal, a lecitina 
de soja, ou subprodutos purificados da 
gema de ovo, as lipoproteínas de baixa 
densidade da gema. 
Vários estudos têm sido conduzidos no 
intuito de confirmar o papel das 
lipoproteínas de baixa densidade extraídas 
da gema de ovo na proteção da membrana 
espermática contra o choque térmico, bem 
como seu mecanismo de ação e as 
concentrações necessárias, no diluidor, para 
que se tenha o efeito desejado. 
9 
 
Por isso, propôs-se a realização de um 
trabalho para testar a interação do sêmen de 
búfalos Murrah com diferentes diluidores, 
comerciais ou não, bem como o efeito 
desses diluidores quando a gema de ovo 
integral foi substituída por lipoproteínas de 
baixa densidade, extraídas da gema de ovo. 
Também se buscou identificar, em caso de 
efeitos positivos, qual a concentração de 
lipoproteína mais indicada para ser 
empregada no congelamento de sêmen de 
búfalos. 
1.1- Objetivo geral 
Comparar o efeito de diferentes diluidores, 
constituídos por gema de ovo de galinha ou 
lipoproteínas de baixa densidade extraídos 
da gema de ovo, durante o processo de 
criopreservação do sêmen de touros búfalos 
da raça Murrah, a fim de definir qual 
fornece maior efeito protetor às 
características espermáticas. 
1.2- Objetivos específicos 
- Pré-experimento: comparar a eficácia de 
três diluidores produzidos com 20% de 
gema de ovo integral (Diluidor comercial, 
Tes-Tris e Tris-ácido cítrico) na 
criopreservação de espermatozoides de 
búfalos submetidos ao congelamento e 
descongelamento; 
- Experimento 1: comparar o efeito da 
substituição da gema de ovo, no diluidor 
comercial, por 2, 4, 8 ou 14% de 
lipoproteínas de baixa densidade extraídas 
da gema de ovo, sobre as características 
cinéticas dos espermatozóides de búfalos 
antes do resfriamento; 
- Experimento 1: comparar o efeito da 
substituição da gema de ovo, no diluidor 
comercial, por 2, 4, 8 ou 14% de 
lipoproteínas de baixa densidade extraídas 
da gema de ovo, sobre a longevidade da 
motilidade e parâmetros CASA do 
espermatozoide descongelado, e integridade 
de membranas; 
- Experimento 2: comparar o efeito da 
substituição da gema de ovo, no diluidor 
Tes-Tris, por 2, 4, 8 ou 14% de 
lipoproteínas de baixa densidade extraídas 
da gema de ovo, sobre as características 
cinéticas dos espermatozoides de búfalos 
antes do resfriamento; 
- Experimento 2: comparar o efeito da 
substituição da gema de ovo, no diluidor 
Tes-Tris, por 2, 4, 8 ou 14% de 
lipoproteínas de baixa densidade extraídas 
da gema de ovo, sobre a longevidade da 
motilidade e parâmetros CASA do 
espermatozoide descongelado, e integridade 
de membranas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 
 
2- REVISÃO DE LITERATURA 
2.1- Bases da criopreservação de gametas 
masculinos 
Os espermatozoides são formados pelos 
túbulos seminíferos dos testículos, e 
apresentam-se divididos em cabeça 
(envolvida na interação espermatozoide-
oócito), peça intermediária (envolvida na 
produção de energia) e cauda (envolvida na 
motilidade). Todo o espermatozoide de 
mamíferos é recoberto por membrana 
plasmática, sendo que na região anterior da 
cabeça, situa-se o acrossoma, estrutura de 
parede dupla que contém os grânulos 
responsáveis pela digestão enzimática da 
zona pelúcida (Flesh e Gadella, 2000; 
Hafez e Hafez, 2004). 
A estrutura básica da membrana plasmática 
é o dito “mosaico fluido”, onde há uma 
dupla camada de glico e fosfolipídeos 
entremeados por moléculas de proteína e 
colesterol. A fluidez da membrana é 
determinada pela sua composição lipídica, 
sendo que quanto mais cadeias saturadas 
maior será a rigidez e maior a temperatura 
de fusão. O colesterol é também 
considerado um elemento regulador da 
fluidez da membrana, uma vez que ele 
mantém os fosfolipídeos desagrupados 
(Singer e Nicolson, 1972 citado por Valle e 
Silva Filho, 2001). 
Durante o resfriamento, os lípedes da 
membrana passam pela fase de transição, 
podendo alguns segmentos (em caso de 
resfriamento inadequado) passar da forma 
fluida para a cristalina. Por esse motivo há 
um deslocamento das proteínas intrínsecas 
da membrana para as regiões fluidas 
remanescentes permitindo que as cadeias de 
ácidos graxos poliinsaturados formem uma 
micela invertida, com as cabeças 
hidrofóbicas voltadas para a superfície 
externa. Dessa forma podem ser formados 
canais hidrofílicos pelos quais passariam 
íons e pequenas moléculas (Amann e 
Pickett, 1987 citado por Valle e Silva Filho, 
2001). 
A composição lipídica da membrana pode 
afetar a sobrevivência espermática, e 
principalmente, diferenças na composição 
de ácidos graxos e nas concentrações de 
colesterol têm sido associadas à tolerância 
ao choque térmico (Neves, 2008). 
Para evitar esses e outros danos à 
membrana espermática e manter os 
espermatozoides armazenados por períodos 
maiores, durante a criopreservação do 
sêmen, é necessária a adição de uma 
solução protetora. Diferentes soluções têm 
sido utilizadas como diluentes, a maioria 
das quais são variações de poucas fórmulas 
principais (Hafez e Hafez, 2004). 
Os diluidores devem ser capazes de 
proteger as diferentes estruturas do 
espermatozoide em todas as etapas do 
processo de criopreservação. Portanto, em 
sua composição deve haver substâncias que 
garantam pH (soluções tampões), 
osmolaridade (crioprotetores), nutrição 
adequada (substâncias energéticas) e 
interrupção do crescimento bacteriano 
(antibacterianos) (Holt, 2000). 
Os crioprotetores podem ser classificados 
como penetrantes ou não penetrantes de 
acordo com sua capacidade de atravessar as 
membranascelulares (Hammerstedt, 1990). 
Glicerol e outras substâncias como metanol, 
etilenoglicol, 1,2-propanodiol, butanodiol, 
acetamida e DMSO são enquadrados como 
penetrantes, pois agem no interior da célula. 
O efeito protetor do glicerol nos 
espermatozoides parece estar associado as 
suas propriedades coligativas, a redução do 
ponto de congelamento e a conseqüente 
redução da concentração de eletrólitos na 
fração não congelada da célula. Isto 
ajudaria a conter o prejudicial “efeito 
solução”, que é causado pelo aumento da 
pressão osmótica no meio extracelular, em 
função da concentração de solutos na 
11 
 
porção de água ainda não congelada, que 
ocorre durante o processo de congelamento 
(Holt, 2000). Ou seja, o glicerol penetrando 
na célula, provoca rápida saída da água 
intra-celular seguido de lento retorno do 
volume interno inicial. 
O grupo dos crioprotetores não penetrantes 
inclui as proteínas, açúcares de elevado 
peso molecular, polivinilpirrolidona, entre 
outros, que atuam através de mecanismo 
osmótico promovendo a desidratação 
celular, durante o congelamento e 
impedindo a formação de grandes cristais 
de gelo no interior da célula, por restaurar o 
percentual de água ao redor dos grupos 
polares da cabeça dos fosfolipídios (Holt, 
2000). 
Vishwanath e Shannon (2000) citam a 
importância da descoberta de Phillips 
(1939) quando este observou que a adição 
de gema de ovo ao diluidor do sêmen teve 
um efeito benéfico sobre o potencial de 
fertilização do sêmen resfriado. Acreditava-
se que a gema fornecesse proteção ao 
espermatozoide através da diminuição dos 
efeitos negativos do choque frio ao 
estabilizar as membranas espermáticas 
(Holt, 2000). 
A partir de então a grande maioria dos 
diluidores passaram a conter a gema de ovo 
como principal constituinte (Pace e 
Graham, 1974; Cookson et al., 1984). 
Porém, por se tratar de um produto de 
origem animal, várias desvantagens podem 
ser associadas ao uso da gema integral. 
Uma delas é a falta de padronização dos 
seus componentes, uma vez que eles podem 
variar de acordo com a nutrição e idade da 
ave (Anton et al, 2003). Outro importante 
fator é o risco potencial de contaminação do 
sêmen com bactérias, micoplasmas ou 
mesmo vírus. 
Para avaliar a contaminação de diluidores 
comerciais a base de gema de ovo, e 
também leite, Bousseau et al. (1998) 
realizaram testes microbiológicos, 
encontrando considerável contaminação, 
independente da presença de antibióticos na 
composição. Porém, independente desta 
contaminação os autores não encontraram 
diferenças significativas quanto ao 
potencial fertilizante das amostras 
congeladas com diluidores a base de gema 
ou leite (avaliação de taxa de clivagem, em 
fertilização in vitro e taxa de não retorno ao 
cio em vacas inseminadas). 
Outro inconveniente associado a alguns 
componentes da gema de ovo, presentes na 
porção dialisada da gema, causariam uma 
redução/inibição da respiração espermática 
e sua motilidade. Essa ação foi atribuída ao 
peróxido de hidrogênio, formado pela 
deaminação oxidativa, pelo 
espermatozoide, de substratos presentes na 
porção dialisada da gema (Tosic e Walton, 
1950). 
Pelos motivos expostos, foram reforçadas 
as pesquisas para identificar qual a fração 
da gema seria responsável pela 
crioproteção, a fim de purificá-la e usá-la 
em substituição a gema integral em meios 
diluidores para criopreservação do sêmen. 
2.3- As lipoproteínas de baixa densidade 
e sua aplicação para a 
criopreservação 
2.2.1- Caracterização das lipoproteínas de 
baixa densidade 
A gema corresponde a 36% do peso total do 
ovo de galinha. Em matéria seca representa 
entre 50-52%, dependendo da idade da ave 
e do tempo de armazenamento. Em termos 
de matéria seca, a gema de ovo é 
constituída por 66% de lipoproteínas de 
baixa densidade, 10% de livetinas, 16% de 
lipoproteínas de alta densidade, 4% de 
fosvitina e 4% de outros componentes 
(Powrie e Nakai, 1986). Os lipídeos são 
compostos de mais de 62% triglicérides, 
33% fosfolípedes e menos de 5% colesterol. 
12 
 
Os carotenóides representam menos de 1% 
dos lipídeos da gema (Anton et al., 2009). 
A gema pode ser facilmente dividida em 
duas frações depois da diluição com NaCl 
0,3M e centrifugação a 10.000g, quando 
poderão ser notados o plasma (fluido 
amarelo, constituído por 85% de 
lipoproteínas de baixa densidade - LDL e 
15% de livetinas) e o grânulo/agregados 
(constituídos por 70% de lipoproteínas de 
alta densidade - HDL e 16% de fosvitina 
ligadas fortemente por pontes de fósforo-
cálcio) (McBee e Cotterill, 1979; Jolivet et 
al., 2006) (Fig. 1). 
 
Figura 1- Representação esquemática das duas 
frações da gema de ovo obtida após 
centrifugação. (Fonte: Anton et al., 2009) 
As proteínas da gema (solúveis ou 
embebidas em estruturas de lipoproteínas) 
são derivadas das proteínas maternas 
séricas, e são sintetizadas no fígado, 
internalizadas por oócitos em crescimento 
por endocitose mediada por receptores, e 
parcialmente processadas. As lipoproteínas 
de muito baixa densidade da gema, que 
aumentam em quantidade no sangue 
durante a fase de maturidade sexual da 
fêmea (devido à secreção de estrógenos), 
são os precursores das lipoproteínas de 
baixa densidade da gema de ovo. As 
principais apoproteínas da lipoproteína de 
muito baixa densidade são a apovitelina 1 e 
a apo-B (similar a apolipoproteína B-100 
humana) (Jolivet et al., 2006). A essa última 
é atribuída a responsabilidade pelo 
reconhecimento das lipoproteínas pelos 
receptores específicos e subsequente 
controle de seu metabolismo (Kuksis, 
1992). 
As lipoproteínas de baixa densidade (LDL) 
são partículas esféricas, com diâmetro 
variando de 17 a 60 nm, com um núcleo 
lipídico em estado líquido (triglicérides e 
ésteres de colesterol) envolvido por uma 
monocamada de fosfolípedes radialmente 
orientados, com sua cabeça polar e as 
cadeias de proteínas localizadas nas regiões 
periféricas da proteína (Kamat e Lawrence, 
1971; Evans et al., 1973) (Fig. 2). A 
microscopia eletrônica e a difração por raio-
X reforçam o conceito de estrutura em 
mosaico da superfície da partícula de LDL, 
na qual as proteínas e os lipídeos recobrem 
áreas separadas da superfície e não formam 
associações fortes umas com as outras (não 
estáveis) (Holdsworth e Finean, 1972). 
Como os núcleos lipídicos dessas moléculas 
são encontrados de vários tamanhos, 
observa-se uma heterogeneidade quando da 
purificação das moléculas de lipoproteína 
por pesos moleculares (ultracentrifugações, 
cromatografia) (Evans et al., 1973). 
As LDLs são solúveis em soluções aquosas, 
independente das condições de pH e 
iônicas, devido a sua baixa densidade 
(0,982). São compostas por 11-17% de 
proteínas e 83-89% de lipídeos, dos quais 
74% são lipídeos neutros e 26% 
fosfolípedes (Martin et al., 1964; Steer, 
Martin e Cook, 1968). 
Os dois fosfolípedes encontrados em grande 
quantidade na LDL da gema de ovo, após 
passagem em coluna de sílica, são 
fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina 
(Anton et al., 2003). 
13 
 
 
Figura 2- Representação esquemática da 
molécula de lipoproteína de baixa densidade. 
(Fonte: http://www.dislipidemias.com.ar) 
As LDLs são responsáveis pela geleificação 
do ovo durante o tratamento térmico ou no 
processo de congelamento-
descongelamento, enquanto que os outros 
componentes da gema não participam 
diretamente. A geleificação ocorre quando, 
pelo calor ou frio, a estrutura da molécula 
da lipoproteína se rompe, rompendo 
também as ligações lipídeos-proteína e 
aumentando as ligações proteína-proteína. 
Os principais constituintes dessas ligações 
são apoproteínas, que possuem grande parte 
dos aminoácidos hidrofóbicos, favorecendo 
a formação dos géis (Anton et al., 2009). 
As primeiras metodologias para separação 
das lipoproteínas debaixa densidade da 
gema de ovo de galinha consistiam na 
realização de diversas ultracentrifugações, 
por longos períodos (30 a 40 horas), 
intercaladas ou não por diluição em solução 
de baixíssima densidade (principalmente 
soluções de cloreto de sódio). Porém, como 
nem todos os laboratórios dispunham de 
tais equipamentos, Raju e Machadevan 
(1974) propuseram como alternativa a 
separação por cromatografia. Nesse 
trabalho as lipoproteínas de muito baixa 
densidade foram obtidas em 4 passos: 
centrifugação da gema diluída com água 
destilada (60 min); adição de sulfato de 
amônio e solução de NaCl seguido de 
centrifugação (60 min); adição de mais uma 
parte de sulfato de amônio com nova 
centrifugação (30 min); a fração flutuante 
foi então dissolvida em tampão TRIS-HCl 
com EDTA, dialisada e submetida à coluna 
cromatográfica de DEAE- celulose. Os 
produtos obtidos desse processo 
apresentavam quantidades de fosfolipídeos 
e proteínas semelhantes àqueles obtidos por 
ultracentrifugação, permanecendo porém 
uma pequena contaminação de livetinas. 
2.2.2- Novos protocolos para extração das 
lipoproteínas da gema de ovo 
Durante muitos anos as metodologias 
empregadas para a separação das 
lipoproteínas oriundas da gema de ovo 
permaneceram baseadas em 
ultracentrifugações e/ou utilização de 
colunas cromatográficas. Porém esses 
métodos demandavam longos períodos de 
produção e proporcionavam uma baixa 
recuperação de lipoproteína (Moussa et al., 
2002). 
 Por esse motivo Moussa et al. (2002) 
propuseram um método de extração em que 
são realizadas centrifugações brandas 
favorecendo o gradiente de densidade e 
precipitação em sulfato de amônio para 
remoção de proteínas contaminantes. Após 
uma eficiente diálise, para remoção do 
sulfato de amônio, uma LDL 97% pura é 
obtida após uma última centrifugação. O 
rendimento dessa forma de extração foi é 
67%, em função da matéria seca. 
Para o congelamento de sêmen bovino, 
Moussa et al. (2002) usaram a LDL (em 
diferentes concentrações) em substituição a 
gema de ovo em diluidor comercial 
Triladyl®. Eles encontraram que quanto à 
característica do movimento dos 
espermatozoides congelados e 
descongelados, os diluidores que continham 
de 5 a 10% de LDL foram superiores ao 
controle (20% de gema de ovo), sobretudo 
14 
 
quando se utilizou concentração de 8% 
(p/v). 
Com base no conhecimento da 
gelatinização das lipoproteínas, sobretudo 
abaixo de -6°C (Anton et al., 2009), 
Moussa et al. (2002) também sugerem que 
essa gelatinização em torno do 
espermatozoide possa protegê-lo da 
formação de cristais de gelo durante o 
processo de congelamento. 
Visando aumentar a eficiência da extração 
das LDL da gema de ovo pelo protocolo 
proposto por Moussa et al. (2002), Neves 
(2008) testou a adição de diferentes 
concentrações de sulfato de amônio ao 
plasma de gema (após centrifugação). Para 
isso a autora se utilizou de soluções 
saturadas de sulfato de amônio, adicionadas 
ao plasma a 4°C. A partir da eletroforese e 
teor de lipídeos, sugeriu-se que a solução 
saturada a 50% de sulfato de amônio 
adicionada ao plasma resultaria em uma 
melhor purificação das lipoproteínas de 
baixa densidade extraídas da gema de ovo. 
Uma nova forma de extração de 
lipoproteínas proposta por Laca et al. 
(2010) (que investigam as lipoproteínas 
pelo seu poder emulsificante, para a 
indústria alimentícia) envolve a diluição da 
gema em água, apenas uma centrifugação e 
adição de solução de alginato de sódio a 
1%. Após mais uma curta centrifugação são 
obtidas as lipoproteínas de baixa densidade 
(chamada pasta lipídica). No perfil 
eletroforético da fração de lipoproteína se 
observam pesos moleculares de 175, 137, 
60-70 Da, correspondentes a apoproteínas 
presentes na LDL, muito semelhante ao 
perfil eletroforético encontrado por outros 
autores (Moussa et al., 2002; Neves, 2008). 
Porém apresentou também uma 
contaminação com apoproteína de HDL 53 
Da. 
 
2.2.3- Mecanismos de ação das LDL para 
criopreservação de espermatozoides 
Uma vez comprovado que a gema de ovo 
seria o agente crioprotetor principal, Pace e 
Graham (1974) buscaram identificar qual a 
fração da gema estaria relacionada a essa 
ação, sobre o espermatozoide bovino. 
Foram feitas centrifugações e diluições da 
gema em NaCl obtendo-se como resultado: 
fração de baixa densidade e fração solúvel 
em água, além da fração granular. Quanto à 
capacidade de proteção ao frio, a fração 
granular apresentou os piores resultados, 
sendo seguida pela fração solúvel em água. 
Já a fração de baixa densidade crua 
apresentou os mesmos resultados que os 
obtidos pela gema integral. 
Dentro da fração de lipoproteína foi 
observado que havia grande variação 
quanto ao peso molecular, o que poderia 
contribuir para a variação entre trabalhos. 
Estimulados por esse problema, Martin et 
al. (1964) buscaram metodologias para 
purificar essa fração de baixa densidade, 
fracionando-a em duas afim de caracterizar 
cada uma quanto ao peso molecular, 
conteúdo de lipídeos e outras propriedades. 
Eles empregaram técnicas de ultra-
centrifugação, por várias horas, e em 
colunas de cromatografia, Biogel A50 e 
Sephadex G-200. O conteúdo lipídico das 
duas frações foi similar, e constituído 
principalmente por fosfolípedes, com baixa 
concentração de proteína. Quanto ao peso 
molecular a fração 1 (supernadante) foi de 
10,3 x 106 Da e a fração 2 (subnadante) foi 
de 3,3 x 106 Da. Apesar dessas diferenças, 
Pace e Graham, 1974, empregando 
metodologia similar, observaram que 
quanto a capacidade de proteger a 
motilidade espermática pós-
descongelamento, não haviam diferenças 
significativas entre as duas frações obtidas 
da LDL. 
Para avaliar a atividade de preservação da 
fração de lipoproteína de baixa densidade 
15 
 
da gema de ovo, Watson (1976) 
criopreservou espermatozoides de carneiros 
e touros usando diluidores que continham a 
LDL como substituto da gema de ovo. Mais 
uma vez o que se observou foi que a LDL 
tinha um potencial de preservação similar 
ao da gema de ovo, quando considerada a 
motilidade pós-descongelamento. 
Entretanto, quando a lipoproteína foi 
liofilizada, se observou perda do seu 
potencial, mas ainda assim mantendo uma 
capacidade de proteção considerável. 
Foulkes (1977) utilizou a metodologia de 
ultracentrifugação em altas concentrações 
de sais inorgânicos e posterior separação 
por coluna de cromatografia de agarose 
para a separação de frações purificadas de 
lipoproteínas da gema de ovo de galinha. 
Essas frações foram investigadas quanto a 
seu efeito sobre a motilidade do 
espermatozoide de bovino criopreservado. 
Além disso, foi estudada a ligação do 
espermatozoide à lipoproteína por meio de 
gema de ovo marcada com radiação. 
O pesquisador encontrou, após a passagem 
do extrato de lipoproteínas de baixa 
densidade em coluna de cromatografia 
Sepharose 2B, três frações distintas. As 
duas primeiras continham maior razão 
lipídeo:proteína, e a terceira era composta 
pela maior parte dos lipídeos presentes na 
lipoproteína de baixa densidade inicial. 
Porém quanto aos tipos de lipídeos essas 
frações não apresentavam diferenças 
significativas. Ao se acrescentar cada uma 
das frações ao diluidor citrato o que se 
observou foi que o gema/glicerol 
proporcionou maior proteção geral e que a 
terceira fração de lipoproteínas foi a mais 
efetiva das frações de lipoproteína 
(motilidade pós- descongelamento de 28 e 
30%, respectivamente). 
A partir desses achados o autor destaca que 
seria então possível a substituição da gema 
de ovo integral por apenas essa fração da 
lipoproteína. 
O autor também destacou que é muito 
difícil determinar quimicamente se ocorre 
uma ligação dos lipídeos da gema na 
membrana do espermatozoide ou 
incorporação dos mesmos ou se essas 
moléculas seprendem apenas entre as 
células, uma vez que qualitativamente o 
conteúdo lipídico é muito similar. Indícios 
de que há ligação de componentes da gema 
ao espermatozoide foram dados ao se 
acrescentar ao sêmen diluidor contendo 
gema radioativamente marcada. Após 
sucessivas lavagens ainda foi possível notar 
radioatividade na membrana espermática, 
sem, no entanto, ser possível a identificação 
específica de qual tipo de lipídeo estaria 
associado. Além disso, a emissão de 
radiação foi maior quando usado no 
diluidor apenas o sobrenadante oriundo da 
ultracentrifugação da gema, reforçando a 
idéia do papel das lipoproteínas de baixa 
densidade. 
No mesmo ano, Foulkes e Stewart (1977) 
testaram a fertilidade in vivo do sêmen 
diluído em diluidores contendo a terceira 
fração da lipoproteína de baixa densidade 
(10 mg de proteína/mL) comparando com 
aqueles contendo 20% de gema.Para isso 
foram usadas 1.782 (99/grupo) vacas 
Friesian, não selecionadas, inseminadas 
apenas uma vez e monitoradas quanto ao 
retorno ao cio em 16 semanas. O que se 
observou foi que não houve diferenças entre 
as taxas de não retorno das vacas, 
independente do diluidor empregado, 
reforçando que as lipoproteínas 
desempenham também papel protetor 
durante os processos de resfriamento e 
congelamento. 
Uma vez tendo comprovada a eficácia da 
utilização de lipoproteínas de baixa 
densidade em substituição a gema integral 
para preparação de diluidores para sêmen, 
intensificou-se a busca para comprovar 
como e se acontecia interação entre esses 
lipídeos e o espermatozoide (Foulkes, 1977; 
MacDonald e Foulkes, 1981; Quinn et al., 
16 
 
1980; Cookson et al., 1984; Vishwanath et 
al., 1992; Manjunath et al., 2002; Moussa et 
al., 2002; Bergeron et al., 2004). 
Aproveitando-se da forte ligação de alguns 
corantes fluorescentes à membrana 
plasmática do espermatozoide, MacDonald 
e Foulkes (1981) utilizaram o corante 1-
anilino-naphthalene-8-sulphonate (ANS) 
para investigar o local de interação dos 
componentes de uma fração das 
lipoproteínas de baixa densidade (com 
eficácia na criopreservação de gametas 
comprovada por Foulkes, 1977 e Foulkes e 
Stewart, 1977) com o espermatozoide de 
touros. 
Ao incubar a fração da lipoproteína da 
gema de ovo com espermatozoides (na 
ausência de plasma seminal) na presença de 
ANS o que se observou foi um aumento na 
fluorescência, que foi atribuída a um 
aumento do número de sítios de ligação do 
corante à membrana, aumento da afinidade 
dos sítios existentes, ou uma combinação de 
ambos os mecanismos. A partir destes 
resultados os autores reforçaram a 
afirmação de que as lipoproteínas exerciam 
sua função crioprotetora ao estabilizar a 
membrana do espermatozoide durante o 
processo de congelamento e 
descongelamento. 
Quinn et al. (1980) investigaram como os 
fosfolípedes externos, presentes na gema de 
ovo adicionada aos diluidores, 
proporcionavam proteção às células 
espermáticas contra o choque frio. Em seu 
estudo as hipóteses levantadas foram de 
uma possível fusão das vesículas dos 
fosfolípedes ou interpolação de fosfolípedes 
individualmente dentro da membrana 
plasmática aumentando as razões 
fosfolípes: proteína: colesterol ou alterando 
a razão de lipídeos poliinsaturados: 
saturados da membrana. Outra hipótese 
seria de que esses fosfolípedes externos 
interagiam de forma reversível com a 
superfície da membrana, causando um 
rearranjo dos seus constituintes. Este estudo 
confirmou a proteção contra o choque frio 
proporcionado pela adição de fosfolípedes 
ao diluidor, porém essa proteção 
desapareceu quando a mistura foi “lavada”, 
mostrando que a ligação dos lipídeos 
externos com a membrana plasmática seria 
fraca e removível. 
O método de anticorpo marcado por enzima 
também foi empregado a fim de explicar 
como ocorre o processo de proteção pela 
lipoproteína da gema de ovo. Foram 
produzidos anti-corpos específicos anti - 
fração 3 da lipoproteína (Foulkes, 1977), 
em coelhos. Esses anticorpos foram 
incubados com solução contendo 
espermatozoides bovinos e diluidor com 
lipoproteína. Como resultado, os 
pesquisadores encontraram uma forte 
ligação dos anticorpos anti-lipoproteína à 
membrana espermática, além de mostrarem 
que se ligava aos espermatozoides 
individualmente (marcação concentração 
espermática dependente) (Cookson et al, 
1984). 
Na década de 80 o grupo de pesquisa de 
Shannon (citado por Vishwanath et al., 
1992) assinalaram para a existência de um 
grupo de peptídeos catiônicos no plasma 
seminal que ao se ligarem à membrana do 
espermatozoide, que possui carga negativa, 
causariam uma desestabilização dessa 
membrana. Por esse motivo esses 
pesquisadores acreditaram que uma das 
formas de proteção contra o choque frio e 
armazenamento das células espermáticas à 
temperatura ambiente, através do emprego 
da gema de ovo ou leite, seriam exercidos 
por peptídeos catiônicos presentes nesses 
compostos. Vishwanath et al. (1992) 
comprovaram os efeitos positivos do 
extrato catiônico da gema de ovo sobre a 
sobrevivência a temperatura ambiente e 
após o choque frio e sobre a manutenção da 
fertilidade de espermatozoides bovinos. 
Eles reiteraram que o efeito deveria ser 
exercido por uma forte ligação à membrana 
17 
 
plasmática, mas também por competição 
com componentes do plasma seminal. 
Mais tarde, um grupo de proteínas presentes 
em abundância no plasma seminal de 
bovinos, as ditas proteínas do plasma 
seminal (BSPs), foram relacionadas como 
um fator prejudicial para o armazenamento 
dos espermatozoides bovinos, quer seja a 
temperatura ambiente quer seja 
resfriado/congelado. Foi descrito que as 
BSP estimulam o efluxo de colesterol e 
fosfolípedes da membrana, tornando-a mais 
susceptível a injúrias durante os processos 
de criopreservação (Thérien et al., 1999; 
Manjunath e Therien, 2002). 
Homólogos das proteínas BSP são descritos 
também no plasma seminal de outras 
espécies como bisão, eqüinos, ovinos, 
caprinos (20-30% do total de proteínas) e 
suínos (próximo a 1% do total), variando 
quanto a quantidade no plasma seminal, 
sendo que essa variação pode implicar na 
resposta ao processo de armazenamento das 
células espermáticas (Manjunath, 2012). 
Contudo comprovou-se que as ações 
fisiológicas das BSP são tempo e 
concentração dependentes (Manjunath et 
al., 2002). Assim sendo uma das formas de 
proteção exercida pela gema de 
ovo/lipoproteínas de baixa densidade da 
gema de ovo, quando adicionadas aos 
diluidores, seria a de impedir a função das 
BSP, preservando a integridade da 
membrana plasmática do espermatozoide 
(Manjunath et al., 2002). 
A ligação das proteínas BSP ao 
espermatozoide ocorre de forma gradual, 
estando o sêmen diluído ou não. Entretanto, 
no sêmen diluído com meios contendo 
gema a ligação de proteínas BSP é 50 a 
80% menor. Considerando que as LDL são 
o único componente da gema que se liga 
especificamente às proteínas BSP 
(Manjunath et al., 2002), então as LDL são 
ditas as responsáveis por prevenir a ligação 
das proteínas BSP ao espermatozoide 
durante a diluição (Bergeron et al., 2004). 
Estimou-se que 104 moléculas de BSP1 
podem se ligar a uma partícula de LDL, 
sendo que os principais sítios de ligação 
seriam as fosfatidilcolinas (Lusignan et al., 
2011). 
Quando existe a presença de gema de ovo 
no diluidor, foi observado um ganho de 
lipídios pelos espermatozoides. Com base 
nesses achados Bergeron et al. (2004) 
reforçaram a idéia de que o colesterol e os 
fosfolípides colina da gema de ovo são 
adicionados ao espermatozoide, ou mesmo 
a molécula inteira de LDL se liga ao 
espermatozoide durante a incubação do 
sêmen diluído com gema de ovo ou com a 
LDL derivada da gema. 
Porém os mesmos autores também 
destacam que esse ganho de lipídeos é 
maior quando o sêmen diluído é incubadoa 
37°C que quando permanece a 4°C. Eles 
atribuem esse comportamento à fase de 
transição que ocorre nas membranas 
biológicas durante o resfriamento. Nessa 
fase elas se tornam menos fluidas e, 
portanto menos susceptíveis às trocas 
lipídicas. É possível que, associado a esse 
comportamento, um filme de fosfolípides 
da molécula de LDL formado sobre a 
membrana do espermatozoide previna 
parcialmente as trocas de lipídeos. 
Como base em todas as pesquisas descritas 
seria possível dizer que há um conjunto de 
ações atribuídas à LDL que resultam na 
proteção da célula espermática durante os 
processos de criopreservação. 
2.2.4- Emprego das LDL no congelamento 
de espermatozoides de mamíferos 
Uma vez tendo-se a comprovação, por 
diversas pesquisas, da eficácia no emprego 
das LDL em substituição da gema de ovo 
em diluidores usados para preservação de 
sêmen de diversas espécies, os trabalhos 
18 
 
atuais tem focado na identificação de uma 
concentração ideal de lipoproteínas que 
teria o melhor efeito protetor final, com 
base em estudos in vitro e in vivo (Moussa 
et al., 2002; Yamauchi et al., 2009; 
Moustacas et al., 2011; Dong et al., 2011; 
Akther et al., 2011; El-Sharawy et al., 
2012). 
Para avaliar o efeito das lipoproteínas, bem 
como qual a sua concentração ideal para a 
utilização na criopreservação do sêmen de 
suínos, Yamauchi et al. (2009) compararam 
diluidores contendo 20% de gema de ovo, 
com outros contendo 2, 4, 6, 8 ou 10% de 
LDL. Nas concentrações de 4 e 6% foi 
observado maior concentração de colesterol 
na membrana do espermatozoide, além de 
melhores parâmetros cinéticos pós-
descongelamento. Nesse estudo, foi 
observada importante interação entre o 
tratamento de LDL e o indivíduo, o que 
pode indicar que o efeito protetor da LDL 
pode variar de acordo com o animal. 
Sugeriu-se que essa observação poderia ser 
atribuída a diferenças no conteúdo de 
ácidos graxos e níveis de esteróides 
presentes na membrana. 
Em sêmen de ovinos, Moustacas et al. 
(2011) encontraram, comparando diluidores 
a base de gema de ovo integral ou de 8 a 
20% de LDL natural ou liofilizada, que os 
resultados in vitro para os parâmetros 
cinéticos e estruturais do espermatozoide 
foram similares para os diluídos em meios 
contendo gema ou LDL natural. Porém a 
lipoproteína liofilizada não foi capaz de 
proteger os espermatozoides contra os 
danos da criopreservação. 
Dong et al. (2011) testaram as LDL na 
diluição do sêmen de macacos, nas 
concentrações de 10 a 30% e depois de 2 a 
10%, em comparação com diluidores a base 
de gema integral e a base de HDL. Eles 
também não encontraram superioridade nos 
resultados pós-descongelamento em sêmen 
diluído com gema ou LDL. Quanto a HDL, 
os autores afirmaram que elas teriam um 
papel neutro na criopreservação dos 
espermatozoides de macacos. Assim sendo, 
os autores acenam para possíveis vantagens 
de se utilizar a gema integral, tais como a 
presença de fatores antioxidantes (vitaminas 
A e E), luteína e outros aminoácidos. 
Em búfalos dois trabalhos podem ser 
citados empregando as LDL em 
substituição a gema de ovo. Akhter et al. 
(2011) testaram concentrações de 2,5 a 15% 
de LDL e encontraram que os meios 
contendo 10% de lipoproteínas preservaram 
melhor os parâmetros espermáticos pós-
descongelamento que as demais 
concentrações e também que os que 
continham 20% de gema de ovo, bem como 
apresentou maiores taxas de fertilidade. De 
forma semelhante El-Sharawy et al. (2012) 
encontraram os melhores resultados, in 
vitro pós-descongelamento e taxas de 
fertilização in vivo, para a concentração de 
12% de LDL. 
Em bovinos, Hong Hu et al. (2011) 
aplicaram concentrações de 7, 8 ou 9% para 
avaliar a motilidade pós-descongelamento e 
a atividade anti-oxidante do sêmen de 
touros congelado. A concentração de 8% 
exibiu os maiores valores de motilidade, 
integridade de acrossoma e integridade de 
membrana, além disso houve maior 
atividade anti-oxidante da catalase, 
glutationa reduzida e glutationa peroxidase. 
Já foram também testadas associações da 
LDL com outros componentes, como 
açucares, antioxidantes e aminoácidos. 
Amirat-Briand et al. (2009) mostraram que 
a adição de 10mM de glutamina a 
diluidores contendo 8% de LDL para o 
congelamento de sêmen de touros levou a 
um significativo aumento da motilidade 
pós-descongelamento. No ano seguinte 
Amirat-Briand et al. (2010) empregaram 
diluidores contendo 8% de LDL em sêmen 
de touros, para inseminação artificial. Eles 
não encontraram diferenças significativas 
19 
 
entre as taxas de gestação dos animais 
inseminados com diluidores contendo LDL 
ou gema de ovo. 
Existem vários diluidores comerciais 
disponíveis para utilização, sobretudo, em 
bovinos. Alguns desses diluidores tem por 
base a gema de ovo ou lecitinas extraídas da 
soja, como componentes crioprotetores. 
Beran et al. (2013) testaram a adição, nos 
meios Andromed® e Bioxcell®, ou 
substituição da gema, no diluidor 
Triladyl®, por 4, 6 e 8% de LDL, 
respectivamente. Nesse estudo os autores 
submeteram o sêmen diluído de búfalos a 
um choque térmico até 0°C, posteriormente 
as amostras foram reaquecidas e avaliadas 
quanto a porcentagem de células vivas até 
duas horas após o procedimento. Não foram 
encontradas vantagens para a adição de 
LDL nesse estudo. 
Em linhas gerais, vasta literatura defende 
que a substituição da gema de ovo pelas 
lipoproteínas em meios diluidores para 
criopreservação de espécies domésticas 
melhora, ou pelo menos não prejudica, 
sobretudo parâmetros cinéticos dos 
espermatozoides pós-descongelamento. 
Quanto ao efeito sobre a integridade de 
membranas e fertilidade, os resultados são 
menos evidentes, encontrando-se na 
maioria das vezes ausência de diferença 
significativa entre meios com gema ou 
LDL. 
2.3- Características bioquímicas do 
sêmen bubalino 
Para que haja sucesso no emprego de 
qualquer biotecnologia é necessário que se 
conheçam as características relacionadas ao 
objeto de interesse, sobretudo aquelas que 
interferem diretamente sobre a qualidade da 
resposta que se deseja. Por isso, para 
entender a resposta do sêmen de búfalos ao 
processo de criopreservação é necessário 
que se entendam as particularidades dos 
espermatozoides e plasma seminal dessa 
espécie. 
Referências a uma maior susceptibilidade 
do espermatozoide bubalino aos danos 
causados pelos processos de resfriamento e 
congelamento, quando comparados ao 
bovino são encontrados na literatura e a 
esse fator se atribuem as menores taxas de 
fertilidade (Andrabi, 2009). Em revisão 
feita por Andrabi (2009) foi encontrada 
uma média de 45,33% de taxa de concepção 
ao primeiro serviço, quando se 
relacionaram trabalhos publicados entre 
1971 e 2006, desconsiderando-se o tipo de 
diluidor empregado, se houve ou não 
protocolo hormonal de controle de estro, e 
local e época das inseminações. 
O espermatozoide bubalino apresenta uma 
razão de lipídeos e fosfolipídeos na 
membrana plasmática, menor que aquela 
encontrada em bovinos. A quantidade de 
fosfolipídeos estimada no espermatozoide 
de búfalos Murrah foi aproximadamente 
0,064 mg/109 células (Sarmah et al, 1983), 
enquanto para Bos taurus essa quantidade 
foi estimada em 0,416 mg/109 células (Jain 
e Anand, 1976 citado por Andrabi, 2009). 
Desses fosfolípedes os principais 
componentes da membrana do 
espermatozoide bubalino são a 
fosfatidilcolina, a fosfatidiletanolamina e a 
esfingomielina (Sarmah et al., 1976). As 
diferenças apontadas podem ser um fator 
responsável por uma menor resistência ao 
choque frio, pois alteram a fluidez da 
membrana. 
Quanto ao plasma seminal, o que foi 
observado é que o total de lipídeos é maior 
que no plasma seminal de bovinos (483,95 
mg/dL em búfalos Murrah versus 265,46 
mg/dL em Jersey). Já a quantidade de 
colesterolencontrada no plasma seminal de 
búfalos é significativamente menor que em 
Bos taurus o que, considerando o plasma 
como uma fonte de colesterol para a 
membrana do espermatozoide para manter 
20 
 
sua integridade estrutural, pode também 
afetar negativamente o processo de 
congelamento (Nikam et al., 2005). 
Quanto aos constituintes inorgânicos do 
plasma seminal também são apontadas 
diferenças em comparação aos de bovinos. 
Para cálcio os valores reportados estão 
próximos a 22,36 mg/dL (bovinos – 28 
mg/dL), e para magnésio próximos a 11,94 
mg/dL (bovino - 9,8 mg/dL). Esses dois 
minerais foram altamente correlacionados 
com parâmetros como motilidade de massa, 
motilidade progressiva e viabilidade 
espermática, sendo que quanto melhores os 
parâmetros cinéticos maiores as 
concentrações desses minerais (Eghbali et 
al., 2010). 
2.4- Utilização do sêmen bubalino 
criopreservado 
2.4.1- Preparo dos animais para a coleta 
O bubalino é considerado um animal fácil 
de adaptar e ser capacitado para a coleta de 
sêmen em vagina artificial (Sansone et al., 
2000; Vale, 2011). Recomenda-se que, 
quando possível, o treinamento se inicie a 
partir dos 14-15 meses, pois nesse período 
os machos, sobretudo quando são criados 
juntos, apresentam intensa atividade de 
monta uns nos outros (homossexualismo). 
Por isso a observação de machos 
dominantes e dominados pode ser útil para 
o início do treinamento com montas falsas e 
desvios do pênis. Dessa forma os animais 
começam a ser condicionados ao local de 
coleta, período do dia, pessoas envolvidas, 
manejo. (Vale et al., 2008; Vale, 2011). 
Quando o treinamento for iniciado em 
animais adultos (a partir de cinco anos), 
deve-se lembrar que o búfalo possui um 
marcado comportamento de hierarquia e 
demarcação de território (Ohashi et al., 
2011). Por isso é aconselhado que os 
animais sejam mantidos, durante o período 
de quarentena, isolados dos demais 
recebendo banhos diários nas horas mais 
quentes do dia e alimentação controlada 
(Vale, 2011). Para esse condicionamento 
Miyasaki (2009), no centro de coleta de 
sêmen de Bélem no Pará, manteve os 
reprodutores cabrestiados durante todo o 
período de coleta. Para adaptação os 
animais permaneciam por longas horas com 
a cabeça suspensa, amarrados pelo cabresto, 
já que assim permitiam a aproximação 
humana e eram realizados banhos diários 
com fornecimento de tabletes de açúcar, 
além de escovações, principalmente nas 
horas mais quentes do dia. Dessa forma os 
animais ficaram condicionados a serem 
conduzidos pelo cabresto diretamente aos 
manequins no momento da coleta. O autor 
ainda relata que esse período de adaptação 
durou em torno de três meses. 
Para coleta de sêmen recomenda-se a 
utilização de vagina artificial, cujo modelo 
é o mesmo utilizado em bovinos, podendo 
ser um pouco mais curta – em torno de 30 a 
35 cm de comprimento. Não há necessidade 
de lubrificação (lubrificação natural do 
pênis é suficiente) e a temperatura interna 
da vagina artificial deve estar entre 42 e 
45°C (Sansone et al., 2000; Ohashi et al., 
2011; Vale, 2011). Recomenda-se, para 
cada sessão de coleta por vagina artificial, a 
realização de falsas montas para aumentar a 
qualidade do ejaculado, e quando efetivas, 
recomenda-se a utilização de dois 
ejaculados, espaçados de 30 minutos 
(Sansone et al., 2000; Ohashi et al., 2011; 
Vale, 2011). 
O macho bubalino é considerado de mais 
baixa libido que os touros da espécie bovina 
(Vale et al., 2008). Atribui-se esse fato a 
uma menor circulação de andrógenos 
(Nikam et al., 2005). Portanto o tempo de 
reação do macho bubalino pode ser um 
pouco mais longo que aquele observado no 
bovino, em torno de 10 a 15 minutos (Vale, 
2011). 
21 
 
Segundo Ohashi et al. (2011) o método de 
eletroejaculação deve ser utilizado apenas 
para a colheita do sêmen de bubalinos entre 
dois e quatro anos, desde que tenha uma 
boa contenção física, uma vez que o búfalo 
é extremamente sensível ao estímulo 
elétrico. Por isso, em touros adultos, mesmo 
sob forte contenção física, podem ocorrer 
riscos de acidentes com os animais. 
A coleta de sêmen pela massagem das 
ampolas dos dutos deferentes também é 
possível, porém, como em qualquer espécie, 
deve-se ter cuidado na avaliação da amostra 
seminal, tendo em vista que os 
espermatozoides permaneceram expostos à 
alta temperatura (cavidade abdominal). Este 
fato pode levar a alterações no metabolismo 
e na morfologia espermática, induzindo a 
uma interpretação errônea dos resultados, 
principalmente se os animais ejacularem 
dentro da bainha prepucial, o que 
compromete ainda mais a qualidade 
seminal, especialmente do ponto de vista 
microbiológico (Ohashi et al, 2011). 
Cuidado especial deve ser dispensado aos 
touros doadores de sêmen, principalmente 
nas épocas mais quentes do ano. É relatado 
que os búfalos têm dificuldades de dissipar 
calor, pois possuem menor número de 
glândulas sudoríparas (Vale, 2011), por isso 
devem sempre estar disponíveis sombra e 
água. 
2.4.2- Características físicas do sêmen 
A coloração do ejaculado depende da 
concentração da amostra, portanto podem 
ser encontrados ejaculados de aquosos a 
leitosos e cremosos, podendo apresentar, 
quando a concentração for muito alta, 
quando olhado contra a luz, rasgos de cor 
azul escura (Jainudeen et al., 1981/1982; 
Vale, 2011). 
O volume é uma característica também 
variável, principalmente de acordo com a 
idade do touro. Em touros jovens 
geralmente espera-se obter volumes entre 1 
e 3 mL. Já em touros adultos, plenamente 
maduros, podem-se obter amostras de 4 a 8 
mL (Vale, 2011; Ohashi et al., 2011). 
Assim como na maioria dos ruminantes 
domésticos é desejável encontrar 
turbilhonamento no ejaculado, acima de 3, 
em uma escala de 0 a 5 (Vale, 2011). Em 
trabalho realizado por Jainudeen et al., 
1981/1982 observou-se que o movimento 
de “onda” de alta magnitude somente era 
percebido em ejaculados com 
concentrações maiores que 800 milhões de 
células/mL e motilidade total maior que 
70%. 
Quanto a concentrações do ejaculado 
bubalino normal é esperada uma variação 
de 0,6 x 106 a 1,2 x 106 /mm3 (Vale, 2011). 
Em estudo realizado na Bahia com touros 
búfalos, Aguiar et al. (1994) encontraram 
uma concentração de 1.166,3 ± 17,5 x 106 
espermatozoides/ mL. Para contagem de 
células em câmara de Neubauer, Vale 
(2011) recomenda a diluição em formol 
salina de 1:200. 
A motilidade espermática é uma variável de 
importante análise para determinação da 
qualidade do ejaculado. Deve ser avaliada 
imediatamente após a coleta, de forma 
subjetiva, em microscópio, ou por 
metodologia computadorizada, CASA. 
Segundo escala elaborada por Vale (2011) 
um ejaculado pode ser considerado de 
muito boa motilidade quanto apresentar 
acima de 80% de espermatozoides móveis e 
de pobre motilidade se apresentar abaixo de 
20%. 
Outro importante parâmetro que avalia a 
qualidade do ejaculado é a percentagem de 
espermatozoides vivos na amostra. Segundo 
Sansone et al. (2000) uma amostra de 
sêmen com mais de 30% de 
espermatozoides mortos, antes do 
resfriamento, não pode ser aceita para o 
processo de criopreservação. A avaliação de 
22 
 
viabilidade pode ser realizada por coloração 
com Eosina. Nessa coloração os 
espermatozoides vivos irão se apresentar 
claros ou sem coloração, enquanto os 
mortos terão forte tonalidade rósea (Vale, 
2011). 
Em relação ao pH, o sêmen de búfalo 
coletado através de vagina artificial, 
apresenta um pH variando entre 6,5 a 7,2. O 
pH deve ser determinado imediatamente 
após a coleta, pois o sêmen bubalino tem 
uma maior tendência a se acidificar, mais 
ainda se tem uma concentração mais 
elevada de açúcares que são transformados 
em ácido lático, com a diminuição do pH 
do sêmen, ocorrem alterações irreversíveis 
do espermatozoide(Vale, 2011). 
2.4.3- Fatores que afetam o congelamento 
do sêmen de búfalos 
O principio básico para o congelamento de 
sêmen em bubalinos é semelhante às 
demais espécies domésticas. Portanto é 
necessário que o ejaculado seja diluído com 
meios diluidores ou extensores, seja 
submetido a uma curva de resfriamento e 
tempo de equilíbrio, para posteriormente ser 
realizada uma curva de congelamento e 
então armazenamento em nitrogênio 
líquido. Correto binômio 
tempo/temperatura também são muito 
importantes no descongelamento para 
obtenção de um sêmen de boa qualidade. 
Estudando taxas de resfriamento de sêmen e 
período de equilíbrio a 5°C, Dhami et al. 
(1996) encontraram que curvas mais lentas, 
de aproximadamente duas horas, de 30° a 
5°C, combinados a tempo de equilíbrio de 
duas horas foram imprescindíveis para o 
sucesso da criopreservação do sêmen de 
búfalos Murrah. 
Tempos de equilíbrio maiores que duas 
horas, foram testados para o congelamento 
de espermatozoides epididimários de 
búfalos africanos. Herold et al. (2006) 
encontraram que não houve mudança 
significativa na qualidade pós-
descongelamento com tempos de equilíbrio 
de duas a nove horas. 
Com o objetivo de estudar detalhadamente 
a resposta do espermatozoide de búfalos às 
baixas temperaturas, determinando a zona 
crítica de temperatura e desenvolvendo uma 
curva de congelamento adequada para a 
espécie Anzar et al. (2010) congelaram o 
sêmen de quatro touros Nili-Ravi diluído 
em Tris-ácido cítrico. 
Nesse estudo os pesquisadores 
caracterizaram que o intervalo de -10°C e -
40°C seria a zona de temperatura crítica 
para os parâmetros cinéticos do 
espermatozoide, sendo que a temperatura de 
-50°C o limiar crítico, após esse intervalo 
não foram percebidas alterações quanto 
cinética ou morfologia de membrana (até – 
196°C). Já quanto à taxa de congelamento, 
os autores indicam que seja feito um 
congelamento inicial lento (de 4° a -10°C 
usar -3°C/min), para que haja uma correta 
desidratação da célula, sucedido por uma 
rápida taxa de congelamento (-10° a -80°C 
usar -30°C/min), pois assim se reduz o 
tempo de exposição da célula a sua zona de 
temperatura crítica. Dessa forma os 
parâmetros cinéticos, integridade de 
membranas e acrossomal foram 
positivamente afetados. 
Em búfalos adultos, existe uma variação da 
qualidade seminal em função da época do 
ano, o que pode ser atribuído, 
principalmente, a um efeito das 
temperaturas do ambiente sobre o animal e, 
conseqüentemente, sobre a 
espermatogênese (Garcia, 2006). A 
influência da temperatura/estação do ano 
sobre a qualidade do sêmen criopreservado 
foi estudada por Koonjaenak et al. (2007). 
Os pesquisadores utilizaram 218 doses de 
sêmen de búfalos do tipo pântano, coletados 
em um período de 11 anos, nas três estações 
do ano (chuvosa, inverno e verão), na 
23 
 
Tailândia. O percentual de espermatozoides 
vivos e a estabilidade de membrana foram 
maiores nas amostras processadas durante o 
inverno, e não foram encontradas diferenças 
quanto aos parâmetros analisados pelo 
CASA. 
A osmolaridade dos meios diluidores é um 
fator importante a ser observado, uma vez 
que será a osmolaridade extra-celular que 
irá determinar, mesmo antes do início do 
resfriamento, as trocas iônicas da célula 
com o meio. A osmolaridade do sêmen de 
bovinos está em torno de 300 mOsm, 
enquanto de búfalos é dita de 268,8 
mOsm/kg (Khan e Ijaz, 2008). Por esse 
motivo a utilização de diluidores 
desenvolvidos para bovinos pode provocar 
um estresse osmótico sobre o 
espermatozoide bubalino provocando 
injúrias (Meyers, 2005). Mughal et al. 
(2013) congelaram sêmen de búfalos Nili-
Ravi utilizando o diluidor Citrato+gema de 
ovo com diferentes osmolaridades (de 255 a 
295 mOsm/kg). Nesse estudo foram obtidos 
melhores valores para motilidade pós-
descongelamento para aquelas amostras 
congeladas com diluidores de 285 e 295 
mOsm/kg, não sendo observadas mudanças 
significativas quanto a viabilidade, 
integridade de acrossoma e membrana 
plasmática, integridade de DNA e 
peroxidação lipídica. 
Assim como as taxas de resfriamento e 
congelamento, a taxa de descongelamento 
pode ser um fator determinante para a 
resposta pós-descongelamento. Elevar a 
temperatura de descongelamento de 37°C 
por 30 seg para 70°C por 6 segundos foi 
considerado benéfico para os parâmetros 
cinéticos imediatamente após o 
descongelamento, porém essa vantagem 
tende a desaparecer durante a incubação a 
37°C (Dhami et al., 1996; Rastergarnia et 
al., 2013). Além disso, a adoção de altas 
temperaturas de descongelamento foi 
associada a uma maior dispersão da 
cromatina (Rastergarnia et al., 2013). 
Quanto aos diluidores utilizados no 
congelamento do sêmen da espécie 
bubalina, diversos já tem sido testados, na 
maioria das vezes diluidores já utilizados 
para o congelamento de sêmen de bovinos 
que tentam ser adaptados para utilização em 
bubalinos (Andrabi, 2009; Vale, 2011). As 
variações são, sobretudo em relação ao 
tampão, crioprotetor penetrante e aditivos. 
Os resultados obtidos por alguns trabalhos 
publicados entre 1996 e 2013 foram 
sumarizados na Tab. 1. 
 
24 
 
Tabela 1- Características pós-descongelamento do sêmen de búfalos congelados em diferentes diluidores, em trabalhos publicados de 1996-2013. 
Referência Diluidor 
MT % 
(CASA/subj) 
HO+ ou 
Pi- 
Acrossoma Vivos DNA Fertilidade Observação 
Chacur, 1996 Glicina-gema 62 - 61,66 52,2 91,72 - 94,9 - - - 
 
Triladyl® 61,5 - 64 44,3 92,4 - 95,3 - - - 
 Tes-Tris-gema-leite 61,5-67 38,7 89 - 96,7 - - - 
Fabbrocini et al., 
2000 
Laiciphos® - glicerol 2 steps (6,7%) antes do 
tempo de equilíbrio 
55-60 - - - - - Tempos de equilíbrio variando 
de 3 a 5 horas 
 
Laiciphos® - glicerol 2 steps (6,7%) depois do 
tempo de equilíbrio 
55-65 - - - - - 
 
 
Laiciphos® - glicerol 2 steps (6,7%) + 1,25mM 
piruvato 
60-80 - - - - - 
 
Rasul et al., 2000 Citrato gema 48 45,2 69,2 - - - 
 
 
Tris ácido cítrico 48,6 32,6 61,8 - - - 
 
 
Tes-Tris 67 41,4 53,2 - - - 
 
 
Tris-HEPES 54,4 40,8 65,8 - - - 
 
Mota, 2005 Tes-Tris + 20% de gema de ovo 
20-38 31,5 - - - - 
Utilizou o diluidor Tes-Tris 
como controle de um tratamento 
de seleção de espermatozoide 
por gradiente Percoll 
Rasul et al., 2007 Tris-ácido cítrico + glicerol 3% ~10 ~25 ~40 - - - 
 
Tris-ácido cítrico + glicerol 6% ~35 ~40 ~40 - - - 
 
 
Tris-ácido cítrico + glicerol 6%+ DMSO ~20-30 ~30 - - - - 
 Tris-ácido cítrico + DMSO 0 ~5 - - - - 
El-Sheshtawy et al., 
2008 
Tris-citrato-frutose-gema + 25mM de glutamina ou 
glicina 
41-42,50 
50,20-
51,30 
59-61,3 - - - 
 
 
Tris-citrato-frutose-gema + 5mM de cisteína 42,5 53,9 58,3 - - - 
 
 
Tris-citrato-frutose-gema + 100mM de glutamina 
ou glicina ou alanina 
26,50-33 30-33,30 37-39 - - - 
 Tris-citrato-frutose-gema 32,5 41,1 50,3 - - - 
Ijaz et al., 2009 Tris-citrato-gema 44,6 44,5 21 59,7 - - 
 
Tris-citrato-gema + BHT 2 mM 58,5 52,3 28,7 67,6 - - 
 Tris-citrato-gema + BHT 3 mM 54,1 46,5 26,1 60,7 - - 
 
 
 
25 
 
Referência Diluidor 
MT % 
(CASA/subj) 
HO+ ou 
Pi- 
Acrossoma Vivos DNA Fertilidade Observação 
Akhter et al., 2010 Bioxcell® 45 59,2 80,7 64,4 - 47 200 IA 
 Tris-ácido cítrico+ 20% de gema de ovo 45,3 60,4 82,9 66,2 - 44 200 IA 
El- Sheshtawy et al., 
2010 Tris-ácido cítrico + 20% de gema de pata 
37-39 58,6-59,4 51,8-57,4 57-64,6 
11,2-
12,2 
- Gemas in natura ou 
centrifugadas 
 
Tris-ácido cítrico + 20% de gema de codorna 43-44 67,6 - 75,4 64,2-66 69-75,8 8,2-10,4 - 
 Tris-ácido cítrico + 20% de gema de galinha 36-38 48-52,6 43-51,8 59-66,6 12-12,4 - 
Reddy et al., 2010 Tris-ácido cítrico-gema + 50mM taurina 48,33 ~48 - ~70 - - 
 
Tris-ácido cítrico-gema + 100mM trealose 41,67 ~45 - ~70 - - 
 Tris-ácido cítrico-gema 31,67 ~35 - ~55 - - 
Akhter et al., 2011 Tris-ácidocítrico + 2,5, 5, 15% LDL ~37 ~36 - ~55 - - 
 
Tris-ácido cítrico + 10% LDL ~60 ~60 - ~80 - 53,5 200 IA 
 Tris-ácido cítrico + 20% de gema de ovo ~ 45 ~45 - ~65 - 41,5 200 IA 
Akhter et al., 2011 Tris-ácido cítrico + 10% lecitina de soja ~60 ~55 - ~80 - 56 200 IA 
 Tris-ácido cítrico + 20% de gema de ovo ~40 ~40 - ~65 - 41,5 200 IA 
Pessoa et al., 2011 Tes-Tris 39,5 62,2 - - - 38,5 13 IA 
 
Tes-Tris + 3,5 mM pentoxifilina + 2,5 mM 
vitamina C 
46,9 57,6 - - - 30,00 
10 IA 
Swelun et al., 2011 Tris-frutose-gema + 7% glicerol 50,25 - 65,6 61,75 - 38,5 26 IA/grupo 
 
Tris-frutose-gema + 5% etilenoglicol 45,25 - 69,1 61,15 - 46,2 Diluidores centrifugados 
 
Leite-gema + 7% glicerol 45,5 - 61,1 56,6 - 34,6 
 Leite-gema + 5% etilenoglicol 42,25 - 64,1 55,95 - 42,3 
El-Sharawy et al., 
2012 Tris-ácido cítrico + 12% LDL 
63,3 71,3 77,17 - - 72,7 
11 IA 
 Tris-ácido cítrico + 20% de gema de ovo 35 34,7 40,8 - - 50 20 IA 
Kumar e Atreja, 2012 Tris-ácido cítrico-gema 
35 37,3 - ~55 - - 
 
 
Tris-ácido cítrico-gema + 50mM taurina 60 ~60 - ~80 - - 
 
 
Tris-ácido cítrico-gema + 100mM trelose 54 ~50 - ~70 - - 
 
 
Tris-ácido cítrico-gema + 200µM bromofenacil 
55 ~60 - ~75 - - 
 Tris-ácido cítrico-gema + 100 u/mL catalase 56,66 ~45 - ~75 - - 
26 
 
Referência Diluidor 
MT % 
(CASA/subj) 
HO+ ou 
Pi- 
Acrossoma Vivos DNA Fertilidade Observação 
Rastegarnia et al., 
2012 Bioxcell® 
68,8 47,5 78,7 67,9 - - 
 
 
Bioxcell® + 0,5 ou 1 mM glutationa 66,9 51 75,6 63,15 - - 
 Bioxcell® + 2 mM glutationa 53,5 49,5 71,7 55,7 - - 
Miyasaki, 2012 Ringer lactato-leite-gema 67,4 - 90,46 - - - 
 
Leite desnatado-gema 59,7 - 90,56 - - - 
 
 
Tris-Lactose-gema 67,09 - 89,76 - - - 
 Tris-ácido cítrico-gema 70 - 91,65 - - - 
Song et al., 2012 Tris-ácido cítrico-gema 
31,1 ~35 - - 2,26 28,6 
Procedimento em espermatozoides 
durante e após passagem em 
citômetro de fluxo 
 Tris-ácido cítrico-gema + 0,75 glutationa 38,29 ~45 - 1,42 57,1 35 IA/grupo 
Waheed et al., 2012 Tris-ácido cítrico + 20% gema de galinha 
50,5 88,2 - - - 
 
 Tris-ácido cítrico + 20% gema de pata 54,5 87,57 - - - 
Mahmoud et al., 2013 Bioxcell® 
42,51 52,7 - 61,76 - 44,45 
3174 IA 
Mughal et al., 2013 Lactose-gema 49,7 59,6 69,8 57,9 98,9 - 
 Lactose-gema + 20, 40 ou 60mM taurina 41-49 52,9-62,9 70-72,4 57,4-58,4 98,2-98,5 - 
Toproggaleh et al., 
2013 Tris-ácido cítrico-gema 
56,16 61,17 - - 6,11 - 
 
 
Tris-ácido cítrico-gema + 7,5 mM cisteína 67,15 70,97 - - 4,91 - 
 Tris-ácido cítrico-gema + 15 mM glutamina 62,76 65,6 - - 5,7 - 
MT%: média da motilidade total pós-descongelamento por metodologia CASA ou subjetiva; HO+ ou Pi-: percentual médio de membranas íntegras, por metodologia de teste hiposmótico ou 
marcação por sondas fluorescentes; Acrossoma: percentual médio de células com acrossoma íntegro; Vivos: percentual médio de células vivas em coloração vital Eosina/Nigrosina; DNA: 
percentual médio de células com DNA íntegro; Fertilidade: percentual médio de taxas de gestação após inseminação artificial com sêmen bubalino congelado; IA: inseminação artificial. 
27 
 
2.5- Avaliação laboratorial do sêmen 
Tradicionalmente, a quantificação do 
potencial de fertilização espermática tem 
sido baseada na avaliação subjetiva de 
parâmetros como turbilhonamento, 
percentual de células móveis e vigor 
(Verstegen et al., 2002). Estes testes são 
realizados por microscopia ótica colocando-
se uma gota do sêmen entre lâmina e 
lamínula, previamente aquecidas a 
temperatura próxima a 37°C (CBRA, 1998). 
Foi observado que a correlação entre 
fertilidade e motilidade espermática varia de 
0,15 a 0,84 (Dhurvey et al., 2012). 
Particularmente para búfalos da raça 
Murrah, Del Rei et al. (2007) estudaram as 
correlações entre fertilidade (tida como a 
taxa de concepção ao primeiro serviço) e 
percentual de espermatozoides móveis e o 
vigor espermático, avaliados subjetivamente 
em amostra de sêmen congelado. Os valores 
de correlação encontrados foram, 0,315 para 
fertilidade/motilidade e 0,432 para 
fertilidade/vigor. Contrariamente, Barros et 
al. (2007) relataram não encontrar nenhuma 
correlação entre a taxa de gestação e a 
motilidade e vigor, em touros Murrah. Eles 
destacaram a necessidade do emprego de 
testes funcionais para melhor estimativa da 
qualidade de amostra de sêmen de búfalo 
congelado. 
A grande variação entre resultados desta 
estimativa, de 30 a 60% entre laboratórios, 
deve estar relacionada à existência de 
subpopulações espermáticas, com 
características diferentes que não são 
comumente detectadas nos exames 
convencionais (Verstegen et al., 2002). 
As técnicas de maior sensibilidade para 
predição da fertilidade de uma amostra de 
sêmen são, sem dúvida, os testes de 
inseminação artificial e fertilização in vitro. 
Porém, os testes de inseminação artificial 
demandam um grande número de animais 
para serem inseminados para que seja 
encontrada uma resposta satisfatória, o que 
nem sempre está disponível, além de 
demandar muito tempo para sua conclusão. 
As técnicas de fertilização in vitro requerem 
um ambiente altamente controlado, técnicos 
qualificados e protocolos bem estabelecidos, 
o que na maioria das vezes torna o processo 
de custo muito elevado e inviável para a 
pesquisa em geral (Dell’aqua et al., 2009). 
Por isso é proposto que sejam feitos vários 
testes de qualidade seminal, e a partir deles 
sejam feitas associações de respostas bem 
como a correlação destes com a fertilidade 
in vivo, e dessa forma haja uma maior 
aproximação do potencial de fertilização da 
amostra (Farrel et al., 1998; Verstegen et al., 
2002; Dell’aqua et al., 2009). 
2.5.1- Avaliação computadorizada da 
motilidade espermática 
Para tornar as avaliações da qualidade 
espermática mais objetivas e detalhadas, 
foram desenvolvidos equipamentos para a 
análise computadorizada de parâmetros 
espermáticos (CASA). Pelo uso do CASA 
podem ser obtidos vários parâmetros 
específicos de motilidade, que irão descrever 
os movimentos do espermatozoide de 
maneira mais detalhada. Além disso, a 
classificação em espermatozoides móveis, 
de velocidade rápida, média e lenta pode ser 
baseada em limites de velocidade bem 
definidos. Paralelamente às tentativas de 
melhorar o desempenho dos sistemas de 
análise computadorizada, é importante 
investigar a relevância biológica dos 
parâmetros do CASA, no contexto da 
predição do potencial de fertilidade do 
macho, um conhecimento que é de crucial 
importância para a compreensão da biologia 
da fertilização (Larsen et al., 2000). 
Os principais parâmetros utilizados pelos 
pesquisadores quanto a velocidade da 
trajetória dos espermatozoides por unidade 
de tempo são a velocidade curvilínea (VCL), 
que relaciona a trajetória real percorrida; a 
velocidade linear progressiva (VSL), que 
28 
 
relaciona o primeiro e o último ponto 
captados na imagem e a velocidade média da 
trajetória (VAP) que seria relacionada a uma 
trajetória média do espermatozoide. Por 
algumas fórmulas essas velocidades são 
relacionadas e fornecem os parâmetros de 
retilinearidade (STR – VSL/VAP) e 
linearidade (LIN VSL/VCL), que ditam o 
quão linear foi a trajetória percorrida pelo 
espermatozoide (Verstegen et al, 2002). 
Outros parâmetros que também são 
utilizados relacionam a angularidade e 
oscilação da cabeça, eles são a amplitude de 
deslocamento lateral da cabeça (ALH) em 
relação a sua trajetória real, e a freqüência 
de batimento flagelar cruzado (BCF) que é o 
número de vezes que a cabeça do 
espermatozoide cruza a direção do 
movimento (Verstegen et al., 2002) (Fig. 3). 
Em estudo para demonstrar os valores 
prognósticos dos parâmetros analisados pelo 
CASA sobre as interações in vitro entre o 
espermatozoide canino criopreservado e 
oócitos homólogos, Silva et al. (2006) 
analisaram 10 ejaculados após