AlcaloidesErythrinavelutina-Decosimo-2022

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
 CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
 PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 LUANA MEIRINHO DECOSIMO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Alcaloides de Erythrina velutina como possíveis agentes bioativos para 
 transtornos cognitivos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 NATAL/RN 
 2022
 LUANA MEIRINHO DECOSIMO 
 
 
 
 
 
 Alcaloides de Erythrina velutina como possíveis agentes bioativos para 
 transtornos cognitivos 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Farmacêuticas, da 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte como 
requisito para a obtenção do grau de Mestre em 
Ciências Farmacêuticas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Orientadora: Prof. Dra. Raquel Brandt Giordani 
Coorientadora: Prof. Dra. Ana Carolina Luchiari 
 
 
 
 
 
 
 
 
 NATAL/RN 
 2022 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN 
Sistema de Bibliotecas - SISBI 
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS 
 Decosimo, Luana Meirinho. 
 Alcaloides de Erythrina velutina como possíveis agentes 
bioativos para transtornos cognitivos / Luana Meirinho Decosimo. 
- 2022. 
 63f.: il. 
 
 Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências 
da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. 
Natal, RN, 2022. 
 Orientadora: Dra. Raquel Brandt Giordani. 
 Coorientadora: Dra. Ana Carolina Luchiari. 
 
 
 1. Alcaloides - Erythrina velutina - Dissertação. 2. Doença de 
Alzheimer - Dissertação. 3. Memória - Dissertação. 4. Zebrafish - 
Dissertação. I. Giordani, Raquel Brandt. II. Luchiari, Ana 
Carolina. III. Título. 
 
RN/UF/BS-CCS CDU 547.94 
 
 
 
 
 
Elaborado por ANA CRISTINA DA SILVA LOPES - CRB-15/263 
 
 
 
Luana Meirinho Decosimo 
 
 Alcaloides de Erythrina velutina como possíveis agentes 
 bioativos para transtornos cognitivos 
 
 
 
 Banca Examinadora: 
 
 
 
_________________________________________ 
 Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão 
Presidente – UFRN 
 
 
 
_________________________________________ 
Profa. Dra. Ana Carolina Luchiari 
Coorientadora – UFRN 
 
 
 
_________________________________________ 
Profa. Dra. Percilia Cardoso Giaquinto 
Examinador Externo – UNESP 
 
 
 
_________________________________________ 
Dr. Fabiano Peres Menezes 
Examinador Interno – UFRN 
 
 
 
 
Natal, 21 de fevereiro de 2022 
 
 
 
NATAL / RN 
2022
 
 
 
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
SISTEMA INTEGRADO DE PATRIMÔNIO, ADMINISTRAÇÃO E 
CONTRATOS 
 
 
FOLHA DE ASSINATURAS 
 
 
 
Emitido em 21/02/2022 
 
DOCUMENTOS DE ACEITAÇÃO Nº 4/2022 - PPGCF/CCS (15.27) 
 
(Nº do Protocolo: NÃO PROTOCOLADO) 
 
 
 
 
 
(Assinado digitalmente em 25/02/2022 12:41 ) 
ANA CAROLINA LUCHIARI 
PROFESSOR DO MAGISTERIO SUPERIOR 
DFS/CB (17.12) 
Matrícula: 1644341 
 
(Assinado digitalmente em 24/02/2022 22:17 ) 
CICERO FLAVIO SOARES ARAGAO 
COORDENADOR DE CURSO 
PPGCF/CCS (15.27) 
Matrícula: 1492900 
 
 
(Assinado digitalmente em 25/02/2022 11:22 ) 
FABIANO PERES MENEZES 
ASSINANTE EXTERNO 
CPF: 811.318.790-15 
 
(Assinado digitalmente em 04/03/2022 11:50 ) 
PERCILIA CARDOSO GIAQUINTO 
ASSINANTE EXTERNO 
CPF: 137.665.028-24 
 
 
 
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RESUMO 
A doença de Alzheimer (DA) caracteriza-se por um transtorno 
neurodegenerativo que causa a perda irreversível de memória, sendo a principal 
causa de demência na população idosa. A memória é uma função fundamental para 
o nosso dia a dia e a terapia da DA pode apenas melhorar a qualidade de vida, mas 
não evita a progressão da doença e dos sintomas. O arsenal terapêutico para o 
tratamento desta doença limita-se a algumas substâncias com ação na inibição da 
enzima colinesterase, que bloqueia os efeitos da redução da acetilcolina, resultando 
em neuroproteção. Por isso, novas opções de produtos naturais tornam-se 
interessantes. Devido à grande biodiversidade de plantas medicinais encontradas no 
Brasil, principalmente no bioma da Caatinga que é exclusivo do território brasileiro. A 
Erythrina velutina é uma dessas plantas com potencial bioativo, que apresenta uso 
popular terapêutico consagrado e possui em sua composição alcaloides 
isoquinolínicos que demonstraram atividades psicoativas. Assim, o objetivo deste 
trabalho foi avaliar o potencial biológico in vivo de frações enriquecidas em alcaloides 
de sementes de E. velutina sobre aspectos cognitivos utilizando como modelo 
experimental o zebrafish (Danio rerio). A partir das sementes da planta foi obtida uma 
fração enriquecida em alcaloides a qual foi utilizada nos testes biológicos em zebrafish 
para avaliação toxicológica em embriões e adultos. A fração tem concentração letal 
para embriões em 17,40ug/ml, mas não é toxica para adultos. Em adultos, a fração 
causou resposta de diminuição de comportamento tipo-ansioso. Em testes de 
memória de curta duração, o tratamento com a fração melhorou o desempenho dos 
animais, mas não foi observada ação da fração para a memória de longa duração. Ao 
final deste trabalho observamos que a fração enriquecida em alcaloides apresenta 
potencial ansiolítico e melhora a resposta mnemônica de curto prazo, mostrando 
assim potencial bioativo frente a aspectos relacionados à memória. 
 
Palavras-chave: Doença de Alzheimer, Erythrina velutina, alcaloides, memória, 
zebrafish. 
 
 
 
ABSTRACT 
Alzheimer’s disease (AD) is characterized by a neurodegenerative 
disorder that causes irreversible memory loss, being the main cause of dementia 
in the elderly population. Memory is a key function for our everyday life and AD 
therapy can only improve quality of life but does not prevent the progression of 
disease and symptoms. The therapeutic arsenal for the treatment of this disease 
is limited to some substances with action in the inhibition of the enzyme 
cholinesterase, which blocks the effects of acetylcholine reduction, resulting in 
neuroprotection. Therefore, new natural product options become interesting. Due 
to the great biodiversity of medicinal plants found in Brazil, mainly in the Caatinga 
biome that is exclusive to the Brazilian territory. Erythrina velutina is one of these 
plants with bioactive potential, which has a popular therapeutic use and has in its 
composition isoquinolinic alkaloids that have demonstrated psychoactive 
activities. Thus, the objective of this study was to evaluate the in vivo biological 
potential of fractions enriched in E. velutina seed alkaloids on cognitive aspects 
using as an experimental model the zebrafish (Danio rerio). A fraction enriched 
in alkaloids was obtained from the seeds of the plant, which was used in zebrafish 
biological tests for toxicological evaluation in embryos and adults. The fraction 
has a lethal concentration for embryos at 17.40ug/ml but is not toxicto adults. In 
adults, the fraction caused a response of decreased anxiety-type behavior. In 
short-term memory tests, treatment with the fraction improved the performance 
of the animals, but no action of the long-term memory fraction was observed. At 
the end of this study, we observed that the fraction enriched in alkaloids presents 
anxiolytic potential and improves the short-term mnemonic response, thus 
showing bioactive potential in the face of memory-related aspects. 
 
Keywords: Alzheimer’s disease, Erythrina velutina, alkaloids, memory, 
zebrafish. 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
Figura 1: Fisiopatologia cerebral característica da Doença de Alzheimer: A - Imagem 
ilustrativa de um corte transversal no cérebro com um lado saudável e outro lado 
acometido pela DA avançado; B - Demonstração da presença de placas senis sobre 
as células com Alzheimer e saudáveis; C - Imagem sobre microscópio da região de 
uma célula em formação de emaranhados neurofibrilares e outra região saudável; D - 
Demonstração de um processo de neurotransmissão por meio de sinapses em um 
cérebro saudável; E - Cérebro acometido pela DA, com os processos de 
neurotransmissão afetados. ...................................................................................... 16 
Figura 2: Mecanismo molecular de dano neuronal e progressão da Doença de 
Alzhmeir (DA). .......................................................................................................... 18 
Figura 3: Biossíntese de alcaloides e outros metabólitos secundários de plantas. E4P, 
eritrose 4-fosfato; G3P, gliceraldeído 3-fosfato; PEP, fosfoenolpiruvato; PYR, piruvato; 
DOX5P, desoxixilulose 5-fosfato; IPP, pirofosfato de isopentenilo. .......................... 22 
Figura 4: Estrutura geral dos alcaloides eritrínicos e subclasses desses alcaloides.
 .................................................................................................................................. 24 
Figura 5: Fases de obtenção do Extrato Bruto Hidroalcóolico: A- Maceração 
hidroalcoólica; B- Filtração a vácuo; C- Rotaevaporação. ........................................ 29 
Figura 6: Obtenção de frações enriquecidas com alcaloides: A- Solubilização da 
amostra com diclorometano (DCM) + metanol (MeoH) - 8:2; B- Extrato com 
diclorometano/metanol + ácido clorídrico 5%; C- Extrato com diclorometano/metanol 
+ ácido clorídrico 5% no funil; D- Após alcalinizar com NH4OH a 75% a fração aquosa 
ácida, foi feita a extração com diclorometano 6x; E- Última extração com 
diclorometano; F- fração DCM alcaloidica; G- Fração submetida a rotaevaporação a 
35°C; H- Fração enriquecida em alcaloides pronta. ................................................. 30 
Figura 7: Esquema experimental. ............................................................................ 38 
Figura 8: Cromatografia em camada delgada das frações enriquecidas em alcaloides 
obtidas de sementes de Erythrina velutina: A- Frações sobre a luz UV; B- Frações 
reveladas com o reagente Dragendorff..................................................................... 39 
Figura 9: Frações enriquecidas em alcaloides obtidas de sementes de Erythrina 
velutina reveladas com Dragendorff sob luz UV: A e C- frações sobre a luz UV; B- 
frações reveladas com vanilina; D- frações reveladas com Dragendorff. ................. 40 
 
 
Figura 10: Cromatograma obtido por CG-EM das frações enriquecidas em alcaloides.
 42 
Figura 11: Espectro de massas do pico com tempo de retenção em 28.293 min. ... 42 
Figura 12: Espectro de massas do pico com tempo de retenção em 31.682 min. ... 42 
Figura 13: Estrutura da erisodina e erisovina. ......................................................... 44 
Figura 14: Curva de Kaplan-Meier seguida pelo teste Log-rank para comparação da 
taxa de sobrevivência entre os grupos. Nível de significância foi estabelecido em p 
<0,05. ........................................................................................................................ 44 
Figura 15: Análise de parâmetros locomotores de zebrafish submetidos ao teste de 
tanque novo por 6min: A- Distância total percorrida; B- Velocidade Média; C- 
Velocidade enquanto móvel. (*) indica diferença entre os grupos. As diferenças foram 
consideradas estatisticamente significativas a p <0,05. ........................................... 46 
Figura 16: Análise dos parâmetros locomotores que indicam atividade ansiolítica para 
os animais expostos as FEA (50 ug/L e 100 ug/L): A- Ângulo de giro absoluto; B- 
Tempo nas zonas do tanque. As diferenças foram consideradas estatisticamente 
significativas a p <0,05. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os grupos 
(a  b  c). ................................................................................................................. 47 
Figura 17: Gráfico representando a latência para o peixe sair do braço inicial na fase 
de treino e de teste do T-maze. As diferenças foram consideradas estatisticamente 
significativas a p <0,05. (*) indica diferença entre os grupos. ................................... 48 
Figura 18: Gráfico representado o tempo que o peixe permaneceu nos braços na fase 
de treino (a) e de teste (b). As diferenças foram consideradas estatisticamente 
significativas a p <0,05. (*) indica diferença entre os grupos. ................................... 50 
Figura 19: Gráfico de exploração dos objetos entre a fase de memorização e fase 
discriminação, todos os grupos exploraram mais o objeto novo da fase de 
discriminação. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a p 
<0,05. Letras diferentes indicam diferença estatística entre os grupos (a  b  c). .. 52 
Figura 20: Regressão linear onde o índice de memorização é representado pelo eixo 
X e o índice de discriminação, representado pelo eixo Y (variável dependente). (a) 
grupo controle DMSO, (b) grupo 50 ug/L de FEA, (c) grupo controle água. ............. 53 
Figura 21: Análise dos parâmetros locomotores dos animais submetidos ao teste de 
discriminação de objetos. O gráfico mostra a distância percorrida (A), velocidade 
média (B) e alterações na direção da natação (C). A significância foi estabelecida em 
p <0,05. (*) indica diferença entre os grupos. ........................................................... 54 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
Tabela 1: Medicamentos aprovados pela agência Food and Drug Administration 
(FDA) para a terapia da Doença de Alzheimer. ................................................ 20 
 
12 
 
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................... 14 
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................................... 14 
2.1 Doença de Alzheimer ............................................................................. 14 
2.2 Memória .................................................................................................. 18 
2.2.1 Tratamentos farmacológicos ................................................................ 19 
2.3 Caatinga como celeiro de alcaloides bioativos ................................... 21 
2.3.1 Erythrina spp. como fonte de agentes neurais ................................... 24 
2.4 Zebrafish ................................................................................................. 25 
3 OBJETIVOS ............................................................................................ 28 
3.1 Objetivo Geral ........................................................................................ 28 
3.2 Objetivos Específicos ............................................................................ 28 
4 METODOLOGIA ...................................................................................... 29 
4.1 Identificação do material vegetal .......................................................... 29 
4.2 Obtenção do extratohidroalcoólico ..................................................... 29 
4.3 Obtenção das frações enriquecidas .................................................... 29 
4.4 Isolamento dos alcaloides majoritários ............................................... 30 
4.5 Análises cromatográficas ..................................................................... 31 
4.6 Atividade biológica ................................................................................ 32 
4.6.1 Zebrafish ................................................................................................. 32 
4.6.2 Toxicidade .............................................................................................. 32 
4.6.3 Testes de memória ................................................................................ 34 
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................... 38 
5.1 A análise química preliminar do extrato e seus alcaloides através da 
Cromatografia em Camada Delgada (CCD) .................................................. 38 
5.2 Análise por Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de 
Massas (CG-EM) ............................................................................................. 41 
5.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA ........................................................................ 44 
13 
 
5.3.1 Toxicidade .............................................................................................. 44 
5.3.2 Teste de tanque novo ............................................................................ 45 
5.3.3 Teste de memória de curta duração (T- maze) .................................... 48 
5.3.4 Discriminação de objetos...................................................................... 50 
6 CONCLUSÕES ........................................................................................ 55 
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 56 
 
 
14 
 
1 INTRODUÇÃO GERAL 
A Caatinga possui alto potencial medicinal devido sua ampla diversidade vegetal 
(SÁ-FILHO et al., 2021), por isto torna-se um bioma propício para a obtenção de 
biomoléculas como os metabólitos secundários (SANTOS, 2012). Esses metabólitos 
secundários são sintetizados por plantas para auxiliarem na sua sobrevivência e 
reprodução, dentre os quais destacam-se: alcaloides, fenois, esteroides, glicosídeos, 
taninos, terpenoides e fitoalexinas (DEBNATH et al., 2018). Dentre estas moléculas, 
os alcaloides apresentam ampla variedade de estruturas químicas (COQUEIRO; 
VERPOORTE, 2015), além de se destacarem por serem a principal classe a originar 
fármacos comercializados no mercado (HEINRICH; MAH; AMIRKIA, 2021). Alguns 
estudos sugerem que os alcaloides do gênero Erythrina podem agir em receptores do 
sistema nervoso central (SNC) por modificação colinérgica (DECKER et al., 1995; 
SETTI-PERDIGÃO et al., 2013) ou por alteração da neurotransmissão do glutamato 
(FAGGION et al., 2011). A classe dos alcaloides isoquinolínicos, presente em diversas 
famílias de plantas, demostraram atividade inibidora da acetilcolinesterase (AChE) 
(LÓPEZ et al., 2002; PAGLIOSA et al., 2010), cuja ação tem sido proposta como uma 
das principais abordagens terapêuticas para o tratamento da Doença de Alzheimer 
(DA) (BECKER et al., 1988; SHARMA, 2019), condição ainda sem cura ou tratamento 
eficaz (ALZHEIMER'S ASSOCIATION, 2021). 
Assim uma das estratégias é explorar o potencial de produtos naturais, como os 
alcaloides, e para isso a realização de ensaios biológicos torna-se importante. Neste 
estudo objetivamos estudar alcaloides provenientes das sementes de Erythrina 
velutina sobre aspectos cognitivos relacionados a memória e aprendizagem que estão 
alterados na Doença de Alzheimer, visando abrir novas oportunidades para o uso dos 
alcaloides de E. velutina e contribuir para a busca de tratamentos para doenças 
neurodegenerativas. 
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 
2.1 Doença de Alzheimer 
A doença de Alzheimer (DA) é a causa mais comum de demência que afeta 
cerca de 50 milhões de pessoas em todo o mundo (PATTERSON, 2018). É um 
transtorno heterogêneo e multifatorial, caracterizado por comprometimento cognitivo 
15 
 
com perca progressiva da memória, além de desorientação, alterações de 
personalidade e autocuidado prejudicado. A característica principal da DA é a 
presença de placas senis (figura 1B) resultantes do metabolismo anormal da proteína 
precursora do peptídeo amiloide (APP), acarretando a formação de agregados b-
amiloide e emaranhados neurofibrilares (figura 1C), que se formam a partir do colapso 
do citoesqueleto neuronal, decorrente da hiperfosforilação da proteína tau 
(FORLENZA, 2005). 
Devido à presença de altas concentrações de placas e emaranhados na 
progressão da DA, ocorre a infiltração microglial ao redor das placas. As micróglias 
executam um papel importante na manutenção da plasticidade neuronal e na 
remodelação das sinapses, já que são fagócitos residentes no SNC (JI et al., 2013). 
O acúmulo de proteínas ativa as micróglias, que agem como um gatilho patológico, 
iniciando respostas imunológicas inatas (Figura 2) e a secreção de citocinas pró-
inflamatórias e quimiocinas (HENEKA et al., 2015; TIWARI et al., 2019). 
Na progressão da DA o cérebro exibe atrofia significativa predominantemente 
nos lobos temporais e parietais, apresenta também deposição de placas senis e 
degeneração neurofibrilar, inicialmente no córtex entorrinal, no hipocampo e nos 
córtices acústico e visual. Em estágios mais avançados, as placas se encontram no 
lobo frontal e no cerebelo. As patologias dendrítica e espinhal, bem como perda de 
sinapses, também são características neuropatológicas importantes (MAVROUDIS, 
2019). Estas alterações resultam na atrofia acentuada do córtex cerebral e perda dos 
neurônios corticais e subcorticais, observando-se redução na massa encefálica (figura 
1A) do portador de DA (ARENDT, 2015). 
Outra característica da DA é a redução da síntese de acetilcolina (ACh) no 
cérebro, que pode ser crítico para a demência (BECKER et al., 1988; SHARMA, 2019). 
A acetilcolina é um neurotransmissor que está amplamente distribuído no SNC, está 
envolvido nos processos de regulação da memória, aprendizagem e controle motor. 
Quando seus níveis estão baixos, a neurotransmissão colinérgica é comprometida 
(Figura 1E), afetando a regulação dos processos cognitivos (RANG et al., 2016). A 
deterioração de neurônios colinérgicos no cérebro e a perda da neurotransmissão são 
as principais causas do declínio da função cognitiva em pacientes com DA. Por isso, 
uma das estratégias terapêuticas potenciais é baseada no aumento dos níveis 
colinérgicos no cérebro, por meio da inibição da atividade biológica da 
acetilcolinesterase (AChE), que é a enzima responsável por degradar acetilcolina. 
16 
 
Portanto, os inibidores da AChE são usados para limitar a degradação de ACh 
(SHARMA, 2019). Os medicamentos aprovados para tratar a DA estão listados na 
Tabela 1, dentre eles alguns com características de inibição da colinesterase. 
Figura 1: Fisiopatologia cerebral característica da Doença de Alzheimer: A - Imagem ilustrativa 
de um corte transversal no cérebro com um lado saudável e outro lado acometido pela DA avançado; 
B - Demonstração da presença de placas senis sobre as células com Alzheimer e saudáveis; C - 
Imagem sobre microscópio da região de uma célula em formação de emaranhados neurofibrilares e 
outra região saudável; D - Demonstração de um processo de neurotransmissão por meio de sinapses 
em um cérebro saudável; E - Cérebro acometido pela DA, com os processos de neurotransmissão 
afetados. 
 
Fonte: Alzheimer's Association (2021) e adaptado de 
http://alhumairoh.files.wordpress.com/2008/12/alzheimers-disease.jpg 
A DA é caracterizada por sua intensa heterogeneidade em relação ao tipo que 
acomete os indivíduose a gravidade dos sintomas apresentados. Por isso, a 
classificação da DA baseia-se em três subtipos com base na distribuição da patologia 
relacionada à tau e a atrofia cerebral regional, que incluem: (I) típica, (II) com 
predominância límbica e (III) com preservação do hipocampo. A DA típica apresenta 
patologia e atrofia referentes à proteína tau tanto no hipocampo como no córtex. No 
subtipo predominante límbico, atrofia e presença de tau são predominantes no 
sistema límbico enquanto o subtipo poupador do hipocampo, apresenta atrofia mínima 
desta região cerebral. As diferenças entre os subtipos foram encontradas na 
distribuição do sexo, idade de início, idade na avaliação, estado cognitivo global, 
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17 
 
duração da doença, anos de educação, genótipo APOE ε4 e níveis de biomarcadores 
de líquido cefalorraquidiano (LCR) (FERREIRA et al., 2020). 
Duas características microscópicas auxiliam na caracterização da DA: as 
placas amiloides e aglomerados neurofibrilares. Estes elementos são considerados 
responsáveis pela deterioração lenta e gradual da memória que afeta a linguagem, a 
personalidade ou o controle cognitivo (PICANCO et al., 2018). Para o diagnóstico da 
DA, não existe um só teste, são necessárias várias abordagens que incluem: histórico 
médico, exames físicos, testes de diagnósticos cognitivos mentais, exame neurológico 
e imagens cerebrais (ALZHEIMER'S ASSOCIATION, 2021). Os testes 
neuropsicológicos são realizados em diferentes esferas das funções cognitivas, mas 
como nem todas as funções cognitivas são afetadas, biomarcadores do líquido 
cefalorraquidiano são usados junto com esses testes (PICANCO et al., 2018). 
Segundo dados da Alzheimer's Association (2021), nos Estados Unidos o 
número de mortes pela DA aumentou em 145%, entre 2000 a 2019. Mais de 6 milhões 
de Americanos com 65 anos ou mais estão vivendo com Alzheimer e estima-se que 
em 2050 esse número aumentará para 13 milhões. Um em cada três idosos morrem 
em decorrência da DA ou outra demência. No Brasil, cerca de 1 milhão de pessoas 
estão vivendo com algum tipo de demência e em todo o mundo cerca de 44 milhões 
de pessoas apresentam demência. 
Estima-se que a DA e outras demências custam em torno de 355 bilhões para 
a nação dos EUA e estes custos podem ser ainda maiores caso não haja um 
tratamento para retardar, prevenir ou interromper a doença (ALZHEIMER'S 
ASSOCIATION, 2021). Nota-se que a DA (e as demais demências) é um problema 
global de saúde que necessita do investimento para a busca por novos tratamentos. 
18 
 
Figura 2: Mecanismo molecular de dano neuronal e progressão da Doença de Alzheimer (DA). 
 
Fonte: Adaptado de TIWARI et al., 2019. 
2.2 Memória 
Memória diz respeito à capacidade de armazenamento de informações, bem 
como ao resgate e acesso às informações armazenadas. As memórias são originadas 
pela capacidade plástica do sistema nervoso, pois ocorre pela formação de novas 
conexões entre neurônios, novas sinapses. Algumas áreas do SNC são bastante 
importantes para a formação de memórias, entre elas o hipocampo. Esta região, 
localizada centralmente no cérebro, recebe conexões de várias origens sensoriais, por 
onde as informações obtidas do meio ambiente são inicialmente processadas. O 
hipocampo permite o armazenamento de curto prazo das informações e 
posteriormente codifica e prepara a memória para ser transmitida para o córtex. 
Grande parte dessas informações são armazenadas no córtex, no cerebelo e nos 
gânglios da base (FOTUHI, 2020), porém ainda não é sabido de que forma as 
memórias são armazenadas e onde se localizam. 
O armazenamento de informações na forma de memórias é um processo 
mental fundamental para o ser o humano e para os animais (OKANO; HIRANO; 
BALABAN, 2000). Segundo Robertson (2002), existem diversas formas de se adquirir 
memórias, como por exemplo através da experiência de eventos, através de vivencias 
 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tiwari%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=31410002
19 
 
ligadas a respostas emocionais, e também através do tempo. A memória de acordo 
com o tempo pode ser classificada em memória de curto prazo, que dura cerca de 
segundos ou minutos e memória de longo prazo, que pode durar meses ou anos. 
O processo de formação de memórias pode ser comprometido por fatores 
diversos, como doenças neurológicas e psicológicas, problemas metabólicos, 
medicamentos, drogas de abuso (álcool, fumo), intoxicação, etc. No entanto, durante 
o envelhecimento, é natural que o córtex cerebral reduza as atividades e fatores 
genéticos e ambientais podem acelerar esse processo, como é o caso da Doença de 
Alzheimer (DA) (KANDEL, 2014). 
O sintoma mais comum presente no início da DA está associado ao déficit de 
memória de curto prazo, que afeta as atividades diárias (BEKRIS et al., 2010; LANGE 
et al., 2017). Tanto o resgate de memória já armazenada quanto a formação de novas 
memórias são funções fundamentais para o nosso cotidiano. Assim, investigar as 
bases moleculares e neurais da memória torna-se bastante relevante, e o 
investimento em tratamentos novos e alternativos que diminuam os déficits de 
memória em pacientes de DA podem ser de grande valia. 
 
2.2.1 Tratamentos farmacológicos 
O tratamento farmacológico da DA apresenta diversas substâncias psicoativas 
recomendadas para preservar ou restabelecer a cognição e controlar o comportamento 
e as habilidades funcionais do paciente com demência. Porém, os resultados dos 
fármacos hoje aprovados para o tratamento da DA permitem apenas uma melhora 
temporária do estado funcional e na qualidade de vida do paciente. Não existem 
atualmente tratamentos que curem, previnam ou interrompam a progressão da 
doença (FORLENZA, 2005; SIMMONS et al., 2016; ALZHEIMER'S ASSOCIATION, 
2021). 
A principal abordagem terapêutica aprovada pelo FDA (Food and Drug 
Administration) atua na melhora dos níveis de acetilcolina, minimizando os efeitos 
deletérios causados pela deficiência colinérgica. Sendo assim, preconiza-se o uso dos 
inibidores da enzima acetilcolinesterase (IACHE). Juntamente com esta abordagem, 
se utiliza outra estratégia de tratamento que apresenta como mecanismo a inibição de 
ação do glutamato (SHARMA, 2019; TIEDEMAN et al., 2011). Na tabela 1 estão 
descritos os medicamentos aprovados pela FDA para a terapia DA. 
20 
 
Tabela 1: Medicamentos aprovados pela agência Food and Drug Administration (FDA) para a 
terapia da Doença de Alzheimer. 
Princípio Ativo Nome Comercial Mecanismo de Ação 
Tacrina Tacrinal® Inibidor de colinesterases 
Galantamina Reminyl ER® Inibidor de colinesterases 
Donepezila Eranz® Inibidor de colinesterases 
Rivastigmina Rivastigmina® Exelon Patch® Inibidor de colinesterases 
Memantina Ebix® 
Alois Gotas® 
Antagonista não competitivo de 
receptores NMDA 
Aducanumab Aduhelm Redução das placas beta amilóides 
 
Dentre as drogas disponíveis para o tratamento da DA, quatro medicamentos 
têm em comum a ação de inibição da enzima acetilcolinesterase, porém não são 
aprovados para o uso na fase avançada da doença (BRASIL, 2017). Diferente das 
drogas de ação colinérgica, a memantina apresenta como mecanismo de ação o 
antagonismo não competitivo dos receptores NMDA, impedindo a ligação do 
glutamato. Assim, a droga gera neuroproteção em relação a excitotoxicidade do 
neurotransmissor (glutamato), permitindo a neurotransmissão e os mecanismos de 
neuroplasticidade dos neurônios funcionais (ENGELHARDT et al., 2005). 
Outro medicamento, recém aprovado para tratar a DA é o aducanumab, um 
anticorpo. De acordo com a FDA (2021), este medicamento reduz as placas beta 
amilóides, podendo diminuir o declínio cognitivo e funcional dos portadores da doença. 
Aducanumab foi aprovado de acordo com a via de aprovação acelerada, que permite 
o uso do medicamento quando há chance provável de gerar benefício clínico para os 
pacientes com doençasgraves ou quando há risco de vida. Este medicamento ainda 
está passando por ensaios confirmatórios e caso não haja benefício clínico, poderá 
ser retirado do mercado. 
Dentre os princípios ativos dos medicamentos de ação anti-colinesterase, 
tacrina, rivastigmina, donepezil e galantamina, destaca-se a atividade de alcaloides. A 
rivastigmina é um derivado semissintético do alcaloide indólico fisiostigmina, enquanto 
a galantamina é um alcaloide isoquinolínico obtido principalmente de espécies da 
família Amaryllidaceae (MARCO; CARREIRAS, 2006; ROBERTS, 2013). 
Embora a DA acometa grande parte da população, principalmente nas faixas 
etárias mais avançadas, e seja considerada um problema de saúde pública, o arsenal 
https://www.fda.gov/drugs/information-health-care-professionals-drugs/accelerated-approval-program
21 
 
terapêutico para a DA ainda é muito limitado. É necessário e urgente a proposição de 
novas estratégias farmacológicas, torna-se interessante o estudo com produtos 
naturais oriundos de plantas, devido à grande biodiversidade de plantas medicinais 
encontradas no Brasil. 
2.3 Caatinga como celeiro de alcaloides bioativos 
A Caatinga corresponde a um ecossistema encontrado exclusivamente no 
território brasileiro e apresenta o total de 4.332 espécies de plantas com sementes, 
sendo 744 espécies endêmicas deste bioma. Sua vegetação tem características 
arbustivo-arbórea, com folhas caducifólias no verão. Folhas modificadas em espinhos, 
com presença em cactos e bromélias, tornam possível a sobrevivência dessas plantas 
nas condições do solo e clima do semiárido nordestino (FORZZA et al., 2010). 
Devido a sua ampla diversidade vegetal, a caatinga possui alto potencial 
medicinal (SÁ-FILHO et al., 2021). De especial interesse são os metabólitos 
secundários, compostos naturais produzidos por plantas, pois apresentam várias 
ações farmacológicas (BORGES; AMORIM, 2020). Os alcaloides são um dos vários 
grupos de metabólitos secundários encontrados em organismos vivos e são isolados 
tradicionalmente de plantas, mas também de animais, insetos, invertebrados marinhos 
e microorganismos. Estes alcaloides possuem uma variedade de tipos de estrutura, 
vias biossintéticas e atividades farmacológicas (ROBERTS, 2013). São substâncias 
nitrogenadas produzidas predominantes por angiospermas a partir de aminoácidos 
(figura), com caráter alcalino (KUREK, 2019). 
22 
 
Figura 3: Biossíntese de alcaloides e outros metabólitos secundários de plantas. E4P, eritrose 
4-fosfato; G3P, gliceraldeído 3-fosfato; PEP, fosfoenolpiruvato; PYR, piruvato; DOX5P, desoxixilulose 
5-fosfato; IPP, pirofosfato de isopentenilo. 
 
Fonte: Adaptada de Borrelli e Trono, 2016. 
Segundo Simões (2000), os alcaloides são classificados por aspectos 
biossintéticos, químicos e farmacológicos. Os aspectos biossintéticos são 
relacionados ao aminoácido precursor de cada alcaloide, o qual é a origem do átomo 
de nitrogênio heterocíclico de um alcaloide verdadeiro. A classificação química dos 
alcaloides considera a função do sistema heterocíclico e se é alcaloide do tipo 
primário, secundário, terciário ou quaternário. Já a classificação farmacológica é 
baseada na atividade terapêutica, como por exemplo, depressores do SNC, 
anestésicos, antipiréticos, antiespasmódicos, entre outros (SIMÕES, 2000). Os tipos 
de alcaloides são denominados de acordo com seu esqueleto molecular, por exemplo, 
os dois maiores grupos são os alcaloides indólicos e alcaloides isoquinolínicos (cada 
um com mais de 4000 substâncias). Outros grupos importantes são alcaloides 
tropânicos (∼300), alcaloides esteroidais (∼450) e, piridina e alcaloides pirrolizidínicos 
(respectivamente, ∼250 e 570) (VERPOORTE, 2005). Os alcaloides possuem uma 
variedade de classes de substâncias com os mais distintos mecanismos de ação, além 
23 
 
de serem os principais compostos que originam novos medicamentos (QIU et al., 
2014). 
Erythrina velutina é uma planta característica da região semiárida nordestina e 
é também encontrada nos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo. É 
conhecida popularmente como mulungu e muito utilizada popularmente devido às 
propriedades medicinais (DANTAS et al., 2004; VASCONCELOS et al., 2003; 
VASCONCELOS et al., 2004; RIBEIRO et al., 2006). Apresenta como constituintes 
químicos alcaloides, flavonoides, isoflavonoides, sendo a principal fonte de alcaloides 
tetracíclicos do tipo eritrina (NKENGFACK et al., 2000). 
Os alcaloides eritrínicos pertencem ao grande grupo dos alcaloides 
isoquinolínicos e possuem em sua estrutura básica uma espiroamina tetracíclica 
(figura 2A) que pode se apresentar de forma livre ou conjugada a um carboidrato 
(ESTRADA, 2011). De acordo com Amer (1991), os alcaloides eritrínicos são 
classificados em três subclasses: os dienoides, os alcenoides e as lactonas. Os 
dienoides apresentam dupla ligação entre os carbonos 1 e 2 e entre os carbonos 6 e 
7 (figura 4B), já os alcenoides possuem dupla ligação entre os carbonos 1 e 6 (figura 
4C) e a subclasse das lactonas são representadas por uma lactona no anel D (figura 
4D). Os alcaloides mais abundantes no gênero Erythrina são os dienoides, entre eles 
destacam-se a erisovina, erisodina, eritralina e erisotrina (FEITOSA, 2014). 
24 
 
Figura 4: Estrutura geral dos alcaloides eritrínicos e subclasses desses alcaloides. 
 
Fonte: Adaptado de FEITOSA, 2014. 
2.3.1 Erythrina spp. como fonte de agentes neurais 
O gênero Erythrina é amplamente estudado, no entanto dentre suas 115 
espécies apenas 35 já foram investigadas sob os aspectos farmacológicos (MAJINDA, 
2018). No Brasil são conhecidas 12 espécies, das quais 8 se encontram no Nordeste, 
como Erythrina velutina (LORENZI, 2002). 
A espécie E. velutina tem diferentes efeitos biológicos no SNC já comprovados 
cientificamente, como antinociceptivo, hipnótico, depressor do SNC, 
anticonvulsivante, ansiolítico e anti-inflamatório (SOUSA, 2015). Rauppa et al. (2008) 
verificaram que a partir do extrato aquoso-alcoólico da casca do caule de E. velutina 
um efeito semelhante ao ansiolítico foi observado em camundongos. 
A planta também vem sendo estudada quanto a seus efeitos neuroprotetores, 
como no estudo de Silva et al. (2016), estes autores testaram o extrato etanólico 
padronizado de E. velutina e investigaram o potencial neuroprotetor do extrato bruto 
e do ácido rizônico (RA) de E. velutina em células neuronais. Eles observaram 
atividade antioxidante sobre os neurônios, sugerindo um possível mecanismo para o 
efeito neuroprotetor. No trabalho de Rodrigues et al. (2017), o extrato etanólico de E. 
velutina, apresentou efeitos neuroprotetores e reverteu danos de memória induzidos 
em camundongos que foram submetidos a isquemia cerebral. 
25 
 
Outro resultado relevante foi encontrado por Almeida et al. (2020), que isolaram 
alcaloides das sementes de E. velutina (eritralina e erisodina) para avaliações 
biológicas em Caenorhabditis elegans mutantes para super expressão do peptídeo 
beta- amiloide (mutantes CL2006). Os animais selvagens não apresentaram resposta 
de toxicidade aos alcaloides, e os animais mutantes tiveram seu tempo médio de vida 
aumentado em 40% em comparação aos animais não tratados com os alcaloides. Em 
análises in sílico observou-se que erisodina e eritralina têm potencial interação com o 
sítio ativo da proteína BACE-1 (beta secretase humana – 1), indicando a potencial 
relevância desses alcaloides. 
Embora bastante utilizado, o modelo nematoide apresenta a impossibilidade de 
análises comportamentais e a maior distância filogenética com vertebrados, impondo 
algumas limitações ao uso. Assim, os estudos desenvolvidos nesta dissertação 
focaram outro modelo in vivo, o zebrafish, que permite a aplicação de testes 
comportamentais como a avaliação da resposta cognitiva. O uso de modelos 
alternativos é praxe em nosso grupo e segue diretrizes internacionais parareduzir o 
uso de roedores em experimentos in vivo. 
É importante destacar que não há modelos animais que possam mimetizar 
todos os sintomas cognitivos, comportamentais, bioquímicos e anormalidades 
histopatológicas observadas no contexto da DA em humanos. O processo de 
neurodegeneração latente envolvido na doença ocorre espontaneamente apenas em 
seres humanos. Entretanto, a reprodução parcial da neuropatologia e dos déficits 
cognitivos provenientes da doença de Alzheimer tem sido alcançado através de 
abordagens genéticas e farmacológicas (YAMADA; NABESHIMA, 2000). 
 
2.4 Zebrafish 
O zebrafish é um pequeno teleósteo da espécie Danio rerio, popularmente 
conhecido como paulistinha, nativo de regiões tropicais do sudoeste da Ásia onde 
habita riachos de água doce, rasa e de lento fluxo (SUBBIAH; KAR, 2013). Apresenta 
como vantagem a prática e experimentação executável em espaços reduzidos, por 
serem peixes de porte pequeno com tamanho de três a quatro centímetros. Apresenta 
rápido desenvolvimento (em cerca de 24 a 48 horas um óvulo fertilizado se desenvolve 
em larva com batimento cardíacos e olhos (KIMMEL et al., 1995), alta taxa de 
fecundidade (200 a 300 ovos por ovoposição), cerca de 70% de genes homólogos em 
26 
 
seres humanos, além de oferecer um modelo de baixa complexidade para 
manutenção em laboratório. Estas características tornam este peixe um modelo 
promissor e seguro (HILL et al., 2005). 
O zebrafish tem sido empregado como modelo experimental animal para 
estudos comportamentais, genéticos, toxicológicos, para descrever os mecanismos 
de doenças humanas e também para testar novos potenciais agentes terapêuticos 
(SILVEIRA, 2012). O modelo apresentou-se vantajoso em alguns estudos de avaliação 
de toxicidade e potencial terapêutico de várias substâncias em larga escala 
(RESENDE; SOCCOL, 2015). Ainda tem se destacado como modelo para estudar a 
atividade do cérebro, como aprendizado, tomada de decisão e interações socias 
(ORGER; POLAVIEJA, 2017), isso porque o cérebro do zebrafish segue plano geral 
do cérebro de um vertebrado em termos de morfologia e composição, por volta de 1 
dia após a fertilização as principais regiões do cérebro já são morfologicamente 
percebidas (ITURRIAGA-VÁSQUEZ et al., 2020). 
Além disso, possui os sistemas de neurotransmissores clássicos, como 
sistemas dopaminérgicos, serotoninérgicos, colinérgicos, purinérgicos, 
histaminérgicos, nitrérgicos, glutamatérgicos, glicinérgicos e GABAérgicos, 
semelhante aos vertebrados (RICO et al., 2011). Diante dessas características, o 
zebrafish tem se demonstrado um excelente modelo animal para avaliar produtos 
naturais, tendo em vista que a partir dele é possível testar a bioatividade de compostos 
inéditos produzidos por plantas, além da possibilidade de usar pequenas quantidades, 
como microgramas de compostos ativos, frações e extratos brutos para induzir a 
resposta biológica inicial (CHALLAL et al., 2012; BOHNI et al., 2013). 
Alguns trabalhos mostraram formas de avaliar a memória e aprendizado em 
zebrafish, como no trabalho de Lucon-Xiccato e Dadda (2014) que avaliaram a 
memória do animal através da discriminação de um objeto familiar por um objeto novo, 
que se diferenciavam pela forma e cor, os resultados mostraram a capacidade do 
animal em discriminar os objetos, outros trabalhos que fizeram testes semelhante a 
este também mostraram essa capacidade (PINHEIRO-DA-SILVA et al., 2017; 
SANTOS et al., 2016; LOBÃO-SOARES et al., 2018). Outro trabalho mostrou a 
capacidade do zebrafish em aprender e alternar para ter uma recompensa alimentar 
através de uma tarefa de alternância espacial. Para isso, os animais foram 
alimentados em lados diferentes do tanque e um cartão vermelho foi usado para servir 
como pista visual (WILLIAMS; WHITE; MESSER, 2002). Blank (2009) realizou um 
27 
 
teste que teve como objetivo desenvolver um novo paradigma de esquiva inibitória 
para zebrafish com o intuito de avaliar mecanismos celulares e moleculares da 
formação de memória em vertebrados, onde obteve resultados positivos de 
aprendizagem e formação de memória após a punição com eletrochoque por 5s, ainda 
ressaltou que após o choque os animais foram monitorados e não foi observado 
nenhum dano visível, nenhuma alteração de natação, lesão externa ou vulnerabilidade 
de desenvolver alguma patologia. 
Assim, observamos a capacidade que o zebrafish apresenta para estudar o 
processo de formação e resgate de memória. Neste estudo, utilizamos o modelo 
zebrafish para testar o potencial bioativo de alcaloides de Erythrina velutina em 
respostas cognitivas. 
 
 
 
28 
 
3 OBJETIVOS 
3.1 Objetivo Geral 
Avaliar o potencial biológico de alcaloides de Erythrina velutina nas respostas 
cognitivas em zebrafish (Danio rerio) 
3.2 Objetivos Específicos 
• Obtenção de extrato etanólico (bruto) e frações enriquecidas em alcaloides a 
partir de sementes de E. velutina; 
• Elucidação estrutural dos alcaloides das sementes de E. velutina por meio de 
métodos cromatográficos e espectroscópicos; 
• Testar a toxicidade e potencial teratogênico das frações enriquecidas em 
alcaloides das sementes de E. velutina in vivo utilizando o modelo de zebrafish; 
• Avaliar o efeito das frações enriquecidas em alcaloides nas respostas de 
memória em curto e longo prazo em zebrafish. 
29 
 
4 METODOLOGIA 
4.1 Identificação do material vegetal 
Sementes de Erythrina velutina foram doadas pela Floresta Nacional de Nísia 
Floresta (FLONA – Nísia Floresta), oriundas de seu banco de sementes. O acesso ao 
patrimônio genético está regularizado junto ao SISGEN (A4D2E0B). 
4.2 Obtenção do extrato hidroalcoólico 
As etapas relacionadas aos aspectos fitoquímicos foram realizadas conforme 
protocolos já estabelecidos (ALMEIDA, 2018; CHACON, 2018). As sementes 
selecionadas foram fragmentadas, trituradas em liquidificador industrial e tamisadas, 
para obter uma maior área de contato com o solvente extrator, aumentando a 
eficiência da extração. O extrato bruto (EB) foi obtido através da maceração 
hidroalcóolica (figura 5A) (96:4, v/v - etanol:água), durante 48 horas em temperatura 
ambiente na proporção de 1 g de planta para 10 mL de solvente, seguido de filtração 
a vácuo (figura 5B) e rotaevaporação (figura 5C). O processo foi repetido 5 vezes. O 
EB foi armazenado em recipiente fechado ao abrigo da luz, umidade e calor até ser 
utilizado para obtenção da fração enriquecida de alcaloides utilizando o método de 
partição liquido-liquido. 
Figura 5: Fases de obtenção do Extrato Bruto Hidroalcóolico: A- Maceração hidroalcoólica; B- 
Filtração a vácuo; C- Rotaevaporação. 
 
Fonte: Elaborada pelo autor, 2019. 
4.3 Obtenção das frações enriquecidas 
A obtenção da fração enriquecida em alcaloides (FEA) ocorreu através do 
procedimento de extração com variação do pH, caracterizando a extração ácido-base, 
30 
 
conforme previamente padronizado pelo grupo de pesquisa. Inicialmente, o extrato 
bruto foi solubilizado em mistura de diclorometano:metanol (8:2, v/v). Para obtenção 
da FEA foi realizada a extração com solução de ácido clorídrico (HCl) a 5%, pois com 
a adição do ácido, ocorre protonação na amina livre do alcaloide que estará no extrato, 
tornando-o mais solúvel em água e culminando em uma solubilidade do alcaloide na 
fração aquosa ácida. Na sequência, a fração aquosa já ácida foi alcalinizada em 
hidróxido de amônia (NH4OH) a 75%, com um volume suficiente para atingir pH 10. 
Nesse caso ocorreu o processo inverso à extração com ácido, pois o alcaloide voltou 
a ser uma amina de base livre resultando em uma maior solubilidade na fase orgânica. 
Esse fato justifica a próxima etapa do processo, que foi a extração com o solvente 
orgânico diclorometano (DCM), para obtenção da fração DCM alcaloídica (fração 
enriquecida em alcaloides), sendo em seguida submetida à rotaevaporação a 35°C. 
Na figura 6 é demonstrado comofoi realizada a obtenção das frações enriquecidas 
em alcaloides. 
Figura 6: Obtenção de frações enriquecidas com alcaloides: A- Solubilização da amostra com 
diclorometano (DCM) + metanol (MeoH) - 8:2; B- Extrato com diclorometano/metanol + ácido clorídrico 
5%; C- Extrato com diclorometano/metanol + ácido clorídrico 5% no funil; D- Após alcalinizar com 
NH4OH a 75% a fração aquosa ácida, foi feita a extração com diclorometano 6x; E- Última extração 
com diclorometano; F- fração DCM alcaloidica; G- Fração submetida a rotaevaporação a 35°C; H- 
Fração enriquecida em alcaloides pronta. 
 
Fonte: Elaborada pelo autor, 2019. 
4.4 Isolamento dos alcaloides majoritários 
Dois procedimentos foram realizados com o objetivo de isolar os alcaloides 
presentes na fração enriquecida. Para o primeiro, uma massa de 250 mg da fração 
enriquecida em alcaloides de sementes de E. velutina foi submetida à Cromatografia 
31 
 
em Coluna Clássica (CCC) 15x1 cm, usando alumina como fase estacionária, 
clorofórmio e metanol como fase móvel. A eluição da coluna foi realizada empregando 
inicialmente 100% clorofórmio e posteriormente foi empregada a mistura de 
clorofórmio:metanol (7:3, 5:5, 3:7, v/v, v/v, v/v), finalizando com 100% metanol, foram 
coletados um total de 55 frascos. Na segunda tentativa, novamente com a CCC foi 
usada a mesma quantidade da massa de fração, a mesma fase móvel e estacionária, 
o que foi modificado quanto ao primeiro isolamento foi à proporção da eluição da 
coluna, inicialmente 100% de clorofórmio e em seguida a mistura de clorofórmio/ 
metanol (8:2, 5:5, 3:7 v/v, v/v, v/v) e por fim 100% metanol, foram coletados um total 
de 38 frascos nesse isolamento. Para ambos isolamentos foi usada uma lâmpada 
ultravioleta para monitorar a eluição e os resultados foram analisados por 
cromatografia em camada delgada. 
4.5 Análises cromatográficas 
As análises preliminares do extrato e das frações enriquecidas em alcaloides 
foram realizadas através da Cromatografia em Camada Delgada (CCD) utilizando 
cromatoplacas de sílica gel 60GF254 (Macherey-Nagel) de fase normal como fase 
estacionária e clorofórmio, hexano e metanol (5:5:0,5 v/v/v) como fase móvel. A 
Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM) foi utilizada 
como ferramenta de análise de pureza e caracterização estrutural dos constituintes 
da FEA, bem como dos alcaloides tentativamente isolados. Foi utilizado um método 
previamente padronizado pelo grupo de pesquisa onde a análise foi feita com o injetor 
do modo split, a uma temperatura da coluna de 100°C e temperatura de injeção de 
250°C. O gás de arraste empregado foi o gás Hélio, com um fluxo total de 48,1 mL/min 
e 1,10 mL/min da coluna. O programa de temperatura foi: 100°C por 0 min, 220°C por 
10 min e 290°C durante 11 min em coluna DB5. Conforme o trabalho de Chacon 
(2018) foram usados dois reagentes para confirmação de alcaloides, um é o reagente 
Dragendorff, que é um teste qualitativo que indica a possível presença de alcaloides 
por meio de coloração cuja cor varia de acordo com o tipo de composto, desde 
amarelo a vermelho acastanhado e o outro é a vanilina, um reagente universal para 
identificar classes de metabólitos secundários, os quais apresentam colorações 
características e distintas de acordo com as respectivas estruturas químicas. 
32 
 
4.6 Atividade biológica 
4.6.1 Zebrafish 
Para os testes in vivo foram usados peixes da espécie Danio rerio, (zebrafish) 
adultos, com aproximadamente 6 meses de idade, provenientes do Biotério de Peixes 
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os animais foram mantidos em 
sistema de armazenamento (4 tanques de 50 L). Cada conjunto de quatro tanques de 
50 L formaram um sistema de recirculação com filtração de vários estágios, incluindo 
filtro mecânico, filtro biológico, filtro de carvão ativado e uma unidade de esterilização 
por luz ultravioleta/ozônio. A água do sistema foi mantida em 28°C de temperatura, 
6,7 de pH e 6mg/L de oxigênio. O ciclo de luz de 12h claro e 12h escuro (12C:12E) foi 
mantido no ambiente de criação e experimentação. Os animais foram alimentados 
duas vezes ao dia com ração comercial peletizada (alcon Basic®, 45% de proteína, 
5% de gordura, Alcon, Brasil) e náuplios de artêmia (Direct grill brine shrimp, Direct, 
EUA). Os procedimentos foram autorizados pelo Comitê de Ética em Animais da 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (protocolo 002/2021). 
4.6.2 Toxicidade 
A toxicidade foi avaliada de acordo com as diretrizes da Organização para 
Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE, protocolos 215 e 236) para 
peixes. 
As frações enriquecidas em alcaloides (FEA) foram solubilizadas em 
dimetilsulfóxido 2% (DMSO) e obtida uma solução mãe de 50 mg/mL de FEA. Essa 
solução foi diluída para realização dos testes posteriores, incluindo a construção de 
uma curva de concentração para determinar o valor de LC50 (lethal concentration) 
usando o teste de toxicidade de renovação estática. 
4.6.2.1 Embriões 
Inicialmente realizamos o teste de toxicidade em embriões. Para isso, peixes 
adultos (3 fêmeas e 2 machos) foram colocados em tanques de reprodução de 1L e 
1,5L de água do sistema. Na parte inferior do tanque de reprodução, uma placa de 
acrílico com pequenos orifícios favorece a decantação dos ovos e impede o acesso 
dos peixes. Plantas de plástico foram usadas visando o enriquecimento do tanque 
para a reprodução. Os animais reprodutores foram colocados à tarde (por volta das 
33 
 
17h) e mantido fisicamente isolados por uma barreira acrílica transparente e nas 
mesmas condições do biotério (28 ˚C, 12C:12E). A barreira foi removida ao acender 
das luzes e a fertilização foi realizada por desova natural, que geralmente ocorre na 
primeira hora da luz da manhã. 
Os ovos coletados foram acondicionados em placas de petri e mantidos em 
estufas a 28°C. Vinte e quatro horas pós fertilização (hpf), os ovos foram distribuídos 
em placas com 24 poços (3 ovos/poço) contendo diferentes concentrações de FEA. 
Foram testadas as seguintes concentrações: 100, 50, 10, 9 e 8 ug/ml de FEA de E. 
velutina. Dois grupos controles foram adicionados: DMSO 2% (controle) e água do 
sistema (controle água). Em cada concentração, 18 embriões foram mantidos por 2h, 
para garantir que os alcaloides tivessem tempo de atingir o SNC dos animais, depois 
foram lavados em água do sistema e observados por 5 dias, duas vezes ao dia. 
As observações diárias do desenvolvimento dos embriões foram feitas em 27, 
32, 48, 55, 72, 79, 96, 103 e 120 hpf. Os embriões foram fotografados a cada estágio 
de desenvolvimento. O número de animais mortos em cada estágio foi contabilizado. 
A curva de Kaplan-Meier foi construída e uma comparação da taxa de 
sobrevivência entre os grupos foi realizada usando o teste Log-rank, o nível de 
significância foi estabelecido em p <0,05. A avaliação da taxa de mortalidade 
embrionária foi feita a partir da curva dose-resposta, usando o software R (versão 
4.0.5). 
4.6.2.2 Adultos 
Para os peixes adultos (4 a 5 meses), as concentrações testadas foram 100, 
50, 25, 10, 5 ug/L de FEA, além dos controles 0,05% DMSO (controle) e água do 
sistema (controle água). Para as exposições crônicas por 96h, as soluções foram 
dispostas em tanques de 2L que receberam 15 zebrafish adultos cada. As soluções 
foram trocadas diariamente devido à meia-vida desconhecida da FEA e para garantir 
a qualidade da água. 
Os peixes não foram alimentados durante o procedimento. A mortalidade foi 
verificada quatro vezes ao dia em busca da determinação da LC50. Devido à ausência 
de mortalidade, procedemos com um teste de tanque novo. O teste é um protocolo 
comumente usado para obter dados sobre endpoints comportamentais, como 
locomoção e ansiedade, com o objetivo de identificar efeitos tóxicos de compostos no 
cérebro de diferentes espécies animais (FERGUSON; BOWMAN, 1990; KARL etal., 
34 
 
2003; BLASER et al., 2010). O tanque novo em zebrafish pode revelar semelhanças 
entre modelos animais e métodos relacionados à exploração ambiental (EGAN et al. 
2009; BLASER; ROSEMBERG, 2012). 
Assim, após 96h de exposição às concentrações mais elevadas de FEA (100 e 
50 ug/L), os peixes foram testados no paradigma do tanque novo. O teste consiste em 
um aquário trapezoidal (22x 15 x 10 cm) de 2L, em que o comportamento dos animais 
é registrado individualmente por 6 min. Os grupos para o teste foram: 0,05% DSMO 
(controle), água do sistema (controle água), 100 ug/L de FEA e 50 ug/L de FEA (n=15 
por grupo). Para o registro, foi usada uma webcam (Logitech® C920 Full HD) e 
posteriormente o comportamento foi analisado por um software de rastreamento 
denominado ANY-maze (Stoelting Co.). Os seguintes parâmetros foram avaliados: 
tempo na zona inferior do aquário, tempo na zona intermediária e tempo na zona 
superior, ângulo de giro absoluto e parâmetros locomotores (velocidade média, 
distância total percorrida e velocidade média em movimento, que desconta o tempo 
que o animal permaneceu parado no tanque). 
Os dados comportamentais foram comparados pelo teste de ANOVA one-way 
ou Kruskal-Wallis seguido pelo teste post-hoc Student-Newman-Keuls ou Dunn, a 
depender da parametricidade dos dados. As diferenças foram consideradas 
estatisticamente significativas a p <0,05. 
4.6.3 Testes de memória 
4.6.3.1 Tratamento com a fração enriquecida em alcaloides 
De acordo com os resultados obtidos no teste de tanque novo (ver na seção de 
resultados), definimos a concentração de 50 ug/L para os testes de memória em 
zebrafish. Assim, 60 animais adultos foram divididos em 3 grupos (n=20) e expostos 
a 50 ug/L de FEA, 0,05% de DMSO (controle) e água do sistema (controle água) 
durante 1 hora por dia por 7 dias. Em seguida, os animais foram testados quanto a 
memória de curta duração (T-maze) e de longa duração (discriminação de objetos). 
4.6.3.2 Teste de memória de curta duração (T-maze) 
Para avaliar a aprendizagem espacial e a memória de curta duração, 
adaptamos o protocolo de Cognato et al. (2012). 
35 
 
Usamos um tanque em forma de T cujas dimensões dos braços eram: 30 cm 
de comprimento, 10 cm de altura e 10 cm de largura. Cada braço tinha as paredes 
cobertas com papel adesivo preto para evitar estímulos visuais externos, e o chão foi 
coberto com papel branco para contraste com a cor dos peixes. Diferentes formas 
geométricas (triângulos, quadrados e círculos) feitos em papel branco foram 
distribuídos ao longo de cada braço do labirinto para servir como uma pista visual 
diferente. O teste ocorreu em duas fases: treino e teste. Na fase de treino, um dos 
braços foi fechado e os peixes puderam explorar o braço inicial (onde foi colocado 
inicialmente) e outro braço por 10 minutos. Após 1h de intervalo, a memória espacial 
foi testada no mesmo ambiente, porém com os três braços abertos e os peixes 
(inicialmente colocados no braço inicial) tiveram acesso aos três braços (o inicial, o 
outro e o braço novo). No teste, a atividade locomotora foi registrada por 10 min e era 
esperado que o animal aumentasse a exploração do braço novo (indicador de 
memória), pois o peixe lembra dos dois braços anteriores e reconhece o braço novo. 
Para ambas as fases experimentais, o braço inicial foi o mesmo. Outros braços e 
novos braços foram escolhidos aleatoriamente para cada peixe. Cada animal foi 
testado individualmente. Tempo e latência para sair do braço inicial foi medido. 
Padrões locomotores, como distância total percorrida e velocidade média durante o 
movimento foram analisados (controle DMSO: n=20, controle água: n=20 e 50 ug/L 
de FEA: n=20). 
Todo o comportamento foi filmado usando uma webcam (Logitech® C920 Full 
HD) e analisado pelo software de rastreamento ANY-maze. A comparação entre os 
grupos e fases, assim como, o tempo gasto em cada braço, foi analisado por ANOVA 
two-way, considerando como fatores o tratamento (água, DMSO e E. velutina), a fase 
experimental (treino e teste) e a interação entre os dois fatores, seguindo pelo teste 
de post-hoc de Student-Newman-Keuls. As diferenças foram consideradas 
estatisticamente significativas quando p <0,05. A análise estatística foi realizada pelo 
software SigmaStat 5.0. 
4.6.3.3 Discriminação de Objetos 
Para acessar a memória de longa duração, utilizamos o protocolo de Oliveira 
et al. (2015), que implica em um intervalo de 24h entre as sessões de treino e teste. 
O teste ocorre em três fases: (1) aclimatação no tanque (40 x 20 x 20 cm, 
completamente forrado com papel contact branco), (2) fase de memorização e (3) fase 
36 
 
de discriminação. Para os objetos a serem discriminados, foram utilizados cubos de 
plástico Lego® (4x4x4 cm) com cores completamente randomizadas para evitar 
preferência entre objetos. 
A fase de aclimatação (1) teve duração de cinco dias. Os peixes foram 
individualmente colocados no tanque e exploraram por 15 min cada dia, sem objetos, 
para se acostumar com a nova arena e reduzir o estresse da novidade. Para reduzir o 
estresse do isolamento, devido à alta sociabilidade do zebrafish, 5 peixes exploraram 
o tanque de teste juntos no primeiro dia, e o número de animais foi progressivamente 
reduzido até que apenas um animal explorasse o tanque no 5º dia de aclimatação. 
A fase de memorização (2) ocorreu no dia 6º dia. Dois objetos 3D (chamados A 
e A’) com as mesmas cores, tamanho e forma foram introduzidos no tanque, cada um 
posicionado ao lado de cada parede menor e cerca de 30 cm um do outro. Os peixes 
foram individualmente colocados no tanque para explorar os dois objetos por 15 min. 
O comportamento foi gravado usando uma webcam (Logitech® C920 Full HD). Depois 
disso, os peixes foram alocados individualmente em recipientes de 400 ml até o 
próximo dia de teste. No dia seguinte, a fase de discriminação (3) ocorreu. Para isso, 
o objeto A’ da fase de memorização foi substituído por um objeto desconhecido 
(chamado objeto B), com o mesmo tamanho e forma, mas com cor diferente. O 
comportamento de exploração dos peixes foi novamente filmado por 15 min. Em 
ambas as fases, a permanência do animal em uma área de 3 cm ao redor dos objetos 
foi considerada comportamento de exploração (LUCON-XICCATO; DADDA, 2014). 
O comportamento registrado em vídeo foi analisado usando o software de 
rastreamento ANY-maze e foram avaliados os seguintes parâmetros 
comportamentais: velocidade média e máxima de natação, distância percorrida e 
tempo de exploração de cada objeto. Os parâmetros de velocidade média e máxima de 
natação e distância total percorrida foram avaliados por teste de ANOVA one-way para 
comparação entre os grupos experimentais. O tempo gasto em torno dos objetos 
(exploração) foi comparado entre as fases de memorização e discriminação para cada 
grupo experimental (controle DMSO: n=20, controle água: n=20 e 50 ug/L de FEA: 
n=20) pelo teste de ANOVA two-way (considerando tempo de exploração de cada 
objeto e dia de teste, além da interação entre os fatores). Em casos de resultado 
significativo, comparações post-hoc usando Student-Newman-Keuls (SNK) foram 
feitas. 
37 
 
O índice de exploração para a fase de memorização (exploração da 
memorização = Em = A1 + A2) e o índice de discriminação para a fase de 
discriminação (índice de discriminação = Di = B-A3) foram calculados para cada grupo 
para estabelecer se havia diferenças no tempo de exploração do objeto. A análise de 
regressão linear foi realizada para determinar se Em foi preditivo de Di, ou seja, para 
avaliar se o tempo gasto explorando os objetos na fase de memorização se relaciona 
com a exploração de novos objetos na fase de discriminação. 
As análises foram realizadas pelo SigmaStat 5.0. Para todas as comparações, 
o nível de significância foi estabelecido em p <0,05. A seguir a figura 7 resume as 
etapas da metodologiadiscutida neste trabalho. 
 
38 
 
Figura 7: Esquema experimental. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fonte: Elaborado pelo autor. 
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 
5.1 A análise química preliminar do extrato e seus alcaloides através da 
Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
Foi realizada a partir da CCD uma análise preliminar para confirmação de 
alcaloides nas amostras das frações e dos alcaloides isolados. Inicialmente para 
análise das frações foram usadas cromatoplacas de sílica de gel, como fase 
estacionária e como fase móvel clorofórmio, hexano e metanol (5:5:0,5 v/v/v). As 
amostras foram diluídas em DCM e aplicadas na placa. Em seguida foram observadas 
Identificação 
e coleta do 
material 
vegetal
Obtenção do 
Extrato hidro-
alcoólico
Obtenção das 
Frações 
Enriquecidas
Isolamento dos 
alcaloides
majoritários
Análises 
Cromatográficas
Ensaios 
biológicos
Toxicidade
Testes de 
Memória e 
Cognição
Análises 
Cromatográficas
39 
 
sob luz UV para visualização das bandas. Para esta análise foram feitas duas placas 
iguais, cada uma exposta a um reagente diferente. Na figura 8 estão ilustradas as 
frações sob a luz UV e reveladas com o reagente Dragendorff. 
Figura 8: Cromatografia em camada delgada das frações enriquecidas em alcaloides (F1, F2, 
F3, F4, F5) obtidas de sementes de Erythrina velutina: A- Frações sobre a luz UV; B- Frações reveladas 
com o reagente Dragendorff. 
 
Fonte: Elaborada pelo autor. 
Na imagem da figura 8A, observamos algumas bandas evidentes de absorção 
das frações quando em contato com a luz UV, corroborando com o resultado da 
imagem da figura 8B, que indica a presença de alcaloides nas frações. Também foi 
realizada uma CCD das frações com clorofórmio/hexano/metanol (5:5:0,5 v/v/v) como 
fase móvel, que foram observadas na luz UV e reveladas tanto com Dragendorff 
quanto com vanilina. Este último reagente indica classes de metabólitos e compostos 
que não são alcaloides, considerado impurezas. Na figura 9, estão ilustradas as 
frações sob a luz UV, as frações reveladas com o reagente vanilina e com o 
Dragendorff.
40 
 
 
Figura 9: Frações enriquecidas em alcaloides (F1, F2, F3) obtidas de sementes de Erythrina 
velutina reveladas com Dragendorff sob luz UV: A e C- frações sobre a luz UV; B- frações reveladas 
com vanilina; D- frações reveladas com Dragendorff. 
 
Fonte: Elaborada pelo autor. 
Após a exposição das placas sob a luz UV, uma placa foi exposta ao 
Dragendorff, no qual foram reveladas bandas alaranjadas, que corroboram com as 
bandas observadas sobre a luz UV, indicando a presença de alcaloides. A outra placa 
foi revelada com vanilina, e não foi observada banda ou cor que pudesse indicar outro 
composto. As duas placas foram feitas com as mesmas amostras, com o objetivo de 
identificar se as amostram possuíam alcaloides ou algum outro composto. 
Na imagem A e C da figura 9, foram verificadas zonas de absorção vistas na 
luz UV. Na imagem B, revelada com vanilina, foram visualizadas as mesmas bandas 
da imagem D, revelada com Dragendorff, indicando a presença de alcaloides. 
Foram feitas também análises preliminares para confirmação de alcaloides nas 
amostras que foram isoladas a partir da CCC, essa análise foi feita também por CCD, 
usando a fase móvel clorofórmio/hexano/metanol (5:5:0,5 v/v/v) e observadas na luz 
UV para demonstração das bandas. Em seguida, as placas foram reveladas com 
Dragendorff, que revelou bandas alaranjadas de acordo com as bandas observadas 
sob luz UV, indicando a presença de alcaloides nessas amostras. Porém, foi 
observado um baixo rendimento dos alcaloides isolados e a cada vez que a CCD era 
repetida, um novo perfil era observado sugerindo a ocorrência de degradação. Assim, 
foi escolhida a amostra enriquecida em alcaloides como amostra de trabalho e para 
avaliação das respostas biológicas. 
 
41 
 
5.2 Análise por Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas 
(CG-EM) 
Através da análise do extrato dos alcaloides totais por CG-EM, foi obtido o 
cromatograma conforme está representado na figura 10. Entre os componentes 
detectados, dois se apresentaram entre os majoritários, representando 67% da área 
total do cromatograma (pico I e II). O pico I com tempo de retenção em 28.293 min 
apresentou espectro de massas com íon molecular de 299 u.m.a., e pico base em m/z 
268 (figura 11), além de outros fragmentos importantes como: m/z 266, m/z 284, m/z 
299, m/z 215, m/z 228, m/z 241. Esses padrões são característicos do alcaloide 
eritrínico dienoide erisodina (FEITOSA, 2014), que possui a fórmula molecular 
C18H21NO3. O pico II no tempo de retenção em 31.682 min, apresentou o espectro de 
massas similar ao citado anteriormente (figura 12), com os mesmos íons 
característicos do alcaloide erisodina. Esses dados sugerem tratar-se de isômeros 
estruturais com mesma massa molecular, o que é comum aos alcaloides eritrínicos 
apresentando diferenças quanto à posição dos mesmos substituintes em anéis 
aromáticos, posição de insaturações e mesmo presença ou não do grupamento 
metilenodioxi-fenila. Essa quimiodiversidade dos alcaloides com pequenas alterações 
estruturais que dificultam a análise inequívoca estão sendo exploradas e investigadas 
por nosso grupo (CHACON et al., 2021). 
42 
 
Figura 10: Cromatograma obtido por CG-EM das frações enriquecidas em alcaloides. 
 
Figura 11: Espectro de massas do pico com tempo de retenção em 28.293 min. 
 
 
Figura 12: Espectro de massas do pico com tempo de retenção em 31.682 min. 
 
 
Estudos anteriores (FEITOSA, 2014; AMER et al., 1991; LEAL, 2018) 
identificaram o alcaloide erisodina e seu isômero erisovina em amostras de E. velutina 
43 
 
e E. verna. Ambos os alcaloides apresentaram a mesma fragmentação no espectro 
de massa em diferentes tempos de retenção e a mesma forma molecular C18H21NO3 
condizente com os isômeros erisodina (figura 10) e erisovina (figura 10), que se 
diferenciam apenas com alteração na posição do grupo metoxila e hidroxila em R1 e 
R2. Esse resultado foi evidenciado por Singh et al. (1981) através de dados de 
espectrometria de massas com ionização por eletrospray (IES-EM), infravermelho (IV) 
e ressonância magnética nuclear (RMN 1H). Esses dados estão de acordo com os 
padrões descritos de fragmentação para estes isômeros (FEITOSA, 2014; AMER et 
al., 1991). 
A diferenciação de isômeros de forma geral já representa um dos grandes 
desafios na área química e requer o uso de diferentes técnicas analíticas (EBERLIN; 
BENASSI, 2012). Sobretudo nos alcaloides eritrínicos, cuja elevada diversidade 
molecular é atribuída principalmente aos padrões de substituição como –OH, –CH3, -
OCH3, geralmente encontrados em C3, C8 e C11 do esqueleto do núcleo principal do 
alcaloide, diferentes técnicas são indispensáveis (CHACON et al., 2021). A distinção 
entre os isômeros não foi possível pela análise deste estudo, pois para maiores 
informações estruturais de cada componente seria necessário realizar o isolamento 
em situação que garanta a integridade química e análises complementares de 
ressonância magnética nuclear (RMN), conforme executado por Feitosa (2014). 
Considerando a diferença entre o tempo de retenção entre os isômeros apresentado 
por Feitosa (2014) e a identificação estrutural, sugere-se que na fração de alcaloides 
totais de E. velutina tem-se a erisodina no tempo de retenção menor (28.2 min) e a 
erisovina no tempo de retenção maior (31,6 min). 
44 
 
Figura 13: Estrutura da erisodina e erisovina. 
 
Fonte: adaptado de FEITOSA, 2014. 
5.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA 
5.3.1 Toxicidade 
Após o teste de toxicidade aguda com embriões de zebrafish expostos por 2h 
às diferentes concentrações de FEA, a curva de Kaplan-Meier gerada (figura 14) 
indica baixa sobrevivência para as concentrações de 100 e 50 ug/ml (p<0,0001), em 
que os embriões apresentaram coagulação nas primeiras horasde observação. 
Segundo a OECD 236 (2013), esse ponto é um indício de toxicidade aguda. Os 
embriões expostos às concentrações de 0,5 e 8 ug/ml tiveram maior taxa de 
sobrevivência e não apresentaram qualquer anormalidade morfológica até 120 hpf. A 
LC50 da FEA foi estimada em 17,40 ug/ml. 
Figura 14: Curva de Kaplan-Meier seguida pelo teste Log-rank para comparação da taxa 
de sobrevivência entre os grupos. Nível de significância foi estabelecido em p <0,05. 
 
45 
 
No teste de toxicidade crônica para animais adultos, nós não observamos 
mortalidade decorrente da exposição a FEA durante as 96h. Até o presente momento, 
não é de nosso conhecimento qualquer outro estudo que tenha observado toxicidade 
de FEA de E. velutina em zebrafish. O estudo de Craveiro et al. (2008) avaliou a 
toxicidade aguda do extrato aquoso das folhas de E. velutina em ratos wistar adultos 
por via oral, com uma dose limite de 5g/kg do extrato por 14 dias e não houve 
mortalidade ou sinais de toxicidade nesses animais. No trabalho de Chacon (2018), o 
extrato das sementes de E. velutina nas concentrações de 1mg/mL, 5mg/mL e 
10mg/mL, e os alcaloides isolados, eritralina e erisodina, nas concentrações de 10μM, 
50μM e 100μM não causaram efeito tóxico em C. elegans. Portanto, a toxicidade do 
extrato ou de FEA devem estar relacionadas ao estágio de desenvolvimento do SNC. 
Em zebrafish, os primeiros estágios de desenvolvimento embrionário são bastante 
sensíveis a elementos químicos, e diversos estudos mostram alterações morfológicas 
e comportamentais da exposição embrionária a alcaloides como cafeína (CHEN et al., 
2008), nicotina (MORA-ZAMORANO et al., 2016), arecolina (PENG et al., 2015), e 
matrina (TROPEPE; SIVE, 2003). 
No presente estudo, FEA de E. velutina causou toxicidade apenas em 
embriões, mas não houve mortalidade em zebrafish adultos. Assim, realizamos o teste 
de tanque novo para verificar se os animais apresentavam alterações 
comportamentais indicativas de toxicidade das concentrações mais elevadas de FEA. 
5.3.2 Teste de tanque novo 
Após 96h de exposição crônica a 50 e 100 ug/L de FEA de E. velutina, os dados 
comportamentais de zebrafish adultos em tanque novo foram avaliados (figura 15 e 
16). O teste de ANOVA one-way indicou efeito significativo para os parâmetros 
locomotores analisados: distância total percorrida (F = 11,793; P = 0,008; figura 15A), 
velocidade média (F = 11,793; P = 0,008) e a velocidade média em movimento (F = 
3.697; P=0,017; figura 15B). O teste post hoc de SNK mostraram que os indivíduos 
que foram submetidos a FEA reduziram os comportamentos de locomoção e 
exploração do tanque em comparação aos animais dos grupos controle. 
46 
 
Figura 15: Análise de parâmetros locomotores de zebrafish submetidos ao teste de tanque 
novo por 6min: A- Distância total percorrida; B- Velocidade Média; C- Velocidade enquanto móvel. (*) 
indica diferença entre os grupos. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a p 
<0,05. 
 
Os dados referentes ao ângulo de giro absoluto (Anova one-way F = 9,639; P 
= 0,022), tempo despendido na zona superior do tanque (Kruskal-Wallis H = 24,348; 
P <0,001) e na zona inferior do tanque (Kruskal-Wallis H = 25,017; P <0,001) também 
foram estatisticamente significativos. Os testes post hoc (SNK e Dunn) indicaram que 
os animais expostos a FEA de E. velutina apresentam natação com ângulos mais 
fechados (mais zig-zag) e maior tempo de locomoção na área superior do tanque. 
Este tipo de comportamento indica menor ansiedade e mais rápida habituação ao 
ambiente novo (menor estresse) (WIPRICH et al., 2020). Os animais expostos a 50 
ug/L passaram mais tempo na zona superior em comparação aos outros grupos, 
assim observamos resposta dependente da concentração de FEA. 
47 
 
Figura 16: Análise dos parâmetros locomotores que indicam atividade ansiolítica para os 
animais expostos as FEA (50 ug/L e 100 ug/L): A- Ângulo de giro absoluto; B- Tempo nas zonas do 
tanque. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a p <0,05. Letras diferentes 
indicam diferença estatística entre os grupos (a  b  c). 
 
 
Estes resultados demonstraram que a FEA reduz a ansiedade, reduz 
parâmetros locomotores e aumenta o tempo na área superior do tanque e nas viradas 
de ângulo de giro absoluto. A Erythrina velutina já apresenta efeitos farmacológicos 
descritos sobre aspectos relacionados a ansiedade (SILVA, 2020). No estudo de Silva 
et al. (2009), tanto o extrato bruto quanto a fração alcaloídica de E. velutina geraram 
efeito ansiolítico em camundongos. Raupp et al. (2008) sugerem que a administração 
crônica do extrato de hidroalcóolico das cascas de E. velutina em camundongos 
exerce efeito ansiolítico, assim como Ribeiro et al. (2006) mostraram usando o extrato 
hidroalcóolico das cascas de Erythrina velutina em ratos. Em nosso estudo, o primeiro 
a usar o zebrafish como modelo experimental para testar frações enriquecidas em 
alcaloides obtidas a partir das sementes de E. velutina, as concentrações mais 
elevadas de FEA reduziram o comportamento tipo-ansioso, corroborando estudos 
anteriores com a mesma planta. 
De maneira geral, as concentrações de 50 e 100 ug/L de FEA não mostraram 
efeitos diferentes. Apenas para o comportamento de natação na região 
superior/inferior do tanque, a concentração de 50 ug/L induziu efeito significativamente 
diferente da concentração de 100 ug/L. Desta forma, apenas 50 ug/L foi escolhida 
para seguir com os testes de memória. 
48 
 
5.3.3 Teste de memória de curta duração (T- maze) 
Este teste teve como objetivo avaliar a memória de curta duração do zebrafish. 
Esse tipo de memória indica a capacidade de retenção de informação em estado ativo 
e prontamente disponível durante um curto período de tempo. A principal função da 
memória de curto prazo (ou curta duração) é garantir acesso imediato às informações 
recém adquiridas, dentro de um curto período de tempo. Neste caso, a redução do 
estresse, menor ansiedade e habituação ao ambiente favorece a formação de 
memória de curta duração, pois o indivíduo pode focar nas informações relevantes do 
meio. 
O resultado encontrado para este estudo mostra que o zebrafish tratado com 
FEA ou controle apresentam similaridade na latência para deixar o braço inicial do T-
maze (figura 17). ANOVA two-way indicou resposta não significativa relacionada ao 
fator tratamento (F= 0,826; P= 0,44) e não significativa relacionada à interação 
tratamento vs. fase (F= 0,267; P= 0,766), porém indicou resultado significativo para o 
fator fase (F= 5,957; P= 0,016). Este resultado mostra que os animais se comportaram 
de forma semelhante para sair do braço inicial, mas todos os grupos apresentaram 
menor latência de saída no segundo momento no labirinto, indicando ter havido 
reconhecimento do ambiente. Isso pode se dar pelo fato de que no primeiro momento, 
na fase de treino, o ambiente ser desconhecido para o peixe (aumento de ansiedade), 
enquanto no segundo momento, na fase de teste, o ambiente já conhecido provoca 
redução de ansiedade e permite maior exploração. 
Figura 17: Gráfico representando a latência para o peixe sair do braço inicial na fase de treino 
e de teste do T-maze. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a p <0,05. (*) 
indica diferença entre os grupos. 
 
 
49 
 
Na fase de treino, o tempo de permanência no braço inicial e no outro braço 
(apenas esses dois braços podiam ser explorados nesta fase) não foi estatisticamente 
significativo (figura 18a). ANOVA two-way não indicou significância para o fator 
tratamento (F=0,054; P =0,94), para o fator braço (F=0,88; P =0,35), ou para a 
interação entre os fatores (F=0,008; P =0,99). Desta maneira, podemos concluir que 
todos os grupos exploraram de maneira semelhante os 2 braços do labirinto durante 
a fase de treino, tendo permanecido tempo