DeteccaogenesblaIMP-1-Silva-2016

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS 
 
 
 
 
 
 
EDILAINE TIBURCIO DA SILVA 
 
 
 
 
 
 
 
 
DETECÇÃO DOS GENES blaIMP-1, blaNDM-1 e blaVIM-1 EM BACILOS GRAM 
NEGATIVOS ISOLADOS NO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL/RN 
2016 
 
 
EDILAINE TIBURCIO DA SILVA 
 
 
 
 
 
 
 
DETECÇÃO DOS GENES blaIMP-1, blaNDM-1 e blaVIM-1 EM BACILOS GRAM 
NEGATIVOS ISOLADOS NO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE 
 
 
 
 
 
 
Dissertação de mestrado 
apresentada ao Programa de Pós- 
Graduação em Ciências 
Biológicas, da Universidade 
Federal do Rio Grande do Norte, 
como requisito para obtenção do 
título de mestre em Ciências 
Biológicas. 
Orientador: Prof. Dr. Renato Motta Neto 
 
 
 
 
 
Natal- RN 
2016 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN 
Sistema de Bibliotecas - SISBI 
atalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB 
Silva, Edilaine Tiburcio da. 
Detecção dos genes blaIMP-1, blaNDM-1 e blaVIM-1 em bacilos gram negativos 
isolados no Estado do Rio Grande do Norte / Edilaine Tiburcio da Silva. - Natal, 2016. 
59 f.: il. 
 
Orientador: Prof. Dr. Renato Motta Neto. 
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de 
Biociências. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. 
 
 
1. Resistência Bacteriana - Dissertação. 2. Pseudomonas aeruginosa - Dissertação. 3. 
Carbapenêmicos - Dissertação. I. Motta Neto, Renato. II. Universidade Federal do Rio 
Grande do Norte. III. Título. 
 
RN/UF/BSE-CB CDU 616-093/-098 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabalho especialmente 
a minha voinha, Maria Cícera, que partiu 
antes do tempo de receber essa 
singela homenagem; aos meus pais 
que acreditaram na minha capacidade 
e que me instruíram da melhor maneira 
possível para que eu chegasse até aqui. 
 
AGRADECIMENTOS 
Primeiramente a Deus, por me permitir momentos tão especiais e me manter de 
pé frente a cada dificuldade me mostrando sempre o caminho certo a seguir. 
Aos meus pais Diacuy Tiburcio e Francisco Eider que nunca mediram esforços 
para me dar a melhor criação que lhes foi possível. Por me ensinarem a ser forte e por 
acreditarem sempre no meu potencial. A vocês serei eternamente grata e deverei todas 
as minhas vitórias. 
Ao meu irmão, Eider Tiburcio pela amizade companheirismo e carinho. 
 
Aos meus grandes amigos e amigas: Anthony, Bárbara, Citnhya, Laíse, Nelson e 
Tainá que estão comigo desde a graduação. Muito obrigada pelo apoio nos momentos 
difíceis e principalmente pela amizade e risadas nesses quase sete anos de convívio. 
Vocês foram essenciais nessa etapa da minha vida do começo ao fim. Podem ter certeza 
que eu amo mais que Chocolate. 
Aos meus novos amigos: Jéssica, Maxwell, Aíla, Danilo e Wanderson, muito 
obrigada pelo acolhimento e pelos momentos de descontração proporcionados. 
Ao meu orientador Prof. Dr. Renato Motta, o meu muito obrigado por ressaltar 
minhas limitações e, dessa forma, me incentivar a superá-las. Obrigado por confiar em 
mim e por proporcionar oportunidades de crescimento profissional. 
Ao Mestre e Doutorando em Bioquímica, Andrew Douglas, pela ajuda e apoio 
em todos os momentos necessários. Obrigada por toda a atenção, por todos os 
ensinamentos e constantes conselhos científicos. 
À Prof.ª Dr.ª Lilian Giotto que contribuiu durante o andamento do meu trabalho. 
 
Aos meus colegas do LABMIC, especialmente a Fagner Martins, obrigada por 
toda ajuda, incentivo e amizade. 
A Universidade Federal do Rio Grande do Norte e ao Programa de Pós- 
graduação em Ciências Biológicas. 
À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), 
pela bolsa de mestrado concedida. 
A todos que de alguma forma contribuíram para elaboração desse trabalho, meus 
sinceros agradecimentos. 
i 
 
 
RESUMO 
A resistência bacteriana é um problema de saúde pública crescente em todo o mundo e a 
disseminação dos genes de resistência aos antimicrobianos compreende uma 
preocupação recorrente. Diante dessa problemática optou-se em realizar um estudo para 
detectar a ocorrência de Metalo-beta-lactamases (MBLs) dos tipos: blaIMP-1, blaNDM-1 e 
blaVIM-1 em Bacilos Gram negativos recrutados de três centros de referência em saúde 
no Estado do Rio Grande do Norte, durante o período de janeiro de 2013 a dezembro de 
2015. Participaram deste estudo 100 isolados bacterianos com perfil de susceptibilidade 
aos carbapenêmicos reduzido. Destes, 57 foram positivos na triagem fenotípica para 
MBL (utilizando o EDTA como inibidor de MBL) e 6 na triagem molecular, na qual o 
gene blaNDM-1 foi detectado pela Reação em cadeia da polimerase (PCR). Os isolados 
bacterianos que mais apresentaram resistência aos carbapenêmicos foram: 
Acinetobacter spp. (n=38), Pseudomonas aeruginosa (n=47) e Klebsiella sp. (n=14). 
Espera-se que esses resultados possam ser ampliados e utilizados como referência a 
nível estadual, para medidas de controle da dispersão dessa resistência no ambiente 
hospitalar e sirva como dado nacional para a construção de um perfil mais fidedigno no 
que diz respeito à epidemiologia desse mecanismo de resistência. 
Palavras chaves: MBL; Resistência; carbapenêmicos; Pseudomonas aeruginosa, 
Acinrtobacter sp, Klebsiella sp. 
ii 
 
 
ABSTRACT 
Bacterial resistance is a growing public health problem worldwide and dissemination of 
antimicrobial resistance genes comprises a recurring concern. Faced with this alarming 
situation. Faced with this problem it was decided to conduct a study to detect the 
occurrence of Metallo-beta-lactamases (MBLs) types: blaIMP-1, blaNDM-1 and blaVIM-1 in 
Gram-negative bacilli recruited three health centers of reference in State of Rio Grande 
do Norte, during the period January 2013 to December 2015. The study included 100 
bacterial isolates with reduced susceptibility profile to carbapenems. Of these, 57 were 
positive for the phenotypic screening MBL (using EDTA as MBL inhibitor) and 6 in the 
molecular screening, in which the blaNDM-1 gene was detected by polymerase chain 
reaction (PCR). Bacterial isolates that showed more resistance to carbapenems were: 
Acinetobacter spp. (N = 38), Pseudomonas aeruginosa (n = 47) and Klebsiella sp. (N = 
14). It is expected that these results could be extended and used as a reference at a state 
level, preventing dispersion of this resistance and also serving as an additional national 
data to build a more reliable profile in respect to the epidemiology of this resistance 
mechanism. 
Key words: MBL; Resistance; carbapenems; Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter 
sp, Klebsiella sp. 
iii 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
 
 
 
Figura 1: Classificação e estrutura básica dos antimicrobianos beta- 
lactâmicos. ................................................................................................. 17 
 
Figura 2: Representação esquemática da extração de dna utilizando o mini kit dna 
genômico purelink®. ......................................................................... 34 
 
Figura 3: Eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos de pcr do gene blandm-1, 
obtido após padronização .................................................................. 39 
iv 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
 
 
Tabela 1: Classificação e principais representantes dos antimicrobianos beta- 
lactâmicos. .................................................................................................. 16 
Tabela 2: Iniciadores específicos para a detecção dos genes blaIMP-1, blaNDM-1 e 
blaVIM-1 utilizados nas reações de PCR ..................................................... 35 
Tabela 3: Frequência relativa (FR) dos espécimesclínicos analisados. .................... 37 
Tabela 4: Frequência relativa (FR) dos isolados analisados. ..................................... 37 
Tabela 5: Tabela de contingência e análise de proporção multinomial de Goodman 
para o número de casos negativos e positivos nos agrupamentos de isolados 
para o teste fenotípico do EDTA ................................................................ 38 
Tabela 6: Frequência absoluta (n) e relativa (FR) dos espécimes clínicos que 
apresentaram positividade para o teste fenotípico de MBL ....................... 39 
Tabela 7: Dados das amostras positivas para o gene blaNDM-1 ................................... 40 
Tabela 8: Tabela de contingência e análise de proporção multinomial de Goodman 
para o número de casos negativos e positivos nos agrupamentos de isolados 
para o teste genotípico NDM-1. ................................................................. 40 
v 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
 
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária 
 
BHI Brain Heart Infusion (Infusão de Cérebro e Coração) 
 
Bla Gene codificante de beta-lactamase 
 
T Clinical and Laboratory Standards Institute 
 
DNA Ácido Desoxirribonucleico 
 
dDNTP Desoxirribonucleotídeos Fosfatados 
 
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid (Ácido etilenodiamino tetra-acético) 
ESBL Extended Spectrum β-lactamases (Beta-Lactamases de Espectro Ampliado) 
IMI Imipenem 
IMP Imipinemase 
 
LABMIC Laboratório de Micobactérias 
MBL Metalo-Beta-Lactamase 
MDR Resistência a múltiplas drogas 
MPM Meropenem 
µL Microlitros 
 
NDM New Dehli Metalo-Beta-Lactamase 
 
OXA Oxacilinase 
 
pb Pares de base 
 
PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase) 
 
SPM São Paulo Metalo-Beta-Lactamase 
 
VIM Verona Imipinemase 
 
SUMÁRIO 
RESUMO ..................................................................................................................................... i 
ABSTRACT ................................................................................................................................. ii 
LISTA DE FIGURAS. .............................................................................................................. iii 
LISTA DE TABELAS...............................................................................................................,.iv 
LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................................. v 
1- INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 13 
2- REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................................... 15 
2.1. ANTIMICROBIANOS BETA-LACTÂMICOS .......................................................................................... 15 
2.2. RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS BETA-LACTÂMICOS ........................................................ 19 
2.4. METALO- BETA-LACTAMASES ............................................................................................................. 22 
2.4.2. Metalo-beta-lactamases da subclasse VIM ............................................................... 23 
2.4.3. Metalo-beta-lactamase da subclasse NDM ............................................................... 24 
2.4.4 Metalo-beta-lactamase da subclasse SPM .................................................................. 25 
2.4.5. Epidemiologia das Metalo-beta-lactamases .............................................................. 25 
2.4.6. Detecção laboratorial das Metalo-beta-lactamases ................................................... 28 
2.5. AS METALO-BETA-LACTAMASES COMO DESAFIO TERAPÊUTICO .............................................. 29 
3- OBJETIVO GERAL............................................................................................................. 31 
4- METODOLOGIA ................................................................................................................. 32 
4.1. CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO ........................................................................................................... 32 
4.2. RECRUTAMENTO E IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA ........................................................................ 32 
4.3. DETECÇÃO FENOTÍPICA DA PRODUÇÃO DE METALO-BETA-LACTAMASES (MBL) ........... 33 
4.4. DETECÇÃO MOLECULAR DE MBL .................................................................................... 33 
4.4.2. CONDIÇÕES PARA DETECÇÃO DOS GENES BLAIMP-1, BLANDM-1, BLAVIM-1, ATRAVÉS DE 
PCR ......................................................................................................................................... 35 
4.5. ANÁLISES ESTATÍSTICAS ....................................................................................................................... 36 
5- RESULTADOS ..................................................................................................................... 37 
5.1. CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS ................................................................................................... 37 
5.2. CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA PARA A PRODUÇÃO DE MBL .......................................... 37 
5.3. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS PRODUTORES DE MBL DO TIPO NDM-1 
................................................................................................................................................. 38 
6- DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 40 
7. CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 46 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................... 47 
ANEXOS .................................................................................................................................... 59 
13 
 
 
1- INTRODUÇÃO 
A resistência bacteriana aos antibióticos é problema de saúde pública mundial, 
destacado em 2011 pela Organização Mundial da Saúde (OMS), assim como a 
disseminação dos genes de resistência aos antimicrobianos, compreendendo uma 
preocupação recorrente. Nos últimos anos, a OMS e agências de controle sanitário vêm 
apresentando relatórios que retratam não somente o aumento alarmante nos níveis de 
resistência aos antimicrobianos, mas também a disseminação dos microrganismos 
resistentes na comunidade (SAVJANI,2009; ANVISA, 2013). Isso tem preocupado 
microbiologistas, infectologistas e demais profissionais da assistência à saúde, pois 
diversas evidências apontam que infecções ocasionadas por microrganismos 
multirresistentes estão associadas a um aumento na mortalidade, no tempo de 
permanência nos hospitais e nos custos do tratamento (SCHWABER; CARMELI, 
2007). 
Bactérias resistentes a antibióticos estão proliferando entre diferentes 
ecossistemas, em reservatórios naturais e em meio ambiente modificados, encontrando 
rotas de transmissão para o homem. A presença dessas bactérias em diversos ambientes 
contribui para selecionar, introduzir e manter bactérias envolvidas em infecções 
humanas. O hospital é o principal ambiente onde são isoladas bactérias resistentes aos 
antibióticos, decorrente da pressão seletiva existente. Bactérias que anteriormente eram 
encontradas somente em pacientes hospitalizados, atualmente colonizam e causam 
infecções em pacientes da comunidade (HAWKEY, 2008). 
Infecções por bactérias resistentes a antibióticos demonstram aumento 
significativo na falha de tratamento, morbidade e mortalidade em comparação com 
infecções por bactérias sensíveis, tornando-se um fator crítico para o gerenciamento da 
terapêutica em pacientes com infecções por essas bactérias (QUEENAN; BUSH, 2007). 
Diante dessa realidade, a família Enterobacteriaceaee os Bacilos Gram- 
negativos Não Fermentadores de carboidratos (BGNF) figuram como os principais 
protagonistas no panorama da resistência, sendo seus representantes, os que mais 
sofreram modificações quando se trata, sobretudo, da resistência aos antimicrobianos 
beta-lactâmicos. A resistência a essa classe tem reduzido substancialmente as opções 
terapêuticas disponíveis. (QUEIROZ et al., 2012) Diante do grande número desses 
microrganismos isolados em infecções hospitalares e ambulatórias, a identificação 
14 
 
 
precisa dos principais mecanismos de resistência para esses agentes torna-se crucial, 
tanto para a adequação da terapia adequada quanto para fins epidemiológicos. 
Os carbapenêmicos são antimicrobianos utilizados como drogas de escolha no 
tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-Negativas resistentes a outros 
beta-lactâmicos, uma vez que possuem grande espectro de atividade e estabilidade à 
hidrólise pela maioria das beta-lactamases, incluindo as beta-lactamases de espectro 
ampliado (ESBL). Desse modo, recomenda-se restrição no uso de Cefalosporinas e de 
Carbapenêmicos como medida de prevenção da disseminação de bactérias Gram- 
negativas do tipo Pseudomonas aeruginosa com capacidade de produzir MBLs 
(SANTOS FILHO, 2003). 
 
A resistência aos carbapenêmicos na maioria das vezes resulta da produção de 
metalo-beta-lactamases (MBLs), enzimas capazes de hidrolisar eficazmente estas 
drogas. As MBLs pertencem ao grupo 3 das beta-lactamases de largo espectro, uma 
classe de metaloenzimas classificadas com base na habilidade de hidrólise do imipenem 
e meropenem e na característica de sofrerem inibição da atividade quando na presença 
de agentes quelantes de íons metálicos. A maioria dessas MBLs confere resistência não 
somente aos carbapenêmicos, mas também a outros beta-lactâmicos (BUSH, 1995). 
Os genes responsáveis pela produção de MBLs são usualmente mediados por 
integrons carregados em grandes plasmídeos, que são transferíveis entre diferentes 
isolados bacterianos (ANDRADE et al., 2011). Esta característica alerta para a 
importância da identificação destes isolados no efetivo controle da disseminação deste 
mecanismo de resistência. A detecção de microrganismos produtores de MBLs tem sido 
relatada em vários países, tais como Japão, Cingapura, Itália, Inglaterra, Portugal e 
Grécia, além do Brasil e, já faz algum tempo que isolados resistentes a carbapenêmicos 
têm sido relatado no nordeste (Recife), diante dessa problemática optou-se em realizar 
um estudo para avaliar a ocorrência de Metalo-beta-lactamases (MBLs) em isolados 
bacterianos recrutados de três centros de referência em saúde no Estado do Rio Grande 
do Norte. 
15 
 
 
2- REFERENCIAL TEÓRICO 
 
2.1. Antimicrobianos beta-lactâmicos 
As infecções têm sido uma das principais causas de doença ao longo da história 
da humanidade. Os antimicrobianos diferem uns dos outros nas suas propriedades 
físicas, químicas, farmacológicas, no espectro e mecanismos de ação (GOODMAN & 
GILMAN'S, 2008). Para que os mesmos tenham um efeito eficaz é importante que a sua 
concentração, no local da infecção, seja suficiente. Os antimicrobianos podem 
apresentar duas funções distintas, a inibição do crescimento bacteriano através da ação 
bacteriostática, e a destruição de uma população bacteriana, por uma ação bactericida. A 
ação bacteriostática impede o crescimento das bactérias, mantendo o mesmo na fase 
estacionária (PANKEY & SABATH, 2013). Um bactericida atua em processos vitais 
para a célula levando à morte celular (GOODMAN & GILMAN'S, 2008). 
A classificação mais comum dos antimicrobianos baseia-se no seu mecanismo 
de ação. Assim são descritos cinco mecanismos de ação: inibição da síntese da parede 
celular; inibição da síntese ou dano da membrana citoplasmática; inibição da síntese 
proteica nos ribossomos; alterações na síntese dos ácidos nucleicos; alteração de 
metabolismos celulares (TENOVER, 2006). 
Os antimicrobianos beta-lactâmicos agem interferindo nas enzimas que realizam 
síntese da camada de peptideoglicano, foram os primeiros a serem descritos e são até 
hoje, mesmo depois de 80 anos da sua descoberta, o maior grupo de antimicrobianos 
usados na prática clínica, perfazendo aproximadamente 50% dos antimicrobianos 
utilizados de forma sistêmica. O seu uso é extenso em infecções comunitárias ou 
hospitalares, haja vista a grande variedade de formas farmacêuticas disponíveis e sua 
baixa toxicidade. A diversidade de classes nessa família é marcante e sua característica 
comum é a presença do anel beta-lactâmico, cuja estrutura química consiste em uma 
amida cíclica, heteroatômica, formada por três átomos de carbono e um átomo de 
nitrogênio. (THOMAS TT et al., 2007). 
Para que a ação bactericida do anel beta-lactâmico ocorra é necessário que este 
esteja ligado a um ou mais outros radicais, os quais podem ser anéis ou cadeias lineares. 
Os radicais e a estrutura formada pelos dois anéis básicos classificam os beta-lactâmicos 
em: Penicilinas, Cefalosporinas, Carbapenêmicos, Monobactâmicoso e Inibidores de 
beta-lactamases. Dentro de cada grupo, pequenas alterações nas estruturas químicas 
16 
 
 
modificam as características dos antimicrobianos, como espectro de atividade, afinidade 
por receptores e resistência às beta-lactamases (KONG; SCHNEPER; MATHEE, 2010). 
A classificação e principais representantes dos antimicrobianos beta-lactâmicos podem 
ser observados na tabela 1 e a estrutura básica dos mesmos na figura 1, a seguir. 
 
Tabela 1: Classificação e principais representantes dos antimicrobianos beta-lactâmicos. 
 
Grupos Características Representantes 
 
 
 
 
 
 
Penicilinas 
Espectro reduzido 
Benzilpenicilina, 
Fenoxibenzilpenicilina 
Ativas contra 
enterobactérias 
Ampicilina, Amoxicilina 
 
Ativas contra 
Pseudomonas 
Ureidopenicilinas 
(Piperacilina), 
Carboxipenicilinas 
(Ticarcilina, Carbenicilina) 
Antiestafilocócicas Oxacilina 
 
Combinadas com 
inibidores de β-lactamase 
Amoxicilina/Clavulonato, 
Piperacilina/Tazobactam, 
Ticarcilina/Clavulonato, 
Ampicilina/Sulbactam 
 
 
 
Cefalosporinas 
Primeira geração 
Cefazolina, Cefalotina, 
Cefalexina 
Segunda geração Cefaclor, Cefoxitina 
Terceira geração 
Ceftriaxona, Cefotaxima, 
Ceftazidma 
Quarta geração Cefepime 
Carbapenêmicos 
 Imipenem, Meropenem, 
Erftapenem 
Monobactâmicos 
 
Aztreonam 
 
Fonte: adaptado de SUAREZ; GUDIOL (2009). 
17 
 
 
 
Figura 1: Classificação e estrutura básica dos antimicrobianos Beta-lactâmicos. 
 
Fonte: adaptado de SUAREZ; GUDIOL (2009). 
 
 
Entre as classes acima descritas, a penicilina, descoberta em 1928, foi o primeiro 
beta-lactâmico a ser descoberto. Porém, somente em 1940, Ernst Chain conseguiu obter 
um extrato estável de penicilina. (KONEMAN et al., 2008). Nos dias atuais, as 
penicilinas não são indicadas para tratamento de infecções de cepas com elevado nível 
de resistência, pelo fato das penicilinas exibirem um restrito espectro de ação e serem 
hidrolisadas pela maioria das beta-lactamases conhecidas. Mas, as penicilinas ainda são 
usadas para o tratamento de cepas sensíveis de Streptococcus sp., Staphylococcus sp. e 
alguns Gram-negativos, como Treponema pallidum e Neisseria gonorrhoeae (SUAREZ 
C et al., 2009). 
Em 1948, outra importante classe de beta-lactâmicos conhecida como 
cefalosporinas foi descoberta. Giuseppe Brotzu, ao estudar a microbiota presente em 
esgotos, com o intuito de descobrir a ocorrência de beta-lactâmicos naturais, isolou o 
fungo Cephalosporium, cujo composto ativo foi isolado e deu origem aos primeiros 
antibióticos dessa classe: Cefalosporina N (ativa contra Gram-negativos) e 
Cefalosporina P (ativa contra Gram-positivas). Essas drogas foram introduzidas na 
prática clínica em 1960 e atualmente estão disponíveis em mais de vinte compostos, 
distribuídos em quatro grandes gerações, com espectro de atividade característico18 
 
 
representando uma das principais classes utilizadas na clínica para tratamento de 
infecções nosocomiais e ambulatoriais (GREENWOOD D, 2000). 
Entre os beta-lactâmicos, os carbapenêmicos são os antimicrobianos com o 
maior espectro de atividade antibacteriana, em comparação com outros beta-lactâmicos, 
tais como penicilinas e cefalosporinas. Estes antibióticos foram originalmente 
desenvolvidos a partir da tienamicina, um produto natural derivado de Streptomyces 
cattleya (KAHAN et al., 1983), e que são frequentemente utilizados para o tratamento 
de isolados resistentes de Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii que se 
tornaram cada vez mais resistentes a cefalosporinas de amplo espectro utilizadas em 
ambientes hospitalares (LIVERMORE et al., 2006). 
A classe dos monobactâmicos foi inicialmente descrita com a observação da 
produção de beta-lactâmicos monocíclicos por cepas de Chromobacterium violaceum, 
Acetobacter sp.,e Agrobacterium radiobacter em 1981. Hoje o principal membro dessa 
classe é o aztreonam, relativamente inativa contra Gram-positivos e bactérias 
anaeróbicas, mas eficaz contra Gram-negativos aeróbios, mesmo em baixas 
concentrações. Além disso, essa classe é resistente a hidrólise mediada por várias beta- 
lactamases e mostra certo grau de estabilidade contra beta-lactamases originárias de 
plasmídios. Contra beta-lactamases cromossomais, o aztreonam pode agir tanto como 
inibidor ou como substrato fraco (GREENWOOD, 2000). 
19 
 
 
 
2.2. Resistência aos antimicrobianos beta-lactâmicos 
A resistência bacteriana pode ocorrer pela presença de mecanismos intrínsecos, 
correspondendo a uma característica da espécie, ou adquiridos. A associação desses 
mecanismos leva a multirresistência, limitando de maneira drástica as opções 
terapêuticas para o tratamento das infecções causadas por patógenos multirresistentes 
(WILSON, 2013). A aquisição de resistência geralmente ocorre devido ao surgimento 
de algumas alterações genéticas que se expressam bioquimicamente. Diversos 
mecanismos podem estar envolvidos, porém a causa mais frequente é a aquisição de 
genes de resistência através de elementos genéticos móveis (MULVEY; SIMOR, 2009). 
A resistência aos beta-lactâmicos constitui um problema global e emergente, 
uma vez que se trata de uma categoria formada por várias classes de medicamentos 
bastante utilizados pela clínica médica. Os antimicrobianos beta-lactâmicos têm em 
comum na base da sua estrutura molecular um anel β-lactâmico central (MURRAY et 
al., 2006). As cefalosporinas são um grupo de antimicrobianos beta- lactâmicos mais 
utilizados para o tratamento de infecções hospitalares causadas por enterobactérias 
(BRADFORD, 2001). Entretanto, o aumento de cepas resistentes a estes compostos tem 
restringido o uso destes antibióticos pelos profissionais de saúde (DESHPANDE et al., 
2010). 
A resistência bacteriana aos beta-lactâmicos pode ser causada por quatro 
mecanismos: produção de beta-lactamases, falta e/ou expressão reduzida das proteínas 
de membrana externa, hiperexpressão de bombas de efluxo e alteracão do sítio alvo das 
proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs) (SPELLBERG et al., 2008). 
A membrana externa das bactérias Gram-negativas constitui uma barreira de 
permeabilidade seletiva que efetivamente pode oferecer proteção contra vários 
compostos nocivos presentes no ambiente extracelular, selecionando os nutrientes 
necessários. Essa membrana é constituída de fosfolipídeos, lipopolissacarídeos e por 
proteínas da membrana externa, denominadas Outer membrane proteins (OMP), dentre 
as quais se encontram as porinas. As porinas são proteínas capazes de formar canais 
constituídos de água no seu interior que permitem a difusão de solutos hidrofílicos 
através da membrana externa e a expulsão de produtos não utilizados pela célula 
bacteriana (FERNANDEZ; HANCOK, 2012). Quando ocorre a perda ou a diminuição 
da expressão dos genes responsáveis pela expressão das porinas, pode haver redução da 
20 
 
 
entrada de antimicrobianos na célula, diminuindo a concentração interna desse agente, 
e, consequentemente, contribuindo para o mecanismo de resistência aos beta- 
lactâmicos. Na maioria das vezes a perda e/ou a diminuição das porinas pode estar 
associada à produção de beta-lactamases (NIKAIDO, 2003). 
As alterações de permeabilidade da membrana associada à expressão aumentada 
de sistemas de efluxo torna-se um fator determinante na resistência bacteriana à 
antimicrobianos. A hiperexpressão do sistema de efluxo surgiu como um sistema 
evolutivo das bactérias para evitar que compostos tóxicos se acumulassem no interior 
das células. Este sistema tem função de bombear moléculas tóxicas do conteúdo 
intracelular, em um processo que não envolve a alteração ou degradação dos fármacos 
(LISTER; WOLRWE; HANSON, 2009; FERNANDEZ; HANCOCK, 2012). 
Geralmente mutações são responsáveis pelo aumento do nível de expressão da bomba 
de efluxo, resultando no aumento da resistência aos compostos. Em alguns casos, estas 
mutações causam alterações de apenas um aminoácido, que tornam mais eficiente o 
bombeamento dos antibióticos para fora da célula. A grande maioria das mutações 
responsáveis pelas alterações no transporte de antimicrobianos por sistemas de efluxo 
ocorrem nos genes que codificam proteínas com uma função reguladora (NILSEN, et 
al., 1996; VETTORETTI, et al., 2009; FERNANDEZ; HANCOCK, 2012). A presença 
desse mecanismo foi descrita inicialmente em 1978 e desde então, os sistemas de 
efluxo, sejam eles de codificação plasmidial ou cromossomal, vem sendo identificados 
com maior frequência (UGHACHUKWU, UNEKWE, 2012). 
2.3. Produção de Beta-lactamases 
 
O uso excessivo de penicilinas e cefalosporinas contribuiu para o surgimento de 
beta-lactamases, uma família de enzimas bacterianas capazes de hidrolisar esses 
medicamentos, impulsionando o aumento na utilização de carbapenêmicos considerados 
antimicrobianos de última escolha. Porém, o uso indiscriminado dos carbapenêmicos, 
associado à exposição a outros medicamentos e a ausência de protocolos de controle e 
prevenção de infecção hospitalar permitiu a emergência de enterobactérias resistentes a 
este grupo de antimicrobianos (MUNOZ-PRICE; QUINN, 2009). A hidrólise de 
antimicrobianos pelas beta-lactamases é o principal mecanismo de resistência aos beta- 
lactâmicos em bactérias Gram-negativas. Os genes que codificam essas enzimas sofrem 
mutações constantemente em resposta à pressão exercida pelos antimicrobianos, 
21 
 
 
contribuindo para o surgimento de novas classes de enzimas com espectro de atividade 
cada vez maior (NOYAL, et al., 2009). 
A maioria das beta-lactamases age via mecanismo éster de serina, no entanto, 
algumas necessitam de íons zinco para romper o anel beta-lactâmico. Os genes que 
codificam a produção de beta-lactamases podem estar localizados em cromossomos ou 
plasmídeos, sendo as enzimas consequentemente denominadas: cromossômicas ou 
plasmidiais (LIVERMORE, 1995). 
Diversos tipos de beta-lactamases já foram descritas e várias tentativas de 
classificação já foram propostas, sendo que as duas mais importantes são a de Ambler e 
a de Bush, Jacoby e Medeiros (AMBLER, 1980; BUSH, et al., 1995), esta última 
revisada em 2010 (BUSH; JACOBY, 2010). AMBLER (1980) classificou as beta- 
lactamases de acordo com sua estrutura primária em quatro classes, classes A a D , as 
quais estão classificadas dentro de dois grupos de acordo com diferenças em seus 
mecanismos catalíticos, isto é, serina-beta-lactamase (classes A, C e D) e metalo-beta- 
lactamase (classe B). As classes A, C, e D possuem um resíduo de serina no local ativo 
da enzima, enquanto as enzimas de classe B possuem um resíduo de cisteína e utilizam 
íons zinco para romper o anel beta-lactâmico. As beta-lactamases que hidrolisam 
carbapenêmicos pertencem às classes A (penicilinases), B (metalo-beta-lactamase)e D 
(oxacilinases), e possuem a propriedade de hidrolisar pelo menos parcialmente os 
carbapenêmicos juntamente com outros beta-lactâmicos. 
A classificação proposta por Bush relacionou propriedades inibitórias e os 
substratos preferenciais de cada enzima. No entanto, ao longo dos anos essa 
classificação passou por atualizações, sendo que características estruturais e funcionais 
das beta-lactamases foram levadas em consideração. Este esquema baseia-se nas 
características funcionais e divide as beta-lactamases em quatro grupos definidos de 
acordo com os seus substratos e sensibilidade aos inibidores do ácido clavulânico e 
EDTA: Grupo 1: beta-lactamases que não são inibidas pelo ácido clavulânico, 
pertencem a classe C de Ambler, denominadas Ampicilinase C; Grupo 2: beta- 
lactamases inibidas pelo ácido clavulânico, pertencentes as classes A e D de Ambler, 
denominadas beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) e oxacilinases (OXA); 
Grupo 3: são enzimas que possuem no seu sítio ativo íons zinco (Zn2+) e não inibidas 
pelo ácido clavulânico sendo inibidas pelo EDTA, chamadas metalo-beta-lactamases 
22 
 
 
(MBL); Grupo 4: possui enzimas que não são inibidas pelo ácido clavulânico mas não 
se encaixam nos outros grupos (BUSH, 1995). 
2.4. Metalo- Beta-lactamases 
As metalo-beta-lactamases (MBLs) ou carbapenemases da classe B são enzimas 
que apresentam potente atividade contra carbapenêmicos, mas diferem de outras 
carbapenemases em três aspectos: requerem íons Zn+2 ou outros cátions divalentes 
como cofator no sítio ativo; são resistentes à ação dos inibidores das serino-beta- 
lactamases, embora sofram inibição por agentes quelantes como o ácido etilenodiamino 
tetra-acético (EDTA), derivados de tiol e do ácido dipicolínico; não hidrolisam 
monobactâmicos como o Aztreonam (WALSH et al., 2005). Normalmente os genes que 
codificam as MBLs estão inseridos em estruturas genéticas móveis, e as enzimas 
codificadas por estes genes conhecidas como MBLs móveis ou adquiridas. Atualmente, 
já foram descritas 10 subclasses de MBLs adquiridas, porém as mais conhecidas são: 
imipenemase (IMP), Verona imipenemase (VIM), São Paulo metalo-beta-lactamase 
(SPM), German imipenemase (GIM), Seul imipenemase (SIM) e New Delhi metallo- β- 
lactamase (NDM) (PALZKILL, 2013). 
A primeira MBL foi descrita em 1966 em isolado de Bacillus cereus, estando 
seu gene localizado no cromossomo bacteriano (SABATH; ABRAHAM, 1966, 
KUWABARA; ABRAHAM, 1967; HUSSAIN et al., 1985) e apenas 25 anos depois, 
em 1991, foi isolada a primeira MBL em um isolado clínico de P. aeruginosa, 
codificada por genes plasmidiais, ficando esta conhecida como IMP-1 (WATANABE et 
al., 1991; OSANO et al., 1994). Com o surgimento das MBL mediadas por plasmídeos 
em patógenos de importante relevância clínica, como P. aeruginosa, Acinetobacter spp. 
e membros da família Enterobacteriaceae em vários países, este mecanismo de 
resistência tornou-se um sério problema, uma vez que limita as opções terapêuticas para 
infecções causadas por estes patógenos (BUSH, 2001; JONES et al., 2005; 
ROSSOLINI, 2005; WALSH et al., 2005a). 
 
2.4.1. Metalo-beta-lactamase da subclasse IMP 
Três anos após Watanabe et al. (1991) descreverem a primeira MBL adquirida 
em P. aeruginosa, Osano et al. (1994) caracterizaram uma MBL, que foi denominada 
de IMP-1 em amostra de Serratia marcescens, a qual foi isolada em 1991 de um 
paciente com infecção do trato urinário no Hospital de Aichi, Okazaki, Japão. Seu gene, 
23 
 
 
blaIMP, disseminou inicialmente entre as P. aeruginosa e outros bastonetes gram- 
negativos no Japão (SENDA et al., 1996; KOHLER, 1999), possivelmente devido ao 
intenso uso de carbapenêmicos associado ao surgimento de genes blaIMP em elementos 
genéticos móveis (SENDA et al., 1996). 
Atualmente 33 das 51 variantes conhecidas da IMP foram identificados a partir 
de P. aeruginosa, incluindo a recente detecção de cepas produtoras de IMP-8 na 
Alemanha (POTRON, 2015; WILLMANN et al., 2015). No Brasil, os primeiros casos 
de isolados produtores de IMP foram relatados no Hospital Universitário do Rio de 
Janeiro (PELLEGRINO et al., 2001), havendo registros também em Brasília (MENDES 
et al., 2004), João Pessoa (SANTOS-FILHO et al., 2003), São Paulo (TOLLEMAN et 
al., 2002; SADER et al., 2005), Porto Alegre (MARTINS et al., 2007) e SantaCatarina 
(SCHEFFER et al., 2010). 
2.4.2. Metalo-beta-lactamases da subclasse VIM 
O segundo grupo dominante de MBL adquirida são as MBL do tipo VIM, 
também conhecida como MBL Europeia, devido a grande prevalência desta enzima nos 
países do continente europeu (WALSH, 2005a). Atualmente, 24 das 46 variantes VIM, 
incluindo a VIM-43 encontrada nos Estados Unidos (número de acesso GenBank 
KP096412), foram identificadas em P. aeruginosa. A enzima VIM-1 foi a primeira 
variante a ser identificada em P. aeruginosa, isolada de um paciente da UTI no Hospital 
Universitário de Verona na Itália, em 1997 (LAURETTI, 1999). Logo em seguida, 
CORNAGLIA et al. (2000) relataram um surto de P. aeruginosa resistente aos 
carbapenêmicos produtora de VIM-1, nesta mesma instituição. Neste estudo, dos 541 
isolados de P. aeruginosa obtidos entre 1997 e 1998, 35 foram suspeitos de produzir 
MBL e essa suspeita foi confirmada em oito isolados que possuíam o gene blaVIM-1. 
A segunda variante (VIM-2) foi identificada na França em um isolado de P. 
aeruginosa obtido da hemocultura de uma paciente com leucemia (POIREL, 2000). A 
enzima VIM-2 é a variante predominante das MBL do tipo VIM e, já foi relatada em 
várias regiões geográficas em diferentes espécies bacterianas, sendo responsável por 
surtos como o que ocorreu em um hospital grego (MAVROIDI et al., 2000). A MBL 
VIM-2 tornou-se dominante e disseminada nos cinco continentes (WALSH et al., 
2005b; LAHEY, 2011). A grande maioria dos casos de VIM-2 ocorre em P. aeruginosa, 
muitas vezes causando infecções hospitalares, tais como pneumonia associada à 
ventilação (WALSH, 2010). No Brasil, apenas dois estudos identificaram produção de 
24 
 
 
MBL tipo VIM-2, ambos realizados em São Paulo (SADER et al. 2005; FRANCO et 
al., 2010). 
2.4.3. Metalo-beta-lactamase da subclasse NDM 
Em 2009 uma nova subclasse de MBL, a enzima New Delhi metallo-beta- 
lactamase (NDM-1) foi caracterizada em K. pneumoniae proveniente da urina de um 
paciente internado em Nova Delhi, mas que tinha morado por muitos anos na Suécia, 
com internação prévia em hospital indiano (YONG, et al., 2009). Quando o gene 
blaNDM-1 foi caracterizado em 2009, poucos poderiam prever a enormidade de sua 
disseminação e prevalência atual, porém uma série de razões, como o uso inapropriado 
de antibióticos (particularmente na comunidade), o clima quente, abastecimento público 
de água contaminada e falta de políticas de controle de infecção hospitalar contribuíram 
para a disseminação sem precedentes de isolados positivos para NDM-1 (WALSH, 
2010). 
Isolados NDM-1-positivos já foram encontrados no Reino Unido, Estados 
Unidos, Canadá, Austrália, Europa continental, a Europa Oriental, Oriente Médio, 
África e diversos países do Sudeste Asiático, resultado tanto da globalização econômica 
e da plasticidade genética do plasmídeo (YONG et al., 2009; CDC, 2010). Uma das 
primeiras descrições de NDM-1 na América do Sul foi em 2012 no Uruguai, logo 
depois foi relatada a presença da enzima em um surto de K. pneumoniae na Colômbia e 
em uma cepa de A. baumannii no Paraguai (PERÉZ et al.,2013). No Brasil a NDM-1 foi 
descrita pela primeira vez em 2013 em Porto Alegre, a enzima foi identificada em um 
isolado clinico de Providencia rettgeri que apresentava resistência aos carbapenêmicos 
(CARVALHO-ASSEF, et al., 2013). 
Atualmente, seis variantes adicionais da NDM (NDM-2 até NDM-7) foram 
identificadas em P. aeruginosa, Acinetobacter baumannii e E. coli . Cepas produtoras 
de NDM-1 em P. aeruginosa foram relatados pela primeira vez em2011, com dois 
isolados recuperados da Sérvia (JOVICIC, 2011), um ano depois (2012), uma cepa de 
sequência tipo 235 (ST235) foi encontrada na França a partir de um paciente 
previamente hospitalizado na Sérvia (FLATEAU, 2012; JANVIER, 2013). Desde então, 
NDM-1 positivos em isolados P. aeruginosa isolados foram recuperados em vários 
países, incluindo Índia, Itália, Egito e Eslováquia (KHAJURIA, 2013; CARATTOLI, 
2013; ZAFER, 2014; KULKOVA, 2015). 
25 
 
 
2.4.4 Metalo-beta-lactamase da subclasse SPM 
Em 2002, uma nova MBL foi descrita no Brasil, nomeada de SPM-1. Essa 
enzima foi caracterizada a partir de uma cepa de P. aeruginosa recuperada do trato 
urinário de uma paciente hospitalizada no complexo Hospital São Paulo (TOLEMAN, 
et al., 2002). Alguns estudos identificaram a produção de SPM-1 em P. aeruginosa em 
diferentes regiões brasileiras, sendo que a produção desta enzima parece ocorrer de 
forma endêmica, relacionada inicialmente à sua disseminação clonal em vários surtos 
(CARVALHO et al., 2006; PELLEGRINO, et al., 2006; CIPRIANO, et al., 2007. A 
única descrição da produção de SPM-1 fora do Brasil ocorreu em 2010, na Suécia 
(SALABI, et al., 2010). 
A disseminação epidêmica de P. aeruginosa produtora de MBL do tipo SPM-1 
foi evidenciada em vários estados brasileiros (GALES, 2003b). Em um estudo realizado 
no Recife, foram avaliados 19 isolados de P. aeruginosa e 11 foram identificados como 
produtores de MBL. A análise genotípica destes isolados demonstrou que eles possuíam 
o gene blaSPM-1 (POIREL, 2004). ZAVASCKI et al. (2005) avaliaram 35 isolados de P. 
aeruginosa resistente aos carbapenêmicos do Hospital São Lucas (Porto Alegre, RS), 
entre janeiro e outubro de 2004, para a produção de MBL sendo que 27 isolados foram 
positivos e destes, 21 transportavam o gene blaSPM-1. Este foi o primeiro surto por P. 
aeruginosa produtora de SPM-1 descrito no sul do Brasil. 
A disseminação de P. aeruginosa multirresistente produzindo SPM-1 foi 
demonstrada em regiões distintas do Brasil, no entanto, estas cepas ainda não se 
espalharam para outros países, com uma única exceção de um único isolado identificada 
em um paciente suíço que anteriormente tinha sido hospitalizado no Brasil (GALES, 
2003; SALABI, 2010). O gene blaSPM-1 tem sido relatado em isolados de Pseudomonas 
e Acinetobacter spp. de vários hospitais no Brasil, e seu produto é um dos principais 
contribuintes para a elevado nível de resistência aos carbapenêmicos observado na 
América do Sul. Atualmente, a proporção de resistência aos carbapenêmicos na 
América do Sul está entre as mais altas do mundo (JONES, 2005). 
2.4.5. Epidemiologia das Metalo-beta-lactamases 
A ocorrência de MBL mediando resistência em vários patógenos tem sido 
responsável por vários surtos nosocomiais em diferentes partes do mundo, 
demonstrando a necessidade de práticas apropriadas de controle de infecção. Na Grécia, 
a disseminação de MBL do tipo VIM já foi evidenciada por vários estudos 
26 
 
 
(GIAKKOUPI, 2003; IKONOMIDIS, 2005; TSAKRIS, 2000). Na Coréia, encontrou-se 
60,7% de isolados produtores de MBL em 28 hospitais avaliados, com uma maior 
prevalência de P. aeruginosa produtora de MBL do que em outros países e foi 
observado o crescente aumento no número de Acinetobcter spp produtor de MBL (LEE, 
2003a). Na Itália, 20% dos isolados de P. aeruginosa de um hospital ao norte do país 
possuíam MBL do tipo VIM e 70% dos isolados eram resistentes aos carbapenêmicos 
(LAGATOLLA, 2004). Outro estudo, realizado em três hospitais italianos de diferentes 
regiões, demonstrou que P. aeruginosa multirresistente e produtora de MBL é um 
problema nacional, pois se encontra distribuída em diferentes regiões do país 
(TOLEMAN, 2005). No Japão a resistência aos carbapenêmicos aumentou de 19,3% em 
1998 para 38% em 2002 (FRITSCHE, 2005). KIMURA et al. (2005b) demonstraram 
em seu estudo a distribuição clonal de P. aeruginosa em 60 hospitais japoneses. Na 
Austrália o primeiro surto por isolados produtores de MBL foi relato em 2005, 
evidenciando a ampla disseminação desses genes ao redor do mundo (PELEG, 2005). 
 
Na América Latina, a maior concentração de bactérias produtoras de MBL está 
no Brasil e na Argentina. Dentre os países participantes do programa SENTRY 
(Antimicrobial Surveillance Program) entre os anos de 1997-2001, o Brasil contribuiu 
com 90% dos isolados de P. aeruginosa multirresistentes. Segundo dados deste mesmo 
programa no período de 2001-2003, 70% dos isolados de P. aeruginosa do Brasil e 73% 
dos isolados de Acinetobacter spp. da Argentina foram produtores de MBL 
(SADER,2005a). 
No Brasil o primeiro relato de cepas produtoras de MBL ocorreu em 2002, em 
isolados de P. aeruginosa obtidos do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho no 
Rio de Janeiro (PELLEGRINO, 2002). Dados do SENTRY indicam que 44,8% dos 
isolados de P. aeruginosa brasileiros são resistentes ao imipenem e 43,9% são 
produtores de MBL (FRITSCHE, 2005). Com a identificação de SPM-1, em 2001, 
amostras produtoras dessa enzima têm sido identificadas em vários centros brasileiros 
(GALES, 2003b). Na cidade do Recife, das 24 amostras de P. aeruginosa avaliadas 15 
foram produtoras de MBL do tipo SPM-1 (MAGALHÃES, 2005). Em um estudo 
realizado em três hospitais de Porto Alegre, RS, 49 (81,7%) dos 60 isolados de P. 
aeruginosa analisados foram produtores de MBL pertencentes a subclasse SPM-1 ou 
IMP-1 (GASPARETO, 2007). Em 2005, identificou-se K. pneumoniae produtora de 
MBL do tipo IMP-1. Foi o primeiro relato do Brasil e da América Latina (LINCOPAN, 
27 
 
 
2005), evidenciando ampla disseminação desse mecanismo em vários patógenos nos 
hospitais brasileiros. 
Em Brasília, foi descrito o primeiro relato da enzima IMP-16, no mundo 
(MENDES et al., 2004). Este isolado fazia parte da pesquisa do Programa SENTRY de 
Vigilância de antimicrobianos, que monitorava rotineiramente cepas de Pseudomonas 
sp. resistentes aos carbapenêmicos e ceftazidima, no período entre 2002 e 2004. A P. 
aeruginosa que abrigava uma variante do gene blaIMP classificado como blaIMP-16, foi 
isolada em abril de 2002 de um homem de 60 anos de idade em Brasília, Brasil. Trata- 
se de um gene cromossômico, cuja sequência de aminoácidos (IMP-16) apresentou o 
maior identidade com IMP-11 (90,3%) e IMP-8 (89,5%). 
Alguns estudos realizados em São Paulo revelaram a detecção dos genes blaSPM- 
1, blaIMP-1 e blaVIM-2. Sader et al. (2005), em uma amostra de 183 isolados de P. 
aeruginosa de paciente com bacteriemia, internados no Hospital São Paulo (Brasil) no 
período entre 2000 e 2001, obtiveram como resultado a detecção de produção de MBL 
em 36 isolados (19,7%) de todos os isolados e 43,9% dos isolados resistentes a 
imipenem), classificados como SPM-1 (55,6%), VIM-2 (30,6%) e IMP-1 (8,3%), sendo 
considerado o primeiro relato da enzima VIM-2 publicado no Brasil. 
No nordeste brasileiro, Santos-Filho et al. (2003) pesquisaram a produção de 
MBL em uma amostra de 250 isolados não repetitivos de P. aeruginosa identificados 
por métodos de rotina em João Pessoa (PB). Foram considerados para análise os 
isolados multirresistentes, com diminuição de sensibilidade ao imipenem (halo<16mm) 
e a ceftazidima (halo<18mm). Estes foram submetidos aos testes fenotípicos de dupla 
difusão com discos em superfície de ágar e ao método E-test padronizado para a 
detecção de MBLs, que foram confirmadas pelo método molecular de Reação em 
Cadeia da Polimerase (PCR - Polymerase Chain Reaction). Como resultado, observou- 
se 14,8% de resistência cruzada ao imipenem/ceftazidima com identificação de 3,2% de 
amostras produtoras de MBLs, das quais 75% foram positivas para o gene blaSPM-1 e 
25% para o gene blaIMP-1. 
Em Pernambuco, Poirel et al (2004) descreveram uma propagação clonal de P. 
aeruginosa resistentes a ceftazidima e imipenem em uma amostra de 19 isolados 
clínicos coletados de pacientes provenientes deenfermarias neurológicas, UTI, ou 
internados em unidades semelhantes, no período de novembro de 2002 a janeiro de 
2003 em diferentes hospitais de Recife (PE). Neste estudo foi observado que 11 
isolados eram produtores de MBL, todas do tipo SPM-1. No ano seguinte, Magalhães et 
28 
 
 
al. (2005) publicaram um estudo com uma número amostral maior (48 isolados de P. 
aeruginosa), procedentes de cinco hospitais do Recife, dentre públicos e privados, onde 
foi observado que 50% dos isolados eram resistentes ao imipenem, e destes, 62,5% 
eram produtores de MBL do tipo SPM-1. 
2.4.6. Detecção laboratorial das Metalo-beta-lactamases 
Em razão dos inúmeros relatos de bactérias produtoras de MBLs em várias 
partes do mundo, houve a necessidade de desenvolver testes simples, práticos e de baixo 
custo, para tornar possível o rastreamento de bactérias produtoras de MBLs nos 
laboratórios de rotina microbiológica. Devido as MBLs necessitarem de íons divalentes, 
como o Zn2+, para a reação de hidrólise do anel beta-lactâmico, estas enzimas podem ser 
identificadas por testes fenotípicos com auxílio de agentes quelantes de zinco, como o 
EDTA e derivados de ésteres de tióis (PITOUT, 2005). 
Esses testes incluem: - o teste de sinergismo de disco aproximação usando 
EDTA associado ao disco de imipenem (IMI) ou o ácido 2-mercaptopropiônico (MPA) 
com IMI (ARAKAWA, 2000; LEE, 2001; LEE, 2003b); - o teste de Hodge modificado 
(LEE, 2001; LEE, 2003b); - teste do disco combinado de IMI ou Ceftazidima com 
EDTA (YONG, 2002); - as tiras de Etest MBL (ARROYO, 2005; LEE, 2005; WALSH, 
2002); - o método de microdiluição usando EDTA e 1,10-fenantrolina com IMI 
(MIGLIAVACCA, 2002) – o ensaio microbiológico Imipenem-EDTA (MARCHIARO, 
2005) e o teste fenotípico utilizando o ácido dipicolínico como inibidor de MBL 
(KIMURA, 2005a). 
O teste de disco-aproximação é o teste fenotípico mais utilizado, por apresentar 
boa sensibilidade, especificidade, baixo custo e ser de fácil execução, no entanto, as 
MBL variam em seu nível de inibição com certos inibidores e também variam em sua 
habilidade de conferir resistência para alguns substratos como ceftazidima e imipenem. 
Os membros da família Enterobacteriaceae que possuem o gene para MBL podem ser 
sensíveis ou intermediários a esses substratos, dificultando assim o estabelecimento de 
critérios para a seleção de microrganismos suspeitos de portar esse mecanismo de 
resistência (WALSH, 2005a). Segundo FRANKLIN et al. (2006) o método fenotípico 
mais adequado para a detecção de microrganismos sensíveis aos carbapenêmicos é o 
teste do disco combinado, e propõe que o teste fenotípico seja realizado nos 
microrganismos resistentes para ceftazidima ou ticarcilina/ácido clavulânico. O teste do 
disco combinado demonstrou ser adequado para a detecção de MBL em isolados de K. 
29 
 
 
pneumoniae, reforçando o estudo anterior (PETROPOULOU, 2006). No entanto, o teste 
do disco combinado deve ser interpretado com cautela, pois os resultados podem variar 
conforme a preparação dos discos (ANDRADE, 2007). 
As técnicas genéticas usadas para se detectar MBLs são similares àquelas que já 
têm sido usadas para a caracterização molecular de inúmeras outras beta-lactamases, 
como as beta-lactamases de espectro ampliado (ESBLs). A análise por PCR (Reação em 
cadeia da polimerase) oferece resultados confiáveis e satisfatórios (SENDA et al., 
1996), possibilita a amplificação de sequências específicas de DNA através da 
utilização de iniciadores (primers) e permite a replicação, in vitro, de uma seqüência 
definida do DNA, sendo esta amplificada de forma exponencial e possível de ser 
visualizada após uma eletroforese (MATTÉ 1996; MATTÉ 2003). Desde a década de 
1990, novos genes de MBL têm sido detectados por PCR em vários locais do mundo, 
como América do Norte, América do Sul, Europa e Ásia (TOLEMAN et al, 2002; 
CASTANHEIRA et al, 2004). 
Foi constatado que 41,3% das amostras de P. aeruginosa resistentes aos 
carbapenêmicos, isoladas de distintos hospitais brasileiros, eram produtoras de MBL, 
evidenciando o problema da resistência a estes agentes. Além disso, este dado enfatiza 
ainda mais a necessidade da realização de testes adequados na detecção deste fenótipo 
de resistência em laboratórios de microbiologia (MENDES et al., 2006) para uma 
aplicação de medidas de controle de infecção por microrganismos resistentes aos 
carbapenêmicos. 
2.5. As metalo-beta-lactamases como desafio terapêutico 
O tratamento de infecções causadas por cepas produtoras de MBL constitui um 
grande desafio, uma vez que estes isolados geralmente apresentam perfis de resistência 
bastante significativos contra a maioria dos antibióticos comercialmente disponíveis, o 
que incluem os inibidores de beta-lactamases, como por exemplo, o Ácido clavulânico, 
Sulbactam e Tazobactam. Nos dias atuais, a detecção de isolados clínicos produtores de 
MBLs que exibem sensibilidade apenas a Colistina tem aumentado seriamente no 
mundo todo e constituem uma situação ameaçadora tanto para os pacientes como para a 
equipe hospitalar, uma vez que, na prática, isso traduz um fenótipo de pan-resistência 
(SADER et al., 2005; CIPRIANO et al., 2007). Estudos in vitro revelam que a 
Tigeciclina e a Colistina são as únicas drogas com atividades consistentes contra cepas 
multirresistentes (MDR) ou pan-resisitentes produtoras de MBL (MALTEZOU, 2008). 
30 
 
 
A Tigeciclina é uma aminociclina análoga que exibe excelente atividade, alcançando 
taxas de efetividade de até 100% contra patógenos nosocomiais Gram-Negativos, 
incluindo alguns MDR, tais como: A. baumannii, K. pneumoniae e outras 
Enterobacteriaceae; no entanto este agente age pobremente contra P. aeruginosa 
(CHOPRA et al., 2008; SO., 2006). 
Devido à indisponibilidade de regimes terapêuticos efetivos na prática clínica, 
aliado à inexistência de um inibidor seguro contra as MBLs, grandes testes e ensaios 
randômicos controlados são necessários para definir o melhor tratamento dessas 
infecções. Enquanto isso, nossos esforços devem estar focados no uso racional e sensato 
dos agentes antimicrobianos existentes; na implementação e reforço de sistemas de 
vigilância acerca de bactérias resistentes; e na melhoria das práticas de controle de 
infecção (MALTEZOU, 2008). 
31 
 
 
3- OBJETIVO GERAL 
Avaliar a ocorrência de Metalo-beta-lactamases (MBLs) em isolados bacterianos 
recrutados de três centros de referência em saúde no Estado do Rio Grande do Norte. 
 
3.1- OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
 
✓ Identificar os isolados clínicos através das provas fenotípicas convencionais. 
 
✓ Confirmação da resistência dos isolados clínicos aos carbapenêmicos 
(Meropenem e Imipenem). 
 
 
✓ Determinação dos genes blaIMP-1, blaNDM-1 e blaVIM-1. 
32 
 
 
4- METODOLOGIA 
O estudo foi submetido à avaliação e aprovação pelo Comitê de Ética em 
Pesquisa (CEP) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). O estudo foi 
aprovado segundo parecer nº 331/2012. 
4.1. Caracterização do estudo 
Estudo transversal descritivo, onde foram realizadas técnicas de biologia 
molecular para detecção dos genes de resistência em 100 isolados clínicos de bactérias 
pertencentes à família das enterobactérias (Enterobacter sp., Escherichia coli e 
Klebsiella sp.), à espécie Pseudomonas aeruginosa e ao gêneros Acinetobacter sp., 
provenientes de três centros de referência em saúde no Estado do Rio Grande, obtidos 
entre janeiro de 2013 a dezembro de 2015. 
Os isolados clínicos coletados foram oriundos de fezes, líquor, ponta de cateter, 
sangue, secreções diversas, secreção traqueal e urina, obtidos do Hospital Universitário 
Onofre Lopes (HOUL), juntamente com o Hospital de Doenças Infectocontagiosas 
Giselda Trigueiro (HGT) e o Hospital do Coração (HC). A análise dos isolados para 
detecção dos genes codificantes de Metalo-beta-lactamases foi realizada no Laboratório 
de Micobactérias (LABMIC)do Departamento de Microbiologia e Parasitologia da 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte. 
Neste estudo foram incluídos isolados de Enterobactérias e Bacilos Gram 
Negativos Não Fermentadores de carboidratos resistentes aos carbapenêmicos 
(Imipenem ou Meropenem), após a realização dos testes de sensibilidade aos 
antimicrobianos (TSA) nos três locais de coleta e depois de confirmada da resistência 
aos carbapenêmicos, as amostra foram designadas para análise no LABMIC. 
4.2. Recrutamento e Identificação bacteriana 
O recrutamento dos espécimes ocorreu por demanda espontânea. As bactérias 
foram coletadas de placas de cultivo de isolamento primário de exames bacteriológicos 
realizados mediante solicitações de rotina, nos três centros. As cepas foram repicadas 
para microtubos contendo meio de conservação BHI (Brain Heart Infusion – 
HIMEDIA) acrescido com 15% de Glicerol, conservadas em gelo e encaminhadas para 
o LABMIC, seguindo protocolo estabelecido por Koneman et al, 2008. 
33 
 
 
A identificação dos isolados foi realizada por provas fenotípicas convencionais: 
fermentação de carboidratos no Agar TSI (tríplice açúcar-ferro), prova do indol, prova 
da utilização do citrato, prova da descarboxilação de aminoácidos (arginina, lisina e 
ornitina), produção de ácidos mistos (Vermelho de metila), produção de butileno glicol 
(Voges-Proskauer), prova da motilidade, produção de sulfeto e prova da desaminação 
de fenilalanina; e/ou por automação utilizando o aparelho Vitek1 (Biomerieux), no 
Laboratório de Microbiologia do HUOL. Para a estocagem bacteriana, alçadas pesadas 
de colônias isoladas do microrganismo previamente identificado foram suspendidas em 
dois microtubos, cada um contendo 1 ml de BHI (Brain Heart Infusion) acrescido de 
glicerol a 1,5% e armazenado em freezer a -20ºC (KONEMAN et al., 2008) (ANEXO 
1). 
4.3. Detecção fenotípica da produção de metalo-beta-lactamases (MBL) 
As bactérias que se mostraram resistentes a pelo menos um dos carbapenêmicos 
(Imipenem ou Meropenem) foram submetidas ao teste confirmatório de MBL pelo 
método de bloqueio enzimático no LABMIC. Em uma placa de Ágar Mueller-Hinton 
(HIMEDIA), seguindo a escala de turbidez 0,5 McFarland (PROBAC), foi semeada a 
cepa suspeita por toda a extensão da placa, conforme padronizado pelo CLSI (Manual 
Clinical and Laboratory Standards Institute) para realização do teste de sensibilidade 
aos antimicrobianos por disco difusão (CLSI, 2014). Em seguidas dois discos, um com 
Meropenem (10µg) (OXOID) e outro com Imipenem (10µg) (OXOID), foram 
posicionados paralelos a outros dois discos de Meropenem (10µg) (OXOID) e 
Imipenem (10µg) (OXOID) ambos acrescidos de 10µL de EDTA 0,1M, seguindo 
recomendações da Nota Técnica nº01/2013 da ANVISA. Os discos combinados com 
EDTA foram preparados no dia do teste e aplicados nas placas somente após sua 
secagem. Em amostras produtoras de MBL foi observado aumento do halo de inibição 
de crescimento da bactéria-teste na região do ágar onde ocorreu a difusão do agente 
quelante. Já, em testes negativos, não se espera alteração no halo de inibição de 
crescimento da bactéria testada. 
4.4. Detecção molecular de MBL 
 
 
4.4.1 Extração do DNA genômico bacteriano 
34 
 
 
Os isolados estocados em microtubos com glicerol 1,5% e caldo BHI em freezer 
a -20 ºC foram repicados para tubos de vidro contendo apenas caldo BHI (HIMEDIA) e 
incubados em estufa bacteriológica a 37ºC por um período de 18 a 24 horas. A extração 
do DNA total foi realizada utilizando o mini kit DNA genômico purelink® da 
Invitrogen, de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante, como mostra a figura 
2 abaixo: 
Figura 2:Representação esquemática da extração de DNA utilizando o mini kit DNA genômico 
purelink® 
 
Fonte: Adaptado a partir do manual disponibilizado no site: www.invitrogen.com 
 
O DNA bacteriano foi devidamente quantificado através de espectrofotometria 
(nanodrop) em uma faixa de comprimento de onda entre 260 a 280 nm e sua qualidade 
confirmada por eletroforese em gel de agarose. 
http://www.invitrogen.com/
35 
 
 
4.4.2. Detecção dos genes blaIMP-1, blaNDM-1, blaVIM-1, através de PCR 
A técnica de PCR foi empregada de acordo com o perfil de resistência dos 
isolados em estudo para determinação dos genes codificantes das enzimas metalo-beta- 
lactamases: IMP-1, NDM-1, VIM-1 por meio de protocolo próprio, com a utilização dos 
iniciadores listados na tabela abaixo: 
Tabela 2:Iniciadores específicos para a detecção dos genes bla IMP-1, bla NDM-1 e bla VIM-1 
utilizados nas reações de PCR 
 
 
 
Oligonucleotídeos 
 
Sequência do iniciador (5’ 3’) 
Tamanho do 
produto (pb) 
 
Referências 
 
bla IMP-1 
IMP-1-F TGA GCA AGT TAT CTG TAT TC 747 
IMP-1-R TTA GTT GCT TGG TTT TGA TG 
 
YAN et al, 2001 
 
NDM-1-F GGG CAG TCG CTT CCA ACG GT 
NDM-1-R GTA GTG CTC AGT GTC GGC AT 
 
475 
 
MUSHTAQ et al, 
2011 bla NDM-1 
 VIM-1-F AGT TTA AAA GTT ATT AGT AGT 
TTA TTG 
VIM-1-R CTA CTC GGC GAC TGA GC 
 
801 
 
JUAN et al, 2008 
bla VIM-1 
 
 
As cem amostras foram submetidas a PCR para a detecção dos gene citados 
acima. As reações de amplificação foram preparadas em um volume total de 25 µl por 
tubo, compreendendo: 1 µl (25ng) de DNA genômico, 22,5 µl de PCR SuperMix 
Invitrogen, 0,5 µl (10 pmoles) de cada iniciador e 0,5 µl de água free nuclease. Em cada 
reação de amplificação foi incluído um controle negativo, constituído de um tubo com 
todos os componentes da reação ao qual não foi adicionado DNA, e um controle 
positivo para tais genes. 
Para as condições de amplificação dos genes blaIMP-1, blaNDM-1 e blaVIM-1 foram 
utilizados 5 minutos a 94ºC de pré-desnaturação, 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC 
(desnaturação), 2 minutos a 55ºC para anelamento, 2 minutos a 72ºC para extensão, 
sucedido por uma extensão final de 8 minutos a 72ºC. A temperatura de anelamento 
utilizada foi padronizada através de um gradiente de temperatura que variou entre 53ºC 
e 58ºC. Após a reação de PCR, a visualização dos fragmentos amplificados foi realizada 
36 
 
 
através de eletrorese em gel de agarose a 1% em TBE 1X (Tampão Tris-Borato- 
EDTA). 
A eletroforese foi realizada com um tampão de corrida TBE 1X sob uma 
corrente elétrica de 100 Volts e para cada poço foram adicionados 5 µl do produto de 
PCR com 1 µl de GelRed (corante fluorescente de ácidos nucleícos ultrasensível - 
Invitrogen) e 1 µl do tampão de corrida, exceto no poço destinado ao DNA ladder , no 
qual foram adicinados 0,7 µl do marcador de peso molecular (GeneRuler 100 pb DNA 
Ladder – Fermentas), 1 µl de tampão de corrida e 4,3 µl de água livre de nuclease para 
completar o volume final de 7 µl/poço. Após a corrida, os géis foram observados sob 
luz ultravioleta e equipamento L-Pix EX- Loccus biotecnologia (Loccus biotecnologia, 
Cotia/SP) e fotografados. 
4.5. Análises Estatísticas 
Para avaliar os dados de proporção de casos positivos e negativos para os testes 
fenotípico (EDTA) e genotípico com relação aos agrupamentos de isolados 
(Acinetobacter, Pseudomonas e Enterobacteriaceae) foi utilizado o teste de proporções 
multinomiais. O teste avaliou as proporções par a par nos dois níveis da tabela de 
contingência de dados, entre as multinomiais (entre as classificações dispostas em 
colunas) e dentro das multinomiais (entre as classificações dispostas em linhas para 
cada coluna, separadamente). Todo o procedimento de comparações de proporções entre 
e dentro das multinomiais foi baseado em Goodman (1964). 
Para investigar as possíveis associações entre os dados fenotípicos e genotípicos 
foi utilizada a correlação de Spearman. A correlação de Spearman leva em consideração 
a não parametricidade dos dados (ZAR, 2010). Testes de avaliação da parametricidade 
(Teste de Normalidade de SHAPIRO-WILK, SHAPIRO & WILK, 1965) foram 
realizados previamente ao início das análises indicando a não normalidade dos dados. 
Todasas análises estatísticas foram realizadas utilizando o software R (R 
Development Core Team 2012), adotando o nível de significância de 5% (ZAR, 2010). 
37 
 
 
 
 
 
 
5- RESULTADOS 
 
5.1. Caracterização das amostras 
A maior frequência foi observada em ‘Secreções Diversas’ que apresentou 40% 
dos casos enquanto a menor frequência foi observada nas ‘Fezes’, ‘Líquor’ e ‘Ponta de 
Cateter’ correspondendo a 3% dos casos, cada (Tabela 3). 
Em relação às espécies, a mais encontrada foi Pseudomonas aeruginosa com 
frequência correspondente a 47%, enquanto as menos frequentes foram Enterobacter sp. 
e Escherichia coli com 1%, cada (Tabela 4). 
Tabela 3: Frequência Relativa (FR) dos espécimes clínicos analisados. 
 
 Espécime clínico FR (%) 
Fezes 3 
Líquor 3 
Ponta de cateter 3 
Sangue 6 
Secreções diversas 40 
Secreção Traqueal 21 
 Urina 24 
 Total 100 
 
 
Tabela 4: Frequência Relativa (FR) dos isolados analisados. 
 
 Isolados FR(%) 
Acinetobacter spp. 38 
Enterobacter spp. 1 
Escherichia coli 1 
Klebsiella spp. 13 
 Pseudomonas aeruginosa 47 
 Total 100 
 
5.2. Caracterização fenotípica para a produção de MBL 
Dos 100 isolados clínicos analisados, 57 apresentaram perfil fenotípico 
confirmatório, como produtoras de MBLs (Tabela 5). O gênero Acinetobacter foi o que 
apresentou maior número de casos positivos (p <0,05). Das 47 cepas de Pseudomonas 
aeruginosa, 24 foram positivas, e com relação às enterobactérias analisadas todas foram 
negativas para o teste fenotípico para detecção de MBL. 
Na comparação entre todos os grupos de isolados, incluindo as enterobactérias 
(Enterobacter sp., Escherichia coli, Klebsiella sp.),o gênero Acinetobacter apresentou 
38 
 
 
diferença significativa para os demais grupos, sendo o menos pontuado como negativo, 
enquanto nos dados positivos, não houve diferença significativa entre Acinetobacter e 
Pseudomonas (Tabela 5). 
 
Tabela 5: Tabela de contingência e análise de proporção multinomial de Goodman para o número 
de casos negativos e positivos nos agrupamentos de isolados para o teste fenotípico EDTA. 
 
 EDTA Negativo Positivo Total 
Acinetobacter 5 Aa 33 Ba 38 
Enterobacteriaceae 15 b 0 15 
 Pseudomonas 23 Ab 24 Aa 47 
 Total 43 57 100 
Letras minúsculas diferentes na mesma coluna indicam 
diferença estatística significativa entre as proporções (p<0,05). 
Letras maiúsculas diferentes na mesma linha indicam 
diferença estatística significativa entre as proporções (p<0,05). 
 
 
Os 57 isolados clínicos positivos para o teste fenotípico de detecção de MBL, 
pertencentes à espécie Pseudomonas aeruginosa e ao gênero Acinetobacter sp., foram 
oriundos, principalmente, das secreções diversas (40%), trato respiratório (22,5%) e 
urina (21%), de acordo com a tabela 6. 
 
Tabela 6: Frequência absoluta (n) e relativa (FR) dos espécimes clínicos que apresentaram 
positividade para o teste fenotípico de MBL. 
 
 Espécime clínico n FR (%) 
Fezes 2 3,5 
Líquor 2 3,5 
Ponta de cateter 2 3,5 
Sangue 3 5 
Secreção 23 40 
Secreção Traqueal 13 22,5 
 Urina 12 21 
 Total 57 100 
 
 
5.3. Detecção molecular dos isolados produtores de MBL 
Dos 100 isolados, seis apresentaram positividade apenas para o gene blaNDM-1, 
(Figura 2), sendo todos os 100 isolados negativos para os demais genes testados (blaIMP-1 e 
blaVIM-1). As 6 cepas que foram positivas para o gene blaNDM-1, todas foram identificadas 
39 
 
PM + + + + + + C+ C- 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 
1000 pb 
475pb 
 
como Pseudomonas aeruginosa, das quais apenas duas foram positivas no teste fenotípico 
de MBL utilizando o EDTA. (Tabela 7). 
 
Figura 3: Eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos de PCR do gene blaNDM-1. 
PM:Marcador de Peso Molecular. Poço 19 (C-) Controle negativo. Poço 18 (C+) Controle positivo. 
Poços 2, 6, 7, 9, 12 e 16 correspondem as amostras positivas para este gene (475pb). 
 
Fonte: Arquivo Pessoal 
 
 
Tabela 7: Dados das amostras positivas para o gene blaNDM-1. 
 
Espécime Clínico Isolados Teste EDTA Teste NDM-1 
Secreção Traqueal Pseudomonas aeruginosa Negativo Positivo 
Secreção Traqueal Pseudomonas aeruginosa Negativo Positivo 
Secreções diversas Pseudomonas aeruginosa Positivo Positivo 
Ponta de cateter Pseudomonas aeruginosa Positivo Positivo 
Secreções diversas Pseudomonas aeruginosa Negativo Positivo 
Urina Pseudomonas aeruginosa Negativo Positivo 
 
Analisando os resultados obtidos através da caracterização molecular para 
blaNDM-1 (tabela 8), o gene foi detectado em Pseudomonas aeruginosa, mesmo que o 
número de amostras positivas não tenha sido estatisticamente relevante em relação ao 
número amostral, este resultado se torna importante por seu ineditismo em 
Pseudomonas aeruginosa no Brasil. 
40 
 
 
 
Tabela 8: Tabela de contingência e análise de proporção multinomial de Goodman para o número 
de casos negativos e positivos nos agrupamentos de isolados para o teste genotípico NDM-1. 
 
 NDM-1 Negativo Positivo Total 
Acinetobacter 38 a 0 38 
Enterobacteriaceae 15 b 0 15 
 Pseudomonas 41 Aa 6 B 47 
Total 94 6 100 
Letras minúsculas diferentes na mesma coluna indicam 
diferença estatística significativa entre as proporções (p<0,05). 
Letras maiúsculas diferentes na mesma linha indicam 
diferença estatística significativa entre as proporções (p<0,05). 
 
 
Ao correlacionar os dados fenotípicos com os dados genotípicos através da 
correlação de Spearman observou-se uma fraca correlação entre os dados (R2 = 0,14; p 
> 0,05) indicando que os dados analisados não possuem relação significante entre si. 
41 
 
 
6- DISCUSSÃO 
O aumento da prevalência de patógenos multirresistentes nas últimas décadas vem 
preocupando clínicos e a comunidade científica, pois as opções de tratamento para vários 
patógenos de grande relevância estão ficando restritas a poucos antimicrobianos. A 
produção de carbapenemases são um dos mecanismos significativos de resistência aos 
carbapenêmicos, em que Metalo-beta-lactamases possuem o papel principal nessa 
resistência (POIREL E NORDMANN, 2006). Há relatos de isolados produtores de MBLs 
em vários países, sendo responsáveis por surtos e falha na resposta terapêutica com os 
principais antimicrobianos utilizados para o tratamento de infecções por microrganismos 
multirresistentes (FRITSCHE, 2005; LAGATOLLA, 2004; LAUPLAND, 2005). 
O espécime clínico predominante entre os 100 isolados avaliados neste estudo 
foram às secreções diversas (40%), corroborando com vários outros estudos (PELEG, 
2005; LEE, 2003a). Entretanto, no estudo de ANDRADE et al (2003), dos 1894 isolados 
de P. aeruginosa, 43,3% foram provenientes do trato respiratório. No estudo realizado com 
135 isolados de P. aeruginosa, no Hospital São Lucas, em Porto Alegre, 43% dos isolados 
foram provenientes de secreções do trato respiratório, seguido por urina (33,3%), ferida 
cirúrgica (5,9%), cateter (3%) e outras secreções (9,6%) (ZAVASCKI, 2006). Em 
Fortaleza, onde foram avaliados 331 isolados de Pseudomonas spp. os principais 
espécimes clínicos foram aspirado traqueal (26,36%), urina (23,15%) e sangue (12,86%) 
(TORRES, 2006). Neste estudo, urina e secreção traqueal se destacaram em 2º e 3º lugar, 
respectivamente, entre os espécimes prevalentes. 
Em relação ao número de isolados MBLs positivos no teste fenotípico (n=57) 
comparado ao espécime clínico, o representante de maior percentual foi o de secreções 
diversas (40%), resultado esperado devido ao número de isolados desse espécime ter sido 
maior do que os outros. Outro dado a ser pontuado é que os gênero Acinetobacter sp. e a 
espécie Pseudomonas aeruginosa foram os microrganismos mais incidentes em relação à 
resistência aos carbapenêmicos, correspondendo ao que já foi visto em outros estudos 
realizados no Brasil e na América Latina relatados pelos estudos do programa SENTRY 
(SANDER et al., 2005;). 
Os resultadosobtidos nesse estudo estão de acordo com vários outros estudos de 
diversas partes do mundo, onde os isolados MBL estão se tornando um problema de saúde 
pública. No presente estudo, dos 57% isolados que foram classificados como MBL no teste 
fenotípico, 42% foram pertencem à espécie Pseudomonas aeruginosa. No Japão, um 
estudo avaliou 88 isolados de Pseudomonas aeruginosa resistente ao imipenem, de 
42 
 
 
diferentes hospitais japoneses, e identificaram 12,5% das amostras produtoras de MBL. 
Este estudo concluiu que a disseminação de isolados produtores de MBL não aumentou 
nos últimos anos no Japão, no entanto o mesmo clone se disseminou por várias regiões 
daquele país (KIMURA, 2005b). Na Índia dos 50 isolados de Pseudomonas aeruginosa 
avaliados, 14 foram produtores de MBL (HEMALATHA, 2005). Dos 228 isolados 
analisados no Canadá, 98 foram produtores de MBL (LAUPLAND, 2005). Na América 
Latina, a maior concentração de isolados produtores de MBL está no Brasil e Argentina 
(FRITSCH, 2005; SADER, 2005a). No Brasil, isolados produtores de MBL já foram 
identificados em diversas regiões (GALES, 2003b). Das 198 amostras de P. aeruginosa 
analisadas em João Pessoa, Paraíba, apenas 4 foram produtoras de MBL (FILHO, 2002). 
No Recife, 62% dos isolados de P. aeruginosa avaliados foram produtores de MBL 
(MAGALHÃES, 2005). Em um estudo realizado em Porto Alegre dos 298 isolados de 
Pseudomonas aeruginosa avaliados 86 foram identificados como produtores de MBL 
(ZAVASCKI, 2006). Pode-se notar que a prevalência de isolados produtores de MBL varia 
de uma região para outra no Brasil. 
Os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos em Acinetobacter spp. são 
pouco compreendidos, e incluem a produção de MBL e de oxacilinases. O grande número 
de isolados de Acinetobacter spp. apresentando resistência a quase todos os 
antimicrobianos disponíveis atualmente é alarmante. Esta situação pode ser consequência 
de sua origem saprófita, onde este microrganismo esteve exposto por longos períodos a 
outros microrganismos produtores de antimicrobianos no solo e por este motivo consegue 
desenvolver rapidamente mecanismos de resistência (URBAN, 2003). Isolados de 
Acinetobacter baumannii produtores de MBL, no entanto, já foram relatados em diversas 
partes do mundo como: Portugal (SILVA, 1999; SILVA, 2002), Coréia (YUM, 2002; LEE, 
2003a), Itália (RICCIO, 2000), Hong Kong (CHU, 2001), Japão (SHIBATA, 2003; 
TAKAHASHI, 2000), Reino Unido (TYSALL, 2002), Polônia (FIETT, 2006), Argentina 
(SADER, 2005a). No Brasil, o primeiro relato de Acinetobacter baumannii produtor de 
MBL foi em 2003 em um paciente hospitalizado no Complexo Hospitalar São Paulo, onde 
o nível de resistência entre isolados de Acinetobacter spp. chegava a aproximadamente 
10% (GALES, 2003a). Neste estudo, 33 dos 57 isolados que foram positivos no teste 
fenotípico para detecção de MBL pertencem ao gênero Acinetobacter spp., porém nenhum 
dos genes pesquisados foram detectados nesse gênero, devido a possibilidade do mesmo 
possuir outros mecanismos de resistência que diferem dos propostos para este estudo. 
43 
 
 
A identificação rápida e correta dos isolados produtores de MBL é de grande 
importância para a Comissão de Controle de Infecção Hospitalar, pois permite a tomada de 
decisões para evitar surtos e a disseminação desses microrganismos no ambiente 
hospitalar. Várias metodologias para a detecção de isolados produtores de MBL foram 
propostas, sendo as técnicas genotípicas as mais seguras. No entanto, são metodologias 
ainda de alto custo e trabalhosas. Por outro lado, as metodologias fenotípicas são as mais 
utilizadas, pois se baseiam no fato de que essas enzimas necessitam de cátions divalentes 
para desempenhar a sua função e empregam agentes quelantes, como o EDTA ou os 
derivados de ésteres de tióis, os quais capturam esses íons divalentes, inativando as MBL 
(PITOUT, 2005; WALSH, 2005a). 
Neste estudo, visando corroborar uma metodologia simples e de fácil aplicação na 
rotina laboratorial, a metodologia fenotípica foi avaliada. A metodologia de disco 
aproximação, segundo ARAKAWA et al. (2000) e LEE et al. (2001) foi utilizada e 
comparou-se o desempenho de um dos principais agentes quelantes relatados na literatura: 
solução de EDTA 0,1M. A solução de EDTA 0,1M teve um bom desempenho na detecção 
da maioria dos isolados produtores de MBL, porém falhou na detecção de alguns isolados 
por apresentar em uma zona de inibição fraca e de difícil interpretação. Através desta 
metodologia, 33 dos isolados de Acinetobacter spp. dos 57 foram identificados como 
produtores de MBL, porém nenhum apresentou positividade na análise genotípica, este 
fato pode ser explicado devido haver relatos na literatura de isolados de Acinetobacter 
baumannii serem identificados como produtores de MBLs pelas metodologias fenotípicas e 
na análise genotípica identificar a produção de oxacilinases (SEGAL, 2005). 
A detecção precoce desses genes poderia contribuir para o controle de 
disseminação de isolados multirresistentes. Métodos fenotípicos de triagem, apesar de 
simples de executar e baratos, têm mostrado resultados discordantes dependendo da 
metodologia utilizada, dos antibióticos aplicados como substratos, dos inibidores de MBL 
utilizados e das bactérias testadas. Os testes fenotípicos utilizados para detectar isolados 
produtores de MBL devem ser baseados no gênero bacteriano a ser testado, 
independentemente de qual enzima é produzida por esses isolados (PICÃO et al., 2008). 
Apesar de 24 P. aeruginosa apresentarem teste fenotípico positivo neste estudo, a 
especificidade do EDTA como inibidor de MBL foi baixa para as MBL pesquisadas. A 
utilização do EDTA tem sido discutida por possuir efeito na permeabilidade da membrana 
bacteriana, aumentando a sensibilidade a vários antimicrobianos e gerando resultados 
44 
 
 
falso-positivos, o que poderia explicar a baixa especificidade do teste de disco- 
aproximação quando o EDTA foi utilizado (PICÃO et al.,2008). 
A análise por reação da polimerase em cadeia (PCR) é uma das técnicas mais 
adequadas e satisfatórias para a confirmação de amostras MBLs positivas, mas seu uso 
prático tem sido limitado em virtude do elevado custo. Contudo, é importante ressaltar que 
a detecção molecular de MBLs apresenta relevância no contexto epidemiológico 
(SPELDOOREN, V. et al ., 1998). 
Outro dado a ser observado, é que de 47 P. aeruginosa analisadas, apenas 6 são 
produtoras de NDM-1 (MBL). Alguns fatores devem ser considerados para explicar a 
resistência destas bactérias aos carbapenêmicos na ausência de carbapenemases. QUALE 
et al.(2006) ressaltam que na ausência de uma carbapenemase eficiente, a resistência aos 
carbapenêmicos em P. aeruginosa pode ser consequência de uma associação entre 
hiperprodução de AmpC, perda de porina OprD e expressão aumentada de bomba de 
efluxo MexAB-OprM. O achado mais consistente em isolados resistentes aos 
carbapenêmicos tem sido a perda de OprD. No entanto, o aumento da expressão de AmpC 
tem um pequeno efeito sobre o meropenem. Meropenem é um conhecido substrato do 
sistema MexAB-oprM e o aumento da sua expressão pode causar vários efeitos sobre a 
sensibilidade a este antibiótico. Nesse estudo, ainda encontraram diminuição da expressão 
de oprD em todos os isolados resistentes, e a maioria das bactérias resistentes ao 
imipenem/meropenem apresentava também aumento da expressão de ampC e bombas de 
efluxo (QUALE et al.,2006). 
Os resultados obtidos nesse estudo revelam o perfil da resistência aos 
carbapenêmicos em P. aeruginosa devido à produção da enzima NDM-1 (MBL). Sabe-se 
que essa bactéria é o principal não fermentador responsável por infecção hospitalar, e que 
esta espécie adapta-se rapidamente a condições ambientais diversas (HILL; HENRY; 
SPEERT, 2007). Com isso, estudos dessa natureza tornam-se cada vez mais importantes 
para identificar elementos de resistência