EstudoExpressaoGenes-Soares-2012

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
ESTUDO DA EXPRESSÃO DOS GENES DO METABOLISMO DO ÁCIDO 
FÓLICO E ASSOCIAÇÃO COM O DESENVOLVIMENTO DE FENDAS ORAIS 
 
 
 
 
Mestrando: Clélio Diogo Soares 
Orientador: Prof. Dra. Adriana Augusto de Rezende 
Co-orientador: Dr. André Ducati Luchessi 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL-RN 
2012 
 
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ESTUDO DA EXPRESSÃO DOS GENES DO METABOLISMO DO ÁCIDO 
FÓLICO E ASSOCIACÃO COM O DESENVOLVIMENTO DE FENDAS ORAIS 
 
 
 
Dissertação apresentada à Coordenação do 
Programa de Pós-graduação em Ciências 
Farmacêuticas, como requisito para obtenção do 
título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. 
 
 
 
Mestrando: Clélio Diogo Soares 
Orientador: prof. Dra. Adriana Augusto de Rezende 
Co-orientador: Dr. André Ducati Luchessi 
 
 
 
 
 
NATAL-RN 
2012 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Instituições envolvidas na Pesquisa 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, PPgCF - UFRN 
Universidade de São Paulo, FCF - USP 
Hospital de Pediatria Prof. Heriberto Ferreira Bezerra, HOSPED - UFRN 
Hospital Infantil Varela Santiago, Natal/RN 
Escola do IV Centenário, Natal/RN 
 
Equipe de Pesquisa 
Prof. Dr. Mario Hiroyuki Hirata –USP/SP 
Profa. Dra. Maria das Graças Almeida -UFRN 
Profa. Dra. Rosário Dominguez Crespo Hirata - USP/SP 
Profa. Vivian Nogueira Silbiger -UFRN 
Dr. André Ducati Luchessi – Pós Doutorando - UFRN 
Maria Leila Cardoso, Doutoranda - PPgCSA/UFRN 
João Felipe Bezerra, Doutorando - PPgCSA/UFRN 
Gustavo Medeiros de Oliveira, Doutorando - PPgCSA/UFRN 
 
Colaboradores, Doutorandos, Mestrandos e Iniciação Científica 
Dra. Águeda Maria Trindade, Médica - Hospital Infantil Varela Santiago 
Dra. Maria Edinilma Felinto Brito – Médica - HOSPED/UFRN 
Dra. Sandra Regina de Oliveira, Fonoaudióloga - HOSPED/UFRN 
Dra. Tânia Maria de Araújo, Nutricionista - HOSPED/UFRN 
Msc. Francisco Paulo Freire Neto – DBQ/UFRN 
Aglauciele Maria Lima de Oliveira, IC – Farmácia/UFRN 
Anne Caroline Barbosa, IC – Farmácia/UFRN 
Fabrício Melo dos Santos, IC – Farmácia/UFRN 
Leandro Vinícius de Morais, IC – Farmácia/UFRN 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATÓRIA 
 
A Deus, 
Ele é quem nos criou e sabe tudo ao nosso respeito, onde nem o mais sábio 
pesquisador não se compara a grandeza, sabedoria e poder desse Deus. Dedico 
a esse trabalho ao único que é digno de toda honra e glória, pois sem dúvida 
nenhuma, sem a direção dada por Ele eu não teria chegado a bela realização e 
importância desse trabalho. 
 
A minha mãe Socorro, 
Pelo exemplo de dedicação, pessoa reta, íntegra e esforçada que ela é, e que 
nunca mediu esforços muitas vezes sem condições, para realizar meus sonhos 
profissionais e pessoais. Sem dúvida mãe, você é minha maior e verdadeira 
felicidade! 
 
A minha esposa Aniely 
Que sempre esteve e está do meu lado nos momentos bons e difíceis da minha 
vida profissional e pessoal, me dando força e apoio sempre para que eu consiga 
crescer e ser a cada dia uma pessoa melhor. 
 
Ao meu filho Gabriel 
Você é uma benção de Deus na minha vida, mais uma razão de viver, pois 
mesmo o cansaço diário muitas vezes me desanimar sempre o seu sorriso me 
renova. 
 
À minha família, Cledson, Carla e Teté 
Que são também razão da imensa felicidade de concluir esse trabalho porque 
cada um de vocês está estampado em todos os momentos de desenvolvimento 
da minha vida sempre se doaram para que eu pudesse crescer. 
 
Aos meus verdadeiros amigos, 
Pelo companheirismo durante todos esses anos, que sempre estiveram comigo 
me dando ânimo e acreditando em mim independente dos meus defeitos e 
qualidades. 
AGRADECIMENTOS 
 
À Minha orientadora Profa. Dra. Adriana Augusto de Rezende e ao meu Co-
Orientador Dr. André Ducati Luchessi, pelos ensinamentos passados, pela paciência, 
por sempre acreditar que podemos melhorar a cada dia e darmos o nosso melhor 
sempre. 
 
À Profa. Dra. Maria das Graças Almeida por nos ensinar tanto como devemos 
ser e que condutas devemos ter para alcançarmos nossos objetivos. 
 
Ao Prof. Tit. Mario Hiroyuki Hirata que confiou em nosso grupo de forma 
completa, confiando em nossa capacidade submeteu nosso Projeto a FAPESP, 
possibilitando dessa forma a realização do mesmo. 
 
À Sandra Regina de Oliveira, Fonoaudióloga do HOSPED/UFRN que foi a 
idealizadora do Programa de Atendimento aos Pacientes Fissurados desse hospital e que 
sempre lutou para a realização do Projeto, incluindo todos os componentes do 
Programa. 
 
À Dra. Águeda Maria Trindade Germano que nos abriu a possibilidade de 
agregarmos ao nosso trabalho os pacientes atendidos no Hospital Varela Santiago. 
 
Ao Prof. Dr. José Brandão Neto (Depto. de Medicina Clínica - UFRN) 
 
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas pela contribuição 
na minha formação profissional. 
 
Ao Laboratório de Análises Toxicológicas e Clínicas – LIATEC e seus 
funcionários pela disponibilidade e importante contribuição. 
 
À equipe do Hospital de Pediatria, através das enfermeiras Telma e Jane pela 
disponibilidade e cooperação. 
 
Aos indivíduos, casos e controles, que participaram desse estudo, pois eles são 
a razão do nosso esforço e dedicação para cumprir nossa meta de trazer elucidações 
sobre as causas genéticas das fendas orais. 
 
Aos funcionários Aureliana, Fábia e Washington, pela presença amiga, pelo 
carinho e ajuda. 
 
À Cristina e toda equipe do LABMAD/USP pela ajuda, sempre que possível. 
 
 À equipe do LABMULT/LABIOMOL: Gustavo, Leila, Felipe, Heglayne, Karla, 
Yonara, Gabriel, Marcela, Freire, Brunno, Melina, Rand, Raul, Fabrício, Anne 
Caroline, Aglauciéle e Leandro que durante anos dedicam tempo, trabalho e talento em 
prol da pesquisa e do crescimento pessoal. 
 
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP por 
fomentar esse projeto científico. 
 
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq 
pela bolsa de mestrado concedida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
Introdução: Há evidencias consideráveis sugerindo que genes relacionados ao 
metabolismo do folato possuem um papel importante na etiologia das fendas orofaciais. A 
expressão de genes que possam estar ligados às fendas orais requer a presença de 
apropriadas causas ambientais em combinação com fatores genéticos que culminam com 
a falha na fusão dos processos faciais. Objetivo: Realizar estudo de associação da 
expressão dos genes da via do metabolismo do acido fólico - MTHFR, MTR, RFC1, 
MTRR, com a ocorrência das fendas orais. Metodologia: Foram estudados 50 filhos 
casos e suas respectivas mães, e 50 indivíduos controles e suas respectivas mães. 
Inicialmente foram realizadas as análises bioquímicas (Glicose, ALT, AST, Creatinina, 
Folato, Vitamina B12, Homocisteína), hematológicas (hemoglobina, hematócrito, 
contagem de hemácias, os índices hematológicos, VCM, HCM e CHCM) e estudo de 
suas características clínicas. Para a realização do estudo de expressão gênica foi 
extraído o RNA total a partir das células do sangue periférico, o qual foi quantificado e 
analisado quanto a sua pureza e integridade e encaminhado para a obtenção do cDNA a 
ser utilizado para o estudo de expressão utilizando ensaios pré-desenhados. Finalmente 
foi avaliada a influência de determinados genótipos (MTRR A66G; MTHFR C677T; 
MTHFR A1298C; MTR A2756G; RFC1 A80G) sobre a expressão de RNAm dos 
respectivos genes estudados. A análise estatística dos dados foi realizada considerando 
o nível de significância de 95% (P<0,050) Resultados: Foi evidenciada a presença do 
consumo de álcool como fator de risco significativo presente para as mães caso 
(P=0,001). Em relação as dosagens bioquímicas não foram observadas diferençassignificativas entre os casos e respectivos controles os quais apresentaram valores de 
AST, ALT e creatinina dentro dos valores de referência. A dosagem de ácido fólico 
apresentou-se reduzida significativamente para o grupo dos filhos caso (P=0,010) e para 
suas mães (P=0,001). Na análise hematólogica não foram observadas alterações em 
nenhum dos parâmetros avaliados como hemoglobina, hematócrito, contagem de 
hemácias, os índices hematológicos, VCM, HCM e CHCM dentre os grupos avaliados. A 
avaliação da expressão gênica para o grupo das mães caso mostrou uma redução 
significativa na expressão do RNAm em todos os genes avaliados: para o gene da 
metionina sintase (MTR, p=0,008), da metionina sintase redutase (MTRR, p=0,015), do 
RFC1 (P=0,004) e da MTHFR (P=0,017) comparados com o grupo de mães controle. No 
grupo de filhos fissurados, houve uma redução significativa na expressão do RNAm para 
os genes da metionina sintase (MTR, p=0,010) e da metionina sintase redutase (MTRR, 
p=0,034). Para a análise da influencia dos genótipos na expressão observou-se que o 
genótipo recessivo (CC) para o polimorfismo A1298C do gene MTHFR poderia estar 
associada a uma redução da expressão de seu RNAm. Conclusão: Genes do 
metabolismo de folato relacionados são reduzidamente expressos em ambos os grupos 
caso deste estudo, uma vez que todos os quatro genes (RFC1, MTHFR, MTR, MTR), 
estavam reduzidos nas mães e dois genes (MTR, MTRR) em seus filhos. A redução da 
expressão desses genes representa um aumento do risco associado com a presença de 
fendas orais nestes indivíduos. 
Palavras Chaves: Expressão gênica; Fendas Orais, Polimorfismos genéticos. 
 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
Introduction: There is considerable evidence suggesting that folate-related genes play a 
role in the etiology of oral facial clefts. Clefts are known to have a strong genetic 
component. The expression profile of genes involved on the pathway and folic acid 
metabolism which is linked to oral clefts requires appropriate environmental causes in 
combination with genetic factors that culminate in the failure of fusion of facial 
processes. Objective: The objective is to perform the association of differential gene 
expression of folate metabolism genes (MTHFR, MTR, RFC1, MTRR) with the occurrence 
of oral clefts. Methods: We studied 50 subjects with oral clefts and their mothers, and 50 
individuals absent of oral clefts and their mothers, totaling 100 individuals referred cases 
and 100 controls respectively. For gene expression study, total RNA was extracted from 
peripheral blood cells, then it was quantified and analyzed for purity by absorbance 
relation and integrity in MOPS gel. The mRNA samples with good purity and integrity were 
transcribed to cDNA using reverse transcription kit. The cDNA was used in pre-designed 
gene expression assays. In a previous study performed by our group were evaluated by 
PCR-RFLP the MTRR A66G, MTHFR C677T, MTHFR A1298G, MTR A2756G, RFC1 
A80G polymorphisms, in this study we evaluated the influence of these polymorphisms 
on gene expression. It was also performed biochemical, hematological analyzes and a 
clinical characteristics study of these individuals. We performed statistical analysis 
considering the significance level of 95% (P <0.050) Results: The consumption of Alcohol 
was reported as a significant risk factor for the present case mothers (p = 
0.001). Regarding the biochemical there were no significant differences between children 
cases group and their controls which had values of AST, ALT and creatinine within the 
reference values. The folic acid dosage presented significantly reduced in case mothers 
group (P = 0.011). In haematological analysis was not observed significant changes in any 
of the evaluated parameters such as hemoglobin, hematocrit, erythrocyte count, and 
hematological indices, MCV, MCH and MCHC among the groups. The assessment of 
gene expression for case mother group showed a significant reduction in mRNA 
expression in all evaluated genes; for the methionine synthase gene (MTR, p = 0.008), the 
methionine synthase reductase (MTRR, p = 0.015), the reduced folate carrier 1 (RFC1, 
P= 0.004) and methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR, P= 0.017) compared with 
the control group mothers. In the case children group, similar results were obtained, with a 
significant reduction in mRNA expression of methionine synthase gene (MTR, p = 0.010) 
and methionine synthase reductase (MTRR, p = 0.034) analysis of genotypes in relation 
to expression was found that the recessive genotype (CC) for the MTHFR gene A1298C 
polymorphism is associated with reduced expression of its mRNA. Conclusion: Folate 
metabolism related genes are low expressed on both case groups of this study, since all 
four genes (RFC1,MTHFR, MTR, MTR,) were reduced on mothers and two genes (MTR, 
MTRR) in their children. These down regulated genes represent an increased risk 
associated with the presence of oral clefts in these individuals. 
 
 
Keywords: Gene expression, oral clefts, genetic polymorphisms 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO.............................................................................. 15 
1.1 Metabolismo do Ácido Fólico e Fendas Orais............................... 20 
1.2 Aspectos Genômicos: Expressão e Polimorfismos nos Genes 
Candidatos para o Desenvolvimento de Fendas Orais................ 
 
23 
2 OBJETIVOS.................................................................................. 27 
2.1 Objetivo Geral................................................................................ 27 
2.2 Objetivos Específicos.................................................................... 27 
3 METODOLOGIA........................................................................... 28 
3.1 Aspectos do Estudo....................................................................... 28 
3.2 Casuítica ....................................................................................... 28 
3.3 Determinações dos Parâmetros Bioquímicos e 
Hematológicos............................................................................... 
 
29 
3.4 Estudo de Expressão Gênica........................................................ 30 
3.4.1 Extração do RNA Total.................................................................. 30 
3.4.2 Análise da Integridade do RNA total ............................................ 30 
3.4.3 Síntese do cDNA .......................................................................... 33 
3.4.4 Escolha do Gene de Referência .................................................. 32 
3.4.4.1 Análises dos dados de amplificação e definição do gene de 
referência....................................................................................... 
 
33 
3.5 Análise da Expressão Gênica por qPCR ...................................... 35 
3.6 Análise Estatística......................................................................... 36 
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................... 37 
4.1 Caracterização da Amostra........................................................... 37 
4.2 Avaliação dos Fatores de Risco Associados ao 
Desenvolvimento das Fendas Orais ............................................ 
 
39 
4.3 Fatores de Risco Genômicos........................................................ 44 
4.3.1 Estudo da Expressão de RNAm dos Genes do Metabolismo do 
Ácido Fólico – MTHFR, MTR, MTRR, RFC1................................. 
 
44 
4.5 Estudo da Relação dos Genótipos com a expressão De RNAm 
dos Genes do Metabolismo do Ácido Fólico................................ 
 
55 
4.5.1 Relação entre os Genótipos do Polimorfismo A80G do gene 
RFC1 em seu perfil de expressão de RNAm................................ 
 
56 
4.5.2 Relação entre os Genótipos do Polimorfismo A2756G do gene 
MTR em seu perfil de expressão de RNAm.................................. 
 
58 
4.5.3 Relação entre os Genótiposdo Polimorfismo C677T do gene 
MTHFR em seu perfil de expressão de RNAm............................. 
 
61 
4.5.4 Relação entre os Genótipos do Polimorfismo A1298C do gene 
MTHFR em seu perfil de expressão de RNAm ............................ 
 
64 
4.5.5 Relação entre os Genótipos do Polimorfismo A66G do gene 
MTRR em seu perfil de expressão de RNAm............................... 
 
67 
5 CONCLUSÕES............................................................................. 71 
 5 REFERÊNCIAS ............................................................................ 72 
 APÊNDICE A ............................................................................... 79 
 APÊNDICE B................................................................................ 81 
 APÊNDICE C................................................................................ 83 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
 
AAFLAP – Associação de Apoio aos Fissurados Labiopalatais 
ALT – Alanina aminotransferase 
AST – Aspartato aminotransferase 
CADEFI – Centro de Atenção aos Defeitos da Face 
CEFIL – Centro de Apoio e Reabilitação dos Indivíduos com Fissuras Lábio-palatinas de 
Londrina e região 
CHCM – Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média 
DNA – Ácido desoxirribonucleico 
RNA – Ácido ribonucléico 
ECLAMC – Estudo Colaborativo Latino-Americano de Malformações Congênitas 
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético 
FAPESP – Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo 
HCM – Hemoglobina Corpuscular Média 
HOSPED – Hospital de Pediatria Prof. Heriberto Bezerra da UFRN 
HRAC – Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais 
IMIP – Instituto Materno Infantil Professor Fernando Figueira 
LABIOMOL – Laboratório de Biologia Molecular da PPGCF/UFRN 
MS – Ministério da Saúde 
MTHFR – Metilenotetrahidrofolato Redutase 
MTR – Metionina Sintetase (Methionine Synthase) 
OMS – Organização Mundial de Saúde 
ONG – Organização Não-Governamental 
PCR – Reação em Cadeia pela Polimerase 
PPgCF – Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFRN 
RFC1 – Transportador de folato reduzido 1 (Reduced Folate Carrier) 
RRTDCF – Rede de Referência no Tratamento de Deformidades Craniofaciais 
SAM – S-adenosilmetionina 
SIH – Sistema de Informações Hospitalares 
TBE – Tampão Tris Borato EDTA 
TCLE – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 
tHcy – Concentração de homocisteína total 
UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte 
USP – Universidade de São Paulo 
VCM – Volume Corpuscular Médio 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
FIGURA 1. Tipos de fendas orais 
 
16 
FIGURA 2. Esquema da via metabólica do ácido fólico 
 
22 
FIGURA 3. Gel de Integridade de RNAm – Amostra íntegras 
 
31 
FIGURA 4. Gel de Integridade de RNAm – Amostra degradadas 
 
31 
FIGURA 5: Curvas de amplificação dos genes de referência – Filhos 
 
32 
FIGURA 6. Curvas de amplificação dos genes de referência – Mães 
 
33 
FIGURA 7. Imagem da análise do gene de referência através do software 
geNorm. 
 
34 
FIGURA 8. Distribuição dos casos analisados de acordo com o tipo de 
fenda. 
 
37 
FIGURA 9. Distribuição dos casos analisados de acordo com o gênero. 
 
38 
FIGURA 10. Distribuição dos casos analisados de acordo com o tipo de 
fenda subdivididos em função do gênero. 
 
38 
FIGURA 11. Expressão de RNAm dos genes RFC1, MTR, MTHFR e 
MTRR em relação ao gene de referencia β-Actina nos grupos: mães 
caso e mães controles 
 
44 
FIGURA 12. Expressão de RNAm dos genes RFC1, MTR, MTHFR e 
MTRR em relação ao gene de referencia β-Actina nos grupos: filhos 
casos e filhos controles. 
 
45 
FIGURA 13: Correlação de Pearson entre os perfis de expressão de 
RNAm dos genes RFC1, MTR, MTHFR e MTRR do grupo das mães. 
 
49 
FIGURA 14: Correlação de Pearson entre os perfis de expressão de 
RNAm dos genes RFC1, MTR, MTHFR e MTRR do grupo de Filhos 
 
50 
FIGURA 15: Correlação de Pearson entre os perfis de expressão de 
RNAm dos genes, MTHFR e MTR em relação a concentração sérica de 
Homocisteína no grupo das mães 
 
51 
FIGURA 16: Correlação de Pearson entre os perfis de expressão de 
RNAm do gene MTHFR em relação a concentração sérica de 
Homocisteína no grupo dos filhos 
 
52 
FIGURA 17: Análise da expressão do RNAm do gene RFC1 em relação 
ao genótipos do polimorfismo A80G. A: 
 
56 
FIGURA 18: Diagrama de caixas valores de expressão de RNAm do gene 
RFC1 divididos por genótipo do polimorfismo A80G. 
57 
FIGURA 19: Análise da expressão do RNAm do gene da MTR versus 
genótipos do polimorfismo A2756G. A: 
 
59 
FIGURA 20: Diagrama de caixas dos valores de expressão de RNAm do 
gene MTR divididos por genótipo do polimorfismo A2756G. A: 
 
60 
FIGURA 21: Análise da expressão do RNAm do gene da MTHFR versus 
genótipos do polimorfismo C677T. 
 
62 
 
FIGURA 22: Diagrama de caixas dos valores de expressão de RNAm do 
gene MTHFR divididos por genótipo do polimorfismo C677T. 
 
63 
FIGURA 23: Análise da expressão do RNAm do gene da MTHFR versus 
genótipos do polimorfismo A1298C. 
 
65 
FIGURA 24: Diagrama de caixas dos valores de expressão de RNAm do 
gene MTHFR divididos por genótipo do polimorfismo A1298C. 
 
66 
FIGURA 25: Análise da expressão do RNAm do gene da MTHFR versus 
genótipos do polimorfismo A66G. 
 
68 
FIGURA 26: Diagrama de caixas dos valores de expressão de RNAm do 
gene MTRR divididos por genótipo do polimorfismo A66G 
 
 
68 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
TABELA 1. Análise dos valores de CT dos filhos realizada pelo 
Normfinder(MDL, Aarhus, Denmark) indicando a β-Actina como gene 
de referência. 
34 
TABELA 2. Análise dos valores de CT das mães realizada pelo 
Normfinder(MDL, Aarhus, Denmark) indicando a β-Actina como gene 
de referência ideal. 
35 
TABELA 3. Ensaios de expressão gênica TaqMan® padronizados 
pela Applied Biosystems (Foster city, CA, EUA) 
36 
TABELA 4. Fatores de risco associados ao desenvolvimento de 
fendas em mães e controles 
40 
TABELA 5. Idade das mães ao nascimento dos filhos analisados 41 
TABELA 6. Dosagens bioquímicas e hematotólicas dos grupos 
estudados 
44 
 
 
 
16 
 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
As fendas orais são conhecidas por ter um forte componente genético, 
sendo sugerido que resultam de uma complexa interação de fatores genéticos, 
epigenéticos e ambientais. Em humanos, a expressão de genes finamente 
coreografada à migração celular, à transformação celular e apoptose entre 14º e 
60º dias após a concepção origina os tecidos moles e duros da face a partir da 
membrana de origem orofaríngea (WEHBY; MURRAY, 2010, REITER et al., 
2012). Distúrbios nesse processo de desenvolvimento embrionário podem 
culminar com a formação incompleta de estruturas nas cavidades nasal e oral, 
tais como lábios, alvéolos e palato. Outras regiões da face como orelhas e 
pálpebras também podem apresentar malformações e surgem com menor 
frequência, podendo estar parcial ou totalmente acometidas. (MARTELLI JÚNIOR 
et al., 2007). 
As fissuras de lábio e/ou palato são divididas em fissuras de palato 
isoladas (FPI) ou fissura labiopalatina (FL/P). Podem ser sindrômicas, quando 
ocorrem juntamente com outra malformação ou outras síndromes como exemplo 
a síndrome de Down e podem ser não sindrômicas (NS), quando ocorrem 
isoladamente. Aproximadamente 70% dos indivíduos com FL/P e 50% dos com 
FPI possuem essa malformação com origem não sindrômica ou associada a 
outros defeitos congênitos estruturais. Os 30% restantes das FL/P e 50% 
restantes das FPI estão relacionados com outras síndromes e agentes 
teratogênicos (MOORE; STANIER, 2004; REITER et al., 2012). 
Dispostos a descrever as fendas orais de maneira a facilitar os estudos e 
unificar a nomenclatura acerca dessas malformações craniofaciais, vários autores 
buscaram classificá-las de acordo com seu entendimento. Em 1942, Fogh-
Andersen apresentou uma classificação baseada na embriologia e na genética 
envolvida na formação das fendas. Nessa, asfendas foram divididas em três 
principais grupos: I - Fenda labial (simples ou dupla), II - Fenda labiopalatina, que 
é o maior grupo (abrangendo fendas completas da narina até a úvula), III) Fenda 
de palato, sendo sempre mediana e nunca ultrapassando o forame incisivo. 
Já em 1972, Spina propôs uma nova classificação, sendo esta ainda hoje a 
mais utilizada pelas equipes multidisciplinares envolvidas no tratamento das 
crianças portadoras de fendas orais. É uma classificação clara e objetiva baseada 
17 
 
 
 
no forame incisivo (Figura 1). O forame dos incisivos é o marco de separação 
embriológica e anatômica das fendas que acometem o palato primário e 
secundário. Esta classificação pode ser dividida em 4 grupos: I) Fendas Pré-
forame incisivas, sendo do tipo unilaterais (direita ou esquerda, completa ou 
incompleta), bilaterais (completa ou incompleta) ou mediana (completa ou 
incompleta); II) Fendas Transforame incisivas, sendo do tipo unilaterais (direita ou 
esquerda), bilaterais e medianas; III) Fendas Pós-forame incisivas completas ou 
incompletas e IV) Fendas raras da face (SPINA; PSILLAKIS; LAPA, 1972.; 
NUNES, et al. 2007; CYMROT et al., 2010). 
 
FIGURA 1. Classificação dos tipos de fendas orais. A: Representação esquemática em corte 
transversal do palato mostrando a posição do forame incisivo que divide as fendas em: Pré-
forames, Transforames, Pós-forames. B: Corte transversal palato vista inferior mostrando os tipos 
de fenda oral. 1-fissura pré-forame unilateral incompleta; 2-fissura pré-forame bilateral incompleta; 
3-fissura pré-forame unilateral completa 4-fissura pré-forame completa bilateral; 5-fissura 
transforame unilateral; 6-fissura transforame bilateral; 7-fissura pós-forame completa; 8-fissura 
pós-forame incompleta. C: Ilustrações dos tipos de fenda oral em modelo humano. 1- Visão frontal 
externa da fissura transforame unilateral; 2- visão transversal da fissura transforame unilateral; 3- 
Visão frontal externa da fissura pré-forame unilateral incompleta; 4- Visão transversal inferior da 
fissura pós-forame completa. (CYMROT et al., 2010) 
 
As fendas orais geram no indivíduo problemas relacionados à fala, ao 
desenvolvimento dentário como também levam a danos psicológicos, sendo 
frequentemente necessárias cirurgias para correção funcional e estética em que 
18 
 
 
 
na maioria das vezes o paciente precisa ser submetido a uma série de cirurgias a 
fim de que a malformação seja corrigida, e após a(s) cirurgias esse paciente 
precisa ser acompanhado por atendimento fonoterápico, ortodôntico e 
psicológico. A realização do tratamento adequado desses pacientes é 
fundamental para que o fissurado se adapte corretamente na sociedade, porém é 
extremamente complexo e de alto custo (BRUSTOLIN, 2009). 
Estima-se a existência de 1 caso para cada 650 nascidos vivos no Brasil, 
sendo que os poucos estudos disponíveis apresentam reduzida confiabilidade 
devido ao fato de utilizarem-se de amostras pequenas e, em sua maioria, relativas 
a estatísticas hospitalares de algumas localidades do País, onde a maioria dos 
estudos não envolve casos da região Norte e Nordeste (MONLLÉO, GIL-DA-
SILVA-LOPES, 2006). Além disso, os dados disponíveis pelo Ministério da Saúde 
(MS) relacionam apenas os números de cirurgias realizadas para fendas labiais 
e/ou palatinas de acordo com o gênero, a faixa etária e nos Estados onde mais 
frequentemente se realizaram os procedimentos, não existindo estudos 
estatísticos oficiais que determinem a incidência das fendas labiais e/ou palatinas 
(NUNES et al., 2007). 
No Rio Grande do Norte, um levantamento realizado entre 2000 e 2005 
utilizando as notificações feitas ao Ministério da Saúde, através do Sistema 
de Informações sobre Nascidos Vivos (SINASC), revelou uma prevalência fendas 
orais na ordem de 0,49:1.000 nascidos vivos. Esse mesmo estudo aponta que 
nesse período ocorreram 318.667 partos com nascidos vivos no RN e 155 
crianças apresentaram algum tipo de fenda oral. Nessa população, foram 
identificados 32 casos de fendas labiais (0,10:1000), 19 pacientes apresentaram 
fenda palatina isolada (0,06:1000) e 104 pacientes com fissuras labiopalatinas 
(0,33/ 1000 nascidos vivos) (FIGUEIRÊDO, et al., 2011). 
Figueiredo e colaboradores (2011) mostraram um aumento 
na incidência das fendas orais no Rio Grande do Norte ao longo período estudado 
e nos anos 2000 e 2001 foram observados os índices mais baixos 
(0,39 e 0.40:1000, respectivamente), um pico em 2002 com 0,55:1000 e uma leve 
redução em 2003 e 2005 (0,54:1000). Além disso, estima-se, em virtude da baixa 
notificação de casos e de um fator genético recorrente nas famílias, que a 
ocorrência desta malformação nos estados do Nordeste, especialmente no Rio 
Grande do Norte, é possivelmente superior do que na região Centro-Sul. Desta 
19 
 
 
 
forma, torna-se imprescindivel a realização de estudos contínuos que possam 
estimar a prevalência e incidência deste defeito congênito no estado do RN para 
que o Programa de Atendimento aos pacientes com Fendas Orais, atualmente 
instalado no Hospital de Pediatria Professor Heriberto Ferreira Bezerra - 
HOSPED/UFRN, se consolide como centro de referência do Estado, 
encaminhando assim para a efetiva inclusão da assistência aos indivíduos 
acometidos de defeitos congênitos craniofaciais no SUS. Deve ser ressaltado que 
a especialidade de genética clínica exigida na equipe complementar é 
contemplada na equipe do HOSPED, e que o Laboratório de Biologia Molecular 
(LABIOMOL) do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas e em 
Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte foi 
incorporado ao Serviço de alta complexidade para a realização dos estudos 
genéticos. 
Devido à alta incidência das fendas orais em diferentes populações, 
estudos realizados desde a década de 80 foram desenvolvidos a fim de melhor 
compreender o modelo de herança e os genes relacionados com a etiologia das 
fendas orofaciais em pacientes não sindrômicos, contudo os resultados ainda são 
inconclusivos e discreântes. A complexa interação entre fatores genéticos e 
ambientais também deve ser considerada na etiologia das fissuras labiopalatinas. 
O modelo de herança atualmente aceito é o multifatorial com limiar, apesar de 
inconclusivo em algumas populações (MELNICK et al., 1980; MARAZITA et al., 
2004). Este modelo esclarece que a ocorrência das fissuras depende de múltiplas 
alterações genéticas com efeitos sinérgicos associados a fatores ambientais, e o 
acúmulo desses fatores de risco (genéticos e ambientais) podem levar ao 
desenvolvimento das fendas orofaciais. (GORLIN et al., 2000). Portanto as fendas 
orais mostram uma forte agregação familiar, o que denota a existência de um 
componente genético importante e podem ocorrer devido a mais de 450 causas 
incluindo alterações cromossômicas, a um gene isolado, exposição ambiental 
e/ou síndromes de causa desconhecida (BERTOJA, 2006. WEHBY; MURRAY, 
2010). 
Estimativas do risco de recorrência para parentes de primeiro grau (definida 
como a prevalência de fissuras em parentes de primeiro grau em comparação com 
a prevalência da população) revela uma faixa de recorrência em 32 vezes na 
recorrência de fissura de lábio e de 56 vezes na recorrência para fissuras palatinas 
20 
 
 
 
(SIVERTSEN, et al. 2008). Tais estimativas são úteis para a realização de um 
aconselhamento genético, pois podem fornecer evidências para inferências sobre 
a causalidade dessas malformações (HARPER, 1998; FIRTH, 2005). Fogh-
Andersen (1942) mostrou que a fissura palatina pode possuir causas diferentes 
das relacionadas a fissuras labiais, essas com ou sem fenda palatina, mostrando 
que as famílias com alto risco para um tipo não estão em risco aumentado para o 
outro. 
Desse modo há um conjunto informações genéticas, ainda não conclusivas, 
porem indicativas de forte contribuição e predisposição existentesno 
desenvolvimento das fendas orais. Elas podem ser causadas pelas múltiplas 
interações entre os genes e cada gene possui sua própria tendência variável de 
ser expresso. Somado a isso, a expressão dos genes candidatos requer a 
presença de apropriadas causas ambientais. 
Marcadores em mais de 16 regiões cromossomais têm demonstrado 
evidência de ligação às fendas orais e seus fenótipos relatados em muitos estudos 
de associação, sugerindo que estes loci genéticos podem conter muitos genes 
influenciando o desenvolvimento delas, incluindo não exclusivo ou limitadamente, 
genes que regulam fatores de transcrição, fatores de crescimento, sinalização 
celular, metabolismos de detoxificação (MURTHY; BHASKAR, 2009). A interação 
entre os genes, mutações, e polimorfismos pode estar alterando a expressão dos 
genes que regulam o metabolismo do folato. Genes que são responsáveis pela 
herança das fendas sindrômicas são fortes candidatos para as fendas não-
sindrômicas, em que mutações com algum efeito ou polimorfismos podem ser 
fatores de risco (SCAPOLI et al., 2008). 
Atualmente, poucos são os estudos de expressão gênica envolvendo os 
genes do metabolismo do ácido fólico e associação dos mesmos ao surgimento 
das fendas orais. Portanto, a realização de um estudo de expressão com esses 
genes candidatos em indivíduos com fendas orais poderá trazer conhecimentos 
de como estes genes estão expressos e a sua relação com o desenvolvimento 
dessa malformação. 
 
 
 
 
21 
 
 
 
1.1 METABOLISMO DO ÁCIDO FÓLICO E FENDAS ORAIS 
 
Vários estudos mostram que a suplementação materna com ácido fólico no 
período pré-natal reduz a freqüência de neonatos com defeitos congênitos. Várias 
intervenções e estudos de caso-controle têm proposto que o uso pré-natal de 
multivitaminas contendo ácido fólico previne o aparecimento de fendas orais 
(BAILEY et al, 2003; JOHANNING et al 2005; BLIEK et al., 2009, PICKELL et al, 
2009). 
Quando ingerido, o ácido fólico encontra-se geralmente na forma de 
poliglutamato, porém para que haja absorção nas células do jejuno proximal, 
através do carreador de folato reduzido 1 (RFC1) presente na membrana das 
células da mucosa intestinal, o ácido fólico precisa estar na forma de 
monoglutamato. Portanto, o RFC1 deve operar eficientemente para garantir 
adequada concentração intracelular de folato. Variações no transportador de 
folato reduzido são merecedoras de investigações como potenciais fatores de 
risco para distúrbios no tubo neural e nas fendas orais (SHAW et al., 2006). Na 
figura 2 podemos observar o ciclo metabólico do ácido fólico desde a sua 
absorção às reações que objetivam a biossíntese de ácidos nucléicos e formação 
da molécula doadora de radicais metis que regulam a expressão gênica. 
A enzima carboxi glutamato peptidase II é responsável pela desconjugação 
do folato da forma poli para monoglutamato no intestino, permitindo sua absorção 
(WINKELMAYER et al. 2003). Após a absorção no intestino o folato 
monoglutamato é reduzido e convertido a 5-metil-tetrahidrofolato monoglutamato 
e transportado para a corrente sanguínea. (BAILEY et al, 2003; JOHANNING et 
al 2005; BLIEK et al., 2009, PICKELL et al, 2009). O folato atua na principal via 
co-enzimática no metabolismo de doação de carbonos, via essa que está 
diretamente ligada à biossíntese de nucleotídeos e aminoácidos, como também 
na produção da principal molécula doadora de radicais metil que regulam a 
expressão gênica, a S-adenosilmetionina, assim esses são mecanismos 
importantes no processo de proliferação e desenvolvimento celular (KIM, 2009). 
A figura 2 representa esquematicamente os caminhos metabólicos do 
folato. Dentro da célula o folato, na forma de 5-metiltetrahidrofolato (5-CH3THF), é 
um doador de carbono, estando envolvido na biossíntese das purinas e 
pirimidinas e na remetilação da homocisteína. A enzima metilenotetrahidrofolato 
22 
 
 
 
redutase (MTHFR) é responsável pela conversão do 5,10-metilenotetrahidrofolato 
(5,10-CH2THF) a 5-metiltetrahidrofolato, que é utilizado pela metionina sintase 
(MTR) na conversão da homocisteína a metionina. A deficiência da atividade da 
enzima MTHFR no metabolismo do folato em neonatos, é considerada a principal 
causa genética de hiperhomocisteinemia (SCHNAKENBERG et al, 2005, 
PICKELL, et al., 2009). 
No que diz respeito a metilação da homocisteina em metionina, é essencial 
a presença de folato (5-CH3THF) e ainda da vitamina B12. Concentrações séricas 
de folato, e as de vitaminas B6 e B12, são portanto inversamente correlacionadas 
com as concentrações séricas de homocisteína. A metilação da homocisteína é 
reconhecida como um mecanismo relevante para a estrutura e função gênica, 
sendo a metionina o precursor da S-adenosilmetionina, um potente doador de 
grupos metil para os ácidos nucléicos, neurotransmissores, fosfolipideos e 
hormônios. Concomitantemente com a geração de metionina, o tetrahidrofolato 
formado é convertido a 5,10-metilenotetrahidrofolato, facilitado por um enzima 
dependente de vitamina B6. O 5,10-metilenotetrahidrofolato é requerido para a 
biossíntese de nucleotideos purínicos e timidilato necessários a síntese e reparo 
do DNA (HARTMAN et al, 2001, GUERRA-SHINOHARA et al., 2007). 
A homocisteína é biosintetizada apartir da metionina, estando relacionado a 
uma via metabólica entre folato e ciclos de remetilação, onde três principais 
eventos podem ocorrer com a homocisteína: a remetilação da metionina, a 
entrada na via biossintética da cisteína, ou a liberação para o meio extracelular. 
Claramente, este terceiro evento é a principal causa do aumento das 
concentrações da homocisteína na urina e no plasma. O acúmulo da 
homocisteína nos liquídos corporais leva a formação de compostos altamente 
reativos como a homocisteína tiolactona, que contém uma ligação tio-éster 
intramolecular de alta energia, que a deixa quimicamente reativa levando 
facilmente a acilação de grupos amino livres, principalmente na asparagina, 
glutamina, arginina e lisina, sendo esta alta reatividade implicada no envolvimento 
da homocisteína na fisiopatologia de diversas doenças (MEDINA et al, 2001; GIL-
PRIETO et al., 2009). 
23 
 
 
 
 
 
FIGURA 2. Representação esquemática da via metabólica do ácido fólico. 
MTHFR=metilenotetrahidrofolato redutase, MTR=metionina sintase, MTRR=metionina sintase 
redutase, THF=tetrahidrofolato, 5-MTHF=5-metiltetrahidrofolato, 5,10-MTHF= 5,10 
dimetiltetrahidrofolato. Fonte: adaptado de Brandalize, et al., 2005 
 
Uma análise dos dados do Programa de Monitoramento de Defeitos 
Congênitos da Califórnia revelou que o uso materno de multivitaminas está 
associado com uma significante redução na ocorrência das fendas orais. Neste 
estudo, uma redução de 50% na ocorrência de fendas lábio-palatinas e de 27% 
de fendas palatinas isoladas está associada com o uso materno de multivitaminas 
contendo ácido fólico. Um achado similar foi relatado por Itikala et al (2001), que 
estudou mulheres que utillizaram multivitaminas durante o período pré-natal ou 
que iniciaram o uso durante o primeiro mês de gestação. Por outro lado, nenhuma 
associação foi observada em um estudo de caso-controle hospitalar realizado em 
Boston, Philadelphia e Toronto. Entretanto uma investigação posterior na mesma 
área realizada por Werler et al (1999), encontrou diminuição significante para 
fenda palatina, mas não para fenda lábio-palatina entre mulheres que utilizaram 
multivitaminas contendo ácido fólico durante a gravidez (BAILEY et al, 2005). 
 
24 
 
 
 
1.2 ASPECTOS GENÔMICOS: EXPRESSÃO E POLIMORFISMOS DOS 
GENES CANDIDATOS PARA O DESENVOLVIMENTO DE FENDAS ORAIS 
 
Até o presente momento poucos são os relatos de estudos de expressão 
gênica que relacionem a regulação de genes específicos com desenvolvimento de 
fendas orais. No entando, há uma representatividade de trabalhos relatando que 
os genes envolvidosno metabolismo do acido fólico, estão sob influencia de 
fatores regulatórios como a deficiência de folato (má ingestão ou má absorção), 
medicamentos e drogas, e outros fatores ambientais que regulam a expressão 
desses genes. Assim, estas alterações no metabolismo do folato o qual está 
diretamente ligado a sintese de ácido nucléicos e doador de radicais metil que 
regulam a expressão gênica podem estar indiretamente relacionadas com o 
aparecimento de malformações como exemplo as fendas orais (ROY, et al. 
2008., RANGANATHAN, et al.2008; LINHART, et al. 2009;) 
A deficiência de folato pode afetar a expressão gênica por perturbar os 
padrões de metilação do DNA, indução de substituições de bases, quebras de 
DNA, deleções e amplificações gênicas. Alterações na expressão poderiam 
explicar ainda a relação inversa observada entre os níveis de folato e risco de 
algumas doenças como câncer de cólon-retal (CROTT, et al. 2008). 
A baixa disponibilidade de folato no organismo resulta em níveis reduzidos 
de timina o que leva a inserção errada da uracila no DNA com efeito subsequente 
de quebra na fita simples ou dupla do DNA, resultado esse demonstrado em 
células de hamster ovariano chinês, células do epitélio intestinal de murinos, e 
linfócitos humanos (LINHART, et al. 2009). A depleção do folato também leva a 
instabilidade cromossômica, proliferações celulares desreguladas, e 
susceptibilidade aos danos no DNA de linfócitos humanos primários e células 
epiteliais do cólon (KATULA et al. 2007.). A hipometilação global in vivo e in vitro 
do DNA resultante dessa deficiência de folato leva alterações regulatórias 
epigenéticas e na regulação da expressão de genes metabólicos específicos 
(CROTT, et al. 2008). 
Estudos anteriores relataram que o receptor de folato (FOLR1) se 
apresentou mais expresso em uma situação de depleção de folato in vitro, 
enquanto o carreador de folato reduzido (RFC1) é mais expresso no intestino de 
ratos, enquanto o FOLR1 foi indetectável. Esse aumento da expressão do 
25 
 
 
 
FOLR1 e RFC1 in vitro e in vivo respectivamente, reflete a abundância das formas 
disponíveis em um modelo específico e a afinidade de cada proteína à eles. O 
FOLR1 possui uma maior afinidade pelo ácido fólico do que o RFC1 em cultura de 
células, entretanto a forma predominante de folato no plasma é o 5-
metiltetrahidrofolato, pela qual o RFC1 exibe maior afinidade (SHANE, 1995. 
SAID, et al. 2000). No entanto, estas alterações parecem ser uma resposta 
adaptativa das células na tentativa de carrear mais folato. 
Alguns medicamentos como o ácido valpróico (AVP) e metotrexato 
exercem efeitos regulatórios sobre os genes do metabolismo do folato (ROY, et 
al. 2008., RANGANATHAN, et al.2008). O ácido valpróico ou valproato é uma 
droga mundialmente utilizada em vários tratamentos médicos incluindo casos de 
epilepsia e tem sido relatado que ele possui efeito teratogênico sobre o feto 
durante o período gestacional. Porém um estudo de expressão envolvendo a 
malformação no fechamento do tubo neural utilizando camundongos (MTHFR +/+ 
e MTHFR +/-) avaliou a expressão da MTHFR em células do tipo HepG2. Foi 
observado que o AVP aumentou a expressão de RNAm da MTHFR e também da 
proteína no grupo de células HepG2 que receberam a injeção do fármaco em 
relação ao mesmo grupo que foi administrado a solução salina, e também induziu 
uma baixa teratogenicidade na deficiência da MTHFR. Esse resultado sublinha a 
importância da interconversão do folato em uma teratogenicidade induzida pelo 
AVP, uma vez que esse aumenta na expressão da MTHFR e tem baixo potencial 
teratogênico na deficiência da mesma (ROY et al. 2008). 
A expressão da enzima MTHFR com atividade catalítica diminuida em 
conseqüência das mutações e/ou polimorfismos, pode resultar na diminuição dos 
produtos formados e uma elevação do seu substrato, nesse caso a homocisteína, 
causando a hiperhomocisteinemia e homocistinúria. A ocorrência destes 
distúrbios metabólicos tem sido relacionada com o aparecimento de doença 
coronária oclusiva, neuropatia periférica, retardo mental, assim como defeitos de 
fechamento do tubo neural e malformações congênitas (MEDINA et al, 2001). 
O polimorfismo A80G na RFC1 causa a substituição de histidina por 
arginina na posição 27 da proteína expressa. Altas concentrações de folato sérico 
foram encontradas em indivíduos com genótipos A80/A80 quando comparados 
com os indivíduos G80/G80 (CHANGO et al., 2000). Além disso, SHAW et al. 
(2006) observaram maior risco (4,2 vezes maior) de espinha bífida entre as 
26 
 
 
 
crianças com genótipos G80/G80 cujas mães não fizeram uso de suplementos 
vitamínicos quando comparadas às crianças com genótipos A80/A80 e filhos de 
mulheres sem uso de suplementos vitamínicos durante a gravidez (BARBOSA et 
al., 2008). 
O polimorfismo genético MTHFR C677T é uma mutação missense que 
consiste na troca de uma citosina por uma timina na posição 677 no exon 4. Esta 
mutação causa a substituição de uma alanina por uma valina na região do 
domínio catalítico da enzima. O resultado desta substituição é uma enzima 
termolábil que possui atividade catalítica reduzida. Estudos in vitro indicaram que 
individuos com homozigose para esta mutação apresentam apenas cerca de 30% 
da atividade da enzima normal, enquanto que os heterozigotos apresentaram 
60% da atividade catalítica (ROBIEN et al, 2003). Segundo Rosenberg et al 
(2002) os indíviduos com genótipo MTHFR 677TT apresentam menores 
concentrações de folato sérico e maiores concentrações de homocisteína total 
(tHcy) quando comparados aos indivíduos com genótipo CC (SOZEN et al., 2009; 
GIL-PRIETO et al., 2009). 
Um outro polimorfismo associado a MTHFR é o A1298C no exon 7, que 
resulta na substituição de um glutamato por alanina. Este polimorfismo encontra-
se no domínio regulatório de ligação da enzima MTHFR com a da S-
adenosilmetionina (SAM). A ligação da SAM resulta em uma mudança 
conformacional da enzima MTHFR que inibe sua atividade enzimática 
(WEISBERG et al., 1998; ALESSIO et al., 2004, GUERRA-SHINOHARA et al, 
2007). 
Em um estudo realizado, in vitro, com linfócitos de indivíduos com genótipo 
1298AC, evidenciou-se que a atividade da enzima MTHFR correspondia a 60% 
da atividade da enzima nativa, e esta redução na atividade da enzima MTHFR foi 
também observada em individuos com genótipos heterozigotos para as duas 
mutações (MTHFR A1298C e MTHFR C677T) (ROBIEN et al, 2003). 
Outras enzimas, tais como a metionina sintase (MTR) e metionina sintase 
redutase (MTRR) são muito importantes no metabolismo da homocisteína. A 
metionina sintase realiza a conversão da homocisteína á metionina em presença 
de metilcobalamina (coenzima). Já a metionina sintase redutase é responsável 
pela regeneração da metilcobalamina cofator da MTR (JACQUES et al, 2003). 
27 
 
 
 
Jacques et al (2003) identificaram uma mutação no gene da MTRR que 
corresponde a substituição de uma adenina por guanina na posição 66. A 
presença do alelo G resulta numa proteína variante que exibe uma atividade 4X 
menor comparada a enzima nativa , e foi associada ao aumento no risco de 
desenvolvimento de defeitos do fechamento do tubo neural. De particular 
importância é a associação que o genótipo (A66G) da MTRR possui com o 
genótipo 677 TT da MTHFR, que leva a um relevante aumento no risco de 
defeitos do fechamento tubo neural (VAUGHN et al, 2004, O’LEARY et al, 2005, 
WETTERGREN et al., 2010). 
Jacques et al (2003) analisou o cDNA humano da MTR e demonstrou um 
polimorfismo onde ocorre a transição de A por G na posição 2756, resultando na 
substituição de uma glicina por um ácido aspártico. Essa substituição ocorre na 
região de ligação da enzima, que induz a uma modesta redução de homocisteína 
(WETTERGREN, et al., 2010) 
A interação entre o alelo 66GG da MTRR e baixas concentrações de vitamina 
B12 foi associada a um aumento de cincovezes no risco de mães terem filhos 
com espinha bífida, comparadas aquelas mãe que possuíam outros genótipos e 
concentrações de vitamina B12. O alelo 66G pode diminuir a disponibilidade de 
SAM por reduzir o nível de atividade da MTR (BARBOSA et al., 2008, 
WETTERGREN et al., 2010). 
Os conhecimentos sobre como estão expressos os genes dessa via e 
como a presença de polimorfismos genéticos podem influenciar essa expressão 
poderá contribuir para a identificação de indivíduos em risco bem como para a 
intervenção e diminuição da ocorrência das fendas orais na população. 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
 
 
2 OBJETIVOS 
 
2.1 OBJETIVO GERAL 
• Realizar estudo de associação da expressão dos genes da via do 
metabolismo do ácido fólico - MTHFR, MTR, RFC1, MTRR, com a 
ocorrência das fendas orais. 
 
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
• Avaliar as características clínicas dos indivíduos caso e controles. 
• Realizar levantamento das exposições ambientais maternas quanto 
ao tabagismo, etilismo e histórico familiar. 
• Realizar a análise bioquímica dos indivíduos caso controle, e 
respectivas mães. 
• Determinar as concentrações séricas das vitaminas B12 e folato e 
da homocisteína total plasmática dos indivíduos caso e controle, e 
respectivas mães. 
• Realizar as dosagens de glicose, AST, ALT e creatinina, além do 
hemograma nos indivíduos caso e controle, e respectivas mães. 
• Realizar o estudo de expressão de RNAm dos genes MTHFR, MTR, 
MTRR, RFC1 nos indivíduos caso e controle, e respectivas mães. 
• Avaliar a associação da expressão gênica com os genótipos dos 
polimorfismos A80G (RFC1); C677T (MTHFR); A1298C (MTHFR); 
A2756G (MTR), A66G (MTRR) nos indivíduos caso e controle, e 
respectivas mães. 
• Relacionar os dados de expressão desses genes com os 
marcadores bioquímicos e fatores ambientais, e avaliar a 
associação ao risco do desenvolvimento das fendas orais. 
 
 
 
 
29 
 
 
 
3 METODOLOGIA 
3.1 ASPECTOS DO ESTUDO 
 
 3.1 ASPECTOS ÉTICOS E FINANCIAMENTO 
O estudo foi submetido no Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital 
Universitário Onofre Lopes - UFRN, obedecendo às diretrizes regulamentadas da 
pesquisa envolvendo seres humanos, que constam na Resolução do Conselho 
Nacional de Saúde nº. 196/96 e nº. 340/04, sendo aprovado para realização sob o 
nº. 458/10 (CAAE - 0032.0.294.000-10), avaliado e cadastrado pela Comissão de 
Pesquisa do Hospital de Pediatria Professor Heriberto Ferreira Bezerra – UFRN, 
CP-HPHFB-PROJETO Nº 66/2009, para execução dentro da estrutura deste 
Hospital de Pediatria. 
Este Projeto foi aprovado pela Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado 
de São Paulo - FAPESP (2008/05064-9) sob coordenação do Prof. Tit. Mario 
Hiroyuki Hirata colaborador do Projeto, através da colaboração entre Universidade 
Federal do Rio Grande do Norte - UFRN e a Universidade de São Paulo – USP. 
É um estudo transversal do tipo Caso-controle pareado visando avaliar a 
expressão dos genes da via de metabolismo do ácido fólico - MTHFR, MTR, 
RFC1, MTRR, e a associação da expressão dos mesmos com a ocorrência das 
fendas orais. 
 
3.2 CASUÍTICA E COLETA 
Para a realização deste projeto foram estudados 200 indivíduos, divididos 
em dois grupos, casos e controles. O grupo controle foi composto de 50 crianças 
sadias e pareados por faixa etária e suas respectivas mães (n=50). O grupo caso 
foi composto por 50 crianças com fenda orais com diagnóstico baseado em 
critérios clínicos e suas respectivas mães (n=50). Os casos foram atendidos e 
triados pelo Programa de Atendimento aos Fissurados do Hospital de Pediatria 
(HOSPED) - UFRN. A cada mãe caso e mãe controle foi explicado o objetivo 
desse estudo e solicitado que na concordância em participar assinassem o Termo 
de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice A). Os dados das mães e seus 
filhos foram obtidos e registrados através de um questionário (Apêndice C). Em 
seguida Foi realizada uma coleta a vácuo em que foi colhido um total de 14 mL de 
30 
 
 
 
sangue, divididos em um tubo sem anticoagulante de 10 ml para as dosagens 
bioquímicas no soro e plasma e um tubo de 4 ml com EDTA para extração do 
RNA total. A coleta foi realizada após jejum mínimo de 4 horas, de todos os casos 
e controles para realização das dosagens bioquimicas, hematologica e extração 
do RNA total. A análise dos polimorfismos foi realizada com base no banco de 
dados de genotipagem do estudo previamente realizado por nosso grupo 
desenvolvido por Bezerra, J.F. (2010). 
 
Critérios de Inclusão: 
- Individuos com fendas orais não-sindrômicas 
- Individuos com idade a partir de 2 anos. 
- Dosagens de AST e ALT dentro dos valores de referência (10 – 37U/L) 
- Dosagem de Creatinina dentro dos valores de referência (0,4 – 1,4mg/dL) 
 
 
Critérios de Não-inclusão: 
 - Criança com fenda oral sindrômica 
 - Criança com idade inferior a 2 anos 
 - Dosagens de AST, ALT e Creatinina fora dos valores de referência 
 - Parentesco com crianças já incluídas no estudo 
- Indivíduos acometidos de outros tipos de doença 
 
3.3 DETERMINAÇÕES DOS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS E 
HEMATOLÓGICOS 
 
As concentrações séricas de glicose e creatinina foram determinadas 
utilizando o kit Biosystems® (Reagents & Instruments, Barcelona, Espanha) 
seguindo as orientações do fabricante. A atividade sérica das enzimas Aspartato 
aminotransferase (AST), Alanina aminotransferase (ALT) foi determinada 
utilizando os Kits Labtest (Minas Gerais, Brasil) seguindo as instruções do 
fabricante. Todas as medidas foram realizadas em triplicata, através do 
espectrofotômetro RA-50 (Bayer, Irlanda, 1998). 
A determinação de Homocisteína foi realizada utilizando 15µL de plasma 
por imunoensaio competitivo quimioluminescente. A determinação da Vitamina 
31 
 
 
 
B12 e do ácido fólico foi realizada utilizando 250µL de soro por imunoensaio 
quimioluminescente polarizado. Estas dosagens foram realizadas utilizando kits 
Siemens (Los Angeles, CA, USA) no equipamento IMMULITE 1000 (Los Angeles, 
EUA). 
O hemograma foi realizado a partir de sangue total, onde foram avaliados a 
contagem de hemácias, determinação de hemoglobina, hematócrito, índice 
hematimétricos (V.C.M., H.C.M., C.H.C.M.), contagem de plaquetas e contagem 
global de leucócitos. Essas determinações foram realizadas em aparelho 
automatizado ABX micros 60 (ABX Diagnostics, França, 2004). 
 
3.4 ESTUDO DE EXPRESSAO GÊNICA 
 
3.4.1 Extração do RNA Total 
 
O RNA total foi obtido a partir de células do sangue periférico (LTSP), 
colhido com EDTA utilizando o kit de extração QiaAmp RNA Blood Mini Kit® 
(Qiagen, Hilden, Alemanha) imediatamente após a colheita do sangue. O RNA 
obtido foi armazenado no freezer - 80C até a sua análise. O RNA total extraído 
foi quantificado e teve seu grau de pureza avaliado através de espectrofotometria 
no ultravioleta utilizando espectrofotômetro ND-1000 (NANODROP,technologies 
Inc, Wilmington, DE, EUA), através das deteminações das absorbancias A260nm e 
A260/A280nm respectivamente (SAMBROOK et al, 2001). 
 
3.4.2 Análise da Integridade do RNA total 
 
A integridade do RNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a 
2,0% em tampão MOPS [MOPS a 20 mmoles/L (pH 7,0), acetato de sódio a 8 
mmoles/L e EDTA 1mmol/L pH8,0], em seguida corado e revelado sob a luz 
ultravioleta e fotodocumentados em sistema de captura de imagens Gel Logic 100 
Imaging System (Carestream Health Inc. Rochester, NY, EUA) utilizando o 
software Molecular Imaging Kodak 4.5. Na imagem (Figura 3), observam-se as 
bandas dos RNAs ribossomais 28S e 18S. A presença dessas bandas com boa 
nitidez evidencia uma amostra com RNAribossomal não degradado. 
 
32 
 
 
 
 
FIGURA 3: Gel de Integridade de RNAs ribossomais desnaturante de agarose a 2% corado com 
GelRed e fotodocumentado com transiluminador de ultravioleta – UV. No gel foram aplicadas as 
amostras dos individuos participantes desse estudo,A- casos e B- controles. 
 
Durante o processamento das análises que antepõem-se ao ensaio de 
expressão gênica as amostras de RNA de 10 duplas mãe/filho do grupo caso e 10 
duplas mãe/filho controles precisaram ser excluídos desse estudo devido baixa 
qualidade do RNA total demonstrado pela análise de integridade em gel de MOPS 
a 1% que revelou que esses amostras apresentavam-se degradadas (Figura 4). 
Desse modo, foram avaliados o RNAm de 160 indivíduos ao total. Foram 
realizadas as análises de expressão gênica de RNAm de 80 indivíduos para o 
grupo caso, onde são 40 mães de filhos com fenda oral e seus respectivos filhos 
(40) e 80 indivíduos para o grupo controle, sendo 40 mães de indivíduos 
saudáveis sem doenças sindrômicas e seus filhos (40). 
 
FIGURA 4: Gel de Integridade de RNAs ribossomais desnaturante de agarose a 1% corado com 
GelRed e fotodocumentado com transiluminador de ultravioleta – UV. No gel foram aplicadas as 
amostras dos individuos participantes desse estudo, na foto do gel observam-se amostras de 
indivíduos caso (A) e controles (B) apresentando RNA total com perfil de degradação. 
 
 
 
 
3.4.3 Síntese do cDNA 
 
A síntese do cDNA foi realizada a partir de 300ng do RNA total utilizando o 
kit High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit da Applied Biosystems (Foster 
City, CA, EUA), de acordo com a metologia descrita pelo fabricante em 
A B 
A B 
33 
 
 
 
termociclador MyCiclerTM Thermal Cycler (BIORAD, Philadelphia, PA, USA). O 
cDNA obtido em volume final de 60µL foi armazenado a –20°C sendo utilizado 
nos ensaios de expressão por RT-qPCR. 
 
3.4.4 Escolha do gene de referência 
 
A escolha do gene de referência a ser utilizado no estudo de expressão 
gênica do presente projeto foi realizada através da avaliação dos genes GAPDH, 
18S, Ubiquitina C, β-Actina. 
As amostras de cDNA dos casos e seus respectivos controles, e ainda as 
amostras de cDNA das mães caso e mães controles foram estudados para os 4 
genes de referência e os resultados obtidos através de RT-qPCR no aparelho ABI 
7500 fast (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA) estão mostrados nas Figuras 
5 e 6, respectivamente. 
 
 
FIGURA 5: Curvas de amplificação dos genes de referência utilizando amostras de cDNA dos 
filhos fissurados e seus respectivos controles. Verde (18S); Roxo (β-Actina); Vermelho (GAPDH); 
Azul (Ubiquitina C). qPCR realizada no aparelho ABI 7500 fast (Applied Biosystem, Foster City, 
CA, EUA). 
 
 
34 
 
 
 
 
FIGURA 6: Curvas de amplificação dos genes de referência utilizando amostras de cDNA das 
mães dos caso e mães controles. Verde (18S); Roxo (β-Actina); Vermelho (GAPDH); Azul 
(Ubiquitina C).RT-qPCR realizada no aparelho ABI 7500 fast (Applied Biosystem, Foster City, CA, 
EUA). 
 
3.4.4.1 Análise dos dados de amplificação e definição do gene de 
referência 
 
Os resultados obtidos a partir da RT-qPCR foram aplicados nos softwares 
GeNorm e Normfinder. Os dados dos ciclos de threshold (Ct) de cada amostra 
foram aplicados na equação 2-ct assumindo a eficiência como sendo 100%, uma 
vez que a eficiência dos ensaios tiveram índices entre 96% a 98% (Tabela 3). 
Tanto o geNorm (Figura 7) quanto o NormFinder (Tabelas 1 e 2) elegeram o gene 
da β-Actina como gene de referência uma vez que esse gene apresentou o menor 
nível de variação entre os Ct’s. Em vermelho está o gene da Ubiquitina C (UBC) 
que apresentou a maior variação. 
 
35 
 
 
 
 
FIGURA 7: Imagem da análise do gene de referência através do software geNorm na placa 
referente aos filhos caso e filhos controles destacando o gene da β-Actina (verde, menor variação) 
e o gene da UBC (vermelho, maior variação). 
 
A Tabela 1 contém os dados gerados pelo software Normfinder (MDL, 
Aarhus, Denmark) indicando o gene da β-Actina como o gene escolhido para a 
realização desse estudo no grupo dos filhos (casos e controles) por possuir menor 
valor de variação e consequente maior estabilidade, quanto maior esse valor maís 
instável é o gene. Podemos observar também que pelo valor numérico da 
estabilidade, o gene da UBC é o menos indicado devida a alta variação entre os 
valores de CT’s. 
 
Tabela 1. Análise dos valores de CT dos filhos realizada pelo Normfinder(MDL, 
Aarhus, Denmark) indicando a β-Actina como gene de referência. 
 
Gene Valor da estabilidade 
GAPDH 1,417 
GAPDH 1,229 
18S 3,169 
18S 3,171 
UBC 2,326 
UBC 2,392 
B-Actina 0,183 
B-Actina 0,183 
Gene de Escolha B-Actina 
 
36 
 
 
 
A Tabela 2 apresenta os dados gerados pelo software Normfinder (MDL, 
Aarhus, Denmark) indicando o gene da β-Actina como o melhor gene para a 
realização desse estudo no grupo das mães (casos e controles) por possuir 
menor valor de variação e consequente marior estabilidade. Podemos observar 
também que pelo valor numérico da estabilidade o gene da UBC é o menos 
indicado devida a alta variação entre os valores de CT’s. 
 
Tabela 2. Análise dos valores de CT das mães realizada pelo Normfinder(MDL, 
Aarhus, Denmark) indicando a β-Actina como gene de referência ideal. 
 
Gene Valor de estabilidade 
GAPDH 0,604 
GAPDH 0,653 
18S 0,882 
18S 0,917 
UBC 1,363 
UBC 1,362 
B-Actina 0,370 
B-Actina 0,374 
Gene de Escolha B-Actina 
 
 
3.5 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA PELA qPCR 
 
Os cDNAs dos genes da MTHFR (número genbank de acesso 
NM_005957), MTR (número genbank de acesso NM_000254), RFC-1 (número 
genbank de acesso NM_14255), MTRR (número genbank de acesso 
NM_002454.2 ), foram amplificados pela qPCR, no aparelho ABI 7500 fast 
(Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA). Para a amplificação pela qPCR dos 
genes em estudo e do gene de referência foram utilizados ensaios pré-
desenhados e pré-formulados de expressão gênica TaqMan padronizados pela 
Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA). A Tabela 3 apresenta os ensaios 
padronizados utilizados para análise da expressão dos genes MTHFR, MTR, 
MTRR, e RFC1. 
A quantidade de 300ng de cDNA utilizada nos ensaios foi otimizada a partir 
de uma curva padrão sendo realizada com diferentes concentrações de amostra 
cDNA. A curva padrão permite avaliar a linearidade da amplificação bem como a 
37 
 
 
 
eficiência da mesma. Segundo Livak e Schmittgen (2001) para uma reação de 
PCR em tempo real ter eficiência de 100% a inclinação (slope) da curva padrão 
deve ser próximo de -3,3 a eficiência de cada ensaio foi considerada adequada 
para valores acima de 90%. As reações foram realizadas em triplicatas sendo 
aplicado 2µL de cDNA equivalentes a 10ng de RNAm por poço da placa de RT-
qPCR. 
Para calcular a expressão absoluta obtida por ensaio, os valores de Ct’s 
foram aplicados na fórmula 2-ΔCt, os resultados dessa equação serviram como 
dados para aplicação do teste-t. Para normalização dos dados em relação ao 
gene de referência, os valores de Delta Ct de cada amostra foram comparados 
com a média do Delta Ct basal (calibrador), sendo essa relação denominada 
Delta-Delta Ct (ΔΔCt). Os dados de ΔΔCt foram linearizados pela fórmula 2-ΔΔCt 
(LIVAK; SCHIMITTGEN, 2001) para comparar os dados de expressão relativa 
entre os grupos. Foi aplicado o teste estatístico nos valores obtidos após essa 
transformação. 
 
Tabela 3. Ensaios de expressão gênica TaqMan padronizados pela Applied 
Biosystems (Foster city, CA, EUA) e resultados da eficiência dos ensaios com 
nossas amostras. 
Assay Gene Inclinação (Slope) Eficiência (%) R2 
Hs01114484_m1 MTHFR -3,20 96 0,964 
Hs00165188_m1 MTR -3,38 98 0,986 
Hs00985018_m1 MTRR -3,40 98 0,979 
Hs01099140_m1 RFC1 -3,29 97 0,969 
 
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA 
 
Foi elaborado um banco de dados para devidas correlações e tabulação 
das variáveis, utilizando o programa Microsoft Excel para Windows versão 7.0. Foi 
aplicado o teste de Kolmogorov-Smirnov, a fim de avaliar a distribuição dos 
dados. Para variáveis com distribuições normais, foi utilizado o teste-t não 
pareado. Para avaliar a correlaçãoentre a expressão dos genes e análises 
bioquímicas foi utilizado a correlação de Pearson, sendo também realizadas as 
análises de regressão linear univariada e regressão logística univariada. Para 
38 
 
 
 
todas estas análises foi utilizado o programa SPSS 15.01® (Lead Technologies, 
NC, USA e estabelecido o nível de significância de p<0,05. 
 
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA 
 
 A casuística foi constituída de 50 indivíduos com fendas orais e suas mães, 
além de 50 indivíduos controles e suas respectivas mães. A Figura 8 mostra que 
a maioria dos filhos caso apresenta a fenda do tipo labiopalatina (56%), seguida 
da fenda palatina isolada (24%) e da fenda labial (20%). Em relação ao gênero, 
62% dos filhos caso são do gênero masculino e 38% do gênero feminino, como 
mostrado na Figura 9. Quando subdividimos o tipo de fenda de acordo com o 
gênero constatou-se uma prevalência do gênero masculino nas fendas do tipo 
labiopalatina (69%) e labial (69,2%) e no caso das fendas palatinas isoladas 
houve uma predominância do gênero feminino (59%) (Figura 10). 
 
 
FIGURA 8. Distribuição dos filhos casos analisados de acordo com o tipo de fenda 
39 
 
 
 
 
FIGURA 9. Distribuição dos filhos casos analisados de acordo com o gênero. 
 
 
FIGURA 10. Distribuição dos filhos caso analisados de acordo com o tipo de fenda 
subdivididos em função do gênero. 
 
Esses resultados estão de acordo com Freitas-Silva e colaboradores, 
(2008) que encontraram resultados semelhantes em um estudo realizado no 
Estado de São Paulo com pacientes atendidos no Centro de Reabilitação das 
Deformidades Faciais de SP onde 62% desses apresentaram fenda lábiopalatina, 
seguida da fenda palatina isolada (20%) e por último a fenda labial (9%). Estudo 
realizado por Takano e colaboradores (2008) com pacientes do Centro de 
Atenção aos Defeitos da Face (CADEFI) do Instituto Materno Infantil Professor 
Fernando Figueira (IMIP) de Recife – PE, também foi observada uma maior 
prevalência das fendas labiopalatinas (48,6%) seguida da fenda palatina isolada 
(24,6%). Concordam ainda com Jamillian e colaboradores (2007) que observaram 
40 
 
 
 
em estudo realizado no Irã uma maior prevalência da fenda do tipo labiopalatina e 
uma menor frequência da fenda labial. 
Em relação à subdivisão das fendas em função do gênero, resultado 
semelhante foi observado por Coutinho e colaboradores, (2009) estudando 
indivíduos com fenda oral em Recife-PE que observou uma prevalência do gênero 
masculino na fenda labiopalatina (52,3%) e para a fenda palatina isolada o gênero 
feminino foi mais afetado (35,8%). Esses resultados corroboram Carinci e 
colaboradores., (2005) que estudando a população Italiana também observaram 
uma prevalência semelhante quanto ao tipo de fenda. A susceptibilidade sexo-
dependente das fendas orais não é bem compreendida. De acordo com Blanco et 
al., a susceptibilidade do sexo masculino à fenda labiopalatina parece ser, no 
mínimo em parte, uma consequência da variação do gene MSX1, localizado no 
cromossomo 4. A hipótese de que os genes relacionados ao cromossomo X 
tenham papel importante na etiologia das fendas orais também surgiu, porém não 
foi confirmada. 
É importante observar que a fenda labiopalatina também está presente em 
inúmeras síndromes que apresentam fendas bucofaciais, tendo etiologia variada. 
Em muitas dessas síndromes a causa são genes isolados (herança monogênica) 
citando-se como exemplos as síndromes de van der Woude e a de Roberts, 
autossômica recessiva, cujas características incluem fenda labial associada ou 
não a fenda palatina e focomelia. Aparece ainda em síndromes esporádicas de 
herança desconhecida. Entre as anomalias cromossômicas está presente na 
síndrome de Patau (trissomia do cromossomo 13). Em sua maioria de casos, são 
de herança multifatorial, podendo ser causadas também por agentes 
teratogênicos como a talidomida, a hidantoína e a rubéola (OSÓRIO; ROBINSON, 
2006). 
A maior prevalência do gênero feminino na fenda do tipo palatina isolada 
pode estar relacionada ao maior tempo necessário para o fechamento de palato 
em fetos de gênero feminino, levando em torno de uma semana a mais para estar 
completamente fechado (MOORE; STANIER, 2004; MENG et al., 2009). Desse 
modo, esse fato intrínseco a morfogênese do palato feminino somado a presença 
de fatores de risco e também à influência fatores genéticos podem aumentar a 
incidência da fenda palatina isolada em fetos do gênero feminino. 
 
41 
 
 
 
4.2 AVALIAÇÃO DOS FATORES DE RISCO ASSOCIADOS AO 
DESENVOLVIMENTO DAS FENDAS ORAIS 
 
Foram avaliados fatores de risco que são frequentemente relatados na 
literatura como envolvidos no aumento do risco de desenvolvimento de fendas 
lábio-palatinas, entre eles etilismo e tabagismo durante o período gestacional , 
como também o historico familiar e idade materna (TABELAS 4 e 5). 
Em relação ao fator consumo de bebidas alcoólicas relatado durante o 
primeiro trismestre gestacional, foi observado um percentual de 15% de mães que 
relataram consumo de bebidas alcóolicas durante a gravidez, enquanto que as 
mães dos individuos controles foi de 4%, onde essa diferença foi significante 
(p=0,001). Estes resultados são semelhantes aos relatados na literatura 
reforçando, portanto, que o uso de álcool pelas mães durante a gestação 
representou um fator de risco na ocorrência de fendas orais nos filhos. É sabido 
que o álcool é uma substância teratógena em humanos que produz uma ampla 
gama de efeitos dependendo do tempo de exposição e da quantidade ingerida 
(DE-ROO e colaboradores, 2008). Em uma revisão realizada em 2002 foi 
observado que o álcool pode aumentar o risco de ocorrência de fendas orais em 
crianças em até 4 vezes, propondo um efeito teratogênico do mesmo sobre as 
células da crista neural, células estas que darão origem ao sistema nervoso e 
todas as estruturas formadoras da face (LEITE e colaboradores., 2002). De-Roo e 
colaboradores, (2008) também observaram um percentual semelhante cujo índice 
foi de 18% de mães que utilizaram bebidas alcoólicas durante a gestação e 
tiveram filhos afetados pelas fendas. 
Podemos observar na Tabela 4 que 13% das mães caso relataram 
tabagismo durante o 1º trimestre da gravidez, semelhante ao que foi observado 
nas mães dos indivíduos sadios onde 13 % delas relataram prática de tabagismo 
durante o 1º trimestre da gravidez (p=0,869). 
 
TABELA 4. Fatores de risco associados ao desenvolvimento de fendas em 
mães e controles 
Características Mães Casos 
N (%) 
Mães Controles 
N (%) 
P valor 
Consumo de álcool 8 (15%) 2 (4%) 0,001 
Tabagismo 6 (13%) 6 (13%) 0,869 
42 
 
 
 
Histórico familiar* 17 (36%) - - 
*Foram excluídos do grupo controle indivíduos que possuíssem histórico familiar de fendas. 
 
No presente trabalho foi observado um percentual de 15% de mulheres que 
mantiveram o hábito de fumar durante a gravidez, corroborando Lie e 
colaboradores (2008) que verificou um percentual de 16% de mães fumantes em 
estudo realizado na Noruega. O hábito de fumar durante a gravidez é também 
indicado como um fator de risco para o desenvolvimento de fendas orais. Uma 
recente meta-análise de 24 estudos estimou que mães que fumam durante a 
gravidez têm um risco 1,3 vezes maior de ter um filho portador de fenda (SHI et 
al., 2007; LIE et al., 2008) Segundo Shi e colaboradores (2007) estudando uma 
população de mulheres na Dinamarca o hábito de fumar durante a gravidez 
aumentou o risco de desenvolvimento de fendas orais nas crianças. Os 
mecanismos biológicos que dão suporte a essa associação são desconhecidos, 
mas podem estar relacionados com a grande quantidade de tóxicos contidos no 
fumo (LIE et al., 2008). A nicotina, principal componente tóxico do cigarro, é um 
vasoconstritor que no período gestacional diminui o fluxo sanguíneo na artéria 
uteroplacentária, podendo debilitar operfeito desenvolvimento do embrião/feto, 
ainda podendo haver a contribuição do monóxido de carbono na diminuição da 
oferta de oxigênio aos tecidos embrionários e fetais, visto que o mesmo se liga a 
hemoglobina diminuindo sua funcionalidade (BARONEZA et al., 2005). 
Em relação à presença de histórico familiar de fendas observou-se que 
36% mães caso relataram que possuiam parentes com fendas (Tabela 4). DE-
ROO e colaboradores. (2008) também observaram um percentual de 28% de 
indivíduos com fendas orais que possuíam histórico familiar. Baroneza e 
colaboradores (2005) estudando pacientes atendidos no Centro de apoio e 
reabilitação indivíduos com fissura labiopalatina de Londrina e região (CEFIL) 
observou que 26% dos indivíduos com fissuras labiopalatinas possuíam histórico 
familiar de fendas, indicando a existência da contribuição da genética na etiologia 
das fendas orais. 
Em relação a idade materna não foram observadas diferenças significantes 
entre faixas etárias analisadas, sendo a faixa etária de 31 a 40 anos relatada pela 
literatura como um fator de risco no desenvolvimento das fendas (Tabela 5). 
 
 
43 
 
 
 
TABELA 5. Idade das mães ao nascimento dos filhos analisados 
Idade ao Nascimento Mães Casos 
% (N) 
Mães Controles 
% (N) 
P valor 
10 – 20 anos 22 (11) 20 (10) 
0,262 
21 – 30 anos 49 (24) 54 (26) 
31 – 40 anos 28 (13) 22 (12) 
Acima de 40 anos 1 (2) 4 (2) 
 
Estes resultados representam dados de relevância acerca das 
características clínicas dos indivíduos com fendas orais no Estado do Rio Grande 
do Norte, revelando assim uma maior ocorrência para a fenda labiopalatina com 
prevalência no gênero masculino e o consumo de álcool durante o primeiro 
trimestre de gravidez como um fator de risco significante no grupo dos filhos caso. 
Em relação as dosagens bioquímicas não foram observadas diferenças 
significativas entre os filhos casos e respectivos controles os quais apresentaram 
todos os valores dentro dos limites de referência (Tabela 6). Estes resultados são 
importantes uma vez que a diferença nas determinações de AST, ALT e 
creatinina entre casos e controles poderia levar a uma interpretação incorreta das 
concentrações de vitamina B12 e homocisteína. 
Na Tabela 6, observa-se ainda os resultados obtidos para as dosagens de 
ácido fólico, vitamina B12 e homocisteína para os grupos estudados. A média da 
concentração sérica de ácido fólico no grupo das mães caso é significativamente 
(P=0,001) inferior (14,4±2,24ng/mL) à obtida para o grupo das mães dos 
individuos controles (17,5±2,85ng/mL). O mesmo foi observado para o grupo dos 
filhos caso em relação aos filhos controles, onde a média da concetração sérica 
de ácido fólico estava significantemente reduzida (P=0,010) para os casos 
(15,4±0,6 ng/mL) quando comparados aos controles (19,5±3,1 ng/mL). Já para as 
dosagens de vitamina B12 e homocisteina não foi observado diferença 
estatisticamente significativa. 
O ácido fólico provê carbonos essenciais para a síntese de ácido nucléico e 
para as reações de metilação, sendo estas necessárias para a divisão celular, 
expressão gênica e manutenção da estrutura do cromossomo durante o 
desenvolvimento fetal. A deficiência do ácido fólico pode prejudicar o metabolismo 
materno e neonato, podendo estar associado com resultados anormais e aumento 
no risco de defeitos congênitos. Desse modo, a correta suplementação pré-natal 
44 
 
 
 
com ácido fólico em grávidas pode reduzir a ocorrência de fendas orais (SOZEN e 
colaboradores., 2009). 
Um fator limitante desse estudo se relaciona ao tempo da coleta para 
dosagem de ácido fólico. A coleta foi realizada em um período pós-concepcional 
no qual não há a orientação ao uso diário de ácido fólico como ocorre durante 
toda a gestação. A análise dessa dosagem nesse período mostrou que o grupo 
de mães caso possui concentração de ácido fólico significantemente reduzida em 
relação a concentração observada no grupo controle. Essa redução pode estar 
associada a fatores genético-nutricionais que precisam ser avaliados mais 
profundo e especificamente. A hipótese de que essa mesma situação possa ter 
ocorrido no primeiro trimestre de gestação deve ser considerada e reconhecida 
como um importante fator de susceptibilidade ao surgimento de alterações 
congênitas. Além disso, deve ser considerado que esta população de mães 
esteve envolvida com fatores etiológicos de destaque como o uso de álcool, 
hábito de fumar, além de apresentar um histórico familiar de fendas. 
45 
 
TABELA 6 – Dosagens bioquímicas e hematotólicas dos grupos estudados 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AST (aspartato aminotransferase); ALT (alanina aminotransferase); Hcy (homocisteína);VCM (volume 
corpuscular médio); HCM (hemoglobina corpuscular média); CHCM (Concentração de Hemoglobina Corpuscular 
Média). 
Variáveis contínuas são mostradas como média ± desvio padrão and comparadas por teste T. 
Valores de Referência: Ácido Fólico: 7-24 ng/mL, Vitamina B12: 210-720pg/mL, Homocisteína: 3.4-17 µMol/L 
*Dados significantes com valor de P< 0,05 
. 
 Mães Caso Mães Controles P Valor Filhos Caso Filhos Controles P Valor 
Glicose (mg/dL) 85 ± 8,4 74,5 ± 7,9 0,089 83,5 ± 8,5 74,3 ± 6,0 0,097 
AST (U/L) 23 ± 8,3 18 ± 7,5 0,773 30,8 ± 8,0 20,6 ± 7,15 0,059 
ALT (U/L) 21 ± 10 17,7 ± 9,2 0,773 19 ± 7,5 15,4 ± 6,4 0,140 
Creatinina (mg/dL) 0,8± 0,1 0,79 ± 0,1 0,476 0,6 ± 0,15 0,74 ± 0,09 0,558 
Folato (ng/mL) 14.4 ± 2.24 17.54 ± 2.85 >0,001* 15.48 ± 0.6 19.5 ± 3.1 >0,001* 
B12 (pg/mL) 379 ± 179 425 ± 193 0,440 516 ± 234 666 ± 314 0,130 
Hcy (µMol/L) 6.1 ± 2.3 6.7 ± 2.9 0,410 5.1 ± 0.67 5.7 ± 0.37 0,530 
Hemácias (milhões) 4,58±0,38 4,59± 0,37 0,845 4,9 ± 0,4 4,9 ± 0,9 0,768 
Hemoglobina (g/dL) 12,7 ± 1,1 12,7 ± 2,9 0,981 12,2 ± 1,7 12,9 ± 1,06 0,424 
Hematócrito (%) 39,4 ± 2,9 39,4 ± 3,0 0,975 37,7 ± 4,3 39,7 ± 3,3 0,180 
V.C.M (fL) 85,8 ± 6,2 85,7 ± 7,1 0,9304 78,1 ± 7,6 81 ± 6,2 0,065 
H.C.M. (pg) 27,9 ± 2,5 27,9 ± 2,7 0,895 25,3 ± 3,1 26,4 ± 2,3 0,076 
C.H.C.M. (g/dL) 32,4 ± 1,8 32,5 ± 0,9 0,814 32,3 ± 1,6 32,5 ± 0,8 0,434 
46 
 
Em relação a análise hematólogica não foram observadas alterações em 
nenhum dos parâmetros avaliados como hemoglobina, hematócrito, contagem de 
hemácias, os índices hematológicos, VCM, HCM e CHCM dentre os grupos avaliados 
(Tabela 6). 
 
4.3 FATORES DE RISCO GENÔMICOS 
 
4.3.1 Estudo da Expressão de RNAm dos Genes do Metabolismo do Ácido 
Fólico – MTHFR, MTR, MTRR, RFC1 
 
A avaliação da expressão gênica para o grupo das mães mostrou uma redução 
significativa na expressão do RNAm para os 4 genes avaliados; gene da metionina 
sintase (MTR, p=0,008) da metionina sintase redutase (MTRR, p=0,015); do carreador 
de folato reduzido (RFC-1, p=0,004); da metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR 
p=0,017). 
A figura 11 mostra a variação da expressão do RNAm desses genes entre 
grupos estudados em relação ao gene de referência β-Actina. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FIGURA 11: Variação da expressão de RNAm dos genes RFC1, MTR, MTHFR e MTRR em relação ao 
gene de referência β-Actina nos grupos: mães dos pacientes fissurados (caso) e mães de indivíduos 
saudáveis e sem malformações congênitas (controles). Os resultados são mostrados como média ± 
desvio padrão, comparados pelo método de Kolmogorov Smirnov, bem como Teste t, sendo 
considerado p<0,05. 
P=0,008 * 
P=0,004* 
P=0,017* 
33 P=0,015* 
MÃES CASO 
MÃES CONTROLES 
GENES DO METABOLISMO DO ÁCIDO FÓLICO 
RFC1 MTR MTHFR MTRR 
EX
P
R
ES
SÃ
O
 R
EL
A
TI
V
A
 
47 
 
A figura 12 mostra a variação da expressão do RNAm desses genes entre o 
grupos de filhos em relação ao gene de referência β-Actina. Os resultados mostram 
uma redução significativa na expressão do RNAm para os genes da metionina sintase 
(MTR, p=0,01) e da metionina sintase redutase (MTRR, p=0,03).