RuthMO-DISSERT-PARCIAL

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS 
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RUTH MEDEIROS DE OLIVEIRA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE, 
ANTICOAGULANTE E ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS 
AQUOSOS DE Marsdenia megalantha 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL 
2011 
 
RUTH MEDEIROS DE OLIVEIRA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE, 
ANTICOAGULANTE E ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS 
AQUOSOS DE Marsdenia megalantha 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL 
2011 
Dissertação apresentada ao Departamento de 
Bioquímica da Universidade Federal do Rio 
Grande do Norte como requisito parcial para 
obtenção do título de Mestre em Bioquímica. 
 
Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RUTH MEDEIROS DE OLIVEIRA 
 
 
 
 
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE, ANTICOAGULAN TE E 
ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS AQUOSOS DE Marsdenia megalantha 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica da 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para 
obtenção do título de Mestre em Bioquímica. 
 
 
 
 
Aprovado em: 21/03/2011 
 
 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
 
 
 
___________________________________________________ 
Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha 
Departamento de Bioquímica - UFRN 
Orientador 
 
 
 
____________________________________________________ 
 Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade 
Departamento de Biologia Celular- UFPR 
 1º Examinador 
 
 
 
____________________________________________________ 
Profª. Drª. Kátia Castanho Scortecci 
Departamento de Biologia Celular e Genética – UFRN 
2º Examinador 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
À minha família, pelo amor, carinho e incentivo sempre dispensados, 
sem os quais esta jornada não seria possível; Ao meu namorado 
Rafael Barros pela paciência e amor; Ao meu orientador Hugo Rocha 
por toda atenção e ensinamentos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
"A vida é em parte o que nós fazemos dela, e em parte o que é feito pelos 
amigos que nós escolhemos". 
Tennessee Williams 
 
 
A Deus por ter permanecido ao meu lado e me guiado por caminhos de luz e por 
ter colocado na minha vida pessoas sempre tão especiais. 
 
Aos meus pais, Clóvis Almeida e Maria Barros, pelo apoio, incentivo, 
preocupação, amor e carinho, por terem me ensinado o significado da palavra 
família e também por terem me ensinado as coisas boas e ruins da vida. E, 
principalmente, por estarem sempre vigilantes para que eu não seguisse por 
caminhos tortuosos. Vocês são pais e pessoas maravilhosas. Amo muito vocês. 
 
Aos meus irmãos, Thiago Medeiros e Raquel Medeiros, por toda atenção que 
vocês têm por mim, companheirismo, pelo amor e por terem ajudado na minha 
educação. Apesar de nossas brigas, sei que nos amamos muito. 
 
 
Ao meu namorado Rafael Barros pelo companheirismo, cumplicidade, 
compreensão, ajuda, paciência e amor despendidos comigo no último ano e, 
principalmente, nos últimos meses. Não canso de te dizer a sorte que tenho por ter 
te conhecido e por você me aceitar como sou. Sem dúvida, minha melhor 
companhia. Te amo muito. 
 
A minha prima e afilhada Ingrid Medeiros por sempre compartilhar de 
momentos tão importantes na minha vida, por sempre estar presente e ser essa 
pessoa tão prestativa. Pelos passeios com Uni na praça e as confidências 
contadas. Se aquela praça falasse...Também te amo muito Pitxuca. 
 
 
Ao meu cachorro Uni que, por durante 11 anos, me espera chegar em casa sentado 
na frente do portão com um sorriso estampado no rosto. Este, literalmente, está 
sempre ao meu lado, em dias alegres ou tristes. Não canso de dizer o quanto te 
amo e adoro seu cheirinho peculiar. 
Ao meu cunhado Eduardo Melo pelos momentos alegres que você proporciona a 
toda minha família. 
 
A minha sobrinha e afilhada Beatriz Medeiros que, apesar de não entender nada 
na vida, já sabe conquistar a todos com seu lindo sorriso banguelo. Apesar das 
noites em claro que você me proporcionou e proporciona, principalmente quando 
eu precisava escrever esta dissertação, saiba que te amo muito. Chegar em casa 
após um cansativo dia e te ver dormindo é ótimo, mas melhor ainda é chegar em 
casa e ganhar um sorriso seu e escutar sua voz. 
 
Ao meu orientador Hugo Rocha por ter me aceitado em seu laboratório, mesmo 
sem me conhecer muito bem; por ser um exemplo de orientador e por ser sempre 
tão compreensivo. Enfim, obrigada por ter me orientado, pela liberdade, paciência 
e pela amizade. 
 
Aos meus companheiros do BIOPOL: Arthur, Cinthia, Daniel, Dayanne, 
Fernando, Gabriel, Hugo, Ivan, Jailma, Joanna, Kaline, Karol, Leandro, 
Leonardo, Letícia, Mariana, Moacir, Nednaldo, Pablo, Rafael, Raniere, Roni, 
Sara e Vinícius, por tornarem agradáveis meus dias no laboratório. Gostaria de 
agradecer a todos por terem me recebido tão bem, mas em especial agradeço a: 
Leandro (por todos os ensinamentos matemáticos, desculpe-me ter roubado seu 
juízo, por seus conselhos sempre cabíveis e por ser, não oficialmente, meu co-
orientador. Nunca conseguirei retribuir sua ajuda). Mariana (minha M.A. que 
está sempre disposta a ajudar, sempre com alguma sugestão. Muito obrigada 
por ter me permitido fazer parte de seu ciclo de amigos e por ser minha confidente. 
E nós não somos fofoqueiras). Jailma (o coração mais puro do laboratório, uma 
pessoa muito fácil de conviver e de se gostar. Muito obrigada por sua paciência, 
atenção e por ser uma boa ouvinte). Leonardo (amigo da turma do mestrado, 
amigo do laboratório, amigo para toda a vida. Muito obrigada pelos momentos de 
alegria que você me proporciona, pelas conversas úteis e fúteis). Nednaldo 
(muito conhecido por Chatonaldo, Vladinaldo ou Nedélope...nunca vi o nome de 
uma pessoa combinar com tudo. Ned, você é um grande companheiro e amigo, 
adoro estar com você. Sem dúvida alguma, o laboratório não fica completo sem 
sua presença). Rafael (sou muito suspeita para falar, mas muito obrigada pelos 
conselhos, pela atenção, por estar sempre disposto a ajudar e a ouvir. Com 
certeza você torna meus dias no BIOPOL muito mais agradáveis e completos). 
Cinthia (apesar dos nossos desentendimentos iniciais, hoje sei que posso contar 
com você. Obrigada por nossas agradáveis conversas e por ser minha amiga de 
bar). Raniere (pelas boas conversas, pelos conselhos e muito obrigada por 
sempre tirar minhas dúvidas). Kaline (pelos maravilhosos momentos que 
passamos juntas. Nem sei em que momento nos tornamos tão amigas. Te adoro 
irmã péssima). Dayanne (por trazer tanta alegria ao laboratório com sua risada 
contagiante). Sara (por sempre bater em quem merece apanhar e por irradiar 
alegria). Enfim, muito obrigada a todos por tornarem meus dias agradáveis e por 
despertarem em mim a vontade diária de ir ao laboratório. OBRIGADA! 
 
A minha amiga Luciana Rabelo pelos maravilhosos momentos que 
compartilhamos nos dois anos de mestrado e por ter sido minha companheira nos 
momentos ruins (disciplinas) e nos bons. Te adoro. 
 
Aos colegas da turma do mestrado por, juntos, termos conseguido superar todas 
os obstáculos. 
 
Aos professores do Departamento de Bioquímica, que de alguma forma, 
contribuíram para minha formação, em especial à professora Edda, por ser um 
exemplo de luta e perseverança. 
 
Aos funcionários do Departamento em especial a Rogério por ser uma pessoa tão 
prestativa. 
 
A Margarita Mavromatis, secretária da pós-graduação, por ser um exemplo de 
disciplina, elegância e competência. 
 
Aos integrantes dos demais laboratórios do Departamento de Bioquímica. Muito 
obrigada pela ajuda em experimentos e por permitirem a utilização de alguns 
aparelhos. 
 
Ao Programa de Mestrado em Bioquímica da Universidade Federal do Rio 
Grande do Norte pelas condições necessárias para o desenvolvimento destetrabalho; 
 
À Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional 
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo financiamento desta 
pesquisa; 
 
 
OBRIGADA! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Para realizar grandes conquistas, devemos não apenas agir, mas 
também sonhar; não apenas planejar, mas também acreditar". 
Anatole France 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMO 
 
 
As espécies do gênero Marsdenia, Apocynaceae, são bastante utilizadas na 
medicina popular de vários países. No Brasil são encontradas várias espécies 
pertencentes a esse gênero. As atividades antioxidante, anticoagulante e 
antiproliferativa foram avaliadas para os extratos de caule, folha e raiz de Marsdenia 
megalantha. Na capacidade antioxidante total (expressa como equivalente de ácido 
ascórbico), o extrato do caule apresentou 76,0 mg/g, enquanto os extratos da folha e 
raiz apresentaram, respectivamente, 14,3 mg/g e 57,0 mg/g. Os extratos do caule e 
da folha mostraram habilidade quelante em torno de 40% na concentração de 1,5 
mg/mL, enquanto o extrato da raiz, na mesma concentração, apresentou 17%. 
Apenas o extrato da folha apresentou uma capacidade significante em sequestrar 
radicais superóxidos (80% em 0,8 mg/mL). Nenhum extrato mostrou capacidade em 
seqüestrar radicais hidroxila, bem como atividade anticoagulante. A atividade 
antiproliferativa dos extratos foi avaliada contra a linhagem tumoral HeLa. Os 
extratos inibiram, de forma dose-dependente, o crescimento celular. Entretanto, o 
extrato da folha foi capaz de inibir em 80% a proliferação celular na concentração de 
1,0 mg/mL, enquanto os extratos de caule e raiz inibiram 63% e 30%, 
respectivamente. Para avaliar o mecanismo de morte celular causada pelo extrato 
da folha nas células HeLa, foi realizada citometria de fluxo e western blot. Os 
resultados mostraram que o extrato da folha induz morte celular por apoptose 
através de uma via de ativação independente de caspase. Estes resultados indicam 
que os extratos de caule e folha obtidos têm potencial para serem futuramente 
utilizados como fármacos antioxidantes e anticâncer. 
 
Palavras-chave: Antitumoral. HeLa. Caatinga. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
 
The species of the genus Marsdenia, Apocynaceae, are widely used in folk 
medicine of several countries. In Brazil is found several species belonging to this 
genus. The in vitro antioxidant, anticoagulant and antiproliferative activities were 
evaluated to aqueous extracts of stalk, leaf and root of Marsdenia megalantha. In 
the total antioxidant capacity assay (expressed as ascorbic acid equivalents) the 
stalk extract showed 76.0 mg/g, while leaf and root extracts 141.3 mg/g and 57.0 
mg/g, respectively. The stalk and leaf extracts showed chelating activity around 40% 
at 1.5 mg/mL, while root extract, at the same concentration showed, 17%. Only the 
leaf extract showed a significant ability in superoxide scavenging (80% at 0.8 
mg/mL). Any extract was able in scavenge hydroxyl, as well anticoagulant activity. 
The antiproliferative activity of the extracts was evaluated against HeLa tumor cell 
line. The extracts inhibited in a dose-dependent manner the cell growth. However, 
the leaf extract showed 80% of inhibition at 1.0 mg/mL, while stalk and root extracts 
inhibited 63% and 30%, respectively. To assess the mechanism of cell death caused 
by the leaf extract in HeLa, was performed flow cytometry and western blot. The 
results show that leaf extract induces cell death by apoptosis through an activation 
caspase-independent pathway. These data indicate that stalk and leaf extracts 
obtained have potential to be used as antioxidants and anticancer drugs. 
 
Word Keys: Antitumor. HeLa. Caatinga. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1. Redução tetravalente do oxigênio molecular (O2) na mitocôndria 
até a formação de água (H2O), com a formação de espécies 
reativas do oxigênio (EROs)........................................................... 
 
 
23 
Figura 2. Complexo NADPH oxidase de células vasculares. O ânion 
superóxido é produzido intracelularmente. A subunidade Nox (1 
ou 4) se liga a p22 na membrana plasmática.................................. 
 
 
23 
Figura 3. Eliminação das espécies reativas superóxido e peróxido de 
hidrogênio pelas enzimas antioxidantes SOD, catalase e 
GPx.................................................................................................. 
 
 
24 
Figura 4. Eliminação das espécies reativas superóxido e peróxido de 
hidrogênio pelas enzimas antioxidantes SOD, catalase e 
GPx.................................................................................................. 
 
 
24 
Figura 5. Modelo esquemático da produção de EROs 
mitocondrial..................................................................................... 
 
25 
Figura 6. Modelo clássico da cascata de 
coagulação...................................................................................... 
 
30 
Figura 7. Representação esquemática dos complexos procoagulantes....... 31 
Figura 8. Esquema representativo de dois processos de morte celular: 
(a)necrose e (b)apoptose................................................................ 
 
35 
Figura 9. Marsdenia megalantha.................................................................... 39 
Figura 10. Capacidade antioxidante total dos extratos aquosos do caule, 
folha e raiz de M. megalantha......................................................... 
 
51 
Figura 11. Ensaio do poder redutor dos extratos aquosos de diferentes 
partes de M. megalantha................................................................. 
 
52 
Figura 12. Quelação férrica dos extratos aquosos do caule, folha e raiz de 
M. megalantha................................................................................. 
 
54 
Figura 13. Atividade antiproliferativa dos extratos aquosos do caule, folha e 
raiz de M. megalantha frente à linhagem tumoral HeLa.................. 
 
55 
Figura 14. Atividade antiproliferativa do extrato aquoso da folha de M. 
megalantha frente a quatro linhagens celulares tumorais............... 
 
56 
Figura 15. Microfotografias das células HeLa visualizadas em microscópio 
de contraste de fase........................................................................ 
 
57 
Figura 16. Imagem de microscopia de varredura das células HeLa. As fotos 
foram obtidas a partir de microscópio de varredura. As setas 
verdes evidenciam filopódios, as brancas, os lemelipódios e as 
vermelhas, os “ruffles”..................................................................... 
 
 
 
58 
Figura 17. Imagens de microscopia de fluorescência das células HeLa 
coradas com DAPI. As fotos foram obtidas a partir de 
microscópio de fluorescência. As setas brancas evidenciam 
fragmentação nuclear...................................................................... 
 
 
 
60 
Figura 18. Marcação das células HeLa com anexina V-FITC e iodeto de 
propídio. As células HeLa foram tratadas com EAF 0,50 mg/mL 
por 24 horas. Os dados foram obtidos por citometria de 
fluxo................................................................................................. 
 
 
 
62 
Figura 19. Efeitos de EAF na expressão de proteínas envolvidas na morte 
celular............................................................................................. 
 
63 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
 
Tabela 1 . Composição química dos extratos aquosos do caule, folha e raiz 
de M. megalantha............................................................................ 
 
50 
Tabela 2 . Atividade sequestradora do anion superóxido dos extratos 
aquosos do caule, folha e raiz de M. megalantha........................... 
 
53LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS 
 
 
AIF Apoptosis Inducing Factor 
aPTT activated Parcial Thromboplastin Time 
ATCC American Type Culture Collection 
ATP Adenina Trifosfato 
CAT Capacidade Antioxidante Total 
CHOP C/EBP Homologous Protein 
CTE Cadeia Transportadora de Elétrons 
DAPI 4'-6-Diamidino-2-phenylindole 
DD Death Domain 
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium 
DNA Desoxiribunucleic Acid 
DPPH 1,1-difenil-2-pricrilhidrazil 
DTT Ditiotreitol 
EAC Extrato Aquoso do Caule 
EAF Extrato Aquoso da Folha 
EAR Extrato Aquoso da Raiz 
EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético 
EGTA Ethylene Glycol Tetraacetic Acid 
EROs Espécies Reativas do Oxigênio 
FITC Fluorescein Isothiocyanate 
FT Fator Tecidual 
FVIIa Fator VII ativado 
FXII Fator XII 
FXIIa Fator XII ativado 
GPx Glutationa Peroxidase 
IP Iodeto de Propídeo 
JNK c-Jun-N-Terminal Kinase 
MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase 
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura 
mg Miligrama 
mL Mililitro 
mRNA Messenger Ribonucleic Acid 
mtDNA Mitochondrial Desoxiribonucleic Acid 
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide 
NADPH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato 
NBT Nitroblue Tetrazolium 
Nd Não Detectado 
nm nanômetro 
PBS Phosphate Buffer Saline 
pH Potencial Hidrogeniônico 
PT Prothrombin Time 
PVDF Polyvinylidene Fluoride 
RE Retículo Endoplasmático 
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrilamide Gel Electrophoresis 
SFB Soro Fetal Bovino 
SOD Superóxido Dismutase 
TCA Ácido Tricloroacético 
TNF Tumor Necrosis Factor 
TRAIL Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand 
TT Thrombin Time 
UEFS Universidade Estadual de Feira de Santana 
UFPR Universidade Federal do Paraná 
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte 
Z-VAD-FMK Carbobenzoxy-Valyl-Alanyl-Aspartyl-[O-Methyl]- Fluoromethylketone 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO 20 
1.1 FAMÍLIA APOCYNACEAE 20 
1.2 GÊNERO Marsdenia 20 
1.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE 22 
1.3.1 Espécies reativas e antioxidantes 22 
1.3.2 Atividade antioxidante em extratos de plantas 27 
1.4 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 29 
1.4.1 Coagulação sanguínea x anticoagulantes 29 
1.4.2 Atividade anticoagulante de extratos e compos tos obtidos de 
Plantas 32 
1.5 ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA 33 
1.5.1 Efeitos antiproliferativos de extratos e comp ostos obtidos de plantas36 
2 OBJETIVOS 38 
3 MATERIAIS E MÉTODOS 39 
3.1 MATERIAIS 39 
3.1.1 Material biológico 39 
3.1.2 Linhagens tumorais e culturas das células 40 
3.1.3 Outros materiais 40 
3.1.4 Aparelhos 41 
3.2 MÉTODOS 42 
3.2.1 Obtenção dos extratos aquosos do caule, folha e raiz de M. 
megalantha 42 
3.2.2 Determinação dos componentes dos extratos aqu osos de M. 
megalantha 42 
3.2.3 Atividades biológicas dos extratos aquosos de M. megalantha 43 
3.2.3.1 Atividade antioxidante in vitro 43 
3.2.3.2 Atividade anticoagulante 44 
3.2.3.3 Atividade antiproliferativa 45 
3.2.3.4 Análise das células em microscópio de luz e microscópio eletrônico de 
varredura 46 
3.2.3.5 Fragmentação nuclear 46 
 
3.2.3.6 Avaliação da viabilidade e morte celular por Anexina V-FITC/ Iodeto de 
Propídio 47 
3.2.3.7 Western blot 47 
3.2.4 Análise estatística 49 
4 RESULTADOS 50 
4.1 DETERMINAÇÃO DOS COMPONENTES DOS EXTRATOS AQUOSOS 
M. megalantha 50 
4.2 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DOS EXTRATOS AQUOSOS DE M. 
Megalantha 50 
4.2.1 Atividade antioxidante in vitro 50 
4.2.2 Atividade anticoagulante dos extratos do caul e, folha e raiz de M. 
megalantha 54 
4.2.3 Atividade antiproliferativa dos extratos do c aule, folha e raiz de M. 
megalantha 54 
4.2.4 Atividade antiproliferativa do extrato aquoso da folha de M. megalantha 
 frente a linhagens tumorais 55 
4.2.5 Análises morfológicas das células HeLa na pre sença do extrato aquoso 
 da folha de M. megalantha 57 
4.2.6 Fragmentação nuclear nas células HeLa na pres ença do extrato aquoso 
da folha de M. megalantha 59 
4.2.7 Detecção e quantificação de células apoptótic as induzidas pelo extrato 
aquoso da folha de M. megalantha 61 
4.2.8 Efeito do extrato aquoso da folha de M. megalantha na expressão de 
proteínas relacionadas com a apoptose das células H eLa 62 
5 DISCUSSÃO 64 
6 CONCLUSÃO 72 
REFERÊNCIAS 73 
 
 
 
 
 
 
 
INTRODUÇÃO 20 
1. INTRODUÇÃO 
1.1 FAMÍLIA APOCYNACEAE 
As angiospermas da família Apocynaceae são representadas por espécies 
de grande porte e herbáceas. Esta família possui distribuição predominantemente 
pantropical, mas com representantes também na região temperada e abrange cerca 
de 3700 a 5100 espécies distribuídas em cerca de 250 a 515 gêneros, sendo uma 
das dez maiores famílias de angiospermas em número de espécies. No Brasil 
ocorrem cerca de 90 gêneros e 850 espécies (JUDD et al.,2009, RAPINI et al., 2000, 
SOUZA, 2000). 
Muitas espécies desta família são cultivadas como plantas ornamentais, com 
destaque para a alamanda (Allamanda spp.), a vinca (Catharanthus roseus) e a 
espirradeira (Nerium oleander). Nesta família estão incluídas árvores fornecedoras 
de madeira de boa qualidade, como as perobas e os guatambus (Aspidosperma 
spp.). As Apocynaceae são ricas em glicosídeos e alcalóides, especialmente nas 
sementes e no látex. Entre as principais substâncias extraídas das Apocynaceae 
estão a leucocristina e a vincristina, ambas extraídas de Catharanthus roseus, 
utilizadas no tratamento do câncer (JUDD et al., 2009). 
1.2 GÊNERO Marsdenia 
O gênero Marsdenia (Apocynaceae, subfamília Asclepiadoideae) é 
amplamente distribuído em todo o globo (composto de aproximadamente 300 
espécies), estando ausente no Havaí, nos Açores, nas Ilhas Britânicas, na Tasmânia 
e na Nova Zelândia (MORILLO, 1997). As espécies desse gênero são bastante 
utilizadas pela medicina popular de vários países como: China, Índia, Coréia e 
Tailândia. No Brasil o gênero Marsdenia sp é amplamente distribuído, sendo 
representado por dezenas de espécies. Porém, tanto no Brasil como em outras 
partes do mundo, há poucos estudos farmacológicos ou biológicos relacionados a 
este gênero, a grande maioria são estudos sistemáticos. 
São encontradas três espécies de Marsdenia em clima semi-árido, sendo 
duas delas espécies de lianas e apenas uma espécie arbustiva, a Marsdenia 
megalantha, uma espécie endêmica do Brasil, restringindo-se aos domínios da 
Caatinga. Essa espécie foi descrita em 1994 por Goyder & Morillo e trabalhos com a 
espécie, inclusive sistemáticos, são bem escassos (GOYDER; MORILLO, 1994). 
INTRODUÇÃO 21 
Nos últimos anos, as espécies de Marsdenia vêm atraindo a atenção de 
diversos pesquisadores. Isso se deve pelo fato de o gênero sintetizar uma série de 
compostos bioativos, e também pela necessidade de consolidar o conhecimento 
popular em conhecimento científico. Estudos mais antigos relatados na literatura 
mostram que extratos clorofórmicos do tronco de M. tenacissima apresentam 
atividade antiasmática (ZHOU; YANG; YANG, 1980) e antiproliferativa frente ao 
carcinoma de Ehrlich (MIYAKAWA et al., 1986). Um estudo realizado por Wang e 
colaboradores em 2006 mostrou que o extrato aquoso do tronco de M. tenacissima 
apresenta atividade antiproliferativa frente às linhagens tumorais C-26 (carcinoma do 
cólon) e Hepal-6 (carcinoma hepáticode rato) (WANG et al., 2006). Por sua vez, Hu 
e colaboradores, em 2008, relataram que extratos metanólicos do rizoma e raiz de 
M. tenacíssima apresentaram a capacidade de diminuir a resistência às drogas que 
a linhagem tumoral HepG2/Dox (hepatoma humano) apresenta (HU et al., 2008). 
Outra espécie que vem sendo bem investigada é a M. condurango. Desde o 
início da década de 80 estudos vêm sendo realizados com extratos de várias 
naturezas dessa espécie. Trabalhos pioneiros como o de Hayashi e colaboradores 
(1981) mostram que o extrato da casca inibe a proliferação do carcinoma de Ehrlich. 
Dentre os estudos destaca-se o realizado por Umehara e colaboradores em 1994, 
onde obtiveram um extrato metanólico da casca da M. condurango e observaram 
que o extrato induz a diferenciação da linhagem leucemica mielóide de ratos em 
fagócitos (UMEHARA et al., 1994). Há também um estudo verificando a atividade 
antioxidante de extratos etanólicos da folha de M. glabra (TACHAKITTIRUNGROD; 
OKONOGI;CHOWWANAPOONPOHN, 2007). 
Os principais compostos extraídos e estudados das plantas do gênero 
Marsdenia sp são as pregnanas e pregnanas glicosiladas. As pregnanas são 
compostos apolares, semelhantes à progesterona, que apresentam um núcleo 
esteróide, com algumas ligações ésteres ao longo desse núcleo. Já as pregnanas 
glicosiladas, são semelhantes às pregnanas, porém apresentam um açúcar ligado 
ao anel A do núcleo esteróide, conferindo-as solubilidade em água (CHEN et al., 
1999). Ambas são encontradas em Marsdenia sp, e as principais atividades 
farmacológicas apresentadas por esses compostos foram as de antiasmático, 
antiproliferativo, inclusive contra células tumorais, e efeito regulatório de fertilidade. 
(GUPTA et al., 2003 ). 
INTRODUÇÃO 22 
1.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE 
1.3.1 Espécies reativas e antioxidantes 
O termo radical livre refere-se a um átomo ou uma molécula altamente 
reativa, que contém número ímpar de elétrons em seus orbitais mais externos. É 
este desemparelhamento de elétrons, nestes orbitais, que confere alta reatividade a 
esses átomos ou moléculas (BHOOLA; ODHAV; REDDY, 2003; WICKENS, 2001). 
Os radicais livres são formados a partir de reações de óxido-redução, isto é, podem 
ceder elétrons, oxidando-se, ou receber elétrons, reduzindo-se. Esses átomos ou 
moléculas altamente reativos são, em sua maioria derivados do metabolismo do O2 
e, dessa forma, são denominados espécies reativas do oxigênio (EROs) como por 
exemplo os radicais hidroxila (OH●), hidroperoxila (HO2
●) e o ânion superóxido (O2
●-) 
(FERREIRA; MATSUBARA, 1997; Li et al., 2003). São também EROs moléculas ou 
átomos que não apresentam elétrons desemparelhados nos seus orbitais externos, 
mas que podem causar efeitos deletérios nos sistemas biológicos. Dentre estes 
pode-se citar o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o oxigênio singlet (¹O2). 
Há vários modos pelos quais os radicais livres podem ser formados e o 
principal local de formação no meio intracelular é na mitocôndria, onde o oxigênio 
sofre uma redução tetravalente em passos seqüentes, resultando na formação de 
água, como ilustrado na figura 1 (ACHARYA et al., 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INTRODUÇÃO 23 
 
Figura 1. Redução tetravalente do oxigênio molecula r (O2) na mitocôndria até a 
formação de água (H 2O), com a formação de espécies reativas do oxigênio (EROs). Fonte: 
Adaptado de FERREIRA; MATSUBARA, 1997. 
Durante a fosforilação oxidativa, elétrons são ocasionalmente capturados 
pelo oxigênio formando, através de sua primeira redução, o ânion superóxido. Este 
radical pode ser formado através de outros processos como, por exemplo, através 
de um processo regulado pelas NADPH oxidases, as quais têm sido descritas em 
quase todas as células (figura 2) (ARNOLD et al., 2001; CHENG et al., 2001). 
. 
Figura 2. Complexo NADPH oxidase de células vascula res . O ânion superóxido é 
produzido intracelularmente. A subunidade Nox (1 ou 4) se liga a p22 na membrana plasmática. 
Fonte: DUSTING, SELEMIDIS e JIANG, 2005. 
 
Dentro da mitocôndria, esses radicais são prontamente inativados pela ação 
da enzima superóxido dismutase (SOD), resultando na formação de peróxido de 
hidrogênio (Reação 1 da figura 3), o qual é subsequentemente convertido em água 
INTRODUÇÃO 24 
(Reações 2 e 3 da figura 3) pela ação concomitante de outras enzimas como a 
catalase e a glutationa peroxidase (GPx) (figuras 3 e 5). Tem sido demonstrado que 
os complexos I e III da cadeia respiratória são os principais sítios de formação do 
superóxido, apesar de haverem indícios de que o complexo II também possa 
produzir (BUETTNER et al., 2006; FORMAN, 2010). 
 
 
 
 
 
Figura 3. Eliminação das espécies reativas superóxi do e peróxido de hidrogênio pelas enzimas 
antioxidantes SOD, catalase e GPx . Fonte: Adaptado de VALKO et al., 2006. 
 
No segundo passo da redução do O2 é formado o peróxido de hidrogênio 
(figura 01). Apesar de não ser um radical livre, o peróxido de hidrogênio é um 
metabólito do oxigênio altamente deletério, uma vez que participa na formação do 
radical hidroxila quer pela via da redução tetravalente do O2, ou pela reação de 
Haber-Weiss (Reação 4 da figura 4) ou ainda pela reação de Fenton (Reações 5 e 6 
da figura 04) (MASSEY et al.,1969; FORMAN, 2007). 
 
 
 
 
Figura 4. Reações de formação do radical hidroxila a partir do peróxido de hidrogênio. Fonte: 
Adaptado de ANDRADE JÚNIOR, 2005. 
 
O passo seguinte da redução tetravalente do oxigênio molecular é a 
formação do radical hidroxila. Este ERO é altamente reativo e apresenta um tempo 
de meia-vida de apenas 10-9 s, reagindo prontamente no seu sítio de formação, 
Reação 1 
Reação 2 
Reação 3 
Reação 4 
Reação 5 
Reação 6 
INTRODUÇÃO 25 
sendo considerada, portanto, a espécie mais danosa a sistemas biológicos (WELLS 
et al., 2009). O radical hidroxila é formado in vivo, principalmente a partir da reação 
entre metais e espécies reativas de oxigênio (Reações de Fenton e Haber-Weiss) 
(figuras 4 e 5). 
 
 
Figura 5. Modelo esquemático da produção de EROs mitocondrial . Durante a respiração 
mitocondrial, uma pequena quantidade do oxigênio molecular consumido pelas células é convertido 
em ânion superóxido (O2
●-) pelos complexos I e III como um produto tóxico da fosforilação oxidativa. 
Enzimas superóxido dismutase convertem o (O2
●-) a peróxido de hidrogênio (H2O2) o qual pode ser 
convertido sequencialmente em água pela glutationa peroxidase (GPx) ou enzimas peroxiredoxinas. 
O H2O2 pode também reagir com o Fe
2+ gerando o radical hidroxila (OH●). Este radical pode atacar 
todas as moléculas incluindo o mtDNA e consequentemente causa uma diminuição no mRNA 
mitocondrial e altera a expressão de proteínas mitocondriais essenciais para a cadeia transportadora 
de elétrons (CTE) e síntese de ATP. Defeitos nas proteínas mitocondriais afetam a atividade da CTE 
culminando em um ciclo vicioso de produção de EROs.Fonte: Moura, Santos e Van Houten. 
A necessidade dos organismos de apresentarem um complexo sistema de 
vias para metabolizarem as EROS, se dá pelo fato destas espécies apresentarem 
um papel dúbio, podendo ser benéficas ou prejudiciais aos organismos. Os efeitos 
benéficos das EROs envolvem funções fisiológicas como a participação do peróxido 
de hidrogênio na formação dos hormônios da glândula tireóide (MILENKOVIC et al., 
2007). Outro exemplo é seu papel defensivo nas respostas celulares à nóxia, onde 
os fagócitos produzem o ânion superóxido e peróxido de hidrogênio, e na função de 
umasérie de sistemas de sinalização celular. Além disso, em baixas concentrações, 
as EROs induzem respostas mitogênicas. (VALKO et al., 2007) 
INTRODUÇÃO 26 
Estas propriedades benéficas acontecem quando a concentração das EROS 
está em níveis baixos. No entanto, em altas concentrações, as EROs podem atuar 
danificando estruturas celulares. Por exemplo, o ânion superóxido não reage 
diretamente com polipeptídeos, açúcares ou ácidos nucléicos, e sua habilidade em 
peroxidar lipídeos é controversa (VALKO et al., 2006). No entanto, sob algumas 
condições de estresse, um excesso de ânions superóxido, por exemplo, pode reagir 
e liberar o ferro que se encontra associado a algumas proteínas e, uma vez livres, 
esses íons de ferro podem participar da reação de Fenton formando radicais 
hidroxila, que uma vez formados atacam proteínas, DNA, ácidos graxos 
poliinsaturados das membranas celulares e outras moléculas biológicas as quais 
eles tenham contato (JOMOVA et al., 2010). 
Controlar a concentração das EROs em níveis benéficos é extremamente 
importante e para tal os organismos durantes seus processos evolucionários 
desenvolveram sistemas de defesa cujo objetivo é diminuir a alta concentração de 
EROs. No caso dos humanos, este sistema é formado por várias moléculas 
endógenas, principalmente enzimas, mas também por substâncias exógenas que 
são provenientes dos alimentos. Todas estas moléculas são atualmente chamadas 
de antioxidantes. Estes podem ser definidos como substâncias que, quando 
presentes em baixas concentrações em relação ao seu substrato oxidável, retardam 
ou inibem, significativamente, a oxidação desse substrato (HALLIWELL, 1997). Os 
antioxidantes apresentam três principais mecanismos de ação. Eles podem 
seqüestrar os radicais formados, prevenir a formação destes e reparar os danos 
provocados por estas espécies (NIKI et al., 1995). 
Os antioxidantes que previnem a formação de radicais livres atuam como 
uma primeira linha de defesa, como por exemplo, através da redução do peróxido de 
hidrogênio a água ou seqüestrando íons metálicos como ferro e cobre. Os 
antioxidantes seqüestradores removem as espécies reativas rapidamente antes que 
estas “ataquem” moléculas biologicamente essenciais (NIKI, 2010). Por exemplo, a 
enzima superóxido dismutase (SOD) converte o ânion superóxido a peróxido de 
hidrogênio, enquanto carotenóides seqüestram o oxigênio singlet, quer fisicamente 
ou quimicamente. Muitos compostos fenólicos e aminas aromáticas também atuam 
como seqüestradores de radicais livres (NIKI, 2010). Várias enzimas atuam na 
terceira linha de defesa reparando danos, limpando os resíduos e reconstituindo 
funções perdidas. Além disso, existe uma quarta linha de defesa, que na verdade se 
INTRODUÇÃO 27 
trata de um mecanismo de adaptação, onde novos antioxidantes são gerados em 
uma concentração desejada, no momento certo, e são prontamente deslocados para 
uma localização precisa (NIKI, 2010). 
Apesar da existência de um sistema antioxidante, sob certas condições, as 
espécies reativas do oxigênio excedem a capacidade antioxidante do organismo, 
resultando no conhecido estresse oxidativo, o qual vem sendo relacionado a várias 
condições patofisiológicas, incluindo aterosclerose, câncer, desordens neurológicas, 
diabetes, isquemia e envelhecimento (BARNHAM; MASTERS; BUSH, 2004; 
PRASETYO, 2010). 
As evidências relacionando o estresse oxidativo a várias desordens e 
doenças têm atraído a atenção de pesquisadores para o papel dos antioxidantes na 
manutenção da saúde humana e na prevenção e tratamento dessas doenças (NIKI, 
2010). 
1.3.2 Atividade antioxidante em extratos de plantas 
As plantas assim como os animais possuem sistemas antioxidantes. Dentre 
estes mecanismos, destacam-se as substâncias do metabolismo secundário, como 
por exemplo, terpenos oxidados, fenóis, alcalóides, lignanas, cafeína e aminas 
(COTELLE et al., 1996; LARSON 1988; OKADA; KANEKO; OKAJIMA, 1996). Essas 
substâncias, além de serem antioxidantes, também contribuem com diversas 
funções ecológicas de extrema importância nas relações de competição de 
ecossistemas terrestres, como defesa contra herbívoros e patógenos, polinização e 
alelopatia (GOTTLIEB; BORIN, 2002; LANGENHEIN, 1994). 
Os antioxidantes de origem vegetal têm recebido considerável atenção das 
indústrias alimentícia e cosmética. Dentro deste contexto, a capacidade desses 
antioxidantes tem sido foco de diversas pesquisas científicas. (GORDON, 1996) 
Ozsoy e colaboradores, em 2008, por exemplo, realizaram estudos com 
extratos obtidos da folha de Smilax excelsa pelo uso de diferentes solventes. Dentre 
os extratos obtidos, o aquoso e o etanólico apresentaram uma elevada atividade 
antioxidante frente ao teste do DPPH (1,1-difenil-2-pricrilhidrazil). Já para ensaios 
antioxidantes referentes aos sequestros de radicais superóxido e hidroxila o extrato 
aquoso apresentou uma boa capacidade em seqüestrar ambos, enquanto o extrato 
etanólico e com acetato de etila apresentaram capacidade apenas em seqüestrar o 
radical hidroxila (OZSOY et al., 2008). Resultado semelhante foi encontrado para o 
INTRODUÇÃO 28 
extrato aquoso da folha de Helichrysum pedunculatum (AIYEGORO; OKOH, 2009). 
Ozen, Demirtas e Aksit, em 2011, também obtiveram diferentes extratos a partir da 
espécie Thymus praecox. Neste trabalho a capacidade antioxidante dos extratos foi 
avaliada pelo teste do poder redutor e foi observado que os extratos aquosos e 
metanólico apresentaram maior capacidade, seguidos dos extratos cetônico e 
hexânico. Novamente, a capacidade dos extratos em seqüestrar radicais livres 
específicos, no caso o radical superóxido, foi avaliada. Mais uma vez, o extrato 
aquoso apresentou ótimo sequestro do radical superóxido. Todos os extratos 
apresentaram capacidade em quelar íons metálicos (OZEN; DEMIRTAS; AKSIT, 
2011). Estes resultados mostram a promissora atividade antioxidante multipotente 
de compostos obtidos a partir de plantas, bem como a diferença existente entre as 
atividades antioxidantes de extratos obtidos de diferentes solventes, uma vez que, 
de acordo com a polaridade, cada solvente tem a capacidade em extrair compostos 
diferentes e estes expressam-se de formas diferentes, respondendo de formas 
específicas quando submetidos a testes antioxidantes (MENSOR et al., 2001). 
Outros tipos de pesquisas para avaliação da atividade antioxidante são 
realizadas no intuito de se avaliar as possíveis capacidades antioxidantes existentes 
entre diferentes porções vegetativas das plantas. Sabe-se que os diferentes tecidos 
vegetais sintetizam e são formados por substâncias específicas. Além disso, cada 
tecido responde de forma diferente às pressões exercidas pelo ambiente devido 
justamente aos seus componentes moleculares, sendo, portanto, importante a 
investigação das possíveis atividades que um extrato dos tecidos vegetais possa 
apresentar. Neste contexto enquadra-se o trabalho realizado por Koncic e 
colaboradores em 2010, onde são realizados ensaios antioxidantes in vitro 
comparativos entre caule, flores e folhas de Moltkia petraea (KONCIC et al., 2010). 
Os resultados deste trabalho indicam que extratos obtidos de diferentes porções 
vegetativas de uma planta apresentam distintas atividades antioxidantes quando 
submetidas aos diferentes testes antioxidantes, uma vez que os tecidos vegetais são 
constituídos por moléculas diferentes e estas, por sua vez, influenciam nos ensaios 
antioxidantes. 
A ação antioxidante dos extratos obtidos de plantas pode ir além do 
sequestro e impedimento da formação de espécies reativas. Porexemplo, em 2007, 
Naik e colaboradores demonstraram que o extrato aquoso da raiz da espécie vegetal 
Decalepis hamiltonii era capaz de proteger a mucosa gástrica de lesões mucosas 
INTRODUÇÃO 29 
induzidas por estresse quando ingerido em doses adequadas por ratos do tipo 
Wistar antes de serem submetidos a esse estresse. Além disso, o tratamento dos 
ratos com o extrato mostrou que este inibia a secreção gástrica provavelmente pelo 
bloqueio da ação da bomba H+–K+–ATPase. De acordo com os autores uma das 
causas para esse efeito protetor pode ser também explicado devido a um aumento 
das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase nos animais que tinham 
sido submetidos ao tratamento com o extrato (NAIK et al., 2007) 
1.4 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE 
1.4.1 Coagulação sanguínea x anticoagulantes 
A formação do coágulo de fibrina envolve complexas interações entre 
proteases plasmáticas e seus cofatores, que culminam na gênese da enzima 
trombina, que, por proteólise, converte o fibrinogênio solúvel em fibrina insolúvel 
(FRANCO, 2001). 
Em 1964, foi proposta a hipótese da “cascata” para explicar a fisiologia da 
coagulação. Este modelo descreve cada um dos fatores de coagulação como uma 
pró-enzima que pode ser convertida para uma enzima ativa. O mecanismo de 
coagulação é dividido em duas vias: via intrínseca, assim chamada porque todos os 
componentes estão presentes no sangue; e via extrínseca, em que a proteína da 
membrana das células subendotelias, o fator tecidual (FT), é necessária, além de 
componentes circulantes. Como é apresentada na figura 6, a via extrínseca é 
desencadeada pela formação do complexo Fator Tecidual (FT): Fator VIIa (FVIIa) 
que resulta na ativação do fator X. A via intrínseca é iniciada pela ativação do fator 
XII (FXII), quando o sangue entra em contato com qualquer superfície contendo 
cargas negativas (ativação por contato), este processo requer ainda a presença de 
outros componentes do plasma: pré-calicreína (uma serino-protease) e cininogênio 
de alto peso molecular (um cofator não enzimático). O fator XII ativo (FXIIa), 
desencadeia uma série de ativações protéicas, que culmina na ativação do fator X 
(RIDELL et al., 2007) 
O ponto de convergência das vias extrínseca e intrínseca é conhecido como 
via comum da coagulação, e é caracterizada pela ativação de fibrinogênio à fibrina 
pela trombina, formando uma malha de fibrina que vai ser estabilizada pelo fator 
XIIIa (FRANCO, 2001). 
INTRODUÇÃO 30 
 
Figura 6. Modelo clássico da cascata de coagulação. Fonte: FRANCO, 2001 
 
Posteriormente, foi proposto um novo modelo de cascata de coagulação, no 
qual são relacionados três complexos enzimáticos pró-coagulantes que vão culminar 
na ativação da trombina: Complexo “tenase” extrínseco, complexo “tenase” 
intrínseco e complexo protrombinase. Após uma lesão no endotélio vascular, o FT é 
exposto e se liga ao Fator VIIa que é normalmente encontrado no sangue. O 
complexo FT/VIIa ativa os fatores IX e X na presença do cálcio. O fator IXa, por sua 
vez, potencializa a formação de Xa através da formação do “complexo tenase 
intrínseco” . Por fim, o fator Xa forma complexo com o fator Va convertendo o fator II 
(protrombina) em fator IIa (trombina), como observado na figura 7 (ADAMS; BIRD, 
2009;FRANCO, 2001). 
 
INTRODUÇÃO 31 
 
 
Figura 7. Representação esquemática dos complexos p rocoagulantes. (A) O Fator VII encontra-
se ativado em concentrações muito baixas no sangue. (B) O Fator VIIa tem alta afinidade pelo FT. O 
complexo FT/VIIa é capaz de converter uma quantidade significativamente maior de Fator VII, 
gerando o Fator VIIa. (C) No entanto o principal papel de FT/VIIa é formar um complexo com os 
Fatores X e IX (Complexo tenase extrínseco), levando a formação dos Fatores Xa e IXa. O Fator Xa, 
por sua vez, leva a formação de pequenas concentrações de trombina, que por sua vez ativam os 
cofatores V e VIII. (D) Os Fatores IXa e VIIIa se complexam ao Fator X (Complexo tenase intrínseco) 
ativando mais moléculas de trombina. (E) Os Fatores Va e Xa se complexam ao Fator II (Complexo 
protrombinase) aumentando consideravelmente sua conversão em trombina (a formação de trombina 
por este complexo é 50 vezes maior do que pelos demais). FT: Fator tecidual. As setas tracejadas 
indicam pontos de retroalimentação do sistema 
 
Anticoagulantes têm sido amplamente utilizados para o tratamento de 
sangue durante diálises e cirurgias; como medicamentos em várias doenças, como 
coagulação intravascular disseminada e trombose; e para testes sanguíneos in vitro 
(WANG et al., 2010). 
O principal fármaco anticoagulante, usado há mais de 80 anos, é a heparina, 
um polissacarídeo sulfatado de origem animal, extraído de intestino de suínos e 
pulmão de bovinos, constituído por unidades dissacarídicas repetitivas, onde um dos 
resíduos é uma hexosamina (glucosamina); e o outro, um ácido urônico (L-idurônico 
e D-glucurônico), a sulfatação pode ocorrer em vários pontos da molécula (NADER 
et al., 2004). No entanto, o uso deste composto pode apresentar algumas reações 
adversas, como trombocitopenia decorrente do seu uso prolongado (FABRIS et al., 
2000) e efeito hemorrágico residual, apresentado por fragmentos da heparina sem 
atividade anticoagulante (NADER et al., 1979; 2004). Portanto, se faz necessário a 
busca por novos compostos anticoagulantes, com menores efeitos colaterais ou sem 
A B 
E 
C 
 
D 
E 
INTRODUÇÃO 32 
efeitos colaterais, que possam vir a substituir a heparina, ou o seu uso em algumas 
situações específicas. 
1.4.2 Atividade anticoagulante de extratos e compos tos obtidos de plantas 
Extratos de plantas vasculares constituem uma rica fonte de compostos 
farmacologicamente ativos, dentre as atividades que vem sendo avaliadas tem-se a 
atividade anticoagulante. E alguns resultados positivos são encontradosna literatura, 
como por exemplo, dados sobre o estrato aquoso da casca da raiz de Paeonia lutea 
apresentou atividade anticoagulante, fibrinolítica e antitrombótica, no entanto, porém, 
os autores não identificaram os compostos ativos deste extrato (PASTORAVA et 
al.,1999). Um outro gênero de planta que teve seus extratos avaliados quanto a 
atividade anticoagulante foi o Panax. Extratos Panax notoginseng prolongaram o 
tempo de coagulação para os testes de aPTT, PT e TT, já os extratos de Panax 
ginseng e Panax quinquefolium apresentaram atividade somente para o teste de TT 
(LAU et al., 2009). 
No entanto, há também trabalhos que demonstram extratos de certas 
plantas não possuem atividade anticoagulante, como os extratos aquosos das 
folhas, sementes e cascas das sementes de Azadirachta indica e seus derivados 
sulfatados quimicamente, os quais foram submetidos a testes anticoagulantes, mas 
não apresentaram atividade (HELMY et al., 2007). 
Dentre os compostos anticoagulantes isolados de plantas pode-se citar os 
compostos fenólicos (compostos cumarínicos, flavonóides, taninos), terpenos e 
polissacarídeos (DONG et al., 1998; YOON et al., 2002). Por exemplo, Zheng et al 
em 1998 obtiveram triterpernóides (pertencem à classe dos terpenos) do extrato 
metanólico de Geum japonicum, os quais mostraram significante efeito 
anticoagulante na via extrínseca da coagulação (ZENG et al., 1998). Neste mesmo 
ano, Dong et al. (1998) isolaram sete taninos desta planta, destes um tem um efeito 
inibitório competitivo diretamente contra a trombina, outros quatro tiveram efeito 
inibitório não competitivo com a trombina e os demais não apresentaramatividade 
anticoagulante. 
Dentre os trabalhos realizados que avaliam a atividade anticoagulante de 
espécies vegetais, há apenas um trabalho que demonstra a presença de 
polissacarídeos anticoagulantes em vegetais terrestres (YOON et al., 2002). Estes 
autores avaliaram o potencial anticoagulante de 59 espécies de plantas medicinais e 
INTRODUÇÃO 33 
verificaram que os extratos de Porana volubilis e Litsea cerbeba são potentes 
anticoagulantes pelos testes de APTT e TT. Outros extratos também tiveram uma 
boa atividade pelo teste de APTT, como os de Swietenia macrophylla, Piper 
retrofractum, Abelmoschus moschatus. Além disso, verificaram que os 
polissacarídeos de Areca catechu e Woodfordia floribunda eram potentes inibidores 
da agregação plaquetária induzida por colágeno. O polissacarídeo de Porana 
volubilis foi purificado e verificou-se que sua atividade anticoagulante era mediada 
pelo cofator II da heparina. Viu-se ainda, que este composto, diferente de outros 
polissacarídeos anticoagulantes, não tinha éster de sulfato, no entanto, sua atividade 
biológica exigia a presença de resíduos de ácido galacturônico (YOON et al., 2002). 
Recentemente, Gomes et al. (2009) avaliaram ação anticoagulante de 
polissacarídeos da macrófita aquática Eichhornia crassipes. Para tal E. crassipes foi 
dividida em quatro porções vegetativas (raiz, rizoma, pecíolo e folha), e destas foram 
obtidos macerados ricos em polissacarídeos hidrossolúveis. Os ensaios 
anticoagulantes demonstraram que todos os extratos tiveram a capacidade de 
prolongar o tempo de coagulação no teste de APTT, sendo o extrato da raiz o mais 
potente (GOMES et al., 2009). 
1.5 ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA 
O câncer é uma doença genética, decorrente de um acúmulo de mutações 
que promovem seleção clonal de células com comportamento agressivo como, por 
exemplo, proliferação independente dos controles normais. As células selecionadas 
são conhecidas como células tumorais e apresentam a capacidade de invadir e 
colonizar os tecidos circunvizinhos de seu sítio de origem (FEARON, 1997; 
VIDEIRA, et al., 2002). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (WHO) 
entre os anos de 2005 a 2015 oitenta e quatro milhões de pessoas irão morrer 
acometidos de câncer (WHO, 2010). 
 A proliferação celular normal é regulada diretamente, por mecanismos que 
determinam quando uma célula deve passar o seu ponto de restrição do ciclo 
celular, ou indiretamente, através da regulação de seu caminho à diferenciação final. 
Em ambos os casos os genes reguladores normais podem ser geneticamente 
classificados naqueles cujo produto auxilia no estímulo da proliferação celular e 
naqueles cujo produto possa inibi-la. Correspondentemente, há duas rotas 
mutacionais pelas quais a proliferação celular se torna descontrolada podendo 
INTRODUÇÃO 34 
caracterizar um câncer. A primeira seria aquela na qual um gene “estimulador” 
poderia estar hiperativo e a segunda quando um gene “inibidor” estivesse inativo 
(VIDEIRA et al., 2002). 
O gene normal responsável pela codificação de produtos (oncoproteínas) 
que estimulem a proliferação celular é chamado proto-oncogene. Por sua vez, o 
termo oncogene se refere a um proto-oncogene alterado que ativado codifica 
produtos que super estimulem a proliferação celular. Aquele gene que codifica 
produtos de inibição da proliferação celular é denominado gene supressor de tumor 
ou antioncogene (VIDEIRA et al., 2002). 
Uma característica marcante das células tumorais é a perda da capacidade 
de realização da morte celular. A morte celular é uma estratégia essencial para o 
controle do equilíbrio dinâmico nos sistemas vivos e algumas formas de morte já 
foram identificadas e classificadas em: clássica, sendo elas, apoptose; autofagia; 
cornificação e necrose, enquanto a outra classificação engloba os tipos de morte 
celular que não são tão comuns ocorrendo em circunstâncias e tipos celulares 
específicos, como por exemplo: catástrofe mitótica; excitotoxicidade; degeneração 
Walleriana; piropoptose, entre outras (KROEMER et al., 2007; 2009). No entanto, de 
todas essas formas, duas formas fundamentais de morte celular já são bem 
definidas e estudadas: a necrose e a apoptose (VERMEULEN et al., 2005). 
A necrose é um processo passivo acidental caracterizado pelo aumento do 
volume intracelular, cariólise e lise da célula (COTRAN; HUMAR; COLLINS, 1999; 
KANNAN; JAIN, 2000). Em virtude do envolvimento de elevado número de grupos 
celulares e da perda precoce dos componentes citoplasmáticos para o espaço 
extracelular, a necrose geralmente resulta em resposta inflamatória intensa 
(VANENGELAND et al., 1998; WYLLIE, 1997; WILLINGHAM, 1999). Na figura 8, de 
forma simplificada, pode-se observar como ocorre o processo de necrose. 
Já a apoptose é um complexo processo no qual estímulos intrínsecos e 
extrínsecos ativam um programa molecular para a execução de uma série de 
eventos específicos que culminam em morte celular (ver figura 8) (BOLETI et al., 
2008). Células que estão sofrendo apoptose apresentam mudanças morfológicas 
específicas as quais incluem: formação de bolhas na membrana plasmática, 
condensação do citoplasma e da cromatina, fragmentação nuclear e formação dos 
corpos apoptóticos os quais são posteriormente submetidos à ação dos fagócitos 
(CONRADT, 2009). 
INTRODUÇÃO 35 
 
Figura 8. Esquema representativo de dois processos de morte celular: (a) necrose e (b) 
apoptose. Fonte: http://conhecendoapatologia.blogspot.com/2010/08/apoptose.html 
 
No processo apoptótico, são conhecidas três vias de ativação na apoptose: 
A) Via extrínseca, mediada pela interação ligante–receptor. Os receptores de 
membrana plasmática que desencadeiam sinalização para apoptose pertencem à 
superfamília de receptores do Fator de Necrose Tumoral (TNF), incluindo Fas, TNF-
R1, DR3, TRAIL-R1, TRAIL-R2 e DR6. Uma vez unidos aos seus ligantes, estes 
receptores são trimerizados e recrutam proteínas adaptadoras ao domínio de morte 
citosólico (DD). Subseqüentemente, as proteínas ativam a caspase-8 e/ou 10 
formando o complexo DISC, onde as caspases efetoras são ativadas 
(principalmente caspase-3) (KROEMER, 2007; VERMEULEN, 2005). B) Via 
intrínseca, mediada pela via mitocondrial. A liberação de proteínas pró-apoptóticas 
normalmente localizadas no espaço intermembranar da mitocôndria, caracterizam 
esta via. A liberação destas proteínas se dá pela permeabilização da membrana 
externa mitocondrial, principalmente, via componentes da família de proteínas Bcl-2, 
a qual contém membros antiapoptóticos (proteínas Bcl-2 e Bcl-XL) e proteínas pró-
apoptóticas (Bax, Bid e Bak). Quando o citocromo c é liberado no citosol é 
desencadeada uma via apoptótica dependente de caspase, onde o citocromo c ativa 
Apaf-1 e, por sua vez, na presença de ATP, liga-se à procaspase-9, formando o 
apoptosoma. Após esta associação, a caspase-9 ativa as caspases-3-6 e -7, 
permitindo a fragmentação de DNA. No entanto, quando a proteína AIF (fator indutor 
de apoptose) é liberada no citosol, uma via de morte celular por apoptose 
independente de caspase é ativada, uma vez que AIF transloca-se para o núcleo 
INTRODUÇÃO 36 
onde induz fragmentação de DNA e condensação de cromatina (BROKER, 2005; 
KROEMER, 2007). C) A terceira via envolve estresse causado no Retículo 
Endoplasmático (RE). Embora pouco conhecida, acredita-se que a apoptose 
induzida pelo estresse do RE envolve diferentes mecanismos, incluindo a ativação 
direta de caspases (caspases 12 e 4), quinases(JNK e p-38-MAPK e de fatores de 
transcrição mediadores da apoptose (CHOP) (KADOWAKI; NISHITOH; ICHIJO, 
2004; MOMMOI, 2004). 
1.5.1 Efeitos antiproliferativos de extratos e comp ostos obtidos de plantas 
Por ser uma das principais causas de morte em todos os países, grande é a 
busca pela identificação de novas substâncias que sejam realmente efetivas contra 
o câncer. Além disso, com o incentivo de que quimioterápicos largamente utilizados 
foram obtidos de espécies vegetais (como por exemplo, vincristina e vimblastina são 
alcalóides obtidos de Catharanthus roseus), e que estes fármacos causam muitos 
efeitos colaterais aos pacientes, grande é a busca por compostos naturais com 
efeito anticâncer obtidos a partir de plantas (ER et al., 2007) . 
Diversos são os extratos obtidos para se avaliar a ação antiproliferativa, quer 
aquoso, etanólico, metanólico, hexânico ou clorofórmico, entre outros. Além disso, 
esses extratos são obtidos das diferentes porções vegetativas das plantas: folha, 
raiz, caule e flor (DEMARCHI, 2007). 
Em 2004 Shu-Jing Wu e colaboradores obtiveram extrato etanólico da 
espécie Physalis peruviana L e demostraram que este extrato apresenta atividade 
anti-hepatoma, uma vez que induz apoptose em um carcinoma hepatocelular 
humano, Hep G2 (SHU-JING WU et al., 2004). A fim de isolar compostos bioativos 
presentes em Physalis peruviana L, Ching-Yu Yen e colaboradores, em 2010, 
obtiveram o composto 4β-Hydroxywithanolide E a partir do extrato etanólico das 
partes aéreas desta planta. Neste estudo foi demonstrado que o composto obtido foi 
capaz de induzir danos no DNA e inibir a proliferação da linhagem tumoral de 
pulmão H1299 (CHING-YU YEN et al., 2010). 
Em 2009, Rejiya, Cibin e Abraham avaliaram o extrato metanólico obtido das 
folhas de Cassia tora frente à linhagem tumoral HeLa. Eles sugerem que as folhas 
da espécie apresentam potencial para ser uma nova terapia contra o câncer, pois 
pelo ensaio do MTT o extrato metanólico inibiu a proliferação e induziu fragmentação 
INTRODUÇÃO 37 
do DNA das células HeLa. Além disso, foi observada atividade aumentada de 
caspase-3 avaliada por kit colorimétrico (REJIVA; CIBIN; ABRAHAM, 2009). 
Também em 2009 Mesquita e colaboradores realizaram um estudo com 
extratos de 50 espécies de plantas do Cerrado brasileiro utilizando vários solventes. 
Dos 412 extratos testados, 28 apresentaram efeito antiproliferativo, inibindo 85% da 
proliferação das células tumorais MDA-MB-435, HCT-8, SF-295 e HL-60 na 
concentração de 50 µg/mL. Dentre os 28 extratos que apresentaram efeito frente às 
linhagens tumorais, os extratos hexânicos das folhas, tronco e raiz de Casearia 
sylvestris e raiz de Simarouba versicolor; bem como o extrato etanólico da raiz de 
Simarouba versicolor, mostraram-se mais citotóxicos frente às linhagens tumorais 
testadas (MESQUITA et al., 2009). 
Com relação ao gênero Marsdenia poucos estudos nas diversas áreas foram 
encontrados, porém se destacam estudos farmacológicos com extratos e compostos 
extraídos de espécies desse gênero. Contudo, quando se busca dados da espécie 
Marsdenia megalantha, que é uma espécie endêmica da caatinga, não se encontra 
nenhum estudo de suas propriedades farmacológicas. 
Tendo em vista os trabalhos mostrando o potencial farmacológico em 
extratos de espécies do gênero Marsdenia, aliados à escassez de trabalhos com 
Marsdenia megalantha, uma espécie com ampla distribuição na região Seridó, faz-
se necessário um estudo farmacológico com essa planta, para avaliar quais 
atividades desempenhadas pelos compostos presentes na mesma. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
OBJETIVOS 38 
2. OBJETIVOS 
 
Principal 
 
• Avaliar as atividades antioxidante, anticoagulante e antiproliferativa dos 
extratos aquosos de caule, folha e raiz de Marsdenia megalantha; 
 
Específicos 
 
• Obter os extratos aquosos de caule, folha e raiz de M. megalantha; 
 
• Avaliar o potencial antioxidante dos extratos obtidos utilizando os seguintes 
testes: Capacidade antioxidante total (CAT), Sequestro de radical hidroxila, 
Sequestro de radical superóxido, Poder redutor e Quelação férrica; 
 
• Avaliar o potencial anticoagulante dos extratos através dos ensaios de tempo 
de protrombina (PT) e de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT); 
 
• Avaliar a capacidade dos extratos em influenciar a proliferação de células 
tumorais através do ensaio de MTT, selecionando aquele (s) extrato (s) com melhor 
potencial antiproliferativo e analisar o processo de morte celular através de 
citometria de fluxo e western blot. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MATERIAIS E MÉTODOS 39 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
3.1 MATERIAIS 
3.1.1 Material Biológico 
FILO: Magnoliophyta 
 CLASSE : Magnoliopsida 
 ORDEM: Gentianales 
 FAMÍLIA : Apocynaceae 
 GÊNERO: Marsdenia 
 ESPÉCIE: Marsdenia megalantha GOYDER & MORILLO(Figura 9) 
 
Figura 9. Marsdenia megalantha. Fonte: Goyder;Morillo, 1994. 
A planta Marsdenia megalantha foi utilizada como objeto de estudo deste 
trabalho. Os espécimes foram coletados em abril de 2008 no município de Caicó/RN 
(S 6º 30` W 37º 05`), sendo em seguida acondicionados em sacos de polietileno e 
levados no mesmo dia da coleta ao BIOPOL (Laboratório de Biotecnologia de 
Polímeros Naturais), Departamento de Bioquímica da UFRN, onde foram lavados em 
água corrente para a retirada de possíveis contaminantes. Um exemplar de M. 
megalantha foi identificado pelo professor Dr. Alessandro Rapini da Universidade 
Estadual de Feira de Santana (UEFS) e outro exemplar foi depositado no Herbário 
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (N° UFRN 9361). 
MATERIAIS E MÉTODOS 40 
3.1.2 Linhagens tumorais e cultura das células 
As linhagens tumorais humanas do cólon do útero (HeLa) e de pâncreas 
(PANC-1) foram mantidas em meio DMEM; já as linhagens tumorais humanas de 
próstata (PC-3), de leucemia promielocítica (HL-60), e renal (786-0) foram mantidas 
em meio RPMI 1640. Todas as células foram cultivadas a 37 °C em uma incubadora 
umidificada na presença de 5% CO2, com os respectivos meios suplementados com 
10% de soro fetal bovino (SFB) e penicilina/estreptomicina (10000 U e 10 mg para 
cada litro de meio, respectivamente). Todas as células foram obtidas da American 
Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). 
3.1.3 Outros materiais 
• Ácido sulfúrico, álcool etílico, álcool metílico, coomasie brilliant blue R 250, 
fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico, glicina, hidróxido de 
sódio, peróxido de hidrogênio e sulfato de ferro heptahidratado da CRQ 
(Diadema, SP, Brasil); 
• Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) da VETEC (Duque de Caxias, RJ, 
Brasil); 
• Ácido clorídrico e metionina da Synth (Diadema, SP, Brasil); 
• Ácido gálico da CAQ Casa da Química Ind. e Com. (Diadema, SP, Brasil); 
• Ácido ascórbico, ferrozina, nitroblue tetrazolium (NBT) e riboflavina da Sigma-
Aldrich Brasil (São Paulo, SP, Brasil); 
• Cloreto de ferro, reagente de Folin-Ciocalteau e inibidor geral de caspases (Z-
VAD-FMK) da Merck (Darmstadt, Alemanha); 
• Fenol e molibdato de amônio da Reagen Quimibrás Indústrias Químicas S.A. 
(Rio de Janeiro, RJ, Brasil); 
• Kit de tempo de tromboplastina parcial ativada e Kit de tempo protrombina da 
Labtest (Lagoa Santa, MG, Brasil); 
• Reagente de Bradford da Bio-Rad (NY, EUA) 
• Anticorpos policlonais produzidos em coelho (Bax e Bcl-2), anticorpo 
monoclonal produzido em coelho (caspase-3 clivada) e anticorpo secundárioconjugado com peroxidase produzido em cabra anti-coelho foram obtidos da 
Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). O anticorpo monoclonal 
produzido em camundongo (AIF) e anticorpo secundário conjugado com 
MATERIAIS E MÉTODOS 41 
peroxidase obtido de cabra anti-camundongo foram obtidos da Santa Cruz 
Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); 
• DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) e RPMI 1640 da Cultilab 
(Campinas, SP, Brasil); 
• DAPI (4´,6´-diamidino-2-phenylindole) da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA); 
• Membrana de PVDF da Millipore Corp. (Bedford, MA, USA). 
• Anexina V-FITC e Iodeto de propídio (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) 
Todos os demais materiais e reagentes utilizados foram da melhor qualidade 
disponível. 
3.1.4 Aparelhos 
Além dos aparelhos usuais do laboratório pode-se destacar: 
• Agitador orbital modelo 255-B, banhos-maria e estufas de temperatura 
constante da FANEM Ltda. (São Paulo, SP, Brasil); 
• Balanças analítica e de precisão da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil); 
• Bomba de Vácuo da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil); 
• Centrífuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltda (Tóquio, Japão); 
• Coagulômetro da Drake (SãoPaulo, SP, Brasil); 
• Destilador de água MA-270 da Marconi Ltda (Piracicaba, SP, Brasil); 
• Espectrofotômetro da FEMTO Ltda (São Paulo, SP, Brasil); 
• Fontes de corrente contínua da BioAgency Biotecnologia Ltda. (São Paulo, 
SP, Brasil); 
• Medidor de pH da PHS-3B da PHTEK (Japão); 
• Purificador de água Milli-Q® Water System da Millipore Corp. (Bedford, MA, 
USA); 
• PowerPacTM Power Supply; MiniPROTEAN® Tetra Caell; Mini Trans-blot Cell 
®, da BIO-RAD (São Paulo, SP, Brasil); 
• Bancada de Fluxo Laminar Pachane Pa300 (Piracicaba, SP, Brasil); 
• Incubadora Thermoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model 
3110 (USA); 
• Microscópio NIKON CFI60, Spectrum – Spectrum Bioengenharia médica 
hospitalar LTDA (São Paulo, SP, Brasil); 
RESULTADOS 50 
4. RESULTADOS 
4.1. DETERMINAÇÃO DOS COMPONENTES DOS EXTRATOS AQUOSOS DE M. 
megalantha 
Os extratos aquosos do caule, folha e raiz de Marsdenia megalantha foram 
submetidos às análises químicas para determinação do conteúdo de proteínas, 
açúcares e fenólicos totais como mostrado na tabela 1. Extrato aquoso da folha 
(EAF) e extrato aquoso da raiz (EAR) apresentaram os menores teores de açúcares 
totais (27,53% e 28,16%, respectivamente), enquanto EAC apresentou o maior 
conteúdo de açúcares (47,45%). Com relação à presença de compostos fenólicos, 
EAF apresentou o maior conteúdo (37,01 equivalentes de ácido gálico), enquanto 
EAC e EAR apresentaram, respectivamente, 15,23 e 11,53 equivalentes de ácido 
gálico. Em todos os extratos, nas condições testadas, não foi detectada quantidades 
significativas (<0,1%) de proteínas. 
 
Tabela 1. Composição química dos extratos aquosos d o caule, folha e raiz de 
M. megalantha. 
Extratos 
aquosos 
Proteína 
(%) 
Açúcares 
totais (%) 
Fenólicos totais 
(EAG)a 
Caule < 0,1 47,45 ± 0,04a 15,23 ± 0,07 a 
Folha < 0,1 27,53 ± 0,02 b 37,01 ± 0,03 b 
Raiz < 0,1 28,16 ± 0,01 c 11,53 ± 0,05 c 
 
aO conteúdo de fenólicos totais é expresso como equivalentes de ácido gálico (EAG). Os valores são 
expressos como a média ± desvio padrão (n=3). a,b Letras distintas indicam diferença significativa 
(p<0,05) entre os extratos. 
4.2. ATIVIDADES BIOLÓGICAS DOS EXTRATOS AQUOSOS DE M. megalantha 
4.2.1. Atividade antioxidante in vitro 
A atividade antioxidante in vitro dos extratos aquosos foi avaliada por 
diferentes ensaios: capacidade antioxidante total (CAT), poder redutor, quelação 
férrica, sequestro do radical hidroxila e sequestro do radical superóxido. 
No teste de CAT todos os extratos apresentaram atividade detectável (figura 
10). A atividade de EAF foi significativamente maior (p < 0,05) do que a atividade 
dos demais extratos, sendo possível se detectar cerca 141 equivalentes de ácido 
ascórbico. Já as atividades de EAC e EAR foram de 76 e 57 equivalentes de ácido 
RESULTADOS 51 
ascórbico, respectivamente, não havendo diferenças significativas entre os mesmos. 
A correlação realizada entre compostos fenólicos e o CAT mostrou um coeficiente 
de 0,9966, enquanto para açúcares totais este coeficiente foi de -0,3279. 
 
Figura 10. Capacidade antioxidante total dos extrat os aquosos do caule, folha e raiz de M. 
megalantha. Os resultados são expressos como equivalentes de ácido ascórbico. Os valores são 
expressos como a média ± desvio padrão (n=3). a,b Letras distintas indicam diferença significativa (p < 
0,05) entre os extratos. 
O ensaio de poder redutor dos extratos aquosos do caule, folha e raiz de M. 
megalantha foi avaliado através do monitoramento da formação do azul de prussian. 
Na figura 11 observa-se que todos os extratos aquosos de M. megalantha 
apresentaram poder redutor. Pode-se observar também que esta atividade se 
mostrou dose-dependente, se estabilizando a uma concentração em torno de 1,500 
mg/mL (Raiz e caule). Já com relação ao EAF, os valores obtidos com este extrato 
não se estabilizaram. Porém há fortes indícios de que estes chegariam a uma região 
de platô. Novamente, os melhores resultados foram obtidos com EAF. Contudo, 
quando se compara os dados obtidos com os extratos de folha e de caule, esta 
diferença foi menos pronunciada do que no teste de CAT. Para o ensaio de poder 
redutor não foi detectada correlação entre compostos fenólicos ou açúcares totais. 
RESULTADOS 52 
 
Figura 11. Ensaio do poder redutor dos extratos aqu osos de diferentes partes de M. 
megalantha. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). a,b,c Letras distintas 
indicam diferença significativa (p<0,05) entre as concentrações de um mesmo extrato; x, y, z Letras 
distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre a mesma concentração de cada extrato. 
Não foi possível detectar atividade seqüestradora de radicais hidroxilas nos 
extratos aquosos obtidos da Marsdenia megalantha até a concentração máxima 
testada (1,0 mg/mL). 
Quando os extratos foram avaliados quanto a sua capacidade de seqüestrar 
radicais superóxido, observou-se um efeito crescente de forma dose-dependente. 
Mais uma vez destacou-se EAF, sendo capaz de sequestrar cerca de 80% dos 
radicais existentes, a uma concentração de 0,8 mg/mL (Tabela 2). Este resultado foi 
bastante interessante, uma vez que quando se utilizou o ácido gálico, antioxidante 
utilizado como controle positivo nesse teste, observou-se que sua capacidade em 
sequestrar o radical superóxido estava em torno de 85% nesta mesma 
concentração. A capacidade em sequestrar estes radicais não foi observada para 
EAR até a máxima concentração testada (1,0 mg/mL). Já para EAC esta atividade 
só começou a ser observada a partir da concentração de 0,8 mg/mL. A análise dos 
valores obtidos indica que este extrato apresentou cerca de 35% de atividade 
seqüestradora, na máxima concentração testada (1,0 mg/mL), que foi 
aproximadamente 2,4 vezes menor que aquela observada com o ácido gálico na 
mesma concentração. O coeficiente de correlação entre compostos fenólicos e 
RESULTADOS 53 
atividade seqüestradora foi expressivo (r = 0,9502), ao contrário do observado para 
a relação entre açúcares totais e esta atividade antioxidante (r = -0,0997). 
Tabela 2. Atividade sequestradora do anion superóxi do dos extratos aquosos 
do caule, folha e raiz de M. megalantha. 
Extratos 
aquosos 
Concentração(mg/mL) 
Sequestro 
(%) 
Caule 
0,1 nd 
0,2 nd 
0,4 nd 
0,6 nd 
0,8 10,93±1,64a,x 
1,0 35,03±2,33b,x 
 
Folha 
0,1 8,82±1,73a,x 
0,2 13,51±1,07b,x 
0,4 37,02±2,16c,x 
0,6 66,77±1,55d,x 
0,8 79,31±1,38e,y 
1,0 80,76±1,26e,y 
 
Raiz 
0,1 nd 
0,2 nd 
0,4 nd 
0,6 nd 
0,8 nd 
1,0 nd 
 
Ácido gálico 
0,1 15,26 ± 1,73a,y 
0,2 37,15 ± 0,89b,y 
0,4 58,50 ± 0,44c,y 
0,6 82,24 ± 1,01d,y 
0,8 85,68 ± 1,43d,z 
1,0 84,86 ± 1,70d,z 
Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).a,b,c Letras distintas indicam diferença 
significativa (p < 0,05) entre os extratos; x, y, z Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) 
entre a mesma concentração de cada extrato. nd: não detectado. 
Na figura 12 ilustra-se a atividade de quelação férrica dos extratos aquosos 
de Marsdenia megalantha. A análise dos resultados revelou que EAC e EAF 
apresentam um comportamento dose-dependente similar, e a atividade máxima (em 
torno de 42%) foi detectada na concentração de 1,0 mg/mL. Entretanto, quando se 
analisa os dados de quelação obtidos com concentrações entre 0,05 a 0,5 mg/mL 
verifica-se que os valores obtidos com EAF foram significativamente maiores do que 
RESULTADOS 54 
aqueles obtidos com EAC. Já os valores obtidos com EAR não excederam 17,6% de 
quelação mesmo na maior concentração testada (2,0 mg/mL). O coeficiente de 
correlação mais uma vez foi determinado e observou-se baixa correlação entre 
compostos fenólicos ou açúcares totais e a capacidade quelante das amostras (r = 
0,5904 para compostos fenólicos e r = 0,4991 para açúcares totais). 
 
Figura 12. Quelação férrica dos extratos aquosos do caule, fol ha e raiz de M. 
megalantha. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). a,b,c Letras distintas 
indicam diferença significativa (p<0,05) entre as concentrações de um mesmo extrato; x, y, z Letras 
distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre a mesma concentração de cada extrato. 
 
4.2.2 Atividade anticoagulante dos extratos do caul e, folha e raiz de M. 
megalantha 
Os extratos de M. megalantha não apresentaram atividade anticoagulante 
detectável nas condições testadas (0,05 a 2,0 mg/mL) quer para o teste de PT ou 
aPTT. 
4.2.3 Atividade antiproliferativa dos extratos aquo sos do caule, folha e raiz de 
M. megalantha 
Para avaliação do potencial antiproliferativo dos extratos aquosos de M. 
megalantha escolheu-se uma linhagem tumoral da região cervical de útero humano 
(HeLa). Pode-se observar na figura 13 que as células apresentaram uma diminuição 
da proliferação celular na presença das várias concentrações dos extratos, e que na 
RESULTADOS 55 
presença de EAC e EAF esta diminuição se deu de forma dose-dependente. Dentre 
os extratos, EAF foi o mais ativo, podendo-se observar que ele inibiu a proliferação 
da linhagem HeLa em 80% na concentração de 1,0 mg/mL. Além disso, na 
concentração de 0,50 mg/mL EAF já alcança inibição na proliferação em 54%. 
Observou-se comportamento semelhante quando se testou a atividade de EAC 
frente à mesma linhagem celular. Contudo, a atividade antiproliferativa detectada foi 
menor, chegando a valores em torno de 63% na máxima concentração testada (1,00 
mg/mL). EAR não ultrapassou 25% de inibição da proliferação celular até a máxima 
concentração testada (1,00 mg/mL). A atividade antiproliferativa apresentou alta 
correlação com a quantidade de compostos fenólicos presentes nos extratos (r = 
0,8410), e baixa correlação com a quantidade de açúcares totais (r = 0,1543). 
 
Figura 13. Atividade antiproliferativa dos extratos aquosos do caule, folha e raiz de M. 
megalantha frente à linhagem tumoral HeLa . Os valores são expressos como a média ± desvio 
padrão (n=3).a,b,c Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre as concentrações de 
um mesmo extrato; x, y, z Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre a mesma 
concentração de cada extrato. 
4.2.4 Atividade antiproliferativa do extrato aquoso da folha de M. megalantha 
frente a outras linhagens celulares tumorais. 
Levando-se em consideração a capacidade antiproliferativa que EAF 
mostrou frente à linhagem tumoral HeLa, foram realizados ensaios antiproliferativos 
frente a outras linhagens celulares tumorais humanas, tais como: PC-3, PANC-1, 
HL-60 e 786-0. Na figura 14, pode-se observar que as células tumorais mostraram-
RESULTADOS 56 
se sensíveis ao EAF de forma dose-dependente. Entretanto, cada linhagem tumoral 
apresentou uma sensibilidade diferente ao extrato. 
Dentre as células testadas, a linhagem HL-60 foi a mais sensível ao EAF. O 
extrato foi capaz de inibir cerca de 60% da proliferação desta linhagem celular na 
concentração de 1,0 mg/mL, enquanto que para as demais linhagens este 
percentual não ultrapassou 50% de inibição até a máxima concentração testada (1,0 
mg/mL). No entanto, vale salientar um fato interessante. Quando se utilizou baixas 
concentrações de EAF, as demais linhagens celulares avaliadas apresentaram uma 
maior sensibilidade a este extrato do que a HL-60. Por exemplo, EAF conseguiu 
inibir em torno de 35% a proliferação das linhagens 786-0 e PANC-1 e em 22% a 
proliferação de PC-3, utilizando-se a concentração de 0,25 mg/mL, enquanto que 
nessa mesma concentração, a proliferação de HL-60 foi comprometida em apenas 
19%. 
Apesar dos dados obtidos com estas linhagens tumorais terem sido 
interessantes, vale lembrar que EAF quando testado frente à linhagem tumoral HeLa 
(ver figura 13), inibiu em 80% a proliferação desta linhagem na máxima 
concentração testada de 1,0 mg/mL. Sendo assim, esta linhagem celular foi 
escolhida para realização dos experimentos subseqüentes e para tais utilizou-se a 
concentração do IC50 (0,50 mg/mL). 
 
Figura 14. Atividade antiproliferativa do extrato aquoso da fo lha de M. megalantha frente a 
quatro linhagens celulares tumorais . Os valores são expressos como a média ± desvio padrão 
(n=3). a,b,c Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre os tipos celular x, y, z Letras 
distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre a mesma concentração de cada linhagem 
celular. 
 
RESULTADOS 57 
4.2.5 Análises morfológicas das células HeLa na pre sença do extrato aquoso 
da folha de M. megalantha 
 As células da linhagem HeLa foram plaqueadas sobre lamínulas de vidro e 
estimuladas a se proliferarem na ausência (controle) ou presença de 0,50 mg/mL de 
EAF, sendo mantidas nessas condições por 24 horas. Após este período, as células 
foram fotografadas em microscópio de luz e processadas para serem preparadas 
para a visualização em microscopia eletrônica de varredura. 
O aspecto das células HeLa (sem a presença de EAF) avaliado por 
microscopia óptica pode ser observado na figura 15A. As células se apresentaram 
com morfologia fusiforme e totalmente aderidas ao substrato. Em contraste, as 
células tratadas com EAF apresentaram uma redução da adesividade celular e, 
morfologicamente, passaram a apresentar um aspecto arredondado e aparente 
redução do volume celular, dando indícios de que estariam entrando em morte 
celular (figura 15B). 
 
 
Figura 15. Microfotografias das células HeLa visual izadas em microscópio de contraste de 
fase. As fotos foram obtidas após 24h de exposição continua ao EAF. A – Células HeLa controle. 
Ampliação de 4x. No canto superior direito, ampliação de 20x. B – Células Hela tratadas com EAF 
(0,50 mg/mL). Ampliação de 4x. No canto superior direito, ampliação de 20x 
 
Na Figura