Tese_RIBEIROARC_13 12 2019_COMPLETA

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS 
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA 
 
 
 
ANA RAQUEL CARNEIRO RIBEIRO 
 
 
 
 
PROSPECÇÃO QUÍMICA E DE ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E 
ANTIPROLIFERATIVA DOS EXTRATOS DE Myrciaria tenella 
(DC.) O. Berg (Myrtaceae) E Salvia hispanica L. (Lamiaceae) 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL/RN 
2019 
 
 
 
 
ANA RAQUEL CARNEIRO RIBEIRO 
 
 
 
 
 
 
 
PROSPECÇÃO QUÍMICA E DE ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E 
ANTIPROLIFERATIVA DOS EXTRATOS DE Myrciaria tenella 
(DC.) O. Berg (Myrtaceae) E Salvia hispanica L. (Lamiaceae) 
 
 
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Bioquímica da Universidade 
Federal do Rio Grande do Norte como 
requisito parcial para obtenção do título de 
Doutora em Bioquímica. 
Orientadora: Katia Castanho Scortecci 
Co-Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira 
Rocha. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL/RN 
2019 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico esta obra 
 
 
A minha querida irmã Esther, companheira de todas as horas, que estava comigo no início 
desta jornada e continua a torcer por minha vitória. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMENTOS 
 
 
 
À professora Katia Castanho Scortecci, por ter aceitado me orientar e me proporcionado o 
suporte e apoio como orientadora. 
 
 
Aos professores do DBQ por todos os conhecimentos transmitidos durante o curso. 
 
 
À CAPES pela bolsa concedida, pela qual foi possível me manter em Natal durante o período 
do curso. 
 
 
Aos professores que cederam seus laboratórios, reagentes, equipamentos, tempo e suporte 
para que este trabalho fosse realizado: Prof. Hugo, Prof. Cícero, Profa. Riva e Profa. Silvana; 
 
 
Aos colegas do Grupo de Plantas, pela troca de conhecimentos e amizade: Luciana, Verônica, 
Kellya, Ana Karina, Renata, Raquel, Nayanne, Géssica e Nathália. 
 
 
À Sara, que me ajudou na minha chegada a Natal e ao laboratório. À Tatiana que foi uma 
grande amiga e companheira. 
 
 
À Maria Lúcia, minha companheira de batalha no laboratório, por me incentivar a continuar, 
quando minhas forças haviam se acabado. 
 
 
Aos colegas do LGB, Cézar e Ricardo, por me acolherem no laboratório nos ensaios com C. 
elegans; 
 
 
À Larissa, que me ajudou com a fitoquímica, tanto no laboratório quanto na escrita dos 
artigos; 
 
 
Aos colegas do BIOPOL, Moacir, Thiago e Marília, pela ajuda com os ensaios antioxidantes e 
com células; 
 
 
Aos irmãos da Congregação Presbiteriana do Planalto, que me acolheram e sempre oraram 
por mim “Muito pode por sua eficácia a súplica do justo (Tiago 5:16) ”: Às crianças, que vem 
voluntariamente à igreja e alegram meus dias, Pastor Jailson, Irmã Marta, Irmã Leila, Ivone, 
Irmão Cesário, Denis, Samuel, Nadjara, Bia, Mateus, Matson e todos os demais congregados 
que certamente estão comigo em oração. 
 
 
 
 
 
Aos irmãos da Igreja Batista Shekinhah, onde congreguei durante três anos, que me 
acolheram na minha chegada a Natal e estão orando por mim: Pastor Valmir, Irmã Simone, 
Rannier, Hadassa, Joyce Jordana, Irmã Miriã e Irmã Palmira; 
 
 
Às minhas amigas de infância, Sherla e Elisandra, pelo apoio e amizade de sempre; 
 
 
Ao professor Ernani, meu primeiro orientador, na época da graduação da UECE, por me fazer 
acreditar que era possível. ESSA VITÓRIA É NOSSA! 
 
 
Aos colegas tutores que trabalharam comigo na EAD IFPB (Campus Patos) por acreditarem 
em mim, quando eu não acreditava mais: Júnior, Mariana, Bárbara e Verônica, que me 
ouviam nos momentos difíceis e me proporcionaram boas risadas, além do apoio para 
conseguir um emprego... OBRIGADA. Luana, Potiguar de Ouro Branco, que me enviou o 
link do PPG-Bioquímica da UFRN, serei eternamente grata. 
 
 
Ao Adriano, um presente de Deus na minha vida, TE AMO. 
 
 
À Dona Salete, minha sogra, agora minha família aqui em Natal; 
 
 
À família Ribeiro, por torcer sempre por mim e se orgulhar por cada conquista, não só minha, 
mas de todos aqueles que optaram pelo caminho do estudo. Família liderada por um vaqueiro, 
Vô Plínio (In memoriam) que acreditava que a educação era a forma de conseguir uma vida 
melhor. 
 
 
À família Carneiro, meu Vôzinho Raimundo (In memoriam) que está com Jesus, mas sabia 
que eu ia conseguir. Vovó Raimunda, que sempre acreditou em mim e me apoiou nos 
momentos mais difíceis. Tia Lindáuria, com seu bom humor e otimismo sempre, me ajudou 
na passagem mestrado-doutorado. Tia Lídia, Tia Nenê, Tia Nova e a todos os demais tios e 
primos que torceram por mim. 
 
 
Aos meus Pais, Hildebrando e Lindaci, por me apoiarem nas minhas decisões e me darem a 
segurança de uma família. 
 
 
À minha irmã Esther, companheirinha de sempre. Torceu por mim desde o início, sempre 
disposta a me ouvir, nos momentos em que eu precisava desabafar. 
 
 
À Deus pela vida, saúde e por ter colocado todas essas pessoas maravilhosas no meu caminho. 
 
 
MUITO OBRIGADA! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Quando o Senhor restaurou a sorte de Sião, ficamos como quem sonha. 
Então, a nossa boca se encheu de riso, e a nossa língua, de júbilo; então, entre as nações se 
dizia: Grandes coisas o Senhor tem feito por eles. 
Com efeito, grandes coisas fez o Senhor por nós; por isso, estamos alegres. 
Restaura, Senhor, a nossa sorte, como as torrentes no Neguebe. 
Os que com lágrimas semeiam com júbilo ceifarão. 
Quem sai andando e chorando, enquanto semeia, voltará com júbilo, trazendo os seus 
feixes”. 
 
Salmos 126:1-6 
 
 
 
 
 
 
 
 
PROSPECÇÃO QUÍMICA E DE ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E 
ANTIPROLIFERATIVA DOS EXTRATOS DE Myrciaria tenella (DC.) O. Berg 
(Myrtaceae) E Salvia hispanica L. (Lamiaceae) 
 
 
Considerando a importância das plantas como fonte de biomoléculas com ação medicinal, o 
objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antioxidante e antiproliferativa do cambuí 
(Myrciaria tenella (DC.) O. Berg) e chia (Salvia hispanica L.). A partir de suas folhas frescas, 
foi conduzida uma extração seriada (com diferentes solventes em ordem crescente de 
polaridade, partindo de um mesmo material vegetal) mediante maceração a frio durante 24 
horas, para a obtenção dos extratos hexânicos (EHC e EHSh); clorofórmicos (ECC e ECSh); 
etanólicos (EEC e EESh); metanólicos (EMC e EMSh) e aquosos finais (EAFC e EAFSh) a 
partir de suas folhas frescas do Cambuí (C) e Chia (Sh). Partindo de outro pool de folhas, foi 
preparado um extrato aquoso (EAC e EASh), separadamente. Esses extratos foram 
caracterizados fitoquimicamente por ensaios espectrofotométricos para quantificação de 
açúcares, proteínas e compostos fenólicos totais, bem como cromatografia em camada 
delgada (CCD) e cromatografia líquida de ultra-eficiência (UHPLC) com detector de arranjo 
de diodos (SPD-M20A). A atividade antioxidante foi mensurada por meio de diferentes 
ensaios in vitro e in vivo, sobre o modelo Caenorhabditis elegans. A atividade 
antiproliferativa foi avaliada em diferentes linhagens celulares, 3T3, HeLa e AGS. Como 
resultados, foram verificados predominantemente compostos fenólicos nos extratos polares de 
M. tenella (EEC, EMC, EAFC), sendo possível a identificação da rutina em EEC e EMC. 
Contudo nos extratos apolares (EHC e ECC) foram identificados terpenos, dentre eles o ácido 
ursólico. Os extratos foram capazes de sequestrar espécies reativas e quelar ferro e cobre (in 
vitro) desde a menor concentração avaliada, 100 µg/mL. Além disso, EEC a 1 e 10 mg/mL 
reduziu o teor de ERO em C. elegans em até 74%, quando comparado ao controle não tratado 
com o extrato. Para as culturas de células, foi observado que os extratos de M. tenella a 100, 
250 e 500 µg/mL não alteraram a viabilidade para a linhagem celular 3T3, entretanto para as 
linhagens HeLa e AGS foi observado uma redução em até82,61% e 84,68%, 
respectivamente. Para a linhagem AGS esta redução pode ser correlacionada com os 
mecanismos de necrose (80,7%) e apoptose tardia (16,5%). Para a chia (S. hispanica), outra 
espécie estudada, o perfil fitoquímico foi semelhante, sendo identificada a presença de 
terpenos em EHSh e ECSh, dentre eles o ácido ursólico. Além disso, foi verificada a presença 
de compostos fenólicos em todos os extratos. Os extratos a 100, 500 e 1000 µg/mL foram 
capazes de doar elétrons ao substrato oxidado e quelar metais de transição (ferro e cobre) in 
vitro. Enquanto que, in vivo, o pré-tratamento de C. elegans com EASh a 1 e 10 mg/mL 
reduziu para 29,76% os níveis basais de ERO. Assim, S. hispanica foi capaz de reduzir em até 
82,62% e 66,5% a viabilidade das linhagens celulares HeLa e AGS, mas não da linhagem de 
células 3T3 (não tumorais). Para a linhagem HeLa o mecanismo de morte envolvido foi de 
necrose (19,6%), enquanto para a linhagem AGS foi de apoptose inicial (8,09%) e tardia 
(7,16%). Em suma, as folhas de M. tenella e S. hispanica podem ser consideradas como uma 
fonte de compostos com atividade antioxidante e antiproliferativa, sendo assim promissoras 
para a identificação de biomoléculas com o interesse farmacológico. 
 
Palavras-chave: Plantas medicinais, compostos fenólicos, flavonoides, radicais livres, 
Caenorhabditis elegans, atividade antiproliferativa. 
 
 
 
CHEMICAL PROSPECTION, ANTIOXIDANT AND ANTIPROLIFERATIVE 
ACTIVITIES FROM EXTRACTS OBTAINED FROM Myrciaria tenella (DC.) O. Berg 
(Myrtaceae) AND Salvia hispanica L. (Lamiaceae) 
 
 
Considering the importance of plants as a source of biomolecules with medicinal action, the 
objective of this work was to evaluate the antioxidant and antiproliferative activity of cambuí 
(Myrciaria tenella (DC.) O.Berg) and chia (Salvia hispanica L.) extracts. It was obtained 
extract using fresh leaves and a serial extraction approach using apolar to polar solvent. Then, 
it was obtain the following extracts: hexane extract (EHC and EHSh); chloroform (ECC and 
ECSh); ethanolic (EEC and EESh); methanolic (EMC and EMSh) and final aqueous (EAFC 
and EAFSh). Furthermore, it was also made an aqueous extract (EAC and EASh). These 
extracts were phytochemically characterized by measuring sugar, protein and total phenol. It 
was also analyzed by TLC and UHPLC. The antioxidant activity was measured using 
different in vitro assays (CAT, reducing power, iron and copper chelation, hydroxyl, 
superoxide and DPPH) and in vivo assays (ROS, SOD-3 expression and survival under stress 
conditions). Moreover, the toxicity from these extract were also analyzed using cell culture 
and the Caenorhabditis elegans model. In relation to cell lines it was measured the MTT 
reduction on murine fibroblasts (3T3), the human cervical cancer cells (HeLa) and the gastric 
adenocarcinoma (AGS). The tumour cell lines were also analyzed by flow citometry. The 
Caenorhabditis elegans model was evaluating the egg hatching rates and animal size. The 
results obtained here showed that the M. tenella polar extracts (EEC, EMC, EAFC) had 
phenolic compounds and it was identified the presence of rutin in EEC and probably at EMC. 
In M. tenella nonpolar extracts (EHC and ECC) it was identified the presence of terpenes as 
ursolic acid. The in vitro antioxidant assays showed that these extracts were able to scavening 
ROS and chelate metals. Furthermore, in vivo antioxidante assays using C. elegans model 
showed that EEC was able to reduced ROS content by up to 74% when compared to untreated 
control. For cell lines, it was observed that M. tenella extracts did not change the MTT 
reduction, on the other hand it was observed a reduction on cell viability up to 82.61% and 
84.68% for HeLa and AGS, respectively. Flow cytometry data showed that the cell viability 
reduction for AGS was correlated to necrosis (80.7%) and late apoptosis (16.5%). The data 
obtained for chia (S. hispanica) showed a similar phytochemical profile, the terpenes presence 
in EHSh and ECSh and the presence of ursolic acid. The presence of phenolic compounds in 
all extracts was verified by UHPLC. In addition, it was observed that these extracts were able 
to donate electrons to the oxidized substrate and to chelate metals as iron and copper. In vivo 
assays showed that the C. elegans pre-treatment with EASh reduced the ROS levels to 
29.76%. Thus, it was observed that S. hispanica extracts were able to reduce the cell viability 
from HeLa and AGS cell lines by up to 82.62% and 66.5% and for HeLa it was related to 
necrosis (19.6%), on the other hand for the AGS was associated to initial apopthosis (8.09%) 
and to late apoptosis (7.16%). Then, M. tenella and S. hispanica leaves may be considered as 
a potential source of biomolecules with antioxidant and antiproliferative activity. 
 
Key-words: Medicinal plants, phenolic compounds, flavonoids, free radicals, Caenorhabditis 
elegans, antiproliferative activity. 
 
 
 
LISTA DE FIGURAS 
 
Figura 1. Reações de formação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. ...................... 17 
Figura 2. Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e seus locais de produção na célula. .... 18 
Figura 3. Voucher de Myrciaria tenella. ................................................................................. 24 
Figura 4. Salvia hispanica (Chia) cultivada em casa de vegetação no Centro de Biociências 
da UFRN. .................................................................................................................................. 26 
Figura 5. Procedimentos de coleta, herborização e extração................................................... 31 
Figura 6. Extratos de M. tenella (10 mg/mL). ......................................................................... 44 
Figura 7 Perfil fitoquímico dos extratos de Myrciaria tenella por Cromatografia em Camada 
Delgada (CCD) ......................................................................................................................... 46 
Figura 8. Prospecção se saponinas e ácido ursólico, nos diferentes extratos de Myrciaria 
tenella por Co-Cromatografia em Camada Delgada (CCD). ................................................... 47 
Figura 9. Cromatogramas para compostos fenólicos por UPLC em diferentes extratos das 
folhas de M. tenella. ................................................................................................................. 48 
Figura 10. Efeito dos diferentes extratos de M. tenella como doadores de elétrons. .............. 49 
Figura 11. Sequestro de radicais pelos diferentes extratos de M. tenella. ............................... 51 
Figura 12. Percentual de ovos eclodidos em C. elegans tratados com o EEC. ....................... 52 
Figura 13. Efeito do EEC o desenvolvimento de C. elegans. ................................................. 53 
Figura 14. Níveis de ROS em cepas N2 tratadas com EEC 48 horas. .................................... 54 
Figura 15. Efeito do EEC sobre a expressão do gene sod-3::GFP em C. elegans em condições 
basais. ....................................................................................................................................... 55 
Figura 16. Ensaio de sobrevivência em condições de estresse oxidativo em C. elegans (N2) 
tratados com EEC a 1 e 10 mg/mL ........................................................................................... 56 
Figura 17. Atividade antiproliferativa dos diferentes extratos de M. tenella .......................... 57 
Figura 18. Avaliação do Processo de Morte Celular em HeLa tratadas com os extratos de 
Myrciaria tenella ...................................................................................................................... 58 
Figura 19. Avaliação do Processo de Morte Celular em AGS tratadas com os extratos de 
Myrciaria tenella. ......................................................................................................................59 
 
 
 
Figura 20. Extratos de S. hispanica a 10 mg/mL .................................................................... 60 
Figura 21. Perfil fitoquímico dos extratos de Salvia hispanica por Cromatografia em Camada 
Delgada (CCD) ......................................................................................................................... 63 
Figura 22. Prospecção de ácido ursólico (AU) nos extratos de S. hispanica .......................... 64 
Figura 23. Cromatogramas para compostos fenólicos por UPLC em diferentes extratos das 
folhas de S. hispanica ............................................................................................................... 65 
Figura 24. Efeito antioxidante dos extratos de Salvia hispanica na fase de iniciação do dano 
oxidativo ................................................................................................................................... 66 
Figura 25. Sequestro de radicais pelos diferentes extratos de S. hispanica ............................ 68 
Figura 26. Percentual de ovos eclodidos em C. elegans tratados com EASh ......................... 69 
Figura 27. Efeito do EASh sobre o desenvolvimento de C. elegans ....................................... 70 
Figura 28. Níveis de ERO em cepas N2 tratadas com EASh por 48 horas. ............................ 71 
Figura 29. Efeito do EASh sobre a expressão do gene sod-3::GFP em condições basais em C. 
elegans ...................................................................................................................................... 72 
Figura 30. Ensaio de sobrevivência em condioes de estresse oxidativo em C. elegans (N2) 
tratados com EASh a 1 e 10 mg/mL ......................................................................................... 73 
Figura 31. Atividade antiproliferativa dos diferentes extratos de S. hispanica. ...................... 74 
Figura 32. Avaliação do Processo de Morte Celular em HeLa tratadas com os extratos de 
Salvia hispanica. ....................................................................................................................... 75 
Figura 33. Avaliação do Processo de Morte Celular em AGS tratadas com extrato de Salvia 
hispanica ................................................................................................................................... 76 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1. Composição do gradiente da fase móvel usada nas análises ................................... 35 
Tabela 2. Percentual de rendimento e concentrações de DMSO nas diluições dos diferentes 
extratos de Myrciaria tenella em água destilada ...................................................................... 43 
Tabela 3. Composição química dos diferentes extratos das folhas de Myrciaria tenella ....... 44 
Tabela 4. Prospecção de metabólitos secundários nas folhas de Myrciaria tenella ................ 45 
Tabela 5. Resumo dos resultados da análise fitoquímica por Cromatografia em Camada 
Delgada (CCD) para os diferentes extratos de M. tenella. ....................................................... 47 
Tabela 6. Atividade quelante de metais para os diferentes extratos de M. tenella. ................. 50 
Tabela 7. Percentual de rendimento e concentrações de DMSO nas diluições dos diferentes 
extratos de Salvia hispanica em água destilada ....................................................................... 60 
Tabela 8. Composição química dos diferentes extratos das folhas de Salvia hispanica ......... 61 
Tabela 9. Prospecção de metabólitos secundários nas folhas de Salvia hispanica ................. 62 
Tabela 10. Resumo dos resultados da análise fitoquímica por Cromatografia em Camada 
Delgada (CCD) para os diferentes extratos de S. hispanica. .................................................... 64 
Tabela 11. Capacidade quelante de metais dos diferentes extratos de S. hispanica ................ 67 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS/SIGLAS 
 
AGS Adenocarcinoma Gástrico 
CAT Capacidade Antioxidante Total 
CCD Cromatografia em Camada Delgada 
DMEM Meio de Cultura Eagle modificado Dulbecco 
DMEM/F12 Meio Eagle modificado por Dulbecco e meio Ham’F12 (do inglês “Dulbecco’s 
Modified Eagle’s Medium e Ham’s F-12 Nutrient Mixture”) 
DMSO Dimetilsufóxido 
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil 
EAC Extrato Aquoso Cambuí 
EAFC Extrato Aquoso Final Cambuí 
EAFSh Extrato Aquoso Final Salvia hispanica 
EASh Extrato Aquoso Salvia hispanica 
ECC Extrato Clorofórmico Cambuí 
ECSh Extrato Clorofórmico Salvia hispanica 
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético 
EEC Extrato Etanólico Cambuí 
EESh Extrato Etanólico Salvia hispanica 
EHC Extrato Hexânico Cambuí 
EHSh Extrato Hexânico Salvia hispanica 
EMC Extrato Metabólico Cambuí 
 
 
 
EMSh Extato Metanólico Salvia hispanica 
ERN Espécies Reativas de Nitrogênio 
ERO Espécies Reativas de Oxigênio 
GFP Proteína Verde Fluorescente 
H2DCFDA 2,7-Diclorofluoresceína – Diacetato 
IS Índice de Similaridade 
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium 
NBT Nitroazul de tetrazólio 
NGM Meio de crescimento de nematoides 
PBS Tampão Fosfato Salino 
PI Iodeto de Propídeo 
RF Fator de Retenção 
SFB Soro fetal bovino 
t-BOOH tert-Butil hidro peróxido 
UHPLC Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 17 
1.1 Radicais Livres ................................................................................................................ 17 
1.2 Câncer ............................................................................................................................. 20 
1.3 Plantas Medicinais .......................................................................................................... 22 
1.3.1 Myrciaria tenella (DC.) O. Berg ................................................................................. 24 
1.3.2 Salvia hispanica L. ...................................................................................................... 25 
2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 29 
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................................. 29 
2.2 Objetivos Específicos ..................................................................................................... 29 
3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 30 
3.1 Coleta e Herborização do Material Botânico .................................................................. 30 
3.2 Obtenção dos Extratos .................................................................................................... 30 
3.3 Conteúdo total de açúcar, proteínas e compostos fenólicos ........................................... 32 
3.4 Triagem de Metabólitos Secundários ............................................................................. 32 
3.5 Cromatografia de Camada Delgada ................................................................................ 34 
3.6 Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE/UHPLC) ........................................ 34 
3.7 Atividade Antioxidante in vitro ...................................................................................... 36 
3.7.1 Determinação da Capacidade Antioxidante Total (CAT) ............................................ 36 
3.7.2 Teste do Poder Redutor ................................................................................................ 36 
3.7.3 Atividade de Quelação de Ferro .................................................................................. 36 
3.7.4 Atividade de Quelação de Cobre .................................................................................37 
3.7.5 Teste do Sequestro de Íons Superóxido ....................................................................... 37 
3.7.6. Teste do Sequestro de Radical Hidroxila .................................................................... 37 
3.7.7 Sequestro do Radical DPPH ........................................................................................ 38 
3.8 Prospecção de atividade antioxidante in vivo ................................................................. 38 
3.8.1 Obtenção e cultivo de Caenorhabditis elegans ........................................................... 38 
3.8.2 Preparo das placas de NGM contendo os extratos ....................................................... 39 
3.8.3 Efeito dos extratos EEC e EASh sobre a eclosão e o desenvolvimento de C. elegans 39 
3.8.4 Avaliação da produção de ERO em C. elegans tratados com EEC e EASh ................ 40 
3.8.5. Avaliação da expressão de sod-3 em C. elegans tratados com EEC e EASh ............. 40 
3.8.6. Ensaio de Resistência ao Estresse Oxidativo .............................................................. 40 
3.9 Ensaio de Viabilidade Celular ........................................................................................ 41 
3.10. Avaliação do processo de morte celular por marcação com Anexina V e PI .............. 42 
3.11 Análise Estatística ......................................................................................................... 42 
4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 43 
4.1 Myrciaria tenella (DC.) O. Berg .................................................................................... 43 
4.2 Salvia hispanica L. ......................................................................................................... 60 
5 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 77 
 
 
 
5.1 Myrciaria tenella (DC.) O. Berg .................................................................................... 77 
5.2 Salvia hispanica L. ......................................................................................................... 86 
6 CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 92 
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 93 
APÊNDICES .......................................................................................................................... 112 
ANEXOS ................................................................................................................................ 113 
 
17 
 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
1.1 Radicais Livres 
 
Espécies reativas de oxigênio (ERO) ou nitrogênio (ERN) são moléculas instáveis, por 
possuírem elétrons desemparelhados na camada de valência, que, em animais, são geradas por 
processos aeróbicos nas mitocôndrias e peroxissomos, em reações de oxidação do carbono e 
biomoléculas contendo hidrogênio para produzir energia química e calor (LAZZARI et al., 
2018). O oxigênio molecular é progressivamente reduzido, gerando: radical hidro peróxido, 
aníon radical superóxido, peróxido de hidrogênio, ânion hidroxila e radical hidroxila. Metais 
de transição, como ferro e cobre, contribuem para a formação do radical hidroxila (OH.), ao 
reagir com o peróxido de hidrogênio (H2O2), pelas reações de Fenton e de Haber-Weiss 
(FERREIRA e MATSUBARA, 1997). Esses radicais formados podem reagir com moléculas 
nitrogenadas, como óxido nítrico (NO) e dióxido de nitrogênio (NO2) formando espécies 
reativas (DURACKOVA, 2010) (Figura 1). 
 
 
Figura 1. Representação esquemática mostrando as diferentes etapas na formação das espécies reativas. 
Em vermelho, com bordas pontilhadas, estão representadas as espécies reativas: O2.- (radical superóxido), H2O2 
(peróxido de hidrogênio); (OH) radical hidroxila; NO (óxido nítrico). Em verde, estão representadas as enzimas 
que catalisam reações de produção: MnSOD (superóxido dismutase dependente de magnésio); NO sintase 
(enzima óxido nítrico sintase). Para a formação das espécies reativas de oxigênio, o oxigênio molecular é 
reduzido. Há uma ligação do oxigênio com o hidrogênio, formando o peróxido de hidrogênio, processo 
catalisado pela enzima superóxido dismutase dependente de magnésio. Mediante reação com metais de transição 
(ferro ou cobre) é produzido o radical hidroxila. No processo de catabolismo da arginina em citrulina, a enzima 
NO sintase catalisa a formação de óxido nítrico. Adaptado da Kanaan & Harper, 2017. 
18 
 
 
As espécies reativas (ERO e ERN) exercem importante função sinalizadora para 
ativar/bloquear vias (PERSSON, POPESCU, CEDAZO-MINGUEZ, 2014), atuando na 
ativação/inativação de proteínas fosfatases. As ERO também estão envolvidas na sinalização 
de quinases, sinalização para aumento da fosforilação de tirosina, a polimerização de actina e 
ligação de DNA a fatores de transcrição (HOLZEROVÁA e PROKISCHA, 2015) (Figura 2). 
No entanto, havendo desequilíbrio entre produção/degradação das espécies reativas, essas 
moléculas, quando em excesso, podem danificar os componentes celulares (PERSSON, 
POPESCU, CEDAZO-MINGUEZ, 2014) (Figura 2). 
 
 
Figura 2. Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio e seus locais de produção na célula. Representação 
esquemática onde são apresentados o: O2.- (radical superóxido), H2O2 (peróxido de hidrogênio); (OH) radical 
hidroxila; OH2- (radical hidroperóxido); NO (óxido nítrico). As espécies reativas são naturalmente produzidas no 
metabolismo e possuem uma função sinalizadora, mediando, por exemplo, as reações anti-inflamatórias. No 
entanto, havendo um desbalanço persistente entre pró e antioxidantes, podem desencadear dano oxidativo às 
proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos. 
 
A presença de radicais livres pode intensificar o processo de peroxidação lipídica, 
onde ácidos graxos insaturados e outros lipídeos são oxidados formando peróxido de 
hidrogênio. Esse processo leva à perda da atividade das membranas celulares, alterando a 
regulação da bomba de cálcio e o transporte de elétrons para produção durante a fosforilação 
oxidativa (DĄBROWSKA e WICZKOWSKI, 2017). Em proteínas, o estresse oxidativo 
intensifica reações entre ERO e grupos tiol (SH) formando radicais tiol que são dimerizados a 
sulfuretos, levando à perda da atividade de enzimas e transportadores, e a oxidação de grupos 
SH leva à desintegração e alteração da permeabilidade das membranas. Por outro lado, podem 
ocorrer reações entre resíduos de aminoácido e espécies reativas, liberando um radical alquila, 
19 
 
 
o qual reage com oxigênio formando alquil hiroperóxido. Este último é convertido a radical 
alcoxi, que ativa a fragmentação da cadeia polipeptídica. O acúmulo, em excesso, desses 
produtos oxidados pode levar a célula à morte (DALLE-DONNE et al., 2006). 
O estresse oxidativo também pode levar ao dano ao material genético (DNA nuclear, 
DNA ribossomal, RNA), embora em menor frequência que aos lipídeos e proteínas. Podendo 
este ser explicado por duas teorias: (1) A formação de radicais hidroxila pela reação de 
Fenton, com íons metálicos presentes na molécula de DNA. (2) O aumento na concentração 
intracelular de íons cálcio ativam nucleases que que podem digerir a molécula de DNA. A 
oxidação da guanina (G), por espécies reativas de oxigênio (superóxido ou oxigênio singlete), 
leva à formação de 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG), que é capaz de alterar o 
emparelhamento de bases durante a duplicação da dupla fita de DNA, resultando em células 
tumorais. Altos níveis de 8-OHdG estão correlacionados a uma série de doenças, como 
arteriosclerose, diabetes, doenças neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer) e autoimunes 
(artritereumatoide e lúpus eritematoso sistêmico) (DĄBROWSKA e WICZKOWSKI, 2017). 
O organismo humano dispõe de um sistema de defesa antioxidante endógeno, o qual 
inclui enzimas (superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase) e compostos não 
enzimáticos como glutationa, proteínas (ferritina, transferrina, ceruloplasmina e albumina) e 
agentes de remoção de baixo peso molecular (vitaminas C e E, β-caroteno e glutationa). 
(ROLEIRA et al., 2015). De modo geral, as enzimas antioxidantes atuam sequestrando 
espécies reativas. A enzima superóxido dismutase catalisa a reação que produz o peróxido de 
hidrogênio (H2O2) que é convertido à água (H2O) por ação da enzima catalase. Enquanto a 
enzima glutationa peroxidase reduz peróxido de hidrogênio e lipídeos em álcoois. O 
complexo antioxidante não enzimático inclui a vitamina C, que sequestra radicais livres de 
oxigênio e atua no meio intra e extracelular, por ser hidrossolúvel. A vitamina E, por sua vez, 
é lipossolúvel e atua na membrana plasmática doando elétrons ao radical peróxido. O b-
caroteno inibe a ativação do fator nuclear Kappa B (NF-kB), bem como a produção de 
interleucina (IL-6) e fator de necrose tumoral α (TNF-α). A glutationa doa um elétron para 
converter H2O2 em H2O e O2, pode doar elétrons aos lipídeos da membrana prevenindo assim 
a sua oxidação. Atua ainda como um cofator para diversas enzimas antioxidantes, dentre elas 
a enzima glutationa peroxidase (BIRBEN et al., 2012). 
No entanto, a homeostase redox pode ser alterada por fatores genéticos ou ambientais, 
como disfunções no sistema antioxidante endógeno, poluição do ar, tabagismo, luz UV e 
radiação ionizante (PISOSCHI e POP, 2015). Fazendo-se assim necessária a suplementação 
dietética com compostos antioxidantes, presentes em alimentos (nutracêuticos) ou fármacos 
20 
 
 
(MCCLEMENTS e XIAO, 2014). Já foi comprovado que a ingestão de frutos ou chás pode 
reduzir o teor de espécies reativas in vivo (INOUE et al., 2008), podendo esse efeito ser 
explicado pelo fato de que plantas são excelentes fontes de carotenoides, terpenos e 
compostos fenólicos (flavonoides, antocianinas e taninos) (MOLLICA et al., 2017). 
 
1.2 Câncer 
 
O termo “câncer” é uma generalização para uma série de doenças também conhecidas 
como neoplasias ou tumores (COTRAN; KUMAR e COLLINS, 2000). Células com 
características distópicas, devido ao DNA mutado, se multiplicam além dos seus limites 
normais e podem migrar, via corrente sanguínea, para colonizar outros tecidos (metástase) 
(ALBERTS et al., 1997). Tumores metastáticos, também chamados malignos, são a principal 
causa de morte em decorrência do câncer (INCA, 2018). 
Segundo dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA), em 2018 foram diagnosticados 18,1 
milhões de novos casos de câncer, sendo que a nível mundial, ocorreram 9,6 milhões de mortes em 
decorrência dessa doença. No Brasil, dados do INCA estimam para o biênio 2018-2019 a 
incidência de 600 mil novos casos novos de câncer (INCA, 2018). O aumento dos casos deve-
se ao envelhecimento da população, hábitos alimentares e exposição aos raios ultravioleta 
(MONTEIRO et al., 2014). 
Em mulheres, o câncer cervical, caracterizado por tumores malignos que atingem a 
cérvix uterina e a vagina, é responsável por altos níveis de morbidade e mortalidade em todo o 
mundo. Por ano, 530, 000 novos casos de câncer do colo do útero são diagnosticados e 
ocorrem 270, 000 mortes ocorrem, sendo que que, nos países em desenvolvimento, cerca de 
85% das pacientes com câncer cervical morrem (SUN-DONG et al, 2019). No Brasil, o 
câncer de colo do útero é o terceiro mais frequente, acometendo 16.370 mulheres, 8,1% dos 
casos de câncer detectados para essa parcela da população (INCA, 2018). 
Outro importante tipo de câncer é o câncer gástrico, um dos mais frequentes em todo o 
mundo, com o diagnóstico de quase 1 milhão de casos a cada ano (WROBLEWSKI et al., 
2010), em 2018 ocorreram 783.000 mortes decorrentes dessa doença (RAWLA e BARSOUK, 
2019). No Brasil, o câncer de estômago é o quarto mais frequente em homens e o sexto mais 
frequente em mulheres, com 13.540 casos (6,3% dos casos de câncer) e 7.750 (3,8%), 
respectivamente (INCA, 2018). A incidência de câncer gástrico está associada alguns fatores 
de risco: infecção por Helicobacter pylori, alto consumo de álcool, tabagismo, baixa ingestão 
de frutas e vegetais, dietas com alto consumo de sódio e anemia perniciosa (LI et al., 2019). 
21 
 
 
É conhecido que o desbalanço persistente entre produção e degradação de ERO, 
processo denominado estresse oxidativo, pode causar alterações do material genético celular. 
ERO podem reagir com as bases nitrogenadas purina e pirimidinas, ou com a desoxirribose, 
além de causar quebras e ligações cruzadas na molécula de DNA (DIESEN e KUO, 2011). 
Tais alterações podem induzir ou inibir a transcrição e vias de sinalização celular, erros de 
replicação e instabilidade do genoma. Esses mecanismos podem induzir à formação de células 
carcinogêniocas (PISOSCHI e POP, 2015). 
O desenvolvimento de células tumorais é decorrente de alterações genéticas em 
múltiplas vias de sinalização celulares, em especial nos pontos de checagem do ciclo celular, 
modificando os processos de proliferação celular, diferenciação e apoptose. Essa alteração 
celular pode promover ainda a angiogênese, evasão da detecção imunológica, invasão de 
tecidos e metástase (LUO, SOLIMINI e ELLEDGE, 2009). 
Pesquisas recentes indicam que o processo inflamatório atua na progressão de tumores, 
pois muitos casos de câncer surgem a partir de locais de infecção, irritação e inflamação 
crônica. Para o processo neoplásico, as células inflamatórias, que constituem o microambiente 
do tumor, atuam na proliferação, sobrevivência e migração de células tumorais 
(CHEENPRACHA et al., 2010). 
Para regulação dos processos de proliferação celular, atua na célula a proteína P53, 
codificada por um gene constante no cromossomo 17. Pesquisas tem indicado o aumento 
dessa proteína em casos de recuperação do câncer e a análise desta indica que a mutação em 
genes codificantes implica no desenvolvimento de câncer (KHUDA-BUKHSH et al., 2011). 
A expressão dos genes Bax e Bcl-2 também estão relacionados à apoptose. Bax é uma 
proteína pró-apoptótica que induz alterações na membrana mitocondrial com liberação do 
citocromo C para o citoplasma e Bcl-2 é uma proteína anti-apoptótica envolvida na 
sobrevivência celular, resistência a medicamentos e tumorigênese do câncer, que é expressa 
em muitos tumores malignos (AKL et al., 2014). 
De maneira geral, o tratamento do câncer é feito de três formas: intervenção cirúrgica, 
quimioterapia e radioterapia. A combinação entre essa também pode ser realizada (SINDHU e 
BAUMAN, 2019). No entanto, a baixa especificidade torna o tratamento bastante invasivo, 
causando efeitos colaterais aos pacientes (CHENG et al., 2019). Nesse sentido, a busca por 
tratamentos mais eficazes e mais seguros torna-se de primordial importância nos estudos 
científicos. 
Compostos oriundos de plantas tem conhecida ação preventiva de tumores (ARAUJO 
et. al., 2016), além de atuar como adjuvante no tratamento de pacientes acometidos com 
22 
 
 
câncer (FARIAS et al., 2011). Compostos fenólicos, que são produto do metabolismo 
secundário vegetal, além de possuir ação antioxidante apresentam atividade antiproliferativa 
sobre células tumorais (WEBER, 2018). 
Para prospecção de biomoléculas com efeito antitumoral, em culturas de células 
emprega-se uma linhagem normal, no intuito de estimar a especificidade do composto e 
estimar seus efeitos colaterais (HAGLUND et al., 2012), muitos pesquisadores avaliaram esse 
efeito sobre a linhagem de fibroblastos murinos, 3T3 (DEEPA et al., 2012; XIN e YANG, 
2019). Enquanto que, diferentes linhagens humanas de células tumorais são modelo in vitro 
para triagem de compostos com efeito antiproliferativo, dentreelas são bastante estudadas as 
HeLa, de carcinoma cervical, e AGS, de adenocarcinoma gástrico (ARTUN et al., 2016; 
MACUER-GUZMÁN et al., 2019). 
Lin et al. (2019) avaliou o efeito do extrato etanólico bruto de Cyperus rotundus e os 
resultados obtidos indicaram redução da viabilidade das células HeLa devido à apoptose e 
parada do ciclo celular. Haron et al. (2019) avaliou o efeito dos extratos metanólico, aquoso e 
frações hexano, diclorometano e aquosa das folhas de Clinacanthus nutans sobre células 
HeLa. Como resultados, todas as amostras testadas inibiram o crescimento de HeLa, sendo 
que a fração diclorometano apresentou menor IC 50 (70 µg/mL), devido ao mecanismo de 
apoptose e parada no ciclo celular na fase S. 
Sobre a linhagem de adenocarcinoma gástrico humano, AGS, Macuer-Guzmán et al 
(2019) avaliou o efeito do extrato etanólico das sementes de Annona cherimola, verificando 
que o tratamento inibiu a proliferação celular, com IC50 de 80, 43 μg/mL, devida à apoptose. 
Asl et al. (2018) avaliou extratos hidroalcoólicos de diferentes partes da Linum album e 
verificou que os frutos possuíam atividade superior aos demais e o mecanismo de morte 
envolvido é a apoptose. 
 
1.3 Plantas Medicinais 
 
O uso medicinal de plantas é prática comum desde a antiguidade (ARCANJO et al., 
2012), tanto que existem registros do uso de plantas na China, em 500 a. C e em 1.500 a. C. 
no Egito, onde foram emcontrados escritos contendo nomes de espécies vegetais, dosagens e 
indicações de uso (DUARTE, 2006). Até meados do século XIX, a fitoterapia era a forma de 
tratamento predominante, contudo, a partir do século XX, passou a ser à base de 
medicamentos sintéticos (BRASIL, 2005). Quanto ao tratamento do câncer, estudos 
demonstram que os medicamentos existentes no mercado selecionam linhagens de células 
23 
 
 
resistentes causando a progressiva perda da sua função (LUO, SOLIMINI e ELLEDGE, 2009; 
GOMES et al., 2015). Esse fenômeno pode ser explicado por alterações epigenéticas, ativação 
de vias de sinalização que promovem a sobrevivência ou inativação de vias promotoras de 
morte, ou a presença de células tronco tumorais (TOH, LIM e CHOW, 2017). 
O uso etnofarmacológico de plantas é fundamental para a descoberta da espécie vegetal 
e sua ação biológica, ponto de partida para o estudo científico de plantas medicinais 
(REZENDE e RIBEIRO, 2005). Compostos oriundos de plantas mostraram-se capazes de 
inibir a oxidação lipídica em tecidos animais e quando incorporados à alimentação, reduzem o 
risco de arteriosclerose e tumores (SOOBRATTEE et al., 2005). Os fitoterápicos têm 
vantagem sobre os medicamentos sintéticos por atuarem em diversos pontos da replicação 
celular e pela diversidade de compostos presentes no extrato vegetal, minimizando a 
resistência celular (TAN et al., 2011). 
Os metabólitos secundários, também chamados produtos naturais, são substâncias 
químicas produzidas pelas plantas, em diferentes quantidades e tipos, conferindo adaptação ao 
ambiente (GARCÍA e CARRIL, 2009). Diferente do metabolismo primário, que apresenta 
distribuição universal, cujos produtos são carboidratos, lipídeos, aminoácidos e ácidos 
nucleicos (GOBBO-NETO e LOPES, 2007). Os metabólitos secundários podem ser divididos 
em: terpenos (hormônios, pigmentos e óleos essenciais), compostos fenólicos (cumarinas, 
flavonóides, pigmentos e lignina), glicosídeos (saponinas, glicosídeos cardíacos, glicosídeos 
cianogênicos e glucosinolatos) e alcalóides (MATOS, 2000; SILVA et al., 2014). 
Diferentes metodologias de extração promovem a obtenção de metabólicos alvo para 
diferentes estudos. A extração pode ser conduzida por diferentes processos (percolação, 
maceração, ultrasson, etc.) empregando-se variados solventes (água, etanol, hexano, acetato 
de etila, metanol, etc.) ou ainda combinações diferentes entre solventes (etanol e água 70/30 
ou 50/50) (KUBILIENE et al., 2018). A escolha do método ideal depende do objetivo do 
estudo. Para compostos fenólicos, pesquisas anteriores reportam que solventes polares e de 
polaridade intermediária são capazes de extrair maior teor desses compostos (VEBER et al., 
2014). Após a extração, faz-se necessária a avaliação da citotoxicidade e dosagem ideal que 
ofereça eficiência terapêutica e segurança quanto à minimização dos efeitos colaterais 
(AVELINO-FLORES et al., 2015). 
Estudos prévios relatam que as espécies Myrciaria tenella e Salvia hispanica, são fonte 
de moléculas bioativas. Entretanto, fazem-se necessários mais estudos para caracterização de 
atividades biológicas específicas, sendo este o alvo desta pesquisa. 
 
24 
 
 
1.3.1 Myrciaria tenella (DC.) O. Berg 
 
M. tenella, popularmente conhecida como “cambuí”, é uma árvore pertencente à 
família Myrtaceae, nativa do Brasil (Figura 3), ocorrendo nas regiões norte, nordeste, sudeste 
e sul, nos biomas Amazônia, Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica (SOBRAL et al., 2015). 
Apresenta frutos com coloração variando de amarelo a roxo e é comercialmente empregada 
para paisagismo e extração de madeira e lenha (VRIESMANN et al., 2004). Na medicina 
popular, é conhecida por sua ação anti-inflamatória (LÉDO et al., 2014). Estudos químicos 
demonstram a presença de vitamina C (PINHEIRO et al., 2011) e compostos fenólicos 
(ALICE et al., 1991). Por prospecção química qualitativa, foram detectadas a presença de 
flavonoides, esteroides, triterpenóides e saponinas (ALICE et al., 1991). Além disso, foram 
descritas as atividades anti-inflamatória (APEL et al., 2010) e antibacteriana (SCHNEIDER et 
al., 2008). 
 
 
Figura 3. Voucher de Myrciaria tenella. Espécie alvo da presente pesquisa, que foi coletada no município de 
Rio do Fogo-RN. Exemplar herborizado no Herbário da UFRN e disponível para consulta pelo portal de 
‘herbários net’. Fonte: splink.org.br/search?lang=pt&collectioncode=UFRN&images=withimages 
 
 
Schneider et al. (2008) estudando as potencialidades farmacológicas do óleo essencial 
das folhas de M. tenella, realizou cromatografia gasosa e ensaios de atividade antimicrobiana 
sobre Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, 
Micrococcus sp., Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter sp. e Shigella flexnerii. 
25 
 
 
Como resultados, foram identificados 50 compostos no óleo essencial, sendo 78,93% destes 
classificados como terpenos. Observou-se efeito abtibacteriano sobre as linhagens: S. aureus, 
E. faecalis, E. coli, P. mirabilis, Enterobacter e S. flexnerii. 
Ferreira e Vargas (1999) trabalharam com o extrato aquoso de folhas de M. tenella, 
secas e imersas em água fervente numa concentração de 25%. Avaliaram a ação mutagênica 
sobre linhagens de Salmonella typhimurium, testando as concentrações 500, 1000 e 1500 
µL/placa, sendo observados sinais de mutagenicidade e nenhum efeito citotóxico em todas as 
concentrações testadas. 
Apel et al. (2010) avaliaram a composição química e atividade anti-inflamatória do 
óleo essencial extraído das folhas de M. tenella, identificando a presença de 34 compostos, 
dos quais estavam presentes em maior quantidade: β-cariofileno (25,1%) e espatulenol 
(9,7%). Apresentou efeito anti-inflamatório in vitro e in vivo em camundongos, reduzindo a 
migração de neutrófilos em 93%. A administração sistêmica do pó (50 mg/kg) reduziu o 
edema de pata induzido por carragenina, de maneira estatisticamente igual (𝑃 ≤ 0, 05) ao 
controle positivo, indometacina (10 mg/kg). 
 
1.3.2 Salvia hispanica L. 
 
Popularmente conhecida como “chia”, Salvia hispanica, família Lamiaceae é nativa do 
México e Guatemala, sendo seu cultivo realizado há milhares de anos pela civilização 
indígena asteca, que consumia as sementes, como fonte de energia e uso medicinal 
(ULBRICHT et al., 2009). Esta espécie vem sendo cultivada na América do Sul (AYERZA, 
2010) e Brasil, nos estados do Paraná e Rio Grande do Sul (MIGLIAVACCA et al., 2014). 
S. hispanicatem porte arbustivo, chegando à altura de 1 metro, folhas simples e 
alternadas, com comprimento e largura médios de 6 e 4 cm, respectivamente. O caule é 
ramificado e as folhas tem tricomas na superfície, ambas as partes são ricas em óleos 
essenciais com efeito inseticida (DI SAPIO et al., 2012). As flores encontram-se no ápice da 
planta, são hermafroditas, variando entre as cores roxa e branca (Figura 4). Frequentemente 
ocorre autofecundação, gerando frutos indeiscentes que liberam as sementes com cor 
amarelada de 1 a 2 mm de tamanho (JIMÉNEZ, 2010). 
26 
 
 
 
Figura 4. Salvia hispanica (Chia) cultivada em casa de vegetação no Centro de Biociências da UFRN. As 
folhas dessa cultura de Chia foram coletadas para obtenção dos extratos e posterior avaliação fitoquímica, 
antioxidante, citotóxica e antiproliferativa. Escala: 15 cm. 
 
A presença de ácidos graxos poli-insaturados, como ômega 3 e 6, bem como o alto 
teor de compostos fenólicos, conferem à S. hispanica propriedades biológicas interessantes 
(DIWAKAR et al., 2014). Desse modo, a espécie tem sido bastante estudada para 
suplementação alimentar humana, pois a incorporação das sementes de chia como 
componente nutracêutico é útil para prevenção e controle de doenças cardiovasculares, 
obesidade e diabetes (MARINELI et al., 2015). 
Estudos demonstraram que a suplementação alimentar de animais de produção com 
sementes de S. hispânica foi capaz de aumentar o teor de ω-3 ácido α-linoléico e ω-6 ácido 
linoleico nos ovos de galinha e na carne de porco e coelho. Quanto ao sabor da carne dos 
animais submetidos à suplementação, em frangos não foi observada alteração, já nas outras 
carnes houve uma melhoria no sabor (AYERZA e COATES, 2002; COATES e AYERZA, 
2009). Tais efeitos devem-se à presença de componentes bioativos benéficos à saúde e 
nutrição animal (MEINERI et al., 2010). 
Martínez-Cruz e Paredes-López (2014) caracterizaram, por Cromatografia Líquida de 
Alta Eficiência (CLAE), a composição química das sementes de S. hispânica, verificando 
uma alta concentração e variedade de compostos fenólicos, principalmente ácidos 
rosmarínico, protocatecóico, cafeico e gálico. Também presentes, embora em menor 
concentração, foram verificados: daidzina, ácido ferrúlico, glicitina e genistina. 
Em um estudo com as sementes de S. hispanica, comercializada no Chile, foi 
caracterizada a sua composição de proteínas (25, 32 g/100 g), óleo (30,22 g/100 g), fibras 
totais (37,50 g/100 g) e fibras insolúveis (35, 07 g/100 g). Nessa mesma pesquisa, foram 
15 cm 
27 
 
 
identificados ácido α-linoleico, ácido linoleico, ácido palmítico e ácido esteárico, por 
cromatografia gasosa e, para identificação dos triacilgliceróis, mediante espectrometria de 
massas, foi confirmado o predomínio de ácido linoleico e baixo teor de peróxido (MARINELI 
et al., 2014). 
As sementes de S. hispanica também foram alvo de estudos de atividade antioxidante 
in vitro e in vivo. Proteínas isoladas das sementes de S. hispanica (globulinas, albuminas, 
prolaminas e glutelinas) foram avaliadas para sequestro dos radicais ABTS (ácido 2,2'-azino-
bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico), DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) e quelação de ferro. 
Os resultados dos primeiros ensaios indicaram que todas as proteínas testadas se mostraram 
ativas. Contudo, as prolaminas e glutelinas apresentaram maior sequestro de radicais, quando 
comparadas às albuminas e globulinas. Enquanto que, para quelação de ferro, prolaminas, 
glutelinas e globulinas foram capazes de quelar íons ferro na mesma proporção, mas a 
albumina mostrou efeito superior às demais. Vale ressaltar que a farinha das sementes foi 
avaliada pelos mesmos testes, apresentando ação antioxidante significativa e superior à das 
proteínas isoladas (Orona-Tamayo et al., 2015). 
Em modelo animal, sobre ratos Wistar, a alimentação com o óleo de chia como única 
fonte lipídica alterou a atividade das enzimas SOD (Superóxido Dismutase), CAT (Catalase), 
GPX (Glutationa Peroxidase), e GR (Glutationa Redutase). Estando esta atividade relacionada 
à alta concentração de ácido alfalinolênico nas sementes da Chia (64%), prevenindo o estresse 
oxidativo hepático (RINCÓN-CERVERA et al., 2016). 
Apesar de o cultivado enfocar predominantemente a produção das sementes (ALI et 
al., 2012), as folhas de S. hispanica são também uma poderosa fonte de compostos bioativos, 
apresentando óleo essencial composto por β- cariofileno, globulol, γ-muroleno, β-pineno, α-
humoleno, germacreno-B e widdrol (AHMED et al., 2006). Janicsák et al. (2011) constataram 
uma atividade citotóxica do extrato hexânico das folhas de S. hispanica sobre células tumorais 
de pele (A431) e mama (MCF7) usando o ensaio de MTT. 
Essa revisão da literatura acerca da composição química e atividades biológicas da 
Chia (S. hispanica), demonstrou ser esta espécie, uma fonte promissora de moléculas 
biologicamente ativas. No entanto, se fazem necessários mais estudos químicos e biológicos 
das suas folhas, tendo em vista além do potencial biológico, o econômico, para 
aproveitamento desse subproduto da cultura, as folhas, já que a produção está voltada apenas 
para a comercialização das sementes (ULLAH et al., 2016). 
Em suma, as espécies chia (Salvia hispanica) e do cambuí (Myrciaria tenella) tem um 
potencial a ser estudado, visto que são empregadas na etnofarmacologia, tem uma composição 
28 
 
 
química interessante, além de atividades biológicas. No entanto, as folhas ainda são pouco 
estudadas, carecendo de estudos fitoquímicos e de atividades específicas. Nesse contexto, esta 
pesquisa será uma contribuição ao conhecimento fitoquímico das folhas dessas espécies, bem 
como ao estudo das atividades antioxidantes e antitumorais destas. 
29 
 
 
2 OBJETIVOS 
2.1 Objetivo Geral 
Avaliar a composição química e as atividades antioxidante e antiproliferativa das folhas 
de Myrciaria tenella e Salvia hispanica. 
 
2.2 Objetivos Específicos 
• Obter extratos hexânico, clorofórmico, etanólico, metanólico, aquoso final e aquoso, a 
partir das folhas de Myrciaria tenella e Salvia hispanica; 
• Caracterizar quimicamente os extratos produzidos, pela quantificação de carboidratos, 
proteínas e compostos fenólicos totais; 
• Identificar classes de metabólitos presentes nos extratos por meio de ensaios 
qualitativos de triagem, Cromatografia em Camada Delgada (CCD) e Cromatografia 
Líquida de Ultra Eficiência (UHPLC); 
• Mensurar a atividade antioxidante dos diferentes extratos, através dos testes in vitro: 
CAT; Poder Redutor; Quelação de Metais (Ferro e Cobre) e Sequestro de Radicais 
(Hidroxila; Superóxido e DPPH); 
• Analisar a toxicidade de EEC e EASh sobre o organismo modelo Caenorhabditis 
elegans por meio dos testes de eclosão e tamanho; 
• Avaliar a atividade antioxidante de EEC e EASh in vivo, sobre o organismo modelo C. 
elegans, mediante os ensaios de produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), 
sobrevivencia em condições de estresse oxidativo e expressão da enzima superóxido 
dismutase 3 (sod-3); 
• Avaliar a atividade citotóxica e antiproliferativa dos extratos, pelo método de redução 
do MTT e marcação com Anexina V e Iodeto de Propídeo (PI). 
 
30 
 
 
3 MATERIAIS E MÉTODOS 
 
3.1 Coleta e Herborização do Material Botânico 
 
Foram coletadas folhas da espécie Myrciaria tenella, nas proximidades da rodovia que 
liga os municípios de Natal a Rio do Fogo, Rio Grande do Norte, Brasil, coordenadas 
5°17’3’’ S 35°23’9’’ O. Região de clima tropical, precipitação concentrada nos meses de 
março a agosto e temperatura média 28,5°C (IDEMA, 2008). Um exemplar da espécie 
encontra-se herborizado no herbário da UFRN, sob o número 20383. 
Salvia hispanica foi cultivada em casa de vegetação, no Centro de Biociências da 
UFRN, Natal, Rio Grande do Norte, Brasil, 5°50'28.7"S+35°12'10.2"W. Clima tropical 
úmido, com precipitação média anual de 800 - 1.200milímetros, temperatura média 26°C e 
humidade 77% (IBGE, 2010). O voucher encontra-se armazenado no Herbário da UFRN, sob 
o número 12704. 
A coleta das espécies M. tenella e S. hispanica foi autorizada pelo Ministério do Meio 
Ambiente, mediante comprovante de registro para coleta de material botânico, fúngico e 
microbiológico de número 52084-1. 
 
3.2 Obtenção dos Extratos 
 
Foram lavadas 100 g de folhas frescas de M. tenella e S. hispanica, depois cortadas e 
imersas em 1000 mL de solvente (concentração 1: 10) para maceração a frio durante 24 h, sob 
agitação constante. Decorrido esse período, o extrato foi filtrado e ao resíduo vegetal foi 
adicionado o solvente seguinte, pois a extração foi seriada utilizando solventes em ordem 
crescente de polaridade: hexano, clorofórmio, etanol, metanol e água. Separadamente, 100 g 
de folhas frescas foram imersas em 1000 mL de água destilada seguindo a mesma 
metodologia para extração, para obtenção do extrato aquoso. (Figura 5). Os extratos foram 
filtrados e mantidos em frascos de vidro de cor âmbar a 4 °C e em seguida transferidos ao 
evaporador rotativo (TE210, Tecnal, Piracicaba, Brazil) para evaporação total do solvente. 
Em seguida, os extratos foram ressuspensos em Dimetilsulfóxido (DMSO) e congelados a -20 
°C. Para cálculo do rendimento foi usada a fórmula descrita por Rodrigues et al. (2011): 
 
Re = (Pext /Pfolhas) x 100. 
31 
 
 
 
Onde: 
Re = Rendimento total do extrato (%); Pext = Peso do extrato seco (g); Pfolhas = Peso 
das folhas frescas (g). 
 
Figura 5. Procedimentos de coleta, herborização e extração. Fluxograma para a obtenção dos diferentes 
extratos utilizados neste trabalho. As folhas frescas foram imersas no solvente para maceração durante 24 horas. 
Decorrido esse tempo, os extratos foram filtrados e, ao material vegetal, foi adicionado o próximo solvente de 
polaridade crecente. A extração apenas com água seguiu a mesma metodologia, entretanto foi usado um pool 
diferente de folhas e apenas um solvente. As siglas representam: EH: Extrato Hexânico; EC: Extrato 
Clorofórmico; EE: Extrato Etanólico; EM: Extrato Metanólico; EAF: Extrato Aquoso Final; EA: Extrato 
Aquoso. 
 
Esses procedimentos foram realizados no Laboratório de Transformação de Plantas e 
Análise de Microscopia (LTPAM), Departamento de Biologia Molecular e Genética da 
UFRN. 
32 
 
 
 
3.3 Conteúdo total de açúcar, proteínas e compostos fenólicos 
 
Para a dosagem de açúcar total foi realizada a reação de fenol-H2SO4, usando a D-
glucose (Sigma-Aldrich) como padrão, conforme metodologia descrita por Dubois et al. 
(1956). Para proteínas foi utilizado o método proposto por Bradford (1976), com albumina 
bovina (Sigma) como padrão. O teor de compostos fenólicos dos extratos foi determinado 
usando o método colorimétrico de Folin-Ciocalteu (ATHUKORALA, KIM e JEON, 2006) 
com ácido gálico (CAQ Casa da Química, Diadema, SP, Brasil) como padrão. 
 
3.4 Triagem de Metabólitos Secundários 
 
Realizou-se a avaliação química preliminar dos extratos conforme metodologias 
propostas por Matos (2000) e SBFgnosia (2016), para detecção de fenóis, taninos, saponinas, 
flavonoides, antraquinonas, alcaloides, cumarinas, triterpenóides, esteroides e núcleo 
esteroidal insaturado. Mediante a observação do produto das reações (mudança de coloração, 
formação de precipitado ou espuma), a presença ou não de compostos foi classificada como: 
(++) forte presença, (+) presença, (-) ausência e (s) suspeita. Para esses ensaios, os diferentes 
extratos foram diluídos para 10 mg/mL de concentração. 
 
3.4.1 Determinação de Flavonoides 
 
Foi utilizado 1 mL do extrato a 10 mg/mL, aquecido até secura em banho-maria 
(50ºC). O excesso de clorofila foi removido com 0,2 mL de clorofórmio. O resíduo foi 
ressuspendido em 1 mL de etanol 70% e transferido para um tubo de ensaio, onde foi vertido 
1 mL de HCl concentrado e adicionado pequena quantidade de magnésio em pó (cerca de 200 
mg). O desenvolvimento de coloração vermelha é indicativo da presença de flavonoides. 
 
 
 
 
 
33 
 
 
3.4.2 Determinação de Taninos 
 
Para este ensaio, 1 mL de extrato foi filtrado com algodão e transferido para um tubo 
de ensaio, adicionando-se algumas gotas solução aquosa de gelatina a 2,5%. A formação de 
precipitado é indicativa da presença de taninos. 
 
3.4.3 Determinação de Saponinas 
 
Em um tubo de ensaio, a solução de 1 mL de extrato mais 2 mL de água foi agitada 
verticalmente e vigorosamente durante 1 minuto. A formação de espuma persistente é 
indicativa da presença de saponinas. 
 
3.4.4 Determinação de Antraquinonas 
 
Adicionou-se ao extrato 0,5 mL de hidróxido de amônio a 10%. Considerou-se reação 
positiva para presença de antraquinonas, o desenvolvimento de coloração róseo-avermelhada. 
 
3.4.5 Determinação de Cumarinas 
 
Em um papel de filtro, adicionaram-se três gotas do extrato, nas quais foi acrescida 
solução de KOH a 10%. Após alguns instantes, procedeu-se a observação em câmara UV, 
onde a visualização de fluorescência é indicativa da presença de cumarinas. 
 
3.4.6 Determinação de Triterpenos e Esteroides 
 
Para este teste foram filtrados 2 mL dos extratos e posteriormente transferidos para 
cápsulas de porcelana para secura em banho-maria. O resíduo foi ressuspenso em metanol e 
diluído com 2 mL de diclorometano. O conteúdo foi distribuído em 2 tubos de ensaio para 
evaporação em banho-maria. Foi vertido pelas paredes do tubo 1, o reativo de Liebermann-
Burchard e observada a mudança de coloração após 10-15 minutos de repouso, onde cor azul 
ou verde é indicativa da presença de núcleo esteroidal e cor vermelha, rosa, púrpura ou 
violeta, indica a provável presença de núcleo triterpênico. Pelas paredes do tubo 2, adicionou-
se 0,5 mL do reativo de Salkowsky (H2SO4 concentrado). O desenvolvimento de coloração 
castanho-escuro-avermelhada, indica a presença de núcleo esteroidal insaturado. 
34 
 
 
 
3.5 Cromatografia de Camada Delgada 
 
Para avaliação fitoquímica por cromatografia em camada delgada (CCD), 0,01 g de 
cada extrato foi diluída em 1 mL de metanol P.A, os extratos foram aplicados com o auxílio 
de capilares de vidro, em duplicata, nas placas de vidro contendo gel de sílica. Como 
adsorvente, foi utilizado gel de sílica e três fases móveis com diferentes polaridades: 
intermediária (acetato de etila/ácido fórmico/metanol/água; 10: 0,5: 0,6: 0,2 v/v/v/v), polar 
(acetato de etila: ácido fórmico e água. 8: 1: 1 v/v/v) e apolar (tolueno: metanol: água. 
9:1:0,1). Como reveladores, foram utilizados vanilina sulfúrica, reagente natural A (0,5%) e 
reagente de Dragendorff. 
Quanto à composição dos reveladores, a vanilina sulfúrica consiste em 0,5 g de 
vanilina, 2 mL de ácido sulfúrico e 80 mL de metanol. O Natural A, foi obtido pela 
solubilização de 0,2 g de Difenilborato em 100 mL de metanol. O Reagente de Dragendorf 
consiste na mistura das soluções A e B (1:1), cuja composição da Solução A foi: 0,85 g de 
Nitrato Básico de Bismuto, 10 mL de ácido acético glacial e 40 mL de água destilada. Para 
preparo da Solução B foram utilizados 16 g de iodeto de potássio em 40 mL de água 
destilada. Após 24 horas, a cada 10 mL de solução estoque, adicionaram-se 20 mL de ácido 
acético glacial e 100 mL de água destilada. 
Para prospecção de moléculas conhecidas, foram avaliados os padrões: cumarinas, 
saponinas, luteonina, ácido elágico, quercetina, canferol, catequina, luteonina, isorientina, 
ácidos cafeico, clorogênico, ursólico e gálico (Sigma-Aldrich, pureza ≥95%). Após eluição e 
revelação, os compostos foram visualizados na presença ou não de Luz Ultravioleta (UV) a 
365 nm e calculados os Fatores de Retenção (RF) de acordo com a metodologia descrita por 
Wagner (1984). 
A triagem preliminar de metabólitos secundários e a CCD foram conduzidas no 
Laboratório de Produtos Naturais (PNBio), Departamento de Farmácia da UFRN. 
 
3.6Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (CLUE/UHPLC) 
 
Os diferentes extratos obtidos a partir das folhas de M. tenella e S. hispanica foram 
analisados por cromatografia líquida de ultra eficiência com detector do tipo “diode array 
detector” (CLUE-DAD) para separação de compostos fenólicos. Os extratos foram 
35 
 
 
previamente diluídos em água destilada para a concentração final de 10 mg/mL e filtrados em 
membrana 0,22 µm (Merck) para a injeção de 2 µL no equipamento. 
Utilizou-se um cromatógrafo líquido de ultra eficiência da marca Shimadzu, composto 
por bomba analítica binária (LC-20A3 XR), injetor automático (SIl-20AD XR), 
desgaseificador (DGU- 20A3), forno para colunas (CTO- 20AC) e detector de arranjo de 
diodos (SPD-M20A), com sistema controlado pelo software LC Solution®. A coluna utilizada 
foi do tipo Poroshell 120 EC-C18, da Agilent®, C18 (50 x 4,6 mm; 2,7 µm). A fase móvel 
utilizada foi um gradiente de eluição com os solventes: Ácido Fórmico 0,1% (Fase A); 
Acetonitrila e Ácido Fórmico a 0,1% (Fase B) (Tabela 1). O fluxo utilizado na coluna foi de 
0,5 mL/min. Essa metodologia baseou-se no estudo de Fracassetti et al. (2013). 
 
Tabela 1. Composição do gradiente da fase móvel usada nas análises 
Tempo (minutos) % Fase A % Fase B 
0 99 1 
3 91 9 
19 52 48 
23 5 95 
24 99 1 
30 99 1 
 
A identificação dos compostos fenólicos foi efetuada por meio da comparação entre os 
espectros de absorção no UV-vísivel (360 nm) e tempo de retenção referente ao pico 
detectado na amostra com o padrão para as substâncias: rutina (Farmafórmula, 1999), 
quercetina (USP, 2006), pirogalol, canferol (Sigma Aldrich) e ácido gálico (Sigma Aldrich). 
Todas com pureza superior a 95%. Foram calculados os índices de similaridade (IS) entre os 
espectros dos picos presentes nos extratos e padrões, considerando iguais valores próximos a 
1,0. 
A análise foi realizada no Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos 
(LCQMed) do Departamento de Farmácia da UFRN. 
 
 
 
 
 
36 
 
 
3.7 Atividade Antioxidante in vitro 
 
3.7.1 Determinação da Capacidade Antioxidante Total (CAT) 
 
Esse ensaio foi baseado na redução de Molibdênio+ 6 a Molibdênio+ 5 pelos extratos, e 
subsequente formação de um complexo verde fosfato/Mo+ 5 em pH ácido, conforme 
metodologia descrita por Prieto, Pineda e Aguilar (1999). Tubos de ensaio contendo os 
diferentes extratos de M. tenella e S. hispanica nas concentrações 100, 500 e 1000 µg/mL, 
juntamente com solução reagente (ácido sulfúrico a 600 M), fosfato de sódio 28 mM, e 
molibdato de amônio 4 mM, foram incubados a 95 °C durante 90 min. Após este tempo, com 
a mistura arrefecida à temperatura ambiente, a absorbância foi aferida a 695 nm e os 
resultados comparados com um branco, que consistiu em tubos de ensaio com os mesmos 
reagentes anteriormente mencionados, mas com ausência dos extratos e padrão. A capacidade 
antioxidante foi expressa em equivalentes de ácido ascórbico (Eq. AA). 
 
3.7.2 Teste do Poder Redutor 
 
Essa quantificação procedeu-se conforme descrição de Athukorala, Kim e Jeon (2006) e 
Wang et al. (2008). Os extratos de M. tenella e S. hispanica, nas concentrações 100, 500 e 
1000 µg/mL, foram adicionados a uma solução contendo 0,2 M tampão fosfato (pH 6,6) e 
ferricianeto de potássio (1% w/v), para um volume final de 4 mL. A mistura resultante foi 
incubada a 50 °C durante 20 min. A reação foi finalizada pela adição da solução de Ácido 
Tricloroacético (TCA 10% w/v). A solução foi misturada com água destilada e cloreto férrico 
(0,1% w/v) e a absorbância medida em espectrofotômetro a 700 nm. O resultado foi expresso 
como uma porcentagem da atividade apresentada por 100 µg/mL de ácido ascórbico. 
 
3.7.3 Atividade de Quelação de Ferro 
 
Para este teste foi adotada a metodologia descrita por Decker e Welch (1990). Os 
diferentes extratos (100, 500 e 1000 µg/mL) foram adicionados à mistura de 50 µL de FeCl2 
(2 mM) e 200 µL de ferrozina (5 mM) para um volume final de 1 mL. A mistura foi incubada 
por 10 min à temperatura ambiente e absorbância foi verificada a 562 nm e comparada com 
um branco. 
37 
 
 
3.7.4 Atividade de Quelação de Cobre 
 
Esse ensaio baseia-se na identificação do teor de cobre livre nas amostras, verificada 
pela mudança de coloração, conforme a metodologia descrita por Megías et al. (2009). Às 
soluções contendo os extratos (100, 500 e 1000 µg/mL) foram adicionadas 6 µL de violeta de 
pirocatecol a 4 mM, e somadas a 100 µL de sulfato de cobre penta hidratado (50 µg/mL, w/v 
no tampão acetato). A quelação dos íons cobre (Cu2+) foi mensurada em leitor de microplacas 
a 632 nm. 
 
3.7.5 Teste do Sequestro de Íons Superóxido 
 
Este ensaio tem como princípio a capacidade dos extratos inibirem a redução 
fotoquímica do tetrazólio nitroazul (NBT) no sistema de NBT-riboflavina luz (DASGUPTA e 
DE, 2004). A cada tubo contendo 3 mL da solução reagente (tampão fosfato 50 mM (pH 7,8), 
13 mm de metionina, riboflavina 2 mM, EDTA a 100 mM e 75 mM de NBT) foi adicionado 1 
mL dos extratos a 100, 500 e 1000 µg/mL. A produção do azul de formazan foi monitorizada 
pela aferição da absorbância a 560 nm após 10 minutos sob a iluminação de lâmpada 
fluorescente em sistema fechado. 
 
3.7.6. Teste do Sequestro de Radical Hidroxila 
 
Esse ensaio toma como base a reação de Fenton (Fe2 + + H2O2 → Fe
3 + + OH- + OH), 
onde o radical hidroxila é produzido de acordo com metodologia proposta por Smirnoff e 
Cumbes (1989), com adaptações. Em 3 mL de tampão fosfato a 150 mM (pH 7,4), foram 
adicionados FeSO4 × 7H2O (10 mM), EDTA (10 mM), salicilato de sódio a 2 mM, H2O2 a 
30% (200 mL) e os extratos, a 100, 500 e 1000 µg/mL de concentração. Como controle 
positivo, o tampão fosfato de sódio foi substituído por H2O2. As soluções ficaram incubadas a 
37 °C durante 1 h e a presença do radical hidroxila foi detectada por monitorização da 
absorbância a 510 nm. 
 
 
38 
 
 
3.7.7 Sequestro do Radical DPPH 
 
O ensaio baseou-se na metodologia proposta por Shimada et al. (1992), com algumas 
modificações. Em placa de 96 poços, foram adicionados os extratos nas concentrações 100, 
500 e 1000 µg/mL e em seguida, foi acrescida a solução de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil 
(DPPH). Para o controle, foi adicionado apenas o DPPH, e para o branco, esse radical foi 
substituído por etanol P.A. A mistura foi deixada em repouso, na ausência de luz e à 
temperatura ambiente, durante 30 min. A absorbância foi verificada a 517 nm, em leitor de 
microplacas (FEMTO Ltda, São Paulo, SP, Brasil). 
Estes ensaios antioxidantes in vitro, bem como o ensaio espectrofotométrico de 
detecção de compostos fenólicos, foram conduzidos no Laboratório de Biotecnologia de 
Polímeros Naturais (BIOPOL), Departamento de Bioquímica da UFRN. 
 
3.8 Prospecção de atividade antioxidante in vivo 
 
3.8.1 Obtenção e cultivo de Caenorhabditis elegans 
 
Neste trabalho, foram utilizadas duas cepas de C. elegans, uma do tipo selvagem (N2) 
e uma transgênica carregando o gene da proteína GFP sob controle do promotor do gene sod-
3, CF1553 muls84 [pAD76 (sod-3::GFP)]. Essas linhagens foram disponibilizadas pelo 
Caenorhabditis Genetics Center (CGC), University of Minesota, EUA 
(http://www.cbs.umn.edu/CGC). 
Até o uso, as cepas no estágio L1 encontravam-se congeladas em solução de M9 (22 
mM KH2PO4; 42 mM Na2HPO4; 85,5 mM NaCl; 1 mM MgSO4) e solução de congelamento 
(50 mM Tampão Fosfato; 100 mM NaCl; 30% de glicerina), aliquotadas em tubos de 1,5 mL 
e armazenadas a -80 °C. Para uso, as cepas foram descongeladas e transferidas para meio 
NGM (Nematode Growth Medium) contendo Escherichia coli OP50 e incubadas em BOD a 
20 °C (BRENNER, 1974). 
Para sincronizar as cepas no estágio L1, foi feita lise alcalina em animais adultos 
grávidos, com solução de hipoclorito de sódio (50%) e NaOH (2,5 mM), os ovos foram 
incubados em meio M9 overnight à temperatura ambientee sob agitação, obtendo-se apenas 
larvas L1. 
 
39 
 
 
3.8.2 Preparo das placas de NGM contendo os extratos 
 
Foram preparados 500 mL do meio MGM sólido, suplementado com 500 µL de 
MgSO4 (1 M), CaCl2 (1 M), colesterol (5 mg/mL) e estreptomicina (100 mg/mL) e 12,5 mL 
de tampão fosfato (1 M). Para esses ensaios, tendo por base os resultados da prospecção 
química e atividade antioxidante in vitro, foram selecionados extrato etanólico de M. tenella 
(EEC) e o extrato aquoso de S. hispanica (EASh), acrescidos ao meio de cultivo (NGM) para 
alcançar as concentrações finais de 1 e 10 mg/mL. Às placas de Petri foram semeadas com 
Escherichia coli OP50 como fonte de alimentação, incubadas por 48 h e armazenadas em 
geladeira (5 °C) até o uso. Para controle, foram preparadas nas mesmas condições placas na 
ausência do extrato. 
 
3.8.3 Efeito dos extratos EEC e EASh sobre a eclosão e o desenvolvimento de C. elegans 
 
Antes de avaliar a atividade antioxidante, foi mensurada a toxidade dos extratos sobre 
o organismo modelo C. elegans, pelos ensaios de eclosão e tamanho das larvas (Paiva et al., 
2015). 
Para o ensaio de eclosão, os ovos obtidos mediante lise foram semeados em placas de 
Petri contendo os extratos nas concentrações 1 e 10 mg/mL, a contagem dos ovos foi feita 
imediatamente e após 24 h foram contadas as larvas. Foi calculada a porcentagem de eclosão 
pela seguinte fórmula: 
 
Eclosão (%) = (número de L1/número de ovos incubados) *100 
 
Foram incubados cerca de 50 ovos por placa, sendo cinco placas por tratamento. O 
experimento foi realizado três vezes. 
Já para avaliação do efeito dos extratos sobre o desenvolvimento de C. elegans, 
aproximadamente 20 larvas L1 foram semeadas em placas contendo os extratos (1 e 10 
mg/mL) e controles (apenas NGM). Para cada grupo foram feitas 5 repetições (placas) e o 
experimento foi realizado em triplicata. 25 animais de cada grupo foram fotografados em 
câmera acoplada à lupa, imediatamente ao semeio e após 48 h de incubação, o tamanho foi 
mensurado pelo software image J (https://imagej.net/). 
 
40 
 
 
3.8.4 Avaliação da produção de ERO em C. elegans tratados com EEC e EASh 
 
Para avaliar o efeito dos extratos sobre a produção de ERO, cepas N2 (selvagem) em 
estágio larval L1 foram cultivadas em meio NGM sólido contendo EEC e EASh nas 
concentrações de 1 e 10 mg/mL e o controle na ausência dos extratos, durante 48 h à 20 ºC. 
Em seguida os animais foram expostos ou não à solução de Juglone (Sigma-Aldrich) à 100 
mM de concentração, durante 1 h sobre agitação. Decorrido esse tempo, foram feitas três 
lavagens com M9, obtendo-se um pellet contendo os animais. Aproximadamente 40 animais 
de cada grupo foram transferidos para cada poço de uma placa de micro titulação de 96 poços 
contendo 200 µL de M9 em triplicata. A quantificação de fluorescência foi realizada no leitor 
de placas X3™ multilabel VICTOR (Perkin Elmer, Massachusetts, EUA), utilizando 
excitação a 485 nm e emissão a 535 nm. A produção de ERO foi mensurada utilizando a 
sonda fluorescente 2,7-diclorofluoresceína-diacetato (H2DCFDA). Foram realizadas oito 
leituras, com intervalo de 30 minutos entre cada uma (CALAND et al., 2019). 
 
3.8.5. Avaliação da expressão de sod-3 em C. elegans tratados com EEC e EASh 
 
A expressão desta enzima foi verificada em cepas trangênicas de C. elegans contendo 
o gene que codifica a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle do promotor para sod-
3 (CF1553, sod-3::GFP). Os animais cultivados em meio NGM com OP50, foram 
sincronizados em L1 e tratados ou não com EEC e EASh nas concentrações 1 e 10 mg /mL 
durante 48 horas. Decorrido esse período, 25 animais de cada grupo foram anestesiados com 
10 mM de azida sódica, fixados em lâminas com 1% de agarose, para leitura em microscópio 
de fluorescência Olympus, no Laboratório de Imunogenética (DBQ, UFRN), com aumento 
ocular de 10 vezes e filtro para excitação de 365 nm. Os animais foram fotografados, e a 
intensidade de fluorescência emitida pela proteína GFP foi analisada usando o Software 
Image J, versão 1.8 (CALAND et al., 2019). 
 
3.8.6. Ensaio de Resistência ao Estresse Oxidativo 
 
C. elegans da linhagem selvagem (N2) foram sincronizados e as larvas L1 colocadas 
em placas contendo EEC nas concentrações 1 e 10 mg/mL e controle, na ausência de extrato. 
Os animais foram deixados crescer durante 48h a 20°C até atingirem o estágio L4. Decorrido 
41 
 
 
esse tempo, 50 animais de cada grupo foram transferidos para placas de 12 poços contendo 
meio NGM sólido acrescido de 10 mM de tert-butil hidroperóxido (t-BOOH). O número de 
animais vivos e mortos foi verificado decorridos 3, 15, 18, 21, 24 e 27h de experimento, 
através de observação da movimentação dos animais, quando tocados por alça de platina, 
sendo visualizados em lupa estereoscópica (LITHGOW et al., 1995). Três experimentos 
independentes foram realizados (n=150 animais/grupo). 
Os diferentes ensaios supracitados, sobre o organismo modelo C. elegans foram 
desenvolvidos no Laboratório de Genética Bioquímica (LGB), Departamento de Biologia 
Celular e Genética da UFRN. 
 
3.9 Ensaio de Viabilidade Celular 
 
Foram avaliadas três linhagens celulares, uma não tumoral (fibroblasto de murino, 
3T3; (NIH/3T3 ATCC® CRL-1658™, Manassas, VA, USA) e duas tumorais (células 
humanas de câncer cervical, HeLa ATCC® CRL-1427™, Manassas, VA, USA e gástrico, 
AGS ATCC® CRL-1739™). As culturas foram tratadas com os diferentes extratos de M. 
tenella e S. hispanica nas concentrações de 100, 250 e 500 µg/mL, para mensuração da 
proliferação celular pela redução do composto 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo 
de tetrazolina (MTT- (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) a cristais de formazan, pela 
atividade enzimática mitocondrial. Esse ensaio foi realizado de acordo com a metodologia 
descrita por Fernandes-Negreiros et al. (2018) e Mosmann (1983). Procedeu-se o cultivo em 
placa de 96 poços com meio DMEM para células 3T3 e HeLa e meio de Ham F12 para AGS. 
Os meios foram suplementados com soro fetal bovino, SFB (10%), com aproximadamente 5 
x103 células/poço chegando ao volume final de 100 µL por poço. Após adesão das células, o 
meio de cultivo foi removido para realização do carenciamento por 24 h, após as quais foi 
removido o meio e adicionado meio suplementado com SFB e os extratos nas diferentes 
concentrações utilizadas para tratamento durante 24 h. A seguir, foi adicionado o composto 
MTT (1 mg/mL) e incubado por 4 horas. Transcorrido esse período, o meio foi aspirado e 
foram adicionados aos poços 100 µL de etanol PA. A absorbância foi aferida em leitor de 
microplacas a 570 nm. Foi feita a triplicata de cada tratamento e também do controle (apenas 
o meio de cultura), a partir das absorbâncias mensuradas nos grupos, foi feito o cálculo da 
porcentagem de redução do MTT: 
42 
 
 
Redução do MTT (%) = (Absorbância da amostra/Absorbância do controle) x 100 
 
3.10. Avaliação do processo de morte celular por marcação com Anexina V e PI 
 
Células das linhagens HeLa e AGS foram cultivadas nas mesmas condições descritas 
anteriormente, para o ensaio do MTT. Foram selecionados os extratos EEC e EAFC de M. 
tenella e EESh e EASh de S. hispanica a 100 µg/mL de concentração, para teste de 
verificação de apoptpse/necrose de células HeLa. A escolha destes extratos baseou-se nos 
resultados do ensaio de viabilidade celular (MTT). Enquanto que para a linhagem AGS, foram 
avaliados os extratos EAFC e EASh, também baseados nos ensaios de viabilidade celular e 
ainda nos ensaios sobre o nematódeo C. elegans. Para este ensaio, foi escolhida a 
concentração de 1000 µg/mL. 
Após 24 h de tratamento ou não com os extratos, as células aderentes e flutuantes 
foram marcadas com Anexina V e Iodeto de Propídeo (PI), segundo as instruções do 
fabricante do kit Annexin V Apoptosis Detection (AnffymetrixTM e Bioscience