Usosolventeseuteticos-Costa-2020

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Universidade Federal do Rio Grande do Norte 
Programa de Pós-Graduação em 
Engenharia Química 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertação de Mestrado 
 
 
 
 
 
 
 
Uso de Solventes Eutéticos Profundos na Recuperação de Bioativos Obtidos 
A Partir de Rhodotorula mucilaginosa e Aplicação em Sistemas 
Nanoemulsionados 
 
 
 
 
 
 
 
Willyan Araújo da Costa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Natal – RN 
2020 
 
 
 
Willyan Araújo da Costa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Uso de Solventes Eutéticos Profundos na Recuperação de Bioativos Obtidos 
A Partir de Rhodotorula mucilaginosa e Aplicação em Sistemas 
Nanoemulsionados 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa 
de Pós-graduação em Engenharia Química da 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte 
como parte dos requisitos necessários para 
obtenção do título de Mestre em Engenharia 
Química sob a orientação do Prof. Dr. Everaldo 
Silvino dos Santos (PPGEQ – UFRN) e 
coorientação do Prof. Dr. Márcio Ferrari 
(PPGCF – UFRN). 
 
 
 
 
 
 
Natal – RN 
2020 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN 
Sistema de Bibliotecas - SISBI 
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede 
 
Costa, Willyan Araújo da. 
 Uso de solventes eutéticos profundos na recuperação de 
bioativos obtidos a partir de rhodotorula mucilaginosa e 
aplicação em sistemas nanoemulsionados / Willyan Araújo da 
Costa. - 2020. 
 126f.: il. 
 
 Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande 
do Norte, Centro de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em 
Engenharia Química, Natal, 2020. 
 Orientador: Dr. Everaldo Silvino dos Santos. 
 Coorientador: Dr. Márcio Ferrari. 
 
 
 1. Fracionamento - Dissertação. 2. Bioativos - Dissertação. 3. 
Rhodotorula mucilaginosa - Dissertação. 4. Solventes Eutéticos 
Profundos - Dissertação. 5. Nanoemulsão - Dissertação. I. Santos, 
Everaldo Silvino dos. II. Ferrari, Márcio. III. Título. 
 
RN/UF/BCZM CDU 66.07 
 
 
 
Elaborado por Raimundo Muniz de Oliveira - CRB-15/429 
Agradecimentos 
Eu gostaria de iniciar meus agradecimentos por Deus e o Mestre Jesus, sem os quais 
eu não teria forças para seguir em frente e caminhar por onde caminhei. A Eles, meu terno 
agradecimento SEMPRE! 
Agradeço aos amigos espirituais que sempre me acompanham, orientam e guiam. Em 
ambos os planos o amor prevalece e de vocês eu sinto conforto e paz! 
 Também gostaria de agradecer à minha família por todo apoio, compreensão e ajuda 
nos momentos de desgaste físico e mental. Muito obrigado a papai (Robson Costa), mamãe 
(Ângela Costa), Wendel Costa, Jessicka Batista e Lídia Oliveira por todo amor de sempre. 
Amo vocês DEMAIS! 
 Não poderia deixar de registrar meu agradecimento aos novos amigos que a cidade de 
Natal me deu, em especial a: Mizael, Lívio, Franklin e Lucas, por nunca terem me deixado 
sentir sozinho nessa nova jornada. Muito obrigado MESMO e espero levar vocês no meu 
coração sempre! 
 Gostaria de Agradecer também a Carlos Henrique e Valdênio por terem compartilhado 
da moradia comigo durante meu primeiro ano em Natal. Foi a época de adaptação, a mais 
difícil. Sem vocês, eu não teria conseguido. Obrigado! 
 Os agradecimentos precisam ser estendidos a toda FAMÍLIA LEB, mas alguns nomes 
precisam ser destacados... Sendo eles: Prof. Dr. Everaldo Silvino, por toda orientação, 
humildade e acolhimento, Sinara, Julia, Vitor, Ana Laura, Waleska, Catherine, Carlos, 
Cleitiane, Stephanie e Bia por toda amizade e apoio! 
 Também é necessário registrar agradecimento aos membros do PPGEQ-UFRN, em 
especial para o Prof. Dr. Eduardo por sempre acolher muito bem os alunos que vêm de outra 
cidade, a Gustavo por ser zeloso em seu trabalho de manutenção da limpeza do LEB e a todos 
os demais servidores. 
 Ainda com respeito aos novos amigos encontrados na UFRN, gostaria de registrar meu 
afeto por Thaíse, Bia, Marina, Wilza e João por serem tão maravilhosos e por terem me 
divertido MUITO durante todo esse mestrado! 
 Também se faz necessário registrar meus agradecimentos aos laboratórios parceiros 
que colaboraram comigo durante a construção desse trabalho, sendo eles: NUPEG, LTT e 
NUPPRAR, sem vocês eu não teria conseguido fazer MUITA coisa... Essa é a lição de que a 
cooperação e a união fazem a força! 
 Agradeço à Família LaBio, da qual sou originário e sem a qual eu não seria/saberia 1/3 
do que sou/sei hoje... Amo vocês MUIIIITO! 
 Por fim, gostaria de agradecer a CAPES pelo suporte financeiro dado durante todo 
período de execução desse mestrado. 
 No mais, OBRIGADO À VIDA E AO UNIVERSO... Que venham as próximas etapas 
dessa jornada! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DA COSTA, Willyan Araújo – Uso de Solventes Eutéticos Profundos na Recuperação de 
Bioativos Obtidos A Partir de Rhodotorula mucilaginosa e Aplicação em Sistemas 
Nanoemulsionados. Dissertação de Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em 
Engenharia Química, Linha de Pesquisa: Processos Químicos, Catalíticos e Biotecnológicos, 
Nata/RN, Brasil. 
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos 
Coorientador: Prof. Dr. Márcio Ferrari 
 
Resumo: A presente dissertação teve como objetivo a obtenção de bioativos lipídicos por 
meio de um bioprocesso utilizando-se Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 como catalisador 
e melaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono, a recuperação das mesmas por meio de 
um processo verde utilizando solventes eutéticos profundos e a obtenção de um sistema 
nanoemulsionado para aplicação cosmética. Os resultados da primeira etapa mostraram que o 
uso de melaço (CM) na produção simultânea dos ativos pela levedura foi capaz de promover a 
obtenção de rendimentos em lipídeos totais e carotenoides totais (16,50 % ± 0,68% e 0,053 ± 
0,001 mg.g-1, respectivamente) semelhantes ao obtido com o cultivo em meio sintético (S) 
(15,36 ± 1,36 % e 0,051 ± 0,001 mg.g-1). Com respeito à produção de ácidos graxos, o cultivo 
CM mostrou-se ser também se destacou uma vez que o mesmo apresentou uma composição 
rica em ácido oleico (74,05%). Com respeito à suplementação com extrato de levedura 
(CMEL), verificou-se que a mesma não foi capaz de melhorar os rendimentos em relação às 
outras condições. Na segunda parte da pesquisa, verificou-se que o uso de solventes eutéticos 
profundos à base de cloreto de colina foi capaz de promover o aumento da permeabilidade das 
células da levedura e uma correlata recuperação fracionada dos carotenoides. A maior 
recuperação de carotenoides totais (0,110 ± 0,005 mg.mL-1) se deu com o usos do solvente 
sintetizado com cloreto de colina e glicerol (ChGy). A análise do perfil de ácidos graxos dos 
óleos obtidos após cada um dos tratamentos revelou que não houve variação qualitativa nos 
óleos obtidos. A análise termogravimética da biomassa microbiana, antes e após os 
tratamentos realizados, revelou que a depender da espécie química utilizada na síntese do 
solvente, o mecanismo de interação do mesmo para com a parede celular muda 
completamente. Um planejamento experimental (2³) revelou a influência direta que a 
temperatura de processo, a adição de etanol no solvente e o tempo de processo exercem sobre 
toda operação de recuperação. Na última etapa desta pesquisa, constatou-se a forte atividade 
antioxidante do extrato obtido, a qual foi atribuída não só a presença de carotenoides (0,10 ± 
0,02 mg.g-1) mas também dos diferentes açúcares redutores presentes em sua composição, 
como: xilose (2,19 ± 0,02 mg.g-1), glicose (1,03 ± 0,00 mg.g-1) e arabinose (0,36 ± mg.g-1). 
Após a determinação do valor de concentração de meia inibição (IC50) para a atividade 
antioxidante do extrato (10,84 mg.mL-1), o mesmo foi adicionado a 2,5% em uma fase oleosa 
compostapor triglicerídeos de ácido cáprico e caprílico e conservante. A fase foi então 
emulsionada com água destilada (fase aquosa) e Tween 20 (tensoativo), verificando-se então a 
formação de dois sistemas de escalas nanométricas, F1 (42,90 ± 8,17 nm) e F2 (118,85 ± 1,44 
nm). Ambos sistemas obtidos foram caracterizados quanto ao seu pH, potencial zeta e índice 
de polidispersividade (PDI). Após os ensaios de estabilidade, constatou-se que os sistemas se 
apresentaram estáveis em relação ao ensaio de centrifugação e estáveis com relação ao 
comportamento cinético de acordo com as condições térmicas impostas, após 30 dias de 
estocagem. A análise reológica também foi realizada constatando-se que o comportamento 
dos mesmos variou de newtoniano (F1) para não-newtoniano (F2) em função da composição 
da fase oleosa no sistema final. Por fim, os resultados obtidos mostram a possibilidade de 
atrelar à produção de bioativos lipídicos por biocatálise à uma recuperação fracionada e 
possível aplicação na área dos cosméticos. 
 
Palavras-chave: Fracionamento, Bioativos, Rhodotorula mucilaginosa, Solventes Eutéticos 
Profundos, Nanoemulsão. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Willyan Araújo da Costa 
 
 
 
Uso de Solventes Eutéticos Profundos na Recuperação de Bioativos Obtidos 
A Partir de Rhodotorula mucilaginosa e Aplicação em Sistemas 
Nanoemulsionados 
 
 
 
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa 
de Pós-graduação em Engenharia Química da 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte 
como parte dos requisitos necessários para 
obtenção do título de Mestre em Engenharia 
Química sob a orientação do Prof. Dr. Everaldo 
Silvino dos Santos (PPGEQ – UFRN) e 
coorientação do Prof. Dr. Márcio Ferrari 
(PPGCF – UFRN). 
 
 
Aprovado (a) em 19 de fevereiro de 2020. 
 
Banca Examinadora: 
 
 
 
Da Costa, Willyan Araújo – Use of Deep Eutectic Solvents for the Recovery of Bioactivie 
obtained from Rhodotorula mucilaginosa and Application in Nanoemulsified systems. 
Dissertação de Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Linha 
de Pesquisa: Processos Químicos, Catalíticos e Biotecnológicos, Natal/RN, Brasil. 
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos 
Coorientador: Prof. Dr. Márcio Ferrari 
 
Abstract: The present study aimed to obtain lipo-molecules by a bioprocess using 
Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 cells as catalyst and sugarcane molasses as carbon 
source, evaluated a green extraction process of them using Deep Eutectic Solvents and lastly 
to obtain nanoemulsioned systems containing these biosubstances in view of a future 
application in the cosmetic industry. The results obtained in the first part of this work showed 
that the use of molasse (CM) in the bioactive simultaneous production by the yeast was able 
to produce the same content of total lipids and total carotenoids (16.50 % ± 0.68% e 0.053 ± 
0.001 mg.g-1) as a synthetic medium (CS) (15.36 ± 1.36 % e 0.051 ± 0.001 mg.g-1). With 
regards to the fatty acids production, the CM cultivation showed the most interesting profile 
once it present a great content of oleic acid (74,05%). The yeast extract supplementation 
(CMEL) did not provide an improvement in microbial oil-production once it redirected the 
yeast metabolism to others actives instead of secondary metabolites obtainment. In the second 
part of this research, the use of four choline chloride based Deep Eutectic Solvents was 
verified in relation to their ability in to improve the yeast cell permeability and total 
carotenoids recuperation. The best result for the total carotenoid recovery (0.110 ± 0.005 
mg.mL-1) was achieved using the solvent synthetized with glycerol (ChGy). The results of 
the fatty acids analysis showed that DES treatments did not influence in the oil composition. 
The thermogravimetric analysis of the yeast cells, before and after the treatments, revealed 
that the solvent interaction with the cells were conditioned to the chemical specie used in DES 
synthesis. An experimental design (2³) evidenced the process dependence in relation to the 
temperature, etanol addition in the solvent and extraction time. In the last part of this 
research, it was found a strong antioxidant activity for the eutectic extract obtained from the 
Rhodotorula cells and it was conclude that this characteristic was not only due the carotenoid 
presence (0.10 ± 0.02 mg.g-1) but also because of the content of reducing sugars, such as: 
xylose (2.19 ± 0.02 mg.g-1), glucose (1.03 ± 0.00 mg.g-1) and arabinose (0.36 ± 0.00 mg. g-1). 
After the determination of the inhibitory concentration for oxidative species (IC50) (10.84 
mg.mL-1), the extract was added at 2,5% in an oil phase formed by caprylic/capric 
triglycerides and preservative. The phase was emulsified with distilled water (aqueous phase) 
and Tween 20 (surfactant) and the formation of nanoemulsions was noticed, F1 (42.90 ± 8.17 
nm) and F2 (118.85 ± 1.44 nm). Both systems were characterized in relation to their pH, zeta 
potential and polydispersity index (PDI). After the stability tests, the systems showed to be 
stable in relation to the centrifugal action and variant in kinetic terms according to the storage 
temperature (30 days). The rheology of the nanoemulsions was also investigated and it 
revealed that the behavior in ration to a shear stress was conditioned to the oil content, which 
varied from Newtonian (F1) to non-Newtonian (F2) as a function of the oil phase content. At 
leats, the results present here were able to show that the bioproduction of oleaginous 
compounds can be attached to a fractional recovery and cosmetical application. 
 
Key-Words: Fractionation, Bioactive, Rhodotorula mucilaginosa, Deep Eutectic Solvents, 
Nanoemulsion. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“E quanto mais dor recebo, mais percebo que sou indestrutível...” 
(VITTAR, 2018). 
 
 
Sumário 
1. Introdução ........................................................................................................................... 23 
2. Produção Simultânea de Óleos-lipídeos e Carotenoides por Rhodotorula mucilginosa 
CCT3892 Utilizando Melaço de Cana-de-açúcar como Fonte de Carbono ...................... 27 
2.1. Revisão Bibliográfica ....................................................................................................... 27 
2.1.1. Óleos-lipídeos e carotenoides: características bioquímicas, aplicações e obtenção 
por via biotecnológica ............................................................................................................. 27 
2.1.1.1. Lipídeos: aspectos bioquímicos e funcionais ........................................................... 27 
2.1.1.2. Carotenoides: aspectos bioquímicos, funcionais e aplicações em cosméticos ..... 30 
2.1.1.3. Produção de óleos-lipídeos e carotenoides por leveduras do gênero Rhodotorula 
como uma alternativa viável à indústria de bioativos ......................................................... 34 
2.2. Objetivos .......................................................................................................................... 37 
2.2.1. Objetivos gerais ............................................................................................................ 37 
2.2.2. Objetivos específicos ..................................................................................................... 37 
2.3. Materiais e métodos ........................................................................................................ 38 
2.3.1. Obtenção do melaço de cana-de-açúcar ..................................................................... 38 
2.3.2. Microrganismo e manutenção.................................................................................... 39 
2.3.3. Inóculo .......................................................................................................................... 39 
2.3.4. Bioprodução dos ativos lipídicos ................................................................................. 40 
2.3.5. Caracterização físico-química do melaço de cana-de-açúcar ................................... 40 
2.3.5.1 Determinação do teor de sólidos solúveis totais - ºBrix ........................................... 40 
2.3.5.2. Potencial hidrogeniônico (pH) .................................................................................. 41 
2.3.5.3. Proteínas totais ........................................................................................................... 41 
2.3.5.4. Açúcares Redutores ................................................................................................... 41 
2.3.5.4. Quantificação dos açúcares redutores por Cromatografia Líquida de Alta 
Eficiência (CLAE) .................................................................................................................. 41 
2.3.6. Concentração celular (X) ............................................................................................. 41 
2.3.7. Quantificação do teor de lipídeos totais ...................................................................... 42 
2.3.8. Quantificação da concentração de carotenoides totais .............................................. 42 
2.3.9. Determinação do perfil de ácidos graxos .................................................................... 42 
2.3.10. Obtenção dos parâmetros da cinética de crescimento e dos coeficientes 
estequiométricos de conversão .............................................................................................. 43 
2.3.10.1. Produtividade celular (Px)....................................................................................... 43 
2.3.10.2. Velocidade específica máxima de crescimento (µmáx) ........................................... 43 
2.3.10.3. Tempo de geração (Tg) ............................................................................................ 43 
2.3.11. Análise Estatística ....................................................................................................... 44 
2.4. Resultados e Discussões .................................................................................................. 44 
2.4.1. Caraterização do melaço de cana-de-açúcar.............................................................. 44 
2.4.2. Crescimento da levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 no melaço de cana-
de-açúcar ................................................................................................................................. 45 
2.4.3. Avaliação da produção de ácidos graxos, óleos-lipídeos e carotenoides nas 
diferentes condições de cultivo .............................................................................................. 50 
2.5. Considerações .................................................................................................................. 54 
3. Recuperação Fracionada de Bioativos Oleaginosos Produzidos por Rhodotorula 
mucilaginosa CCT3892 Utilizando Solventes Eutéticos Profundos .................................... 57 
3.1. Revisão Bibliográfica ....................................................................................................... 57 
3.1.1. Solventes Eutéticos Profundos como uma alternativa à extração de Bioativos ...... 57 
3.2. Objetivos ........................................................................................................................... 62 
3.2.1. Objetivos gerais ............................................................................................................ 62 
3.2.2. Objetivos específicos ..................................................................................................... 62 
3.3. Materiais e métodos ........................................................................................................ 63 
3.3.1. Microrganismo e manutenção ..................................................................................... 63 
3.3.2. Inóculo ........................................................................................................................... 63 
3.3.3.Pro dução dos óleos-lipídeos e carotenoides pela levedura Rhodotorula mucilaginosa 
CCT3892 .................................................................................................................................. 63 
3.3.4. Avaliação do comportamento dos compostos oleaginosos produzidos pela levedura 
em relação ao estresse térmico .............................................................................................. 64 
3.3.5. Síntese dos Solventes Eutéticos Profundos (DES) à base de cloreto de colina ........ 64 
3.3.6. Determinação da viscosidade dos DES à base de cloreto de colina .......................... 64 
3.3.7. Avaliação preliminar do efeito de diferentes tratamentos com DES na recuperação 
dos compostos oleaginosos de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 ................................... 64 
3.3.8. Quantificação do teor de lipídeos totais e carotenoides totais .................................. 65 
3.3.9. Determinação do perfil de ácidos graxos .................................................................... 65 
3.3.10. Avaliação da permeabilidade das células de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 
por termogravimetria ............................................................................................................. 65 
3.3.11. Avaliação da temperatura, adição de etanol como adjuvante e do tempo de 
extração na habilidade de extração do DES ......................................................................... 65 
3.3.12.Análise estatística ......................................................................................................... 66 
3.4. Resultados e Discussões .................................................................................................. 66 
3.4.1. Avalição da temperatura de secagem das células de Rhodotorula mucilaginosa 
CCT3892 .................................................................................................................................. 66 
3.4.2. Avaliação da habilidade dos DES de atuarem no processo de recuperação dos 
ativos oleaginosos .................................................................................................................... 68 
3.4.3. Avaliação do Efeito dos Tratamentos com DES Sob o Perfil de Ácidos Graxos da 
Levedura .................................................................................................................................. 71 
3.4.4. Caracterização termogravimétrica das células de Rhodotorula mucilaginosa 
CCT3892 após os tratamentos avaliados .............................................................................. 73 
3.4.5. Influência da temperatura, adição de etanol no DES como adjuvante e do tempo 
de extração sob o aumento da permeabilidade das células de levedura e acúmulo de 
carotenoides na fase do solvente ............................................................................................ 74 
3.5. Considerações .................................................................................................................. 83 
4. Obtenção de Nanoemulsões Para Uso Cosmético Contendo Extrato Antioxidante Obtido A 
Partir de Células de Rhodotorula mucilaginosa Pós Tratamento com Solventes Eutéticos 
Profundos ............................................................................................................................. 85 
4.1. Revisão Bibliográfica ....................................................................................................... 85 
4.1.1. Sistemas Nanoemulsionados:Aplicações, Conceitos e Formação ............................ 85 
4.1.2. Inserção de moléculas bioativas em sistemas nanoemulsioanodos e sua 
aplicabilidade na indústria de cosméticos ............................................................................ 88 
4.2. Objetivos .......................................................................................................................... 92 
4.2.1. Objetivos gerais ............................................................................................................ 92 
4.2.2. Objetivos específicos ..................................................................................................... 92 
4.3. Materiais e métodos ........................................................................................................ 93 
4.3.1. Obtenção do Extrato Eutético de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 ................... 93 
4.3.2. Caracterização do Extrato Eutético ............................................................................ 93 
4.3.2.1. Teor de Açúcares Redutores e Açúcares Redutores Totais ................................... 93 
4.3.2.2. Quantificação qualitativa dos Açúcares Redutores por Cromatografia Líquida 
de Alta Eficiência (CLAE) ..................................................................................................... 94 
4.3.2.3. Determinação do Teor de Proteínas Totais ............................................................. 94 
4.3.2.4. Quantificação do teor de carotenoides totais .......................................................... 94 
4.3.2. Avaliação in vitro da Ação Antioxidante do Extrato Eutético ................................. 94 
4.3.3. Obtenção das Nanoemulsões contendo o Extrato Eutético da Levedura ............... 95 
4.3.4. Caracterização das Nanoemulsões .............................................................................. 97 
4.3.5. Avaliação da Estabilidade das Nanoemulsões Obtidas Frente à Ação de uma Força 
Centrífuga ............................................................................................................................... 98 
4.3.6. Avaliação do Comportamento Reológico das Nanoemulsões Obtidas..................... 98 
4.3.7. Avaliação da Estabilidade Cinética das Nanoemulsões ............................................ 98 
4.3.8. Análise estatística dos resultados ................................................................................ 98 
4.4. Resultados e Discussão .................................................................................................... 99 
4.5. Considerações ................................................................................................................ 113 
5. Conclusões.........................................................................................................................114 
Referências............................................................................................................................116 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lista de Figuras 
- Capítulo 1 - 
 
Figura 1.1 - Fluxograma geral dos processos estudados/desenvolvidos no presente estudo. 
Fonte: Autor. ............................................................................................................................ 25 
 
- Capítulo 2 - 
Figura 2.1 - Representação da estrutura de algumas moléculas de ácidos graxos. Fonte: Voet 
e Voet (2013) (Adaptado pelo autor). ....................................................................................... 29 
Figura 2.2 - Algumas moléculas de xantofilas (esquerda) e carotenoides (direita). Fonte: 
Autor. ........................................................................................................................................ 31 
Figura 2.3 - Mecanismo simplificado da síntese de vitamina A e seus subsequentes produtos. 
Fonte: Nelson e Cox (2014). .................................................................................................... 32 
Figura 2.4 - Aves com penas coloridas devido aos carotenoides contidos na sua cadeia 
alimentar. Fonte: Nelson e Cox (2014). .................................................................................. 32 
Figura 2.5 - Fluxograma geral dos procedimentos experimentais realizados no capítulo 2. 
Fonte: Autor. ............................................................................................................................ 38 
Figura 2.6 - Aspecto do melaço de cana-de-açúcar utilizado nos bioprocessos avaliados. 
Fonte: Autor. ............................................................................................................................ 39 
Figura 2.7 - Aspecto da levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 crescida em placa de 
Petri (a) e no inóculo após 24 h (b). Fonte: Autor. .................................................................. 40 
Figura 2.8 - Células de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 vistas por microscópio. Fonte: 
Autor. ........................................................................................................................................ 46 
Figura 2.9 - Perfis de crescimento da levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 (a) e de 
consumo de açúcares redutores (b) para os cultivos CS (▪), CM (●) e CMEL (♦). Fonte: 
Autor. ........................................................................................................................................ 47 
Figura 2.10 – Resultados obtidos para os fatores de conversão de substrato em células (YX/S), 
lipídeos (YL/S) e carotenoides (YC/S) nos cultivos CS, CM e CMEL. Fonte: Autor. *Diferentes 
letras indicam diferenças estatisticamente significativas entre as médias (p < 0,05). .............. 48 
Figura 2.11 - Resultados obtidos para a produtividade celular (PX), velocidade específica 
máxima de crescimento (μmáx) e para o tempo de geração (Tg) para os cultivos CS, CM e 
CMEL. Fonte: Autor. *Diferentes letras indicam diferenças estatisticamente significativas 
entre as médias (p < 0,05). ........................................................................................................ 49 
Figura 2.12 – Aspectos dos cultivos realizados antes (a) e após 96h de processo (b) para as 
condições CS, CM e CMEL. Fonte: Autor. ............................................................................. 50 
Figura 2.13 - Aspecto das biomassas microbianas obtidas após 96 h de crescimento da 
levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 nos cultivos CS (1), CM (2) e CMEL (3). 
Fonte: Autor. ............................................................................................................................ 51 
Figura 2.14 - Percentual de lipídeos totais (a) e carotenoides totais (b) acumulados pela 
levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 após 96 h de cultivo nas condições CS, CM e 
CMEL. Fonte: Autor. *Diferentes letras indicam diferenças estatisticamente significativas 
entre as médias (p < 0,05). ........................................................................................................ 51 
- Capítulo 3 – 
Figura 3.1 - Típico diagrama de fases para uma mistura eutética. Fonte: Smith, Abbott e 
Ryder (2014). Nota: mpA e mpB são os pontos onde os componentes A e B apresentam-se 
puros e ΔTf é a diferença de temperatura entre o sistema eutétio e a temperatura que sereia 
apresentada caso o mesmo não se formasse. ............................................................................ 59 
Figura 3.2 - Espécies químicas utilizadas como aceptoras e doadores de ligação de 
hidrogênio na síntese de DES. Fonte: Florindo et al. (2018) (Adaptado pelo autor). ............. 61 
Figura 3.3 - Fluxograma geral dos procedimentos experimentais realizados no capítulo 3. 
Fonte: Autor. ............................................................................................................................ 63 
Figura 3.4 - Efeito da temperatura de secagem na recuperaçãode bioativos lipídicos de 
Rhodotorula mucilaginosa CCT3892. Fonte: Autor. Nota: Todas as porcentagens de 
recuperação foram calculadas tomando o resultado à 60 ºC como referencial. *Diferentes 
letras indicam diferenças estatisticamente significativas entre as médias (p < 0,05) ............... 67 
Figura 3.5 - Aspectos do meio de cultivo (a) e das células de Rhodotorula mucilaginosa 
CCT3892 obtidas após 96 h de cultivo (b). Fonte: Autor........................................................ 67 
Figura 3.6 - Recuperação de lipídeos totais e carotenoides totais das células de Rhodotorula 
mucilaginosa CCT3892 (a) e a concentração de carotenoides totais na fase dos DES (b) após 
todos os tratamentos avaliados. Fonte: Autor. *Diferentes letras indicam diferenças 
estatisticamente significativas entre as médias (p < 0,05). ....................................................... 69 
Figura 3.7 - Análise termogravimétrica das células de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 
após todos os tratamentos realizados (a) e suas respectivas curvas derivadas (b). Fonte: Autor.
 .................................................................................................................................................. 73 
Figura 3. 8 - Estimativa dos efeitos (Diagrama de Pareto) das variáveis independentes sob a 
migração de carotenoides para a fase do DES (a) e sob o teor de lipídeos que remanesceram 
nas células (b). Fonte: Autor. ................................................................................................... 76 
Figura 3.9 - Aspecto dos extratos lipídicos obtidos das células de Rhodotorula mucilaginosa 
CCT3892 após os diferentes tratamentos com o DES ChGy. Nota: Os termos “A” e “B” nas 
figuras referem-se ao fato de o frasco conter o obtido na primeira ou segunda replica de cada 
ensaio, respectivamente. Fonte: Autor..................................................................................... 78 
Figura 3.10 - Aspecto do DES ChGy antes e após os diferentes ensaios de recuperação dos 
carotenoides presentes nas células de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892. Fonte: Autor. .. 79 
Figura 3. 11 - Superfícies de resposta para o efeito da temperatura (T) e da concentração de 
etanol (CE) sob a liberação dos lipídeos totais (a) e o acúmulo de carotenoides na fase do 
solvente ChGy (b) após o tratamento. Fonte: Autor. Nota: Para a representação gráfica, a 
variável t foi mantida em seu valor intermediário. ................................................................... 81 
Figura 3. 12 - Superfícies de resposta para o efeito da temperatura (T) e do tempo de 
processo (t) sob a liberação dos lipídeos totais (a) e o acúmulo de carotenoides na fase do 
solvente ChGy (b) após o tratamento. Fonte: Autor. Nota: Para a representação gráfica, a 
variável CE foi mantida em seu valor intermediário. ............................................................... 81 
Figura 3. 13 - Superfícies de resposta para o efeito da concentração de etanol (CE) e do 
tempo de processo (t) sob a liberação dos lipídeos totais (a) e o acúmulo de carotenoides na 
fase do solvente ChGy (b) após o tratamento. Fonte: Autor. Nota: Para a representação 
gráfica, a variável T foi mantida em seu valor intermediário. .................................................. 82 
Figura 3. 14 - Futuro processo integrativo de extração e aproveitamento dos lipo-compostos 
obtidos a partir das células da levedura. Fonte: Autor............................................................. 82 
- Capítulo 4 – 
Figura 4.2 - Obtenção de uma nanoemulsão O/A a partir de uma emulsão A/O pelo método 
da inversão de fase. Fonte: Komaiko e McClements (2018) (Adaptado pelo autor). ............. 88 
Figura 4. 3 - Fluxograma dos procedimentos experimentais realizados no presente capítulo. 
Fonte: Autor. ............................................................................................................................ 93 
Figura 4.4 – Diagrama pseudoternário para o sistema água (A)- tween 20 (T)-Crodamol 
GTCC (O). Fonte: Autor. ........................................................................................................ 96 
Figura 4.5 - Avaliação in vitro da ação antioxidante do extrato eutético de Rhodotorula 
mucilaginosa CCT3892 pela inibição dos radicais DPPH (a) e ABTS (b). Fonte: Autor. .... 101 
Figura 4.6 - Correlação entre os dados obtidos para a inibição dos radicais DPPH e ABTS 
para todas as concentrações estudados (a) e para a faixa de 90 a 330 mg.mL-1 (b). Fonte: 
Autor. ...................................................................................................................................... 102 
Figura 4.7- Aspectos visuais das microemulsões (esquerda) e dos sistemas emulsionados 
(direita) das formulações F1 (a), F2 (b), F3 (c) e F4 (d). Fonte: Autor. ................................ 103 
Figura 4.8 – Aspectos macroscópicos das formulações F1 (a), F2 (b), F3 (c) e F4 (d) 24h 
após suas obtenções. Fonte: Autor......................................................................................... 104 
Figura 4.9 - Aspectos macroscópicos das formulações F1 e F2 antes e após a ação do campo 
centrífugo. Fonte: Autor. ....................................................................................................... 105 
Figura 4.10 - Diâmetro hidrodinâmico médio (Dp) e Potencial Zeta (ξ) (a), Índice de 
Polidispersão (PDI) e pH (b) das nanoemulsões F1 e F2 antes e após o ensaio de estabilidade 
em relação à ação de um campo centrífugo. Fonte: Autor. ................................................... 106 
Figura 4.11 - Distribuição do tamanho de gotículas para as nanoemulsões F1 (a) e F2 (c) 
antes e depois ((b) e (d), respectivamente) dos testes de resistência a ação de uma força 
centrífuga. Fonte: Autor......................................................................................................... 106 
Figura 4.12 - Comportamento reológico da nanoemulsão F1 em relação à taxa de 
cisalhamento (a) e a sua viscosidade (b). Fonte: Autor. ........................................................ 108 
Figura 4.13 - Comportamento reológico da nanoemulsão F2 em relação à taxa de 
cisalhamento (a) e a sua viscosidade (b). Fonte: Autor. ........................................................ 108 
Figura 4.14 – Resultados da cinética de estabilidade da nanoemulsão F1 em relação ao 
tamanho hidrodinâmico médio (Dp) (a), índice de polidispersão (PDI) (b); pH (c) e ao 
potencial zeta (d) durante 30 dias de estocagem a 4, 25 e 45 ºC. Fonte: Autor. .................. 109 
Figura 4.15 - Resultados da cinética de estabilidade da nanoemulsão F2 tamanho 
hidrodinâmico médio (Dp) (a), índice de polidispersão (PDI) (b); pH (c) e ao potencial zeta 
(d) durante 30 dias de estocagem a 4, 25 e 45 ºC. Fonte: Autor............................................ 110 
Figura 4.16 - Aspectos apresentados pela nanoemulsão F1 em T0 (a) e em T30 a 4 ºC (b), 25 
ºC (c) e 45 ºC (d). Fonte: Autor. ............................................................................................ 112 
Figura 4.17 - Aspectos apresentados pela nanoemulsão F2 em T0 (a) e em T30 a 4 ºC (b), 25 
ºC (c) e 45 ºC (d). Fonte: Autor. ............................................................................................ 112 
Figura 4.18 - Curvas monomodal de distribuição de Dp para a nanoemulsão F1 em T0 (a) e 
T30 a 4 ºC (b), 25 ºC (c) e 45 ºC (d). Fonte: Autor. .............................................................. 112 
Figura 4.19 - Curvas monomodal de distribuição de Dp para a nanoemulsão F1 em T0 (a) e 
T30 a 4 ºC (b), 25 ºC (c). Fonte: Autor. ................................................................................. 113 
 
Lista de Tabelas 
 
- Capítulo 2- 
Tabela 2.1 - Ácidos graxos biológicos mais comuns: nomenclatura, estrutura e solubilidade 
em água. ....................................................................................................................................29 
Tabela 2.2 - Produtos cosméticos enriquecidos com carotenoides.......................................... 33 
Tabela 2.3 - Produção de óleos-lipídeos e carotenoides por diferentes microrganismos 
empregando-se diferentes substratos. ....................................................................................... 36 
Tabela 2.4 - Caracterização físico-química do melaço de cana-de-açúcar. ............................. 45 
Tabela 2.5 - Perfil de ácidos graxos obtidos para cada condição de cultivo. .......................... 54 
 
- Capítulo 3- 
Tabela 3.1 - Configurações e composições de Solventes Eutéticos Profundos Naturais 
(NADES) já reportados na literatura. ....................................................................................... 60 
Tabela 3.2 - Viscosidades dos DES utilizados no estudo. ....................................................... 68 
Tabela 3.3 - Perfis de ácidos graxos obtidos para extratos oleosos de Rhodotorula 
mucilaginosa CCT3892 após os tratamentos com DES e ácido sulfúrico. .............................. 72 
Tabela 3. 4 – Conjunto de tratamentos realizado durante a execução do planejamento 
experimental e os respectivos resultados experimentais. ......................................................... 75 
Tabela 3.5 - Tabela da ANOVA para o modelo que correlaciona as variáveis independentes 
com o teor de lipídeos que remanesceram nas células após os tratamentos com o DES ChGy.
 .................................................................................................................................................. 77 
Tabela 3.6 - Tabela da ANOVA para o modelo que correlaciona as variáveis independentes 
com o teor de carotenoides que migraram para a fase do DES ChGy após o tratamento. ....... 78 
 
-Capítulo 4- 
Tabela 4.1 - Propriedades apresentadas pelos diferentes tipos de sistemas emulsionados. .... 86 
Tabela 4.2 - Caracterização do tipo de sistema emulsionado com base no seu aspecto visual e 
no efeito de espalhamento da luz. ............................................................................................. 87 
Tabela 4.3 - Pesquisas sobre a obtenção de extratos ricos em bioativos com aplicação 
cosmética. ................................................................................................................................. 89 
Tabela 4.4 - Uso de diferentes microalgas e cianobactérias como produtoras de bioativos de 
interesse para área cosmética. ................................................................................................... 90 
Tabela 4.5 - Substâncias empregadas nas fases oleosa e aquosa das nanoemulsões obtidas. . 96 
Tabela 4.6 - Composição mássica das microemulsões (inicial) e nanoemulsões (final) 
avaliadas. .................................................................................................................................. 97 
Tabela 4.7 - Caracterização Bioquímica do Extrato Eutético de Rhodotorula mucilaginosa 
CCT3892. ................................................................................................................................. 99 
Tabela 4.8 - Modelos matemáticos, parâmetros reológicos e ajustes obtidos para as 
nanoemulsões F1 e F2. ........................................................................................................... 108 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Capítulo 1: 
Introdução 
 
_____________________________________________ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertação de Mestrado – PPGEQ (UFRN) DA COSTA, Willyan Araújo 
___________________________________________________________________________ 
23 
 
1. Introdução 
 
Nas últimas décadas vem sendo observada uma tendência global em se explorar 
tecnologias e processos baseados no conceito de química verde (COSTA et al., 2013). Nesse 
contexto ainda pode-se destacar, como razão para tais modificações, as inúmeras cobranças 
por parte da sociedade e das entidades competentes quanto às questões da sustentabilidade 
(SILVA, 2016). 
Dentro deste cenários, os processos biotecnológicos vêm se destacando cada vez mais 
como uma solução a essas questões, uma vez que os mesmos são capazes de oferecer rotas 
alternativas para a obtenção de insumos e produtos, que assumem cada vez mais uma 
conotação ecologicamente correta (SILVA et al., 2017). 
Com relação a este cenário competitivo, o Brasil não tem se destacado quando 
comparado com as grandes potências pois, conforme destacado por Costa et al. (2013), para 
cada US$10,00 gerados pelo ramo da biotecnologia, US$9,00 são arrecadados por indústrias 
americanas. 
Ainda sobre a atuação dos processos biotecnológicos, sabe-se que estes englobam 
inúmeros setores da cadeia industrial global como, por exemplo, a indústria de alimentos e 
novos materiais, mas é na indústria farmacêutica que a biotecnologia vem galgando elevados 
patamares de destaque (MATOS, 2016). 
É através de bioprocessos que novos fármacos menos agressivos ao sistema biológico 
do ser humano vêm sendo obtidas, assim como bioativos e moléculas de alto valor agregado. 
Tal fenômeno tem levado ao surgimento de interligações econômicas entre grandes 
conglomerados farmacêuticos e pequenas empresas produtoras de insumos biotecnológicos 
com o intuito de assim potencializar as capacidades produtivas deste setor em expansão 
(MATOS, 2016; BRASIL, 2017). 
Dentre o vasto leque de biomoléculas atrativas ao mercado farmacêutico, e a outros 
setores industriais, destaca-se a categoria dos lipídeos, em especial as classes dos compostos 
lipídicos. Tais compostos possuem relevante atividade hidratante e antioxidante. Ambos 
bioativos podem ser sintetizados por microrganismos que utilizam resíduos agroindustriais 
como substratos precursores de açúcares redutores e que convertem essas moléculas em 
produtos de interesse da sociedade (SILVA et al., 2015). 
Um dos ramos com alta rotatividade tecnológica e que demanda por novos produtos 
com propriedades antioxidantes e umectantes, dentro do contexto farmacêutico, é a indústria 
Dissertação de Mestrado – PPGEQ (UFRN) DA COSTA, Willyan Araújo 
___________________________________________________________________________ 
24 
 
dos cosméticos. A cosmetologia é ciência que estuda o desenvolvimento e a funcionalidade 
dos produtos cosméticos, sendo um ramo em expansão e que só tem mostrado rentabilidade e 
crescimento de mercado, mesmo em períodos de crise econômica (DINO, 2016). Neste setor 
industrial é evidente a existência de um interesse constante por inovação, buscando-se à 
formulação de produtos multifuncionais que apresentem segurança tanto no cenário da 
aplicação quanto do ponto de vista ambiental. 
Dentro desta temática, o estudo de novos processos extrativos tem sido bastante 
enfatizado. Uma classe de solventes que tem surgido como uma alternativa aos agentes 
convencionais, é a dos Solventes Eutéticos Profundos (do inglês Deep Eutectic Solvents), a 
qual surgiu na literatura de forma mais enfática devido aos estudos realizados por Abbott et 
al. (2004). 
Nesse contexto, a presente dissertação objetivou produzir óleos-lipídeos e 
carotenoides, por síntese bioquímica usando a levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 
cultivada em melaço de cana-de-açúcar, bem como estudar a recuperação dos mesmos 
utilizando-se solventes eutéticos profundos como agentes de recuperação. Por fim, a obtenção 
de sistemas nanoemulsionados contendo o extrato obtido também foi alvo de estudo. 
 A presente dissertação está escrita em cinco capítulos. No capítulo 2, após uma breve 
introdução e uma revisão bibliográfica, apresenta-se os resultados referentes à produção 
simultânea dos compostos oleaginosos pela levedura em questão. No capítulo 3 apresenta-se 
uma abordagem acerca do uso desolventes eutéticos profundos na recuperação das 
biomoléculas alvo, uma sugestão acerca do seu modo de interação com as células e variáveis 
de processo chaves. No capítulo 4, é apresentado o estudo acerca da atividade antioxidante e 
possibilidade de nanoemulsionamento dos bioativos obtidos. Por fim, no capítulo 5 
apresenta-se as conclusões finais do trabalho. 
 A Figura 1.1 apresenta um fluxograma geral a respeito de todo estudo realizado bem 
como da conexão existente entre as etapas apresentas em cada um dos capítulos reportados 
acima. 
 
Dissertação de Mestrado – PPGEQ (UFRN) DA COSTA, Willyan Araújo 
___________________________________________________________________________ 
25 
 
 
Figura 1.1 - Fluxograma geral dos processos estudados/desenvolvidos no presente estudo. 
Fonte: Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Capítulo 2: 
Produção Simultânea de Óleos-lipídeos e 
Carotenoides por Rhodotorula mucilaginosa 
CCT3892 Utilizando Melaço de Cana-de-açúcar 
como Fonte de Carbono 
 
_____________________________________________ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertação de Mestrado – PPGEQ (UFRN) DA COSTA, Willyan Araújo 
___________________________________________________________________________ 
27 
 
 
2. Produção Simultânea de Óleos-lipídeos e 
Carotenoides por Rhodotorula mucilginosa CCT3892 
Utilizando Melaço de Cana-de-açúcar como Fonte de 
Carbono 
Este capítulo apresenta os resultados concernentes à avaliação da produção de óleos-
lipídeos, ácidos graxos essenciais e carotenoides pela levedura Rhodotorula mucilaginosa 
CCT3892 por cultivo submerso utilizando melaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono. 
Foram avaliadas três condições de cultivo das quais duas foram elaboradas empregando-se o 
melaço com (CMEL) e sem a suplementação de extrato de levedura (CM). Uma terceira 
condição foi elaborada como um padrão para fins de comparação, a mesma consistiu de um 
meio sintético no qual foi utilizado glicose e outros macro/micronutrientes (CS). Os 
resultados aqui registrados foram organizados na forma do artigo intitulado “Oil-lipids, 
Carotenoids and Fatty Acids Simultaneous Production by Rhodotorula mucilaginosa 
CCT3892 Using Sugarcane Molasses as Carbon Source”, o qual foi submetido e encontra-se 
aceito para publicação pelo periódico Brazilian Journal of Food Technology (Qualis CAPES: 
B2). 
2.1. Revisão Bibliográfica 
2.1.1. Óleos-lipídeos e carotenoides: características bioquímicas, aplicações e 
obtenção por via biotecnológica 
2.1.1.1. Lipídeos: aspectos bioquímicos e funcionais 
O termo “lipídeos” vem do grego lipos, que significa gordura. As moléculas 
pertencentes a essa classe são conhecidas por serem substâncias que se mostram solúveis em 
solventes como hexano e clorofórmio e insolúveis, ou pouco solúveis, em água. Na natureza 
existem muitos exemplos de compostos lipídicos como as gorduras, os óleos, certas vitaminas 
e hormônios e a maioria dos componentes não-proteicos das membranas biológicas (VOET e 
VOET, 2013). 
 Nelson e Cox (2014) evidenciam a importância das moléculas lipídicas ao 
mencionarem as várias funções biológicas exercidas pelas mesmas, como por exemplo, o fato 
das gorduras e óleos serem uma das principais formas de armazenamento de energia para 
vários tipos de organismos. Essa classe de compostos também desempenha o papel, embora 
Dissertação de Mestrado – PPGEQ (UFRN) DA COSTA, Willyan Araújo 
___________________________________________________________________________ 
28 
 
que em menor quantidade, de atuarem como cofatores enzimáticos, transportadores de 
elétrons, âncoras hidrofóbicas para várias proteínas, agentes tensoativos associados ao trato 
intestinal, mensageiros intracelulares e pigmentos fotossensíveis (NELSON e COX, 2014). 
 Quanto aos lipídeos associados aos processos de armazenamento energético vale 
ressaltar que os mesmos são em sua maioria derivados de ácidos graxos (NELSON e COX, 
2014). Os ácidos graxos são compostos orgânicos, constituídos majoritariamente por átomos 
de carbono, e que apresentam em sua estrutura química um grupo funcional carboxila (-
COOH). 
Na natureza, são raramente encontrados na forma livre, pois em geral estão ligados a 
outros agrupamentos moleculares em sua forma esterificada. São os principais constituintes 
estruturais dos vários lipídeos encontrados nos sistemas biológicos (VOET e VOET, 2013). 
Do ponto de vista de sua origem, os ácidos graxos são derivados de hidrocarbonetos 
com baixo estado de oxidação. Em sua estruturação, apresentam uma cadeia hidrocarbônica 
que varia de comprimento de acordo com o tipo de ácido graxo, podendo conter de quatro 
(C4) até trinta e seis (C36) carbonos. Essas cadeias orgânicas podem estar na forma saturada ou 
insaturada e esses diferentes graus de insaturação são responsáveis por configurarem as 
propriedades físico-químicas dos mesmos (NELSON e COX, 2014). 
 De um modo geral, os ácidos graxos possuem um número par de átomos de carbono 
em sua estrutura molecular, pois são oriundos de reações envolvendo unidade C2 (acetatos), 
os exemplos mais comuns apresentam de doze a vinte e quatro carbonos estruturais. Outro 
padrão comum às estruturas dessas biomoléculas refere-se à disposição das suas duplas 
ligações. 
Ainda sobre a insaturação apresentada pelos mesmos, quando o composto é 
monoinsaturado verifica-se que insaturação se faz presente entre o nono carbono da cadeia 
(C-9) e o décimo (C-10). Para as espécies poli-insaturadas a posição mais comum é entre o C-
12 e o C-15. (NELSON e COX, 2014; VOET e VOET, 2013). A Figura 2.1 ilustra a estrutura 
molecular dos ácidos esteárico, oleico, linoleico e α-linolênico, exemplos de moléculas 
lipídicas. 
Dissertação de Mestrado – PPGEQ (UFRN) DA COSTA, Willyan Araújo 
___________________________________________________________________________ 
29 
 
 
Figura 2.1 - Representação da estrutura de algumas moléculas de ácidos graxos. 
Fonte: Voet e Voet (2013) (Adaptado pelo autor). 
 A cadeia hidrocarbonada, que configura a estrutura desses bioativos é responsável pela 
baixa solubilidade em água que estes apresentam (NELSON e COX, 2014). Essa 
característica traço é tão marcante para os mesmos que quanto maior o número de 
grupamentos acilas e menor número de duplas ligações, mais hidrofóbico é o composto. No 
caso das estruturas de cadeia curta, a presença do grupo ácido carboxílico possibilita um 
processo de solubilização em água (NELSON e COX, 2014). A Tabela 2.1 apresenta os 
ácidos graxos que são encontrados com maior frequência na natureza. 
Tabela 2.1 - Ácidos graxos biológicos mais comuns: nomenclatura, estrutura e solubilidade 
em água. 
Representação 
simbólica* 
Estrutura Nome 
sistemático** 
Nome comum Solubilidade em 
H2O 
(mg.g-1 de H2O) 
12:0 CH3(CH2)10COOH Ácido 
dodecanóico 
Ácido láurico 0,063 
14:0 CH3(CH2)12COOH Ácido n-
tetradecanóico 
Ácido mirístico 0,024 
16:0 CH3(CH2)14COOH Ácido n-
hexadecanóico 
Ácido palmítico 0,0083 
18:0 CH3(CH2)16COOH Ácido n-
octadecanóico 
Ácido esteárico 0,0034 
20:0 CH3(CH2)18COOH Ácido n-
eicosanóico 
Ácido 
araquídico 
- 
22:0 CH3(CH2)20COOH Ácido 
docosanóico 
Ácido beênico - 
 
24:0 CH3(CH2)22COOH Ácido n-
tetracosanóico 
Ácido 
lignocérico 
- 
16:1 (C-9) CH3(CH2)5CH=C
H(CH2)7COOH 
Ácido cis-9-
hexadecenoico 
Ácido 
palmitoleico 
- 
Dissertação de Mestrado – PPGEQ (UFRN) DA COSTA, Willyan Araújo 
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30 
 
18:1 (C-9) CH3(CH2)7CH=C
H(CH2)7COOH 
Ácido cis-9-
octadecenoico 
Ácido oleico - 
18:2 (C-9 e 12) CH3(CH2)4CH=C
HCH2CH=CH(CH
2)7COOH 
Ácido cis-,cis-
9,12-
octadecadienoico 
Ácido linoleico - 
18:3 (C-9,12 e 
15) 
CH3CH2CH=CHC
H2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH 
Ácido cis-,cis-,cis-
9,12,15-
octadecatrienoico 
Ácido α-
linolênico 
- 
*Número de átomos de carbono: número de duplas ligações. (C-n) indica a posição da dupla ligação; 
**O prefixo “n-” indica que a estrutura é “normal”, ou seja, não ramificada. 
Fonte: Nelson e Cox (2014); Voet e Voet (2013). 
 
Do ponto de vista dermatológico, os lipídeos são compreendidos como constituintes 
essenciais à manutenção da saúde da pele humana uma vez que os mesmos fazem parte de sua 
barreira natural. O estrato córneo é a camada mais superficial da epiderme, a mesma pode ser 
compreendida pelo modelo brick & mortar (tijolo e cimento). Segundo essa abordagem, o 
estrato córneo é constituído por unidades bases (corneócitos) que estão aderidos uns aos 
outros por uma “argamassa” lipídica (ADDOR e AOKI, 2010). 
 De acordo com Addor e Aoki (2010), o grau de hidratação cutânea e o nível de perda 
de água transepidérmica são funções desta camada lipídica. Quando a mesma está defasada 
por alguma razão, há um aumento substancial das chances de aparecimento das dermatites de 
contatos e outras inflamações. 
 Assim, a indústria de cosméticos e fármacos está em constante procura pelo 
desenvolvimento de formulações emolientes (ricas em óleos-lipídeos) e umectantes, uma vez 
que estas são capazes de manter a elasticidade, maciez e flexibilidade da pele 
(MONTENEGRO et al., 2016). 
 O conhecimento da estruturação lipídica da pele tem conduzido às pesquisas que 
visam ao desenvolvimento de produtos nanotecnológicos nos quais seja possível dispersar 
importantes ativos lipídicos em sistemas hidrofílicos e com considerável área superficial de 
contato para, assim, potencializar a penetração destes no estrato córneo. 
 2.1.1.2. Carotenoides: aspectos bioquímicos, funcionais e aplicações em 
cosméticos 
 
 Os carotenoides são pigmentos lipossolúveis, em geral, divididos entre o grupo das 
xantofilas e o dos carotenos, isso de acordo com a presença de átomos de oxigênio 
(xantofilas) ou não (carotenos) em sua estrutura (CHENG e YANG, 2016). Quimicamente, a 
fórmula molecular geral dos carotenoides é C40H56On, sendo n = 0 para os carotenos e n > 0 
para as xantofilas. Tais compostos também são conhecidos devido à sua atividade pró-
Dissertação de Mestrado – PPGEQ (UFRN) DA COSTA, Willyan Araújo 
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31 
 
vitamina A e por apresentar boa estabilidade quanto a diferentes condições de pH e 
aquecimento (DESMARCHELIER e BOREL, 2017). 
 Sobre tais biocompostos, pode-se destacar ainda que o mesmo é o segundo 
agrupamento de agentes colorantes mais abundantes nos sistemas vivos, ficando atrás apenas 
das clorofilas (ESTEBAN et al., 2015). Mais de 750 moléculas deste nicho já foram 
catalogadas sendo essas responsáveis por promover coloração, na faixa do amarelo para o 
vermelho, a todos os meios nos quais estejam dispersas (KACZOR, BARANSKA e 
CZAMARA, 2016). 
Uma informação relevante é que os animais superiores são incapazes de sintetizar 
carotenoides, porém os mesmos precisam ingeri-los pois estes são essenciais à manutenção da 
saúde de todo seu sistema biológico (KACZOR, BARANSKA e CZAMARA, 2016). 
Do ponto de vista nutricional, estudos demonstram, por exemplo, que uma dieta rica 
em tais biomoléculas promove a manutenção da saúde de fetos atrelados a uma gravidez de 
risco e isso se deve ao fato das mesmas serem precursores da vitamina A, uma adjunta 
fundamental à manutenção da visão e das atividades do sistema imunológico (THORNE-
LYMAN e FAWZI, 2012). 
 
Figura 2.2 - Algumas moléculas de xantofilas (esquerda) e carotenoides (direita). 
Fonte: Autor. 
 Ainda sobre a vitamina A, sabe-se que sua biossíntese é um processo natural e comum 
aos seres vivos e que se dá por meio de uma cadeia de reações que se inicia com a clivagem 
de uma molécula de β-caroteno, tal etapa gera duas moléculas de vitamina A, também 
chamada de retinol. Em seguida, a oxidação ocorrida no carbono 15 converte o retinol em 
aldeído (retinal) e esse ao ser oxidado produz o ácido retinóico, espécie ligada ao processo de 
renovação das células da pele (NELSON e COX, 2014). 
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32 
 
Porém, segundo Nelson e Cox (2014), quando excitado pela luz visível, o retinal segue 
outra rota e se transforma na sua configuração trans, essa por sua vez está associada à 
tradução de sinais neurais ligados à visão dos seres humanos e outros animais. A Figura 2.3 
ilustra, de forma simplificada todo mecanismo envolvido nestas etapas bioquímicas. 
Uma das características fundamentais dos carotenoides é o fato dos mesmos 
apresentarem em sua estruturação um arranjo alternado de duplas ligações, tal fato 
fundamenta sua capacidade pigmentante e ação antioxidante (IRAZUSTA et al., 2013). 
 
 
Figura 2.3 - Mecanismo simplificado da síntese de vitamina A e seus subsequentes produtos. 
Fonte: Nelson e Cox (2014). 
 Alguns seres vivos expressam o teor de carotenoides, obtidos por meio de sua 
alimentação, através de uma coloração externa e visível, como no caso de algumas aves e 
algas de tonalidade vermelho-amarelado (Figura 2.4). Outros organismos apresentam a 
capacidade de sintetizar esses bioativos e os mesmos são responsáveis por produzirem ~108 
toneladas destes lipopigmentos por ano (ESTEBAN et al., 2015). 
 
Figura 2.4 - Aves com penas coloridas devido aos carotenoides contidos na sua cadeia 
alimentar. Fonte: Nelson e Cox (2014). 
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33 
 
 Destaca-se que nos seres unicelulares, esses lipídeos pigmentantes, por meio de sua 
ação antioxidante, são responsáveis por manterem a membrana celular intacta dos danos 
causados por radicais livres. Essa propriedade tem sido amplamente aproveitada na indústria e 
a suplementação de alimentos e fármacos com essas moléculas possuindo um mercado global 
amplo e com arrecadação média de US$ 935 milhões (MAROVA et al., 2012). 
 Pesquisas vêm mostrando que o poder antioxidante dos carotenoides tem forte 
atividade na prevenção à diabetes, doenças cardiovasculares, degeneração visual e várias 
doenças imunológicas e neurais (FIERDO e BURDA, 2014). Além disso, esse poder de 
combate às espécies reativas de oxigênio (agentes oxidantes) tem sido amplamente utilizado 
pela indústria de produtos cosméticos em produtos do tipo antienvelhecimento (MESQUITA, 
TEIXEIRA e SERVULO, 2017). 
 A Tabela 2.2 apresenta alguns produtos comerciais que são suplementados com 
carotenoides. 
Tabela 2.2 - Produtos cosméticos enriquecidos com carotenoides. 
Carotenoide Produto Marca/ 
Fabricante 
Aplicação e/ou função 
β-caroteno Beta caroteno Sundown 
Naturals 
Nutricosmético 
β-caroteno e 
licopeno 
Inneov Solar Nestlé e L’oréal Nutricosmético 
Luteína Linha Profuse Ensolei Aché Dermocosmético 
Licopeno Lycopene Sundown 
Naturals 
Nutricosmético 
Luteína Ionzyme® C Quence 
creme 
Skinlumina Dermocosmético 
Fonte: Mesquita, Teixeira e Servulo (2017). 
 
 Com o exposto acima, fica evidente a razão de haver uma grande demanda industrial 
por processos que possam trazer bons rendimentos de obtenção destas biomoléculas. Assim, 
além de poder potencializar os lucros das grandes marcas envolvidas, tais processos 
atenderiam às expectativas de um público consumidor cada vez mais exigente. 
 
 
 
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34 
 
2.1.1.3. Produção de óleos-lipídeos e carotenoides por leveduras do gênero 
Rhodotorula comouma alternativa viável à indústria de bioativos 
 
Dentre as rotas alternativas para a obtenção de moléculas de alto valor agregado, como 
os óleos-lipídeos e os carotenoides, pode-se destacar os processos bioquímicos como sendo 
uma das melhores soluções para a adequação ao conceito de sustentabilidade. 
Em geral, óleos-lipídeos são obtidos industrialmente por meio de processos extrativos 
que usam vegetais como principal fonte destes, já os carotenoides podem ser obtidos tanto por 
extração ou por síntese química. Devido à demanda de mercado, a rota oriunda das atividades 
agrárias não é viável, pois está condicionada à sazonalidade e variabilidade geográfica. 
Quanto à obtenção por rota química, esta vem recebendo severas críticas devido à toxicidade 
dos reagentes utilizados e subprodutos gerados (MATA-GOMÉZ et al., 2014). 
Nesse contexto, as rotas biotecnológicas vêm se mostrando bastante vantajosas uma 
vez que há um maior controle do processo como um todo, já que estas não estão limitadas por 
intempéries ambientais, especificidades de solo, necessidade de largo espaço para cultivo e 
por restrições quanto ao posicionamento geográfico (RIBEIRO et al., 2017a). 
A principal vantagem atrelada à produção de lipídeos via catálise microbiana está no 
fato desses processos poderem ser conduzidos utilizando-se diferentes resíduos agrícolas, ou 
industriais, como substratos majoritários. A escolha da fonte de carbono/nitrogênio apropriada 
tem sido um dos principais parâmetros estudados para fins de otimização (MATA-GÓMEZ et 
al., 2014). 
Um subproduto da indústria da cana-de-açúcar e que apresenta relevante 
aplicabilidade como fonte majoritária de carbono em bioprocessos é o melaço. Os estudos de 
Banzatto, Freita e Mutton (2013) apontaram, por exemplo, que de fato há uma forte 
correlação entre os altos rendimentos em moléculas lipídicas e o uso deste resíduo como fonte 
de nutrientes uma vez que a maior produção celular (15,0 g.L-1), para um cultivo submerso de 
Rhodotorula rubra, foi alcançada utilizando-se este insumo. Consequentemente, a maior 
produtividade de carotenoides (2,74 mg.L-1) se deu também nesta mesma condição. 
Outro estudo que corrobora com a ideia de que o uso de substratos alternativos 
apresenta potencial para a produção de lipídeos, em especial para os pigmentantes, foi 
realizado por Kanzy et al. (2015). Neste estudo os autores verificaram que a maior 
concentração de biomassa de Rhodotorula mucilaginosa (9,02 g.L-1) ocorreu após 120 h de 
cultivo, com uma concentração volumétrica de carotenoides totais equivalente a 5,04 mg.L-1. 
Os mesmos utilizaram soro de queijo salgado como principal fonte de nutrientes. 
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35 
 
Lian, Chen e Garci-Perez (2013) avaliaram a aplicabilidade de levoglucosanos não 
hidrolisados como fonte de carbono para um cultivo de Rhodotorula glutinis e obtiveram uma 
produção celular de 6,8 g.L-1, com uma correlata produção lipídica de 2,7 g.L-1. 
Karatay e Donmez (2010) também observaram um aumento na produção de lipídeos, 
por três leveduras diferentes (Candida lipolytica, Candida tropicalis e Rhodotorula 
mucilaginosa), ao empregarem melaço como principal nutriente do cultivo, sendo seu maior 
resultado equivalente a 69,5 % para o cultivo submerso com a Rhodotorula mucilaginosa. 
Ainda sobre o exposto acima, é notório observar que vários gêneros de 
microrganismos são capazes de sintetizar, via ação metabólica, óleos-lipídeos e carotenoides. 
Porém, o gênero Rhodotorula é o que mais se destaca dentre estes (KOT et al., 2016). 
Até pouco tempo as leveduras desse gênero eram unicamente conhecidas devido aos 
seus sucessivos casos de contaminação de alimentos. Porém, vários estudos vêm reportando 
que elas constituem um grupo de seres unicelulares dotados de várias características de 
interesse industrial (KOT et al., 2016). 
Um membro deste agrupamento de leveduras, que já foi mencionado e vem sendo 
descrito com ênfase nas literaturas especializadas em bioprocessos, é a Rhodotorula 
mucilaginosa. Esta classe de microrganismos pertence à família Sporidiobolaceae do filo 
basidiomycota e apresentam morfologia que pode variar de esférica para elipsoidal. Outra 
característica dos mesmos é que estes podem ser encontrados em várias partes do mundo, 
desde os ambientes aquáticos ou terrestres até a superfície das membranas mucosas de vários 
animais, inclusive dos humanos (TSIODRAS et al., 2014). 
A Tabela 2.3 apresenta estudos recentes nos quais foram utilizados diferentes 
substratos alternativos em bioprocessos que objetivaram a produção de biomoléculas 
lipídicas. 
 Do ponto de vista da bioquímica celular, Garay, Boundy-Mills e German (2014) 
concluem que a produção de compostos lipídicos por leveduras oleaginosas pode ser 
compreendida por meio de quatro etapas principais. Na primeira etapa o microrganismo 
direciona seu metabolismo para a produção de Acetilcoenzima A (Ac-CoA), assim também 
como NADPH, a qual é a força motriz responsável pelo direcionamento da rota de síntese dos 
ácidos graxos microbianos. No segundo estágio de ação metabólica, a Ac-CoA sofre 
carboxilação para então produzir malonil coenzima A (Mal-CoA), transferido para a enzima 
transportadora do acilo (ACP), para em seguida gerar acil ACP. 
 No terceiro passo, a cadeia acila pode terminar gerando um agrupamento específico de 
lipídeos, como componentes lipídicos da membrana ou poder ser eventualmente convertida 
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36 
 
em um núcleo de gotículas lipídicas neutras. A localização, a dinâmica e a natureza desse 
estágio podem variar conforme o microrganismo em questão. Por fim, o quarto estágio 
envolve a produção de gotículas intracelulares de lipídeos (GL), acúmulo este que está 
diretamente ligado às condições ambientais como disponibilidade e assimilação de nutrientes 
majoritários, como carbono e nitrogênio (GARAY, BOUNDY-MILLS e GERMAN, 2014). 
 
Tabela 2.3 - Produção de óleos-lipídeos e carotenoides por diferentes microrganismos 
empregando-se diferentes substratos. 
Microrganismo Fonte de 
carbono 
Fonte de 
nitrogênio 
Biomoléculas 
produzidas 
 
Autores 
Rhodotorula 
glutinis ATCC 
204091 
Água residual de 
uma destilaria de 
tequila 
- Óleos-lipídeos Gonzalez-Garcia 
et al. (2013) 
Rhodotorula 
mucilaginosa 
BCRC 23454 
Restos de comida 
(melaço, ketchup 
e suco detox) 
Extrato de 
levedura 
Carotenoides 
(β-caroteno) 
Cheng e Yang 
(2016) 
Chlorella 
protothecoides 
ATCC 30411 
Soro de queijo do 
tipo scotta 
Nitrato de sódio Carotenoides Ribeiro et al. 
(2017)b 
Rhodotorula 
glutinis BCRC 
22360 
Hidrolisado de 
biomassa 
lignocelulósica 
Extrato de 
levedura e sulfato 
de amônia 
Óleos-lipídeos Yen e Chang 
(2015) 
Rhodotorula 
mucilaginosa 
Meio BDA* + 
pesticida orgânico 
- Óleos-lipídeos, 
carotenoides e 
hemoproteínas 
Pacia et al. (2016) 
Sporobolomyces 
ruberrimus H110 
Glicerol Sulfato de 
amônio, peptona 
e extrato de 
levedura 
Carotenoides Cardoso et al. 
(2016) 
Rhodotorula 
mucilaginosa 
Glicerol** Sulfato de amônia 
e extrato de 
levedura** 
Óleos-lipídios Yen, Liao e Liu 
(2016) 
*Meio Batata-Dextrose-Ágar; 
**Meio diluído em água do mar ao invés de água destilada ou comum. 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertação de Mestrado – PPGEQ (UFRN) DA COSTA, Willyan Araújo 
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2.2. Objetivos 
2.2.1. Objetivos gerais 
 
Avaliar a produção de óleos-lipídeos, ácidos graxos e carotenoides por Rhodotorula 
mucilaginosa CCT3892 utilizando o melaço de cana-de-açúcar como substrato. 
2.2.2. Objetivos específicos 
 
✓ 1222Realizar a caracterização físico-química do melaço de cana-de-açúcar; 
✓ Avaliar o crescimento da levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 em meio 
sintético e em meio contendo melaço como fonte de carbono; 
✓ Avaliar o potencial do melaço de cana-de-açúcar como fonte majoritária de carbono 
na síntese biotecnológica de ativos lipídicos; 
✓ Avaliar o sinergismo entre a fonte de carbono e a fonte de nitrogênio (extrato de 
levedura) nos rendimentos e no perfil de ácidos graxos produzidos pela levedura. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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38 
 
2.3. Materiais e métodos 
A Figura 2.5 apresenta um fluxograma geral dos procedimentos experimentais que foram 
realizados durante o desenvolvimento do presente capítulo. 
 
Figura 2.5 - Fluxograma geral dos procedimentos experimentais realizados no capítulo 2. 
Fonte: Autor. 
2.3.1. Obtenção do melaço de cana-de-açúcar 
O melaço de cana-de-açúcar foi fornecido pela usina Japungu Agroindustrial de sua 
planta de produção de etanol que fica situada no município de Santa Rita, Paraíba, Brasil 
(6º59’17’’S 35º01’24’’W). Antes de ser utilizado como substrato, o melaço foi hidrolisado de 
acordo com a metodologia de Banzato et al. (2013) no intuito de aumentar seu teor de 
açucares redutores. A Figura 2.6 apresenta o aspecto do melaço utilizado no presente estudo. 
Dissertação de Mestrado – PPGEQ (UFRN) DA COSTA, Willyan Araújo 
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39 
 
 
Figura 2.6 - Aspecto do melaço de cana-de-açúcar utilizado nos bioprocessos avaliados. 
Fonte: Autor. 
2.3.2. Microrganismo e manutenção 
O microrganismo utilizado foi a levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892, a qual 
foi fornecida pela Função André Tosselo – Coleção de Culturas Tropicais (Campinas – 
Brazil). De acordo com a fundação, a levedura é classificada como segura pra o meio 
ambiente e seres humanos (Biossegurança I). A mesma foi mantida em câmara climática 
(CONTINENTAL, RCCT440) a 4 ºC em placas de vidro contendo meio Y. M. A., o qual 
consiste de (g.L-1): glicose (40,0), extrato de levedura (3,0), peptona (5,0) e ágar (2,0). 
2.3.3. Inóculo 
 
O inóculo foi preparado através da adição de 5,0 mL de água destilada sobre uma 
placa de Petri contendo as células de levedura. A suspensão foi então transferida para um 
Erlenmeyer contendo 200 mL do meio proposto por Frengova et al. (1964), o qual 
apresentava a seguinte composição em (g.L-1): glicose (40,0), KH2PO4 (8,0), MgSO4.7H2O 
(0,5) e extrato de levedura (3,0). O crescimento celular foi então conduzido em incubador 
rotatório (New Brunswick – C25K) a 30 ºC e 200 rpm por 24h. Por fim, 50,0 mL do caldo 
fermentado foi centrifugado (Solab, SL-706) a 2500 rpm por 10 minutos e as células 
recuperadas foram ressupensas em 5,0 mL de água destilada estéril para então serem 
transferidos para os meios de cultivo em volume adequado para que os mesmos 
apresentassem uma concentração celular inicial de ~107 células.mL-1, a qual foi padronizada 
em câmara de Neubauer (Figura 2.8) . 
. 
Dissertação de Mestrado – PPGEQ (UFRN) DA COSTA, Willyan Araújo 
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40 
 
2.3.4. Bioprodução dos ativos lipídicos 
 
Para avaliar a capacidade de produção de óleos-lipídeos e carotenoides pela levedura 
Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 em meio contendo melaço de cana-de-açúcar, três 
condições de processo foram realizadas. A primeira foi conduzida utilizando o meio composto 
por Frengova et al. (1964), a segunda foi formulada utilizando apenas melaço invertido a uma 
concentração de açúcares redutores (AR) de 40,0 g.L-1. Por fim, a terceira condição foi 
conduzida com a mesma concentração de AR das demais, porém suplementada com 3,0 g.L-1 
de extrato de levedura. Destaca-se que todos os ensaios foram conduzidos em frascos do tipo 
Erlenmeyer (250 mL), contendo 125 mL de meio de cultivo, em incubador rotatório e nas 
mesmas condições do inóculo da seção 2.3.3. A Figura 2.7 apresenta o aspecto da levedura 
Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 em placa e o aspecto do inóculo após 24 h de 
crescimento. 
 
Figura 2.7 - Aspecto da levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 crescida em placa de 
Petri (a) e no inóculo após 24 h (b). Fonte: Autor. 
2.3.5. Caracterização físico-química do melaço de cana-de-açúcar 
2.3.5.1. Determinação do teor de sólidos solúveis totais - ºBrix 
O teor de sólidos solúveis foi determinado por meio da aferição do ºBrix, de uma 
diluição 1:10 do mesmo, em um refratômetro digital (Smart-1/Atago/nº 3150). 
 
 
Dissertação de Mestrado – PPGEQ (UFRN) DA COSTA, Willyan Araújo 
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2.3.5.2. Potencial hidrogeniônico (pH) 
O pH do melaço foi determinado de acordo com a metodologia utilizada por Zenebon, 
Sadocco e Tiglea (2008). Sendo assim, foi preparada uma diluição do mesmo em água 
destilada na proporção de 1:10 (m.v-1) e o seu pH foi então medido em pHmetro (MS 
TECPON – LUCA 210). A análise foi realizada em triplicata. 
2.3.5.3. Proteínas totais 
A quantificação do teor de proteínas totais foi feita pelo método colorimétrico 
proposto por Bradford (1976). A leitura espectrofotométrica foi feita a 595 
nm(ThermoSpectronic – GENESYS 10uV) para então ser convertida em concentração de 
proteínas totais (mg.L-1) por meio de uma curva de calibração previamente construída 
utilizando-se albumina de soro bovino - BSA (Sigma-aldrich) como padrão, compreendo uma 
amplitude de concentração variando de 0,1 a 1,0 mg.mL-1. As análises foram conduzidas em 
triplicata. 
2.3.5.4. Açúcares Redutores 
A quantificação do teor de açúcares redutores foi realizada pelo método 
espectrofotométrico proposto por Miller (1959). A leitura da análise foi feita a 540 nm e a 
mesma foi então convertida em concentração de açúcares redutores (g.L-1) por meio de uma 
curva de calibração construída utilizando-se glicose (Labsynth) como padrão, dentro de uma 
faixa de concentração de 0,1 a 1,0 g.L-1. Esta mesma metodologia também foi aplicada na 
quantificação do teor de açúcares residuais ao longo dos cultivos conduzidos de acordo com 
exposto no item 2.3.4. 
2.3.5.4. Quantificação dos açúcares redutores por Cromatografia Líquida de 
Alta Eficiência (CLAE) 
A quantificação dos açúcares redutores específicos foi realizada por cromatografia 
líquida de alta eficiência (CLAE) utilizando uma plataforma ACELA (Thermo scientific) 
equipada com uma coluna Shim-Pack (Shimadzu Co., Japão). A temperatura de operação foi 
65 ºC e a fase móvel utilizada foi uma solução de H2SO4 (5,0 mM) a uma vazão de 0,6 
mL.min-1. A análise foi realizada em triplicata (NOGUEIRA et al., 2019). 
2.3.6. Concentração celular (X) 
Para a quantificação da concentração celular (g.L-1) ao longo dos bioprocessos, 
realizados de acordo com o item 2.3.4, foi efetuada a coleta em triplicata de 1,0 mL de meio 
Dissertação de Mestrado – PPGEQ (UFRN) DA COSTA, Willyan Araújo 
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42 
 
nos tempos 0, 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72, 92 e após 120 h de cultivo. As alíquotas foram então 
diluídas e suas absorbâncias foram lidas a 600 nm para em seguida serem convertidas em 
concentração de células secas (g.L-1) por meio de uma curva de calibração