Aula_3_Valida__o ppt

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UNIDADE 1 INTRODUÇÃO À QUALIDADE
1.1 Histórico da Evolução do Conceito de Qualidade
1.2 ? Definições e importância da prática de qualidade
1.3 Conceitos e definições de Gestão de Qualidade, Garantia da 
Qualidade e Controle de Qualidade
1.4 Ferramentas de gestão da qualidade 
UNIDADE 2 ASSUNTOS REGULATÓRIOS NA GARANTIA E NO 
CONTROLE DE QUALIDADE
2.3 Apresentação das principais resoluções relacionadas ao controle 
de qualidade (BPF, BPM, Validação, estudos de estabilidade, etc)
2.4 Apresentação das Farmacopéias: estrutura, monografias e suas 
aplicações
5.3 Registro de produtos farmacêuticos e Renovação de registro de 
produtos farmacêuticos
Validação
Prof Arthur Luiz Corrêa
Quais as medidas/equipamentos utilizadas no preparo de um 
café?
Quais as medidas/equipamentos utilizados para saber o teor de um 
medicamento?
 Para que os métodos analíticos são utilizados na Indústria 
farmacêutica?
 Qualquer método pode ser utilizado?
 Sempre é necessário desenvolver e validar novo método?
Art. 4° A validação deve demonstrar que o método analítico 
produz resultados confiáveis e é adequado à finalidade a que se 
destina, de forma documentada e mediante critérios objetivos 
de que os requisitos específicos para seu uso pretendido são 
atendidos; 
RDC Nº 166, DE 24 DE JULHO DE 2017
A utilização de método analítico não descrito em compêndio oficial 
reconhecido pela Anvisa requer a realização de uma validação 
analítica
A Validação de um método é o processo de
conseguir uma evidência documentada que
este é capaz de medir o que ele tem como
finalidade medir
 Critérios de aceitação
Primeiro passo na validação:
Estabelecer critérios de aceitação para cada um 
dos parâmetros 
 internamente ao laboratório;
 ou por norma;
 ou por imposição do Órgão Fiscalizador ou 
Credenciador.
https://revistas.ufpr.br/pesticidas/article/viewFile/3173/254
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seletividade 
• Capacidade de determinar um analito em presença de outros 
componentes potenciais.
• Habilidade do método medir somente o componente de interesse 
na presença de outras substâncias na matriz.
• Capacidade de avaliar, de forma inequívoca, as substâncias em 
exame na presença de componentes que podem interferir com a 
sua determinação.
• Avalia o grau de interferência de espécies como:
• excipientes; 
• impurezas e produtos de degradação,
• outros compostos de natureza química semelhante. 
seletividade 
• Se a seletividade não for assegurada, a linearidade, a exatidão
e a precisão estarão seriamente comprometidas.
• A seletividade é o primeiro passo no desenvolvimento e
validação de um método instrumental de separação e deve ser
reavaliada continuamente durante a validação e subseqüente
uso do método.
seletividade 
• Análise qualitativa (Teste de identificação):
– Como determinar?
resultados positivos X resultados negativos
(ausência de resposta)
Amostra ou Padrão X Placebo
Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais
Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais
seletividade 
• Análise quantitativa (Teste de Impureza e Teste de Teor):
 Excipientes / Impurezas Não Disponíveis.
 “Estressar” Amostras (armazenadas sob condições de 
estresse por ex. luz, calor umidade, hidrólise ácida/básica, 
oxidação)
 Comparar amostras “estressadas” e não “estressadas” 
Demonstrar inexistência de interferência.
 Excipientes / Impurezas Disponíveis.
 Fortalecimento (“Spike”) com impurezas / degradantes.
 Demonstrar Resolução e Inexistência de interferência.
Cromatogramas obtidos por CLAE: A- Padrão de zidovudina e timina; 
B- Amostra de cápsulas; C- Placebo..
seletividade 
seletividade 
• Análise quantitativa (Teste de Impureza e Teste de Teor):
 Critérios de Aceitação:.
Métodos cromatográficos. 
Demonstrar Pureza do Pico 
Como?
Uso de detectores modernos (arranjo de diodos de fotodiodos ou 
espectrômetro de massas), que comparam o espectro do pico obtido 
na separação com o de um padrão e utiliza-se isto como uma 
indicação da presença do composto puro. 
seletividade 
LINEARIDADE
Curva de calibração 
• É a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que
os resultados obtidos são diretamente proporcionais à
concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo
especificado.
• A relação matemática entre o sinal e a concentração ou massa da 
espécie de interesse deve ser determinada empiricamente. Essa 
relação matemática pode ser expressa como uma equação de reta 
chamada de curva de calibração. 
• No mínimo 5 concentrações diferentes.
• Efetuar análise por no mínimo 3 vezes, cada
• Plotar diagrama de dispersão dos pontos: Y = f ( X ) 
• Aplica-se reta de regressão linear: Y = a + b X
LINEARIDADE
Curva de calibração 
• Embora somente dois pontos definam uma reta, na prática as linhas 
devem ser definidas por no mínimo cinco pontos que não incluam o 
ponto zero na curva, devido aos possíveis erros associados.
º O coeficiente de 
correlação deve estar 
acima de 0,990.
LINEARIDADE
Curva de calibração 
 No mínimo 5 concentrações diferentes, dentro da seguinte faixa:
Ensaio Intervalo
Determinação Quantitativa 80% a 120% concentração teórica
Uniformidade Conteúdo 70% a 130% concentração teórica
Teste de dissolução ± 20% além do intervalo especificado; 
impurezas do nível esperado até 120% do limite 
máximo especificado.
Reportar : 
coeficiente linear da reta (a) ;
coeficiente angular da reta (b) ; 
coeficiente de correlação (r)
Intervalo de confiança 
Critério de aceitação
Ideal
r > 0,99
LINEARIDADE
Curva de calibração 
A curva de calibração pode ser obtida através dos seguintes métodos:
 padronização externa; 
 padronização interna; 
 superposição de matriz; 
 adição padrão.
LINEARIDADE
Curva de calibração 
LINEARIDADE
Curva de calibração 
 Padronização Externa; 
 Compara a área da substância a ser quantificada na amostra com 
as áreas obtidas com soluções de concentrações conhecidas preparadas 
a partir de um padrão. 
 Utilizando a equação da curva do padrão, pode-se calcular a 
concentração desta substância na amostra a partir da área da substância 
obtida no cromatograma resultante de uma injeção separada da 
amostra. 
 É o método mais utilizado em CLAE
Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais
 Padronização Externa; 
LINEARIDADE
Curva de calibração 
LINEARIDADE
Curva de calibração 
 Preparação das soluções padrão de concentrações conhecidas da 
substância de interesse, às quais se adiciona a mesma quantidade 
conhecida de um padrão interno. 
A amostra também é analisada após a adição da mesma quantidade 
conhecida do padrão interno. Através da razão de áreas obtidas no 
cromatograma tem-se a concentração da substância na amostra. 
Solução: Uso de Padrão Interno
Após análise dessas soluções, constrói-se um gráfico, relacionando 
a razão de áreas (área da substância/ área do padrão interno que 
tem concentração constante) com a concentração (variada) da 
substância. 
LINEARIDADE
Curva de calibração 
 O padrão interno deve ser similar à substância a ser quantificada, ter 
tempo de retenção próximo a esta substância, não reagir com a 
substância ou outro componente da matriz, não fazer parte da amostra 
e, quando cromatografada, ficar separada de todas as demais 
substâncias presentes. 
 Se o padrão interno se comporta da mesma forma que o analito, 
então ele deverá experimentar as mesmas condições e exibir as 
mesmas flutuações de sinal.
LINEARIDADE
Curva de calibração 
 Padronização Interna; 
• É o método menos sensível à erros de injeção, erros de diluição,
erros relacionados ao preparo das amostras, variações instrumentais,
etc., uma vez que estes erros são compensados pela utilização das
relações entre as áreas;
Calcula-se a concentração pela equação da reta ou ponto duplo.
Área padrão/ Área do PI = Área do analito / Área do PI
Concentração do Padrão Concentração do Analito
 Padronização Interna:Sx/Spi X Cx/Cpi
LINEARIDADE
Curva de calibração 
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Linearidade
É a capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os resultados
obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro
de um intervalo especificado.
16mg/mL
18mg/mL
20mg/mL
22mg/mL
24mg/mL
Curva calibração 
α-humuleno
% analito
Á
re
a
 a
n
a
lit
o
/Á
re
a
 P
I
% analito Área analito Área PI Área analito/Área PI
0,05 18,8 50 0,38
0,1 48,1 64,1 0,75
0,15 63,4 55,1 1,15
0,2 63,2 42,7 1,48
0,25 93,6 53,8 1,74
+ PI
 Superposição de matriz (Placebo Contaminado):
 Consiste na adição do padrão da substância em diversas 
concentrações em uma matriz similar à da amostra, isenta da 
substância, e construção do gráfico de calibração relacionando as áreas 
obtidas com as concentrações dos padrões.
 O método de superposição de matriz pode ser utilizado para 
calibração, tanto com a padronização interna como com a padronização 
externa.
 Este método é usado para compensar o efeito da matriz ou de 
possíveis interferentes e é de suma importância em determinações 
quando a matriz pode interferir na pré-concentração, extração, 
separação ou detecção da substância de interesse.
LINEARIDADE
Curva de calibração 
Adição do padrão 
 O método de adição padrão consiste na adição de quantidades
conhecidas da substância de interesse que está sendo analisada 
a quantidades conhecidas da amostra, antes do seu preparo. 
 O ponto onde a reta corta o eixo das ordenadas corresponde à 
área do pico da substância que está sendo determinada, sem 
qualquer adição do padrão. 
Uso:
Amostras complexas, quando as interações com a matriz são 
significativas;
 dificuldade de encontrar um padrão interno adequado ou uma 
matriz isenta da substância de interesse.
LINEARIDADE
Curva de calibração 
Precisão x Exatidão
 A precisão expressa o grau de dispersão entre medições independentes a 
partir de uma mesma amostra

A precisão pode ser contemplada em dois níveis:
Repetitividade
� mesmo procedimento de medição;
� mesmo observador;
� mesmo instrumento de medição, utilizado nas mesmas condições;
� mesmo local;
� repetição em curto período de tempo.
Reprodutibilidade
� princípio de medição;
� método de medição;
� observador;
� instrumento de medição;
� padrão de referência;
� local;
� condições de utilização
Precisão
• É expressa pelo desvio padrão absoluto (DP) ou desvio padrão 
relativo (DPR) - Coeficiente de Variação 
x1 = cada valor obtido CMD = concentração 
x= média determinada. 
x = média aritimética
n = número de valores obtidos
Precisão
A precisão pode ser diversa para diferentes concentrações
 Normalmente, métodos que quantificam compostos em macro 
quantidades requerem um DPR de 1 a 2%. 
 Em métodos de análise de traços ou impurezas, são aceitos DPR 
de até 20%, dependendo da complexidade da amostra. 
 Uma maneira simples de melhorar a precisão é aumentar o 
número de replicatas.
Precisão
• Repetibilidade (precisão intra-corrida):
• Representa a concordância entre os resultados de medições
sucessivas de um mesmo; mesmo analista; mesmo instrumento
usado sob as mesmas condições; mesmo local; repetições em um
curto intervalo de tempo.
• Números de ensaios para avaliar:
 9 determinações dentro do intervalo linear do teste, ou seja,
concentrações baixa, média e alta, em triplicata ou
 6 determinações a 100% da concentração do teste.
 Precisão do Instrumento – uma solução -10 medidas no mesmo 
instrumento
Precisão
Repetibilidade (precisão intra-corrida):
https://www.scielo.br/j/qn/a/bbZzgT5wfMdyY3NPDqnrC
Tm/?format=pdf&lang=pt
• Precisão intermediária (precisão inter-corridas): 
• Concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas 
obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou 
equipamentos diferentes
 O objetivo da validação da precisão intermediária é verificar que no
mesmo laboratório o método fornecerá os mesmos resultados.
Precisão
Precisão intermediária (precisão inter-corridas): 
https://www.scielo.br/j/qn/a/bbZzgT5wfMdyY3NPDqnrC
Tm/?format=pdf&lang=pt
• A precisão em validação de métodos é considerada 
em três níveis diferentes:
• Repetibilidade (precisão intra-corrida): 
• Precisão intermediária (precisão inter-corridas): 
• Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial): 
Precisão
• Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial):
• concordância entre os resultados obtidos em laboratórios
diferentes em estudos colaborativos.
• Não precisam ser apresentados para a concessão de registro.
• ser considerada em situações como a padronização de
procedimentos analíticos a serem incluídos, por exemplo, em
farmacopéias.
Precisão
 É uma medida da proximidade entre o valor encontrado e o 
verdadeiro.
 Métodos avaliar exatidão 
Exatidão
 uso de material de referência certificado (MRC)
 comparação do método proposto com um método de 
referência,
 uso de ensaios de recuperação na matriz 
reflete a quantidade de determinado analito, recuperado no 
processo, em relação à quantidade real presente na amostra
Comparação dos métodos para determinação Carvedilol:
 Espectrofotometria
 Cromatografia Liquida alta eficiência (CLAE)
 Titulação potenciométrica
 Uso de ensaios de recuperação na matriz 
Observe que as curvas apresentam a mesma inclinação, ou seja, são 
paralelas. Neste sentido, pode-se concluir que NÃO há efeito de 
matriz.
Observe que as curvas não apresentam a mesma inclinação,
ou seja, não são paralelas. Neste sentido, pode-se concluir
que HÁ efeito de matriz.
Exatidão
Ensaio de recuperação na matriz 
Três concentrações 
(baixa, média e alta) 
com três réplicas cada 
(9 determinações)
Critério de Aceitação
Para ensaios de teor (maior componente) a recuperação média
deve ser de 100% + 2% para cada concentração na faixa de 80
a 120% da concentração alvo ou de estudo.
Exatidão
Exatidão
> 0,1%: 95-105%
O método é exato?
No estudo da recuperação são realizados testes de significância, 
utilizando o teste "t" de Student
Rec = a média das recuperações obtidas para n repetições; 
100 = a recuperação percentual desejada; 
n = o número de determinações 
SRec = o desvio padrão das recuperações. 
tcalc<ttab
sem diferença
ESTUDO DE CASO: ANÁLISE DE HERBICIDAS EM 
AMOSTRAS DE SOLO 
T tab =4,17 (IC=95%)
*
*
*
*
*
*
*
*
* = sem diferença estatística entre as 
fortificações (exato)
*
*
*
*
*
*
*
*
ESTUDO DE CASO: ANÁLISE DE HERBICIDAS EM 
AMOSTRAS DE SOLO 
O método é considerado preciso?
A menor concentração do analito que pode ser detectada, mas
não necessariamente quantificada, sob condições
experimentais estabelecidas constitui o limite de detecção
Limite Detecção (LD)
concentração
sinal
s = desvio-padrão da resposta (branco) (y=ax+b)
S = o coeficiente angular do gráfico de calibração (sensibilidade 
do aparelho). (y=ax+b)
É definido como a menor concentração do analito, que pode ser
quantificada na amostra, com exatidão e precisão aceitáveis, sob as
condições experimentais adotadas
Limite de Quantificação (LQ)
s = desvio-padrão da resposta (branco) (y=ax+b)
S = o coeficiente angular do gráfico de calibração (sensibilidade 
do aparelho). (y=ax+b)
concentração
sinal
A razão sinal/ruído com valor 3 é geralmente 
considerada aceitável para estimar o limite de detecção.
A razão sinal/ruído com valor 10 é geralmente 
considerada aceitável para estimar o limite de quantificação.
s = desvio-padrão da resposta (branco) (y=ax+b)
S = o coeficiente angular do gráfico de calibração (sensibilidade do 
aparelho). (y=ax+b)
Determine os valores de LQ e LD......
ROBUSTEZ
• Capacidade de um método de análise para resistir a pequenas
variações dos parâmetros. Indica sua confiança no uso normal.
• Os testes de robustez, em geral, servem para indicar os fatores
que podem influenciar, significantemente, a resposta do
método estudado.
ROBUSTEZ
Exercícios 
De acordocom o artigo , o método espectofotométrico
desenvolvido é considerado específico para a quantificação de 
carvedilol no comprimento de onda de 240nm? Justifique.
O que é Limite de quantificação e Limite de detecção?
A partir das informações da Tabela 1, calcule o valor de LQ e LD? Apresente 
os cálculos?
No artigo em questão, como foi realizado o ensaio de precisão? 
Qual a diferença entre precisão intemediária e repetibilidade? 
Baseado na tabela 2, o método desenvolvido pode ser 
considerado preciso? justifique
O método espectrofotométrico desenvolvido para quantificação de 
carvedilol foi comparado com outros dois métodos: TP e CLAE. A 
partir das informações da tabela 6, o método pode ser considerado 
preciso? Justifique.
Qual a importância do ensaio de exatidão? Como o ensaio de 
exatidão foi realizado no artigo apresentado? Com base nas 
informações da tabela 4, o método pode ser considerado exato? 
Justifique.
Qual a importância da realização do ensaio de robustez? Como 
foi determinada a robustez do método?
Uma amostra de Efavirenz (EFZ) foi contaminada com uma 
impureza, a zidovudina. A partir da figura abaixo é possível 
afirmar que o métodos (espectrofotometria em comprimento de 
onda e 247nm) é específico para Efavirenz?