Slides de Aula - Unidade II

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Prof. Me. Octávio Lourenço
UNIDADE II
Introdução em
Ciências Farmacêuticas
 A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de 
uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. 
 A precisão pode ser expressa como desvio-padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação 
(CV%), segundo a fórmula a seguir:
DP ou s é o desvio padrão
é a concentração média determinada
Precisão
 Ela é considerada em três níveis
1. Repetibilidade (precisão intracorrida)
 Avaliar as amostras sob as mesmas condições de operação;
 Mesmo analista, mesmo dia, mesmo equipamento.
Precisão
 A repetibilidade (intracorrida) do método é verificada por, no mínimo: 
a) 9 (nove) determinações contemplando o intervalo linear do método, ou seja, 3 (três) 
concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada ou;
b) 6 (seis) determinações a 100% da concentração do teste.
Precisão
 Desenvolvimento e validação de método analítico em CLAE-UV para a quantificação de 
ácido retinóico em microcápsulas de alginato e quitosana. 
 Avalia a precisão ao longo da faixa de trabalho.
Exemplo
Fonte: Adaptado de: MORETTO, L; CALIXTO, J. Qualificações e validações. V. 17. Sindusfarma, 2013.
Valores obtidos para avaliação da precisão intracorrida
Concentração
teórica de AR
(μg/mL)
Concentração
obtida de AR
(μg/mL)
Precisão (CV%)
10 9,96 0,20
20 20,10 1,12
30 29,79 1,52
2. Precisão intermediária (precisão intercorrida)
 Concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, 
com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.
 Para a determinação da precisão intermediária, recomenda-se um mínimo de 2 dias 
diferentes com analistas diferentes.
 A determinação pode ser: n = 6 para cada analista a 100%.
 DPR calculado em cima das 12 análises.
Precisão
Exemplo de resultados – precisão intermediária
Fonte: Adaptado de: MORETTO, L; 
CALIXTO, J. Qualificações e validações. 
V. 17. Sindusfarma, 2013.
Dia de análise Teor de ativo do produto (%)
1 102,5
1 101,3
1 102,8
1 102,2
1 103,6
1 101,9
2 102,5
2 100,7
2 101,7
2 101,9
2 101,6
2 100,7
Média dia 1 102,4
Média dia 2 101,5
Média geral 102,0
DPR % (n = 12) 0,82
Diferença absoluta % 0,9
3. Reprodutibilidade (precisão interlaboratorial) 
 Concordância entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes como em estudos 
colaborativos, geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica, por exemplo, 
para inclusão de metodologia em farmacopeias. 
 Esses dados não precisam ser apresentados para a concessão de registro.
Precisão
 Os critérios de aceitação para a precisão podem variar de acordo com a finalidade do 
método analítico e de acordo com a técnica analítica empregada.
Critério de aceitação
Fonte: Adaptado de: MORETTO, L; CALIXTO, J. 
Qualificações e validações. V. 17. Sindusfarma, 2013.
Parâmetros Teor de ativo - FARMA
Repetitividade do método DPR < 2,0%
Precisão intermediária
DPR < 2,5% (diferença
absoluta < 2,0%)
Reprodutibilidade
DPR < 3,0% (diferença
absoluta < 2,0%)
Qual a diferença entre precisão intermediária e repetitividade?
Interatividade
Qual a diferença entre precisão intermediária e repetitividade?
Precisão intermediária inclui a influência de efeitos aleatórios de acordo com o uso pretendido 
do método dentro do mesmo laboratório, mas variando operador, instrumento e os dias que 
têm que ser alterados. Já a repetitividade é a obtenção de resultados a partir de ensaios 
independentes, com o mesmo método, com material de ensaio idêntico, no mesmo laboratório, 
pelo mesmo operador e utilizando o mesmo equipamento.
Resposta
 É a concordância entre o resultado de um ensaio e o valor de referência aceito como 
convencionalmente verdadeiro.
 A exatidão (tendência) de um método analítico é geralmente determinada pelo estudo de 
materiais de referência relevantes.
Exatidão
Para a determinação da exatidão, deve ser utilizada a abordagem mais adequada, de acordo 
com o método analítico em estudo:
I. Para IFA:
a) Aplicar o método proposto utilizando substância de pureza conhecida (SQR);
b) Comparar os resultados obtidos com aqueles resultantes de um segundo método validado, 
cuja exatidão tenha sido estabelecida; ou
c) No caso de análise em matriz complexa, realizá-la pelo 
método de adição de SQR no qual quantidades conhecidas 
de SQR são acrescentadas à amostra.
Exatidão
II. Para produto terminado:
a) Aplicar o método proposto na análise de uma amostra, na qual a quantidade conhecida de 
SQR foi adicionada à matriz;
b) Na indisponibilidade de amostras de todos os componentes do produto, pode ser realizada 
a análise pelo método de adição de SQR, no qual quantidades conhecidas de SQR são 
acrescidas à solução do produto terminado;
c) Comparar os resultados obtidos com aqueles resultantes de 
um segundo método validado.
Exatidão
 A exatidão deve ser expressa pela relação percentual de recuperação do analito de 
concentração conhecida adicionado à amostra ou pela relação entre a concentração média, 
determinada experimentalmente, e a concentração teórica correspondente, dada pela 
fórmula 1, do Anexo II.
 A equação de medição da recuperação é dada por:
Em que:
 Rec: é a recuperação, em (%);
 Co: é a concentração obtida em mg/mL;
 Ct: é a concentração teórica em mg/mL.
Exatidão
Fonte: Adaptado de: Anvisa (2017).
Cálculo deve envolver determinações contemplando o intervalo linear do procedimento,
ou seja:
 3 concentrações baixas – triplicate;
 3 concentrações médias – triplicate;
 3 concentrações altas – triplicate.
Exatidão
Critério de aceitação – por ensaio
Fonte: adaptado de: MORETTO, L; CALIXTO, J. 
Qualificações e validações. V. 17. Sindusfarma, 2013.
Concentração do analito % Intervalo de recuperação aceito % DPR
Teor 98-102 < 2%
Uniformidade conteúdo 98-102 < 2%
Dissolução 95-105 < 5%
Exemplo:
 Na metodologia para determinar o teor de cloreto de sódio (volumetria de precipitação), a 
metodologia pede para que seja pesado cerca de 250 mg de produto.
 Para a determinação da exatidão, deve-se efetuar o ensaio por 3x pesando 80% de 250 mg 
(baixa), 3x os 250 mg (concentração média) e 3x 120% de 250 mg.
Exatidão
 Exemplo: uma solução preparada com 100,5 mg da substância ativa em balão volumétrico 
de 100 mL –concentração 1,005 mg/mL
 ExatidãoConcentração da amostra
 O método é exato na faixa entre 80% e 120%, pois a 
legislação aceita valor entre 98% e 102% de recuperação..
Exatidão
Fonte: adaptado de: MORETTO, L; CALIXTO, J. 
Qualificações e validações. V. 17. Sindusfarma, 2013.
Concentração da amostra Concentração
obtida
Recup.
(%)% mg/mL
80 0,0804 0,0799 99,4
100 0,1005 0,0995 99,0
120 0,1206 0,1195 99,1
 Em conjunto com os resultados de recuperação, é possível avaliar a média e o desvio-
padrão relativo das porcentagens de recuperação, para poder conferir maior poder ao teste, 
uma vez que com a média e o valor de DPR é possível determinar o intervalo de confiança 
do método (IC).
 Avaliar o valor de DPR em cada concentração (80, 100 e 120%), que foram executados em 
triplicata. O DPR é calculado em função da média das 9 análises.
 Cálculo do DPR
Cálculo de DPR para a Exatidão
 Deve ser calculado o desvio-padrão relativo (DPR) para cada concentração.
 Os critérios de aceitação para percentuais de recuperação e desvio-padrão relativo obtidos 
devem ser justificados conforme critérios preconizados no art. 39, da RDC 166.
Exatidão
Cálculo da média e do DPR
Fonte: adaptado de: MORETTO, L; 
CALIXTO, J. Qualificações e 
validações. V. 17. Sindusfarma, 3.
Concentração
teórica
Recuperação
(%)
Média
(%)
DPR (%)
1-80% 99,4
99,8 0,64
2-80% 100,1
3-80% 99,6
1-100% 99,0
2-100% 100,5
3-100% 100,4
1-120% 99,1
2-120% 100,7
3-120% 99,4
 Solução mãe = estoque
Exemplo de cálculos em diluições a partir da solução estoque
0,12 mg em 100 mL
= 0,0012 mg/mL 
ou 1,2µg/mL
é a concentração final dessa solução.
120 mg em 100 mL
= 1,2 mg/mL
12 mg em 100 mL
= 0,12 mg/mL 
Alíquota de 10 mL = 1,2 mg/mL
Alíquota de 10 mL = 12 mg/mL
 Para avaliar a exatidão de um método analítico, deve-se avaliar o desempenho desse 
parâmetro em 3 níveis de concentração. Normalmente 80, 100 e 120% da concentração 
teste.
Se um método preconiza a utilização de uma solução a 0,10 mg/mL a 100%, como seriam 
preparadas e qual seriam as demais concentrações que seriam utilizadas na execução
dessa análise?
Interatividade
 Para avaliar a exatidão de um método analítico, deve-se avaliar o desempenho desse 
parâmetro em 3 níveis de concentração. Normalmente 80, 100 e 120% da
concentração teste.
Se um método preconiza a utilização de uma solução a 0,10 mg/mL a 100%, como seriam 
preparadas e qual seriam as demais concentrações que seriam utilizadas na execução
dessa análise?
 Para obter uma solução de concentração 0,10 mg/mL, pesar 
100 mg da amostra e diluir para 1000 mL; para obter uma 
solução a 80%, deve-se utilizar a concentração 0,08 mg/mL, 
para isso pesar 80 mg da amostra e diluir para um litro; para 
se obter uma amostra a 120%, deve-se utilizar a concentração 
0,12 mg/mL, pesando 120 mg da amostra e diluir para 1000 
mL em balão volumétrico.
Resposta
 Mede a sensibilidade que um método de ensaio apresenta face a pequenas variações.
 A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas 
e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. 
 Indica sua confiança durante o uso normal.
Embora seja considerada um parâmetro de validação, a robustez do método deve ser: 
a) Considerada durante o desenvolvimento da metodologia;
b) Confirmada durante a validação, constatando-se a suscetibilidade do método que deve ser 
incluída no procedimento.
Robustez
 Estabelecer quais os fatores que podem influenciar nos resultados.
 Variar cada fator em pelo menos dois níveis.
 Definir critérios de aceitação.
 Etapas do estudo da robustez.
Etapas do estudo de robustez
 Um dos fatores mais importantes é a estabilidade das substâncias químicas.
 A verificação da estabilidade das soluções de amostra e padrão, após sua preparação, é 
avaliada para garantir o tempo máximo que essas substâncias podem ser utilizadas.
 Recomenda-se comparar a resposta instrumental gerada por uma solução padrão e amostra 
armazenada com a resposta instrumental gerada por uma solução recém-preparada.
 O estudo deve ser realizado em todos os tipos de solução padrão, partindo da solução 
padrão estoque, passando por uma concentração intermediária, até a concentração
de trabalho.
Estudo de estabilidade das soluções
Guia para ensaio de Robustez
Fonte: adaptado de: MORETTO, L; 
CALIXTO, J. Qualificações e 
validações. V. 17. Sindusfarma, 2013.
Preparo
das amostras
Estabilidade das soluções analíticas
Tempo de extração
Espectrofotometria
Variação do pH da solução
Diferentes fabricantes de solventes
Cromatografia
líquida
Variação do pH da fase móvel
Variação na composição da fase móvel
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
Temperatura
Fluxo da fase móvel
Cromatografia
gasosa
Diferentes lotes ou fabricantes de colunas
Temperatura
Velocidade do gás de arraste
Outras técnicas
analíticas
As variações a serem testadas
deverão ser apresentadas e os seus resultados
avaliados criticamente
 Há poucas variáveis a serem estudadas quanto aos parâmetros do equipamento, sendo 
mais importantes as variáveis de preparo das amostras, como tempo de extração, pH das 
soluções, concentração dos reagentes etc.
 No caso de titulações, o tempo da reação envolvida, temperatura, tempo de agitação, 
alteração na concentração da solução volumétrica e a marca dos reagentes.
Métodos instrumentais não cromatográficos
 Isso significa que a diferença entre os valores obtidos com as alterações não poderá variar 
mais que +2% e +10%, conforme sua categoria, em relação ao método nas
condições originais.
 Serão consideradas estáveis as soluções padrão e as 
amostras que não ultrapassarem essas porcentagens.
 O método será considerado robusto quando o resultado 
analítico não for influenciado ou pouco influenciado pelas 
variações testadas, ou seja, atendendo os critérios
de aceitação.
Avaliação e critérios de aceitação
Fonte: adaptado de: MORETTO, L; CALIXTO, J. Qualificações e validações. V. 17. Sindusfarma, 2013.
Parâmetro Categoria I (ativo e MP) Categoria II (impurezas)
Robustez Recuperação + 2%
Quantitativo Teste limite
Recuperação + 10% Recuperação + 10%
 Técnica analítica: cromatografia líquida (CLAE)
 Categoria do teste: categoria I
 Teor de substância ativa em X comprimidos
 Fase móvel: tampão fosfato pH 5,0 e metanol na proporção 80:20
 Coluna: C18, 5 µm, 150 x 4,6 mm
 Fluxo: 1,0 mL/min
 Detector: 275 nm
 Temperatura da coluna: 40 ºC
 Diluente: metanol
 Exemplo prático de preparação de soluções para um estudo 
de robustez
Exemplo prático de preparação de soluções para um estudo de robustez
Avaliar a influência dessas variações nas soluções padrão e amostra de trabalho, conforme 
exemplo a seguir:
Exemplo
Fonte: adaptado de: MORETTO, L; 
CALIXTO, J. Qualificações e 
validações. V. 17. Sindusfarma, 2013.
Condição
Valor
original
Variação
abaixo
Variação
acima
Porcentagem de
orgânico na fase móvel
20 18 22
pH tampão 5,0 4,8 5,2
Temperatura do forno 40 ºC 38 ºC 42 ºC
Velocidade do fluxo 1,0 0,8 1,2
 Avaliar a influência dessas variações nas soluções padrão e amostra de trabalho, conforme 
exemplo a seguir:
 n = mínimo 6 amostras de cada (padrão e amostra) para que a 
análise tenha poder estatístico
Avaliando tampão
Fonte: adaptado de: MORETTO, L; 
CALIXTO, J. Qualificações e 
validações. V. 17. Sindusfarma, 2013.
pH tampão Amostra Teor (mg/g)
Recuperação em relação
à condição original: + 2%
Tampão pH 5
Padrão 0,9090 N/A
Amostra 0,9185 N/A
Tampão pH 4,8
Padrão 0,9064 99,7%
Amostra 0,9135 99,5%
Tampão pH 5,8
Padrão 0,9093 100,0%
Amostra 0,9244 99,4%
Para que avaliamos a robustez?
Interatividade
Para que avaliamos a robustez?
A robustez é avaliada para medir a capacidade de um método analítico de sofrer pequenas e 
deliberadas modificações sem interferência no resultado. Indica sua confiança no uso normal.
Resposta
As mais comuns são: 
 Student: distribuição normal dos valores experimentais – linearidade e faixa, robustez.
 Cochran: testa a homogeneidade (variância) dos dados – linearidade e faixa,
exatidão, precisão. 
 Dixon: descobre dados outliers, se o teste de Cochran for falso – linearidade e faixa, 
exatidão, precisão. 
 Fischer: compara a variância de duas populações –
linearidade e faixa, exatidão, precisão, robustez.
Ferramentas estatísticas aplicadas em validação usadas para facilitar 
a tomada de decisões
 É fundamental que, após a finalização do processo de validação, sejam registrados os 
procedimentos do método de forma clara e sem ambiguidade.
 O método deve ser implantado de acordo com a descrição do procedimento para se evitar 
que ele seja realizado de maneira diferente daquela que foi validada.
 Deste modo, os registros têm como finalidade minimizar a introdução de variação acidental 
no método.
Documentação de métodos validados
 A documentação com os registros do processo de validação pode ser exigida para fins 
contratuais ou até mesmo por organismos regulamentadores.
 O procedimento do método deve ser escrito de forma minuciosa e de acordo com a ordem 
em que será executa a análise, a fim de se garantir que, independentemente do técnico que 
realize a análise, os resultados sejam similares aos obtidos pelo técnico que validou a 
metodologia.
Documentação de métodos validados
 A documentação dos métodos é parte importante no sistema de qualidade do laboratório, 
devendo ser controlada para assegurar que somente métodos e procedimentos validadossejam utilizados.
 A documentação deve conter informações sobre quando os procedimentos foram 
autorizados para o uso e se estão completos.
Documentação de métodos validados
 Os documentos devem ser revisados de acordo com a periodicidade estabelecida pelo 
sistema da qualidade ou quando ocorrer modificação significativa no método.
 O controle dos documentos do laboratório deve ser realizado por pessoas autorizadas 
responsáveis pela retirada de circulação dos documentos obsoletos e a substituição deles 
pelos documentos revisados.
Documentação de métodos validados
 Nome do produto.
 Nome do método.
 Assinaturas e data.
Modelo de protocolo de validação
 Nessa parte, definir o objetivo da validação da metodologia analítica.
 Descrever a metodologia detalhadamente.
 Definir os parâmetros da validação e justificar.
Estabelecer um plano de ação:
 Nessa etapa, descrever a preparação das soluções de amostras em diferentes 
concentrações para o estudo de cada parâmetro.
 Definir quantas amostras devem ser preparadas para cada concentração.
Introdução
Critérios de aceitação
 Definir limites de aceitação para cada parâmetro de validação com base em normas e 
critérios específicos.
Definir responsabilidades para:
a) Execução do protocolo.
b) Revisão.
c) Aprovação.
Introdução
 Definir equipamentos e número de série.
 Verificar status da última calibração e da próxima.
 Padrões de referência e reagentes utilizados e demais matérias-primas.
 Nome, fabricante, lote e validade.
Definir parâmetros operacionais
 Espero vocês em seguida no Chat para discussão da aula.
Orientação para atividade do Chat
ATÉ A PRÓXIMA!