Botucatu - parte 1

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Perfil de resistência genotípica do HIV-1 em pacientes
com falha na terapia antirretroviral atendidos pela
Rede Nacional de Genotipagem (RENAGENO) na região
de Botucatu, SP – Brasil
Lilian da Silva Reis Munhoz
Botucatu
2011
Lilian da Silva Reis Munhoz
Perfil de resistência genotípica do HIV−1 em pacientes
com falha na terapia antirretroviral atendidos pela
Rede Nacional de Genotipagem (RENAGENO) na região
de Botucatu, SP − Brasil
Dissertação apresentada à Faculdade
de Medicina, Universidade Estadual
Paulista ”Julio de Mesquita Filho”,
Campus de Botucatu, para obtenção
do título de Mestre
Orientador: Profa. Dra. Rejane Maria Tommasini Grotto
Co−Orientador: Profa. Dra. Maria Inês de Moura Campos Pardini
Botucatu
2011
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICADE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Munhoz, Lilian da Silva Reis.
Perfil de resistência genotípica do HIV-1 em pacientes com falha na terapia
antirretroviral atendidos pela Rede Nacional de Genotipagem (RENAGENO)
na região de Botucatu, SP – Brasil / Lilian da Silva Reis Munhoz. - Botucatu,
2011
Dissertação (mestrado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade
Estadual Paulista, 2011
Orientador: Rejane Maria Tommasini Grotto
Co-Orientador: Maria Inês de Moura Campos Pardini
Capes: 20804008
1. Biologia molecular. 2. HIV (vírus) - Efeito das drogas.
Palavras-chave: Antirretrovirais; Genotipagem; HIV-1; Mutações; Resistência.
Dedico esta disserta ão aos meus pais
Aguinaldo (in memoriam) e Evangelina, aos
meus irmãos Yiviane e Paulo e ao meu esposo
Gustavo.
Agradecimentos
A Deus, que me deu força e sabedoria para conduzir e concluir este trabalho.
À minha família, meu porto−seguro, fonte de inspiração para todos os meus passos, que tem me
dado carinho, apoio e força durante toda minha vida e principalmente durante minha jornada em
Botucatu, sendo fundamentais nesta importante etapa da minha vida.
Ao meu esposo Gustavo, pelo apoio incondicional, paciência, dedicação, compreensão, carinho, força
e por sempre me incentivar, em todos os momentos.
À Profa. Dra. Rejane Maria Tommasini Grotto, pela orientação, dedicação, apoio e oportunidade de
aprendizado durante a realização deste trabalho e durante todo o período do Aprimoramento.
À Profa. Dra. Maria Inês de Moura Campos Pardini, co−orientadora deste trabalho, pelo incentivo e
pela oportunidade de aprendizado e crescimento, através do meu ingresso no Laboratório de
Pesquisa e de Rotinas Diagnósticas em Biologia Molecular do Hemocentro da FMB − UNESP e na
RENAGENO.
Ao Departamento de DST/Aids e Hepatites Virais do Ministério da Saúde, Unidade de Laboratórios,
nas pessoas da Dra. Lilian Amaral Inocêncio e Dra. Denise Ferreira Corrêa de Souza.
Aos funcionários e amigos do Laboratório de Rotinas Diagnósticas em Biologia Molecular do
Hemocentro da FMB aos quais dedico grande admiração: Regina, pela amizade, alegrias,
companheirismo, auxílio e apoio em todos os momentos; Rosângela, pela amizade, ensinamentos e
apoio; Maércio, grande amigo, pelas conversas, ensinamentos e conselhos; Sílvia, pela amizade, por
todos os dias que se dedicou a me ensinar passo a passo as técnicas da RENAGENO, pela
oportunidade e confiança emmim depositada.
Às colegas e amigas do Laboratório de Biologia Molecular durante esses três anos: Chiara, Patrícia,
Camila, Juliana Capannacci, Dra. Adriana Ferrasi, Dra. Paula Hokama e Bete (pela amizade,
oportunidade de acompanhá−las durante as técnicas de biologia molecular e aprendizado); Juliana
Padovani, Luciana e Aline pelo companheirismo e amizade durante os anos de Aprimoramento e
seguintes; Natália (pela amizade, auxílio e inúmeras caronas); Sarita, Tainara, Priscila, Jovita e Luanda
pela amizade e auxílio.
A todos os professores que compõem o curso de Mestrado Profissional do Programa de Pós−
Graduação em Pesquisa e Desenvolvimento (Biotecnologia Médica) da FMB − UNESP.
À Janisse, secretária do programa de pós−graduação, pela amizade, orientações e disponibilidade em
todos os momentos.
À Profa. Dra. Liciana Vaz Silveira (GAP) pelo inestimável auxílio com a finalização do banco de dados e
análise estatística.
À Dra. Rita Maria Saccomano Henriques, pelas valiosas sugestões durante a qualificação desta
dissertação.
Ao Dr. Paulo Eduardo de Abreu Machado, pelas valiosas sugestões durante a qualificação desta
dissertação.
Aos meus sogros e cunhada, pelo apoio e carinho e às minhas amigas da minha cidade, que mesmo
distantes, continuaram torcendo e me dando forças para continuar.
Às amigas da ”copinha”: Cléo, Juliane, Denise, Adaíze, Marisa, Dani, Néia e Ritinha e todos os demais
funcionários do Hemocentro da FMB, por todo apoio, amizade e força em todos os momentos.
À todos os colegas da turma do Mestrado: Ana Cláudia, Simone, Regina, Cláudia, Juliana, Mariele
Thaiane, Carla, Dr. Mair, Dr. Mauad, Dra. Pollyanna, Priscila, Marcos e demais, pela amizade e
constante aprendizado durante todas as disciplinas.
Aos Laboratórios de Pesquisa e de Rotinas Diagnósticas em Biologia Molecular do Hemocentro da
FMB − UNESP, na pessoa da Dra. Maria Inês de Moura Campos Pardini, pela disposição do espaço,
estrutura, material e oportunidade da realização deste estudo.
E a todos aqueles que torceram por mim e que, de alguma forma, contribuíram para o meu
crescimento pessoal e profissional durante esse período da minha vida.
"Quando uma criatura humana desperta para
um grande sonho e sobre ele lan a toda a for a
de sua alma, todo o universo conspira a seu
favor!"
Johann Wolfgang von Goethe
PREFÁCIO
Este trabalho foi desenvolvido a partir da minha experiência na Rede Nacional de
Genotipagem (RENAGENO). Tendo atuado como Aprimoranda durante dois anos no
Laboratório de Rotinas Diagnósticas em Biologia Molecular, mais especificamente na Rotina
de Genotipagem do HIV-1 - RENAGENO, meu interesse nesse tema foi crescente e a cada
novo exame, novas descobertas e aprendizado foram surgindo.
Desde sua implantação, em 2007, no Laboratório de Biologia Molecular, o exame de
Genotipagem do HIV-1 vem gerando um grande número de dados moleculares, material de
conteúdo extraordinário, no qual me fundamentei para desenvolver essa Dissertação de
Mestrado, que tem como tema principal o perfil de mutações e resistência aos
antirretrovirais dos pacientes atendidos pela RENAGENO no referido laboratório, fatores
fundamentais durante a orientação e otimização de uma terapia de resgate para pacientes
com falha na terapia antirretroviral.
Desta forma, meu trabalho foi desenvolvido na forma de dissertação, e consiste em
uma extensa análise de dados moleculares, clínicos e epidemiológicos da RENAGENO,
refletindo o resultado de minha participação no Laboratório de Biologia Molecular, nestes
três anos (Aprimoramento e Mestrado) de vivência e aprendizado.
Como material complementar desta dissertação, apresento um Artigo (Relato de
Caso), submetido à Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, que descreve a
detecção de uma inserção no códon 35 da protease do HIV-1, a qual ainda é pouco
documentada no Brasil. Este relato constitui um achado importante dentro da evolução
molecular do HIV, o qual somente posso apresentar aqui devido ao meu envolvimento e
comprometimento com a Rotina de Genotipagem do HIV-1 (RENAGENO).
Enfim, considero aqui apresentados os resultados de uma vivência diária desta etapa
da minha vida profissional.
Lilian da Silva Reis Munhoz
Resumo
Os antirretrovirais (ARVs) interferem nas enzimas virais resultando na inibição da replicação
do HIV. O uso combinado destas drogas tem demonstrado grande eficácia no controle da
progressão da infecção pelo HIV e aumento da sobrevida do paciente. Entretanto estes
benefícios podem ser comprometidos pelo desenvolvimento de resistência às drogas,
consequência da emergência de mutações nas enzimas virais, representando um grande
obstáculo para o sucesso do tratamento de pacientesinfectados pelo HIV−1. Os testes de
resistência, principalmente de genotipagem do HIV−1, permitem a orientação de novos
esquemas, possibilitando o retorno da supressão viral. Este estudo teve como objetivo
avaliar o perfil de mutações e a resistência genotípica aos Inibidores da Transcriptase
Reversa análogos de Nucleosídeos (ITRN), Inibidores da Transcriptase Reversa Não−análogos
de Nucleosídeos (ITRNN) e Inibidores da Protease (IP) em pacientes com falha terapêutica
submetidos ao exame de genotipagem, realizado no Laboratório de Rotinas Diagnósticas em
Biologia Molecular do Hemocentro da FMB − UNESP, ponto executor da RENAGENO (Rede
Nacional de Genotipagem do HIV−1). Foram analisadas sequências genômicas da região pol
do HIV−1 provenientes de todos os pacientes com exame de genotipagem realizados durante
os anos de 2008 e 2009. Dois grupos distintos foram formados: grupo ”Adulto” (idade ≥ 18
anos), com 386 indivíduos, e grupo ”Pediátrico” (<18 anos), com 45 pacientes, totalizando
431 pacientes. A genotipagem foi realizada pelo kit comercial Trugene HIY−t Genotyping Kit
(Siemens Healthcare Diagnostics). As sequências obtidas foram submetidas ao Algoritmo de
Interpretação de Resistência Genotípica da Universidade de Stanford (HIVdb) e a subtipagem
foi realizado pelo REGA HIY−t Subtyping Tool e pelo programa RIP 3.0. O subtipo B foi o mais
frequente nos dois grupos estudados, seguido pelas formas híbridas B e F (BF ou FB) e
subtipo F1. Foram encontradas mutações de resistência em 97,15% dos pacientes do grupo
adulto e na totalidade dos indivíduos do grupo pediátrico com falha terapêutica. As
mutações de resistência relacionadas aos ITRN foram as mais frequentes, sendo a principal
M184V, com frequência de 81,35% e 60,98% no grupo adulto e pediátrico, respectivamente,
seguida pelas TAMs (Mutações associadas aos Timidínicos), em 67,1% dos indivíduos do
grupo adulto e em 85,37% dos indivíduos do grupo pediátrico. A mutação relacionada aos
ITRNNs mais frequente no grupo adulto foi a K103N, encontrada em 41,97%, seguida pela
G190A, em 16,06%; essas mutações foram as mais frequentes no grupo pediátrico, ambas
presentes em 24,39% dos indivíduos. As mutações principais associadas aos IP mais
frequentes foram I54V, V82A, M46I e L90M nos dois grupos estudados. A análise da
resistência aos ARVs mostrou que 3TC/FTC e NVP possuem a maior frequência de resistência
alta e o DRV/r a menor entre todas as drogas analisadas, com grande potencial de uso na
terapia de resgate. A frequência de resistência total a toda uma classe de ARVs foi superior
para os ITRNs (32,28% [grupo adulto] e 48,78% [pediátrico]) e ITRNN (27,98% e 39,02%),
quando comparada aos IPs, que apresentaram o melhor desempenho (4,15% e 2,44%),
sendo a multirresistência (resistência total às três classes) muito baixa. Pela análise da
evolução imunovirológica, o teste de genotipagem mostrou−se uma ferramenta muito útil
para auxiliar na escolha de uma terapia de resgate, com um elevado número de pacientes
alcançando o sucesso na supressão viral e na restauração imune, os principais objetivos da
TARV.
Palavras-chave: Antirretrovirais; Genotipagem; HIV−1; Mutações; Resistência
Abstract
Antiretrovirals (ARV) interfere with viral enzymes resulting in the inhibition of HIV
replication. The use of antiretroviral combinations has demonstrated highly effectiveness in
controlling of the progression of HIV infection and increased of the patients' survival.
However these benefits can be compromised by the development of drug resistance, as
consequence of the mutations emergence in viral enzymes, representing a major obstacle to
successful treatment of HIV−1 patients infected. Resistance tests, mainly HIV−1 genotyping,
allow the orientation of new schemes, enabling the return of viral suppression. This study
aimed to evaluate the profile of mutations and genotypic resistance to the Nucleoside
Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTI), Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors
(NNRTI) and Protease Inhibitors (PI) in the patients in therapeutic failure submitted to the
genotyping test, performed in Diagnostic Routine Laboratory in Molecular Biology at the
Blood Center of FMB − UNESP, part of RENAGENO (National Network of HIV−1 Genotyping).
HIV−1 pol region genomic sequences from all patients with genotype test performed during
the years 2008 and 2009 were analyzed. The patients were separated in two distinct
groups: ”Adult group” (age ≥ 18 years), with 386 individuals, and ”Pediatric group” (<18
years), with
45 patients, in a total of 431 patients. Genotyping was performed by Trugene HIV−1
Genotyping Kit (Siemens Healthcare Diagnostics). The sequences obtained were submitted
to the Genotypic Resistance Interpretation Algorithm of Stanford University (HIVdb) and the
subtyping was performed by REGA HIV−1 Subtyping Tool and by RIP 3.0 program. Subtype B
was the most frequent in both groups followed by hybrid forms B and F (BF or FB) and
subtype F1. Resistance mutations were found in 97.15% of patients in the adult group and in
all individuals in the pediatric group with therapeutic failure. Mutations related to NRTI
resistance were the most frequent, being the main M184V, with a frequency of 81.35% and
60.98% in adult and pediatric group, respectively, followed by TAMs (thymidine−associated
mutations), in 67.1% of individuals in the adult group and 85.37% of the individuals in the
pediatric group. The NNRTI−related mutation more common in the adult group was K103N,
found in 41.97%, followed by G190A in 16.06%, these mutations were the most frequent in
the pediatric group, both present in 24.39% of individuals. The most frequent major
mutations associated with PIs in both groups were I54V, V82A, M46I and L90M. The ARVs
resistance analysis showed that 3TC/FTC and NVP have the highest frequency of high
resistance and the DRV/r the lowest among all drugs evaluated with great potential for use
in salvage therapy. The frequency of total resistance to an entire class of ARVs was superior
to the NRTIs (32.28% [adult group] and 48.78% [pediatric]) and NNRTI (27.98% and 39.02%)
when compared to PIs, which showed the best performance (4.15% and 2.44%), being
multidrug resistance (total resistance to three classes) very low. Through analysis of the
immunovirologic evolution, the genotyping test showed be a useful tool to assist in choosing
a rescue therapy, with a high number of patients achieving success in viral suppression and
immune restoration, the main objectives of ARV therapy.
Keywords: Antiretrovirals; Genotyping, HIV−1; Mutations; Resistance.
Lista de ilustrações
Figura 1- Esquema ilustrativo da partícula viral do HIV−1 ligada à superfície do linfócito T CD4+,
evidenciando as principais proteínas, estruturas e enzimas virais envolvidas na replicação
(ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008).......................................................................................... 18
Figura 2- Organização do genoma do HIV−1. Todas as três fases abertas de leitura (ORF) são
extensivamente sobrepostas, originando as proteínas e enzimas virais (DIMMOCK; EASTON;
LEPPARD, 2007).......................................................................................................................19
Figura 3- Cristalografia de raio−X da estrutura da enzima TR. O monômero p51 é mostrado em cinza. O
monômero p66 é colorido e possui os subdomínios. A enzima está associada ao ácido
nucleico (amarelo)/iniciador (laranja), a entrada de dNTP é mostrada em amarelo, e o sítio
ativo da enzima, que consiste de três aspartatos catalíticos, D110, D185, D186 é mostrado
em branco (HUANG et al., 1998).............................................................................................21
Figura 4- Esquema ilustrativo do processo de transcrição do HIV−1, evidenciando os sítios de ínicio e
término do processo (setas em preto) RNAs genômicos inteiros são sintetizados. Alguns
funcionarão como RNAm, enquanto outros vão se tornar os genomas do vírus da progênie
(CARTER; SAUNDERS, 2007)....................................................................................................23Figura 5- Maturação viral: A poliproteína Gag, composta pela MA, CA, NC e P6, além dos pequenos
peptídeos espaçadores, p2, entre CA e NC, e p1, entre NC e p6 é processada pela PR do HIV−
1, formando as estruturas internas do vírion maduro (VON SCHWEDLER et al., 1998) 25
Figura 6- Estrutura da protease do HIV: A protease é um dímero de subunidades idênticas, mostradas
em azul e amarelo. Os resíduos de ácido aspártico no sítio ativo, um de cada cadeia, são
mostradas como estruturas de haste e esfera. As abas irão fechar na fenda de ligação após
a ligação com o substrato (BERG et al., 2002)........................................................................ 26
Figura 7- Representação esquemática do processo de geração da recombinação do HIV. Pela infecção
sequencial ou simultânea por duas variantes (rosa e azul) origina−se um vírus heterozigoto
(roxo), o qual ao infectar nova célula hospedeira pode conduzir a geração de um genoma
recombinante (NAJERA et al., 2002)....................................................................................... 27
Figura 8- Estimativa de adultos e crianças vivendo com HIV no mundo em 2009 (UNAIDS, 2010)........29
Figura 9 - Posição relativa dos sítios de ligação dos ITRNs (círculo vermelho) no sítio ativo da TR, e dos
ITRNNs (círculo azul) na região do bolso hidrofóbico. A subunidade p51 é representada em
cinza enquanto os subdomínios de p66 são codificados por cores: dedos em amarelo,
polegar em laranja, palma em azul claro, conexão em verde e RNAseH em roxo (FREISZ et
al., 2010)..................................................................................................................................32
Figura 10- Mecanismo de ação dos inibidores de transcriptase reversa. ITRN (A): a incorporação do
análogo de nucleosídeo resulta na terminação da cadeia de DNA e mostra a resistência do
vírus selvagem à excisão do análogo mediada pelo ATP. ITRNN (B): a ligação da droga no
bolso hidrofóbico bloqueia a polimerização pela TR (CLAVEL; HANCE, 2004)....................... 33
Figura 11- Local de ligação dos IPs. Representa a protease ligada ao Lopinavir (amarelo) (STANFORD,
2010)....................................................................................................................................... 34
Figura 12- Pressão seletiva dos ARVs e emergência de variantes resistentes. As partículas virais em
azul claro representam o vírus selvagem, que durante a terapia são inibidos, havendo a
emergência de variantes resistentes (laranja); devido à replicação persistente, ocorre o
acúmulo de mutações (azul escuro), levando a uma recuperação do fitness e acentuada
replicação (KURITZKES, 2004)................................................................................................. 37
Figura 13- Mecanismos de resistência aos ITRNs. (A) discriminação do análogo de nucleosídeo pela
presença de mutações. (B) Excisão do análogo mediada por ATP. Determinam a
continuidade da transcrição pela TR (CLAVEL; HANCE, 2004)................................................ 42
Figura 14- Mecanismo de resistência aos ITRNNs: alterações estruturais dificultam a acessibilidade
dos ITRNN à enzima (CLAVEL; HANCE, 2004)..........................................................................43
Figura 15- Sítios das mutações de resistência no dímero da protease. O dímero da protease está
representado nas fitas cor de rosa ligado ao Darunavir (verde). Mutações principais e
acessórias são representadas como esferas vermelhas e azuis, respectivamente. As
mutações estão distribuídas em ambos os monômeros para aumentar a visibilidade
(WEBER; AGNISWAMY, 2009).................................................................................................45
Figura 16- Rede Nacional de Laboratórios de Genotipagem: mapa representando a distribuição dos
23 laboratórios da rede (BRASIL, 2009a)................................................................................ 46
Figura 17- Sequenciamento do gene da polimerase (pol) do HIV−1 (Trugene HIV−1 Genotyping Kit). A
ilustração mostra as etapas do teste, retrotranscrição, amplificação e as posições dos
primers no produto, delimitando os fragmentos que serão sequenciados: Protease (laranja)
e P2 (preto) − gene da protease; e RT beggining (azul) e RT middle (vermelho) − gene da
transcriptase reversa (SIEMENS, 2008)...................................................................................52
Figura 18- Distribuição dos subtipos e formas híbridas do HIV−1 circulantes nos pacientes do grupo
Adulto, atendidos pelo Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Botucatu,
ponto executor da Rede Nacional de Genotipagem, nos anos de 2008 e 2009.....................54
Figura 19- Frequência das mutações de resistência aos ITRNs.................................................................. 58
Figura 20- Frequência das mutações de resistência aos ITRNNs................................................................61
Figura 21 - Frequência das mutações de resistência principais aos IP.......................................................64
Figura 22- Frequência das mutações acessórias de resistência aos IP.......................................................65
Figura 23- Perfil de Resistência aos Inibidores de Transcriptase Reversa análogos de Nucleosídeos:
Lamivudina (3TC), Emtricitabina (FTC), Zidovidina (AZT), Estavudina (d4T), Abacavir (ABC),
Didadosina (ddI), e Tenofovir (TDF)......................................................................................68
Figura 24- Perfil de Resistência aos Inibidores de Transcriptase Reversa Não−análogos de
Nucleosídeos: Efavirenz (EFV), Nevirapina (NVP), Delavirdina (DLV) e Etravirina (ETR). 69
Figura 25- Perfil de Resistência aos Inibidores de Protease: Atazanavir/r (ATV/r), Darunavir/r (DRV/r),
Fosamprenavir/r (FPV/r), Indinavir (IDV/r), Lopinavir/r (LPV/r), Nelfinavir (NFV),
Saquinavir/r (SQV/r), e Tipranavir/r (TPV/r) ; r: potencializados com Ritonavir..................70
Figura 26- Média de contagem de T CD4+ (células/mm3) e carga viral (log10 cópias/mL) no momento
do exame de genotipagem (FT− Falha terapêutica) e 6 e 12meses após o teste................ 73
Figura 27- Distribuição dos subtipos e formas híbridas do HIV−1 circulantes nos pacientes do grupo
Pediátrico, atendidos pelo Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Botucatu,
ponto executor da Rede Nacional de Genotipagem, nos anos de 2008 e 2009.................. 74
Figura 28- Frequência das mutações de resistência aos ITRNs.................................................................. 78
Figura 29- Frequência das mutações de resistência aos ITRNNs................................................................80
Figura 30- Frequência das mutações de resistência principais aos IP........................................................81
Figura 31- Frequência das mutações de resistência acessórias aos IP.......................................................81
Figura 32- Perfil de Resistência aos Inibidores de Transcriptase Reversa análogos de Nucleosídeos:
Lamivudina (3TC), Emtricitabina (FTC), Zidovidina (AZT), Estavudina (d4T), Abacavir (ABC),
Didadosina (ddI), e Tenofovir (TDF)......................................................................................83
Figura 33- Perfil de Resistência aos Inibidores de Transcriptase Reversa Não−análogos de
Nucleosídeos: Efavirenz (EFV), Nevirapina (NVP), Delavirdina (DLV) e Etravirina (ETR). 84
Figura 34- Resistência aos Inibidores de Protease: Atazanavir/r (ATV/r), Darunavir/r (DRV/r),
Fosamprenavir/r (FPV/r), Indinavir (IDV/r), Lopinavir/r (LPV/r), Nelfinavir (NFV),
Saquinavir/r (SQV/r), e Tipranavir/r (TPV/r); r: potencializados com Ritonavir...................85
Figura 35- Média de contagem de T CD4+ (células/mm3) e carga viral (log10 cópias/mL) no momento
do exame de genotipagem (FT− Falha terapêutica) e 6 e 12meses após o teste................ 87
Figura 36- Comparação da frequência das principais mutações relacionadasaos IPs, ITRNs e ITRNNs
nos grupos Adulto e Pediátrico............................................................................................ 88
Lista de Tabelas
Tabela 1- Análise descritiva das características demográficas, clínicas, virológicas e imunológicas dos
indivíduos incluídos no estudo (n=431).................................................................................. 50
Tabela 2- Frequência do número de mutações de resistência na PR e TR (total e classes)................... 56
Tabela 3- Frequência da exposição aos antirretrovirais e presença de mutações de resistência por
classe de droga........................................................................................................................57
Tabela 4- Frequência das mutações TAMs e perfil das vias na população de estudo..............................59
Tabela 5- Mutações de resistência à ETR de acordo com o uso dos ITRNNs no último esquema de
TARV e exposição prévia......................................................................................................... 63
Tabela 6- Número de Mutações de resistência ao DRV/r...........................................................................66
Tabela 7- Suscetibilidade as classes dos ITRNs, ITRNNs e IPs (suscetibilidade e resistência totais)....... 67
Tabela 8- Frequência dos valores de contagem de carga viral plasmática no momento do exame de
genotipagem (Falha terapêutica) e após 6 e 12 meses...........................................................72
Tabela 9- Frequência dos valores de contagem de Linfócitos T CD4+, Nadir, no momento do exame
de genotipagem (Falha terapêutica) e após 6 e 12 meses......................................................72
Tabela 10- Frequência do número de mutações de resistência na PR e TR (total e classes).................. 76
Tabela 11- Frequência da exposição aos antirretrovirais e presença de mutações de resistência por
classe de droga no grupo de pacientes com falha na terapia.................................................77
Tabela 12- Frequência das mutações TAMs e perfil das vias na população de estudo............................79
Tabela 13- Suscetibilidade as classes dos ITRNs, ITRNNs e IPs (suscetibilidade e resistência totais)..... 82
Tabela 14- Frequência dos valores de contagem de carga viral plasmática no momento do exame de
genotipagem (Falha terapêutica) e após 6 e 12 meses...........................................................86
Tabela 15- Frequência dos valores de contagem de Linfócitos T CD4+, Nadir, no momento do exame
de genotipagem (Falha terapêutica) e após 6 e 12 meses......................................................86
Tabela 16- Frequência da resistência genotípica aos ARVs (Classificação de Stanford) segundo os
grupos Adulto e Pediátrico......................................................................................................89
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
HIV = Vírus da Imunodeficiência Humana
T CD4+ = Linfócitos T CD4+
ssRNA = RNA fita simples de polaridade positiva
NC = nucleocapsídeo
CA = capsídeo
MA = matriz protéica
gp = glicoproteína
gag = group−specific antigen (antigeno de grupo específico)
pol = polymerase (polimerase)
env = envelope
Tat = transcriptional transactivator (transativador da transcrição)
Rev = regulator of virion gene expression (regulador da expressão viral)
Nef = negative effector (fator regulatório negativo) Vif
=viral infectivity factor (fator de infectividade viral) Vpr
= viral proteins r (proteína viral r)
Vpu = viral proteins u (proteína viral u)
PR = Protease
TR = Transcriptase Reversa
IN = integrase
RNAm = RNA mensageiro
LTRs = Long Terminal Repeat (Repetições Terminais Longas)
HR1/2 = região helical 1/2
tRNAlys3 = RNA transportador de lisina
PIC = complexo de pré−integração NPC
= complexo poro nuclear
TAR = trans−activating response element (elemento de resposta transativadora)
RRE = Rev Response Element (elemento de resposta a Rev)
CRF = Circulating Recombinant Forms (formas recombinantes circulantes)
ARV = antirretrovirais
RENAGENO = Rede Nacional de Genotipagem
TARV = terapia antirretroviral
SISCEL = Sistema de Controle de Exames Laboratoriais SISGENO
= Sistema de Informação para Rede de Genotipagem T-20 =
Enfuvirtida
FDA = Food and Drug Administration
ITRN = Inibidores de Transcriptase Reversa Análogos de Nucleosídeos ITRNN
= Inibidores de Transcriptase Reversa Não−análogos de NucleosídeosIP =
Inibidores de Protease
AZT = Zidovudina
TDF = Tenofovir
d4T = Estavudina
3TC = Lamivudina
FTC = Emtricitabina
ddI = Didadosina
ABC = Abacavir
DLV = Delavirdina
NVP = Nevirapina
EFV = Efavirenz
ETR = Etravirina
RAL = Raltegravir
SQV = Saquinavir
IDV = Indinavir
RTV = Ritonavir
NFV = Nelfinavir
ATV = Atazanavir
APV = Amprenavir
FPV = Fosamprenavir
LPV = Lopinavir
DRV = Darunavir
TPV = Tipranavir
IP/r = Inibidor de Protease reforçado com ritonavir
HAART = Highly Active Antiretroviral Therapy (terapia antirretroviral altamente ativa)
VHB = Vírus da Hepatite B
VHC = Vírus da Hepatite C
TAM = thymidine analog mutations (mutações associadas aos análogos de timidina)
MRG =Médicos de Referência em Genotipagem
POP = Procedimento Operacional Padrão
Sumário
1 INTRODUÇÁO......................................................................................................................................18
1.1 Descoberta do HIV/AIDS...............................................................................................................18
1.2 Vírion: estrutura e genoma.......................................................................................................... 18
1.3 Ciclo Replicativo............................................................................................................................20
1.3.1 Entrada na célula hospedeira................................................................................................20
1.3.2 Transcrição Reversa...............................................................................................................20
1.3.3 Integração..............................................................................................................................22
1.3.4 Expressão do HIV−1...............................................................................................................22
1.3.5 Brotamento e Maturação viral..............................................................................................24
1.4 Variabilidade Genética................................................................................................................. 26
1.5 Epidemiologia do HIV/AIDS.......................................................................................................... 28
1.6 Acompanhamento e Tratamento.................................................................................................29
1.7 Antirretrovirais............................................................................................................................. 31
1.7.1 Classes de drogas...................................................................................................................31
1.7.2 Tratamento............................................................................................................................34
1.7.3 Falha terapêutica...................................................................................................................35
1.7.4 Resistência aos antirretrovirais............................................................................................. 36
1.7.5 Barreira Genética...................................................................................................................38
1.7.6 Testes de Resistência.............................................................................................................39
1.7.7 Mutações de Resistência.......................................................................................................411.7.7.1 Mutações de Resistência aos ITRNs................................................................................... 41
1.7.7.2 Mutações de Resistência aos ITRNNs.................................................................................43
1.7.7.3 Mutações de Resistência aos IP..........................................................................................44
1.8 Rede Nacional de Genotipagem do HIV−1 − RENAGENO.............................................................45
1.8.1 Critérios de inclusão no exame............................................................................................. 46
1.8.2 Fluxo da RENAGENO..............................................................................................................46
2 OBJETIVOS..........................................................................................................................................48
2.1 Objetivo Geral...............................................................................................................................48
2.2 Objetivos específicos....................................................................................................................48
3 CASUÍSTICA.........................................................................................................................................49
4 MÉTODOS............................................................................................................................................51
4.1 Processamento das amostras.......................................................................................................51
4.2 Extração de RNA, Amplificação e Sequenciamento.....................................................................51
4.3 Identificação das mutações de resistência...................................................................................52
4.4 Determinação do subtipo.............................................................................................................53
4.5 Coleta e análise dos dados........................................................................................................... 53
5 RESULTADOS E DISCUSSÁO............................................................................................................... 54
5.1 Grupo Adulto................................................................................................................................54
5.1.1 Subtipo viral...........................................................................................................................54
5.1.2 Mutações de resistência........................................................................................................55
5.1.2.1 Mutações de resistência aos ITRNs....................................................................................57
5.1.2.2 Mutações de resistência aos ITRNNs..................................................................................61
5.1.2.3 Mutações de resistência aos IP.......................................................................................... 64
5.1.3 Resistência aos ARVs............................................................................................................. 67
5.1.3.1 Resistência geral.................................................................................................................67
5.1.3.2 Resistência aos ITRNs......................................................................................................... 68
5.1.3.3 Resistência aos ITRNNs.......................................................................................................69
5.1.3.4 Resistência aos IP............................................................................................................... 70
5.1.4 Evolução imunovirológica......................................................................................................71
5.2 Grupo Pediátrico...........................................................................................................................74
5.2.1 Subtipo viral...........................................................................................................................74
5.2.2 Mutações de resistência........................................................................................................75
5.2.2.1 Mutações de resistência aos ITRNs....................................................................................77
5.2.2.2 Mutações de resistência aos ITRNNs..................................................................................79
5.2.2.3 Mutações de resistência aos IP.......................................................................................... 80
5.2.3 Resistência aos ARVs............................................................................................................. 82
5.2.3.1 Resistência geral.................................................................................................................82
5.2.3.2 Resistência aos ITRNs......................................................................................................... 82
5.2.3.3 Resistência aos ITRNNs.......................................................................................................83
5.2.3.4 Resistência aos IP............................................................................................................... 84
5.2.4 Evolução imunovirológica......................................................................................................85
5.3 Análise dos Grupos.......................................................................................................................87
6 CONSIDERAÇÓES FINAIS....................................................................................................................91
REFERÊNCIAS.........................................................................................................................................92
APÊNDICE A− Uso no esquema atual e exposição aos ARVs pelos grupos Adulto e Pediátrico...........109
APÊNDICE B− Esquemas de ARVs em uso nomomento do exame pelos grupos Adulto e Pediátrico.110
APÊNDICE C− Frequência individual das mutações de resistência relacionadas aos IPs......................111
APÊNDICE D− Frequência individual das mutações de resistência relacionadas aos ITRNs e ITRNNs 112
APÊNDICE D− Frequência individual das mutações de resistência relacionadas aos ITRN e ITRNN.....113
ANEXO A− Código de aminoácidos (três letras e uma letra).................................................................114
ANEXO B− Formulário para solicitação de Exame de Genotipagem: Formulário A..............................115
ANEXO C− Formulário para solicitação de Exame de Genotipagem: Formulário B..............................116
18
1 INTRODUÇÁO
1.1 Descoberta do HIV/AIDS
Em 1981, uma nova doença foi observada nos Estados Unidos, com o aparecimento
de casos de doenças que até então acometiam apenas pacientes imunodebilitados, como o
Sarcoma de Kaposi e a pneumonia causada por Pneumocystis jiroveci (anteriormente
denominado Pneumocystis carinii) (CDC, 1981; GOTTLIEB, 2006).
Caracterizada por uma deficiência imunológica progressiva, com declínio das células
T CD4+, a fase sintomática desta imunodeficiência adquirida é conhecida atualmente como
aids. Em 1983−84, um novo retrovírus humano foi isolado e identificado como agente
etiológico da aids, o qual recebeu mais tarde a denominação de Vírus da Imunodeficiência
Humana do tipo 1 (HIV−1) (BARRÉ−SINOUSSI et al., 1983; GALLO et al., 1984). Um segundo
retrovírus, o HIV−2, também relacionado à doença, foi identificado no Oeste da África em
1986 (CLAVEL et al., 1986).
1.2 Vírion: estrutura e genoma
O HIV−1 é um retrovírus pertencente ao gênero lentiviridae, com genoma constituído
por duas fitas idênticas de RNA fita simples de polaridade positiva (ssRNA+),revestidas pelas
proteínas do nucleocapsídeo (NC), enzimas e proteínas virais do hospedeiro, formando um
complexo que é envolvido pelo capsídeo (CA) em forma de cone, matriz protéica (MA), e
mais externamente por uma dupla camada de fosfolipídios, derivada da membrana da célula
hospedeira, com glicoproteínas virais (gp41 e gp120) ancoradas (Figura 1).
Figura 1- Esquema ilustrativo da partícula viral do HIV−1 ligada à superfície do linfócito T CD4+,
evidenciando as principais proteínas, estruturas e enzimas virais envolvidas na replicação (ABBAS;
LICHTMAN; PILLAI, 2008)
19
O genoma viral é constituído por genes estruturais, comuns aos retrovírus, gag
(group−specific antigen), pol (polymerase) e env (envelope), que codificam poliproteínas
precursoras Gag, Gag−Pol e Env, as quais são posteriormente processadas, originando
proteínas estruturais internas, enzimas virais e glicoproteínas do envelope, respectivamente
(Figura 2). Além destes, o RNA viral apresenta os genes regulatórios Tat (transcriptional
transactivator) e Rev (regulator of virion gene expression), e os genes auxiliares, Nef
(negative effector), Yif (viral infectivity factor), Ypr (viral proteins r) e Ypu (viral proteins u),
que dão origem a proteínas de mesmo nome e com diversas funções no ciclo replicativo viral
(CULLEN, 1998).
A poliproteína percursora Gag é proteoliticamente processada por proteases virais,
para gerar as proteínas da matriz (MA [p17]), capsídio (CA [p24]), nucleocapsídeo (NC [p7]) e
p6. A poliproteína Gag−pol é segmentada nas três enzimas envolvidas na replicação viral, a
protease (PR), responsável pela clivagem postraducional dos produtos gênicos, a
transcriptase reversa (TR), envolvida na transcrição reversa do RNA em DNA dupla fita, e a
integrase (IN), cuja função consiste na integração do DNA viral ao genoma do hospedeiro. O
gene env codifica a proteína precursora gp160, clivada por proteases celulares nas
glicoproteínas do envelope, gp120 e gp41 (ALLAN et al., 1985; ROBEY et al., 1985).
Figura 2- Organização do genoma do HIV−1. Todas as três fases abertas de leitura (ORF) são
extensivamente sobrepostas, originando as proteínas e enzimas virais (DIMMOCK; EASTON; LEPPARD,
2007)
As extremidades do RNA viral são constituídas pelas estruturas Cap no final 5' e
cauda Poli A no final 3', adquiridas durante o processamento do RNA mensageiro (RNAm)
20
genômico viral, além das sequências únicas 5' (U5) e 3' (U3), flanqueadas por regiões R
(sequência repetida), que darão origem, após diversas etapas durante o processo de
transcrição reversa, à duas regiões lTRs (long Terminal Repeat − Repetições Terminais
Longas), conhecidas como 5'lTR e 3'lTR (ambas compostas pelas regiões U3, R e U5), que
flanqueiam o DNA proviral e tem papel fundamental durante a integração e transcrição
celular do provírus (COFFIN; VARMUS, 1997).
1.3 Ciclo Replicativo
1.3.1 Entrada na célula hospedeira
A infecção pelo HIV−1 tem início com a interação da glicoproteína do envelope viral
gp120 com moléculas CD4, expressas na superfície de diversos tipos celulares, incluindo
linfócitos T auxiliares/helper (T CD4+), o principal alvo do HIV−1, macrófagos, células da
microglia e células dendríticas, sendo utilizado como receptor primário pelo vírus
(DALGLEISH et al., 1984; KLATZMANN et al., 1984). Esta ligação conduz a mudanças
conformacionais na gp120, as quais contribuem para a ligação com os receptores de
quimiocinas CCR5 ou CXCR4, utilizados como correceptores (DORANZ et al., 1996; DRAGIC et
al., 1996; FENG et al., 1996). Alterações conformacionais na subunidade viral gp41 são
desencadeadas, resultando na inserção de seu peptídeo de fusão na membrana celular,
ligação da região helical 1 (HR1) e 2 (HR2) da gp41, encurtando a molécula e promovendo a
fusão das membranas, liberando o capsídeo viral para o interior da célula hospedeira (CHAN
et al., 1997; WEISSENHORN et al., 1997).
1.3.2 Transcrição Reversa
Após a entrada, o capsídeo é parcialmente desencapsulado no citoplasma da célula,
iniciando o processo de transcrição reversa, no qual a enzima TR atua na polimerização do
DNA dupla fita a partir do RNA viral (HUBER et al., 1989; GOFF, 1990).
A TR, uma DNA polimerase dependente de RNA e DNA, com atividade de RNaseH, é
um heterodímero composto pelas subunidades p66 e p51 (DI MARZO VERONESE et al., 1986).
A subunidade p66 contém 560 aminoácidos, enquanto a subunidade p51 contém apenas os
primeiros 440 resíduos, devido a ausência do domínio RNaseH. Embora a sequência inicial da
p51 seja idêntica a da subunidade p66, ela adquire uma conformação estrutural totalmente
diferente, não exibe atividade enzimática e funciona como uma
21
Ativo
Sítio
plataforma para a p66 (SARAFIANOS; ARNOLD, 2008). A subunidade p66 contém o sulco de
ligação ao DNA, o sítio ativo e o domínio RNaseH, e sua estrutura é comparada com uma
“mão direita“, possuindo os domínios dedos (fingers), palma (palm), e polegar (thumb). Os
domínios dedo e polegar interagem com a enzima quando não associada ao ligante, pois ao
interagir com o DNA, ela adquire uma conformação “aberta“, perturbando esta interação. A
ligação do dNTP provoca o fechamento do domínio dedos em direção a palma, de forma que
o DNA é bloqueado na posição e os resíduos do sítio ativo podem coordenar a entrada de
nucleotídeos (HUANG et al., 1998; BASAVAPATHRUNI; ANDERSON, 2007).
Figura 3- Cristalografia de raio−X da estrutura da enzima TR. O monômero p51 é mostrado em cinza. O
monômero p66 é colorido e possui os subdomínios. A enzima está associada ao ácido nucleico
(amarelo)/iniciador (laranja), a entrada de dNTP é mostrada em amarelo, e o sítio ativo da enzima,
que consiste de três aspartatos catalíticos, D110, D185, D186 é mostrado em branco (HUANG et al.,
1998)
No processo de transcrição reversa, uma molécula de tRNAlys3 (RNA transportador)
do hospedeiro, previamente associada ao genoma viral, é utilizada como iniciador para a
síntese do DNA pela enzima TR. A extremidade 3' do tRNA celular pareia com uma região
localizada próximo ao final 5' do RNA genômico, formando um complexo RNA−RNA que é
reconhecido pela TR, que inicia a síntese do DNA fita negativa (GOFF, 2001). O domínio
RNaseH da TR atua sobre o híbrido RNA:DNA degradando o RNA, liberando a fita de DNA
recém formada, que é inteiramente estendida pela TR (DNA fita positiva), resultando em um
DNA dupla fita flanqueado por dois lTRs (DIMMOCK; EASTON; LEPPARD, 2007).
22
1.3.3 Integração
O DNA viral dupla fita recém−sintetizado, permanece associado com as proteínas
virais NC, MA, TR, Vpr e a enzima viral integrase, além de diversas proteínas celulares,
formando um grande complexo de nucleoproteína chamado complexo de pré−integração
(PIC). A transcrição reversa ocorre no citoplasma, sendo necessário que o PIC atravesse o
envelope nuclear intacto antes da integração do DNA viral no genoma da célula hospedeira
(FARNET; HASELTINE, 1990; STEVENSON, 1996). Este processo é mediado por fatores
cariofílicos presentes em vários de seus componentes, que interagem com elementos
celulares e do complexo poro nuclear (NPC), permitindo a importação do PIC para o interior
do núcleo (SHERMAN; GREENE, 2002; IORDANSKIY et al., 2006).
A integrase, uma proteína globular de 32 kDa, consiste em três domínios N−terminal,
cerne, responsável pela atividade catalítica da enzima e domínio C−terminal, e funciona
como um tetrâmero ou multímero. Os eventos do processo de integração do HIV−1 são
mediados pela IN que, inicia a formação do PIC, se ligando em sequências específicas nas
extremidades do DNA viral logo após a transcrição reversa; promove o processamento 3',
removendo 2 nucleotídeos de cada extremidade 3' do DNA viral e gerando extremidades
reativas; corta os filamentos do DNA da célula hospedeira e executa a etapa irreversível de
transferência de filamento, ligando de maneira covalente as extremidades do DNA viral ao
cromossomo hospedeiro (ASANTE−APPIAH; SKALKA, 1999; ESPOSITO; CRAIGIE, 1999).
Apósa inserção, enzimas celulares reparam as lacunas (gaps) na cadeia de DNA,
finalizando o processo de integração e de formação do provírus ou DNA proviral do HIV−1
(BUSHMAN; CRAIGIE, 1991). Não há sítios específicos para a integração, embora exista
alguma preferência para regiões relativamente abertas na cromatina que possuem genes
ativos (SCHRODER et al., 2002).
1.3.4 Expressão do HIV-1
Após a integração, fatores de transcrição celulares são capazes de ativar a transcrição
de genes virais e produção de suas proteínas, comportando−se como qualquer gene
humano, com a transcrição iniciando no final 5' e finalizando no final 3' (BUSHMAN;
FUJIWARA; CRAIGIE, 1990; JONES; PETERLIN, 1994).
As duas regiões lTR (compostas por U3, R, U5) que flanqueiam as extremidades do
provírus são idênticas, porém funcionalmente diferentes, sendo cada uma responsável pelo
23
início e término da transcrição. A região U3 possui sequências promotoras e enhancers, com
sítios onde diversos fatores de transcrição se ligam e posicionam a RNA polimerase II celular
no sítio correto, iniciando a transcrição na junção U3−R (Figura 4). A transcrição do genoma
viral continua até a região R do final 3', onde há um sinal de poliadenilação e terminação,
que ocorre na junção R−U5 (CULLEN, 1995).
Inicialmente, a transcrição resulta na síntese de uma pequena quantia de fitas
inteiras de RNA viral, que passam por múltiplos processos de splicing para formar pequenos
RNAm que codificam as proteínas Tat e Rev. A proteína regulatória Tat funciona como um
ativador de transcrição, ligando−se a uma estrutura em forma de haste em alça no RNA
nascente, conhecida como TAR (trans−activating response element), que é codificada
próximo ao sítio de início de transcrição, na região R (ROSEN et al., 1986). O complexo Tat−
TAR liga−se a proteínas quinases da célula hospedeira, que hiperfosforilam a RNA polimerase
II, aumentando sua eficiência e velocidade da transcrição. Na ausência da Tat a trancrição do
HIV inicia, mas a elongação é ineficiente (JONES; PETERLIN, 1994; ZHOU; SHARP, 1995).
O HIV−1 produz três classes de RNA mensageiros de comprimentos distintos. O maior
RNAm possui a extensão do genoma inteiro, cerca de 9,3 Kb, codifica as poliproteínas Gag e
Gag−Pol e é idêntica ao RNAm genômico empacotado no vírion. As outras classes são
produzidas a partir destes RNAm completos que sofreram splicing. A de 4.5 Kb é gerada por
um único splicing e codifica os produtos dos genes env, vif, vpr e vpu. A classe de RNAm de 2
Kb é produto de dois ou mais splicings (múltiplos splicings) e origina as proteínas Tat, Rev e
Nef (CULLEN, 1991; CARTER; SAUNDERS, 2007).
Figura 4- Esquema ilustrativo do processo de transcrição do HIV−1, evidenciando os sítios de ínicio e
término do processo (setas em preto) RNAs genômicos inteiros são sintetizados. Alguns funcionarão
como RNAm, enquanto outros irão se tornar os genomas do vírus da progênie (CARTER; SAUNDERS,
2007)
24
Nas fases iniciais, apenas os transcritos de 2 Kb, são capazes de atravessar a
membrana nuclear, enquanto aqueles que passaram por processos incompletos ou nenhum
splicing permanecem retidos no núcleo. A proteína Rev, traduzida a partir destes transcritos,
acumula−se no núcleo e atua na indução da transição da fase inicial à fase final de expressão
dos genes do HIV, pela ligação no elemento de resposta a Rev (RRE − Rev Response Element),
presente apenas em RNAm virais sem processamento completo, acionando a exportação
nuclear destes transcritos (MALIM et al., 1989).
Após a exportação para o citoplasma, as poliproteínas Gag e Gag−Pol são sintetizadas
de transcritos sem splicing em ribossomos livres, que sintetizam Gag até encontrarem um
stop códon, e quando há uma mudança de fase de leitura ribossomal (frameshift ribossomal)
continuam a leitura no transcrito na porção do gene pol, produzindo Gag−Pol (JACKS et al.,
1988). Isso ocorre em cerca de cinco por cento das ocasiões em que um ribossomo atravessa
a sequência UUUUUUA, conhecida como uma sequência escorregadia (slippery sequence),
na junção dos domínios de gag NC e p1. Este sequência, aliada a uma estrutura secundária
posterior, faz com que o ribossomo deslize do frame de leitura 1 para o 3, produzindo a
poliproteína Gag−Pol (CARTER; SAUNDERS, 2007). As modificações pós−traducionais das
poliproteínas envolvem a adição de ácido mirístico na proteína MA (p17), presente na
porção N−terminal de Gag, que fornece um domínio hidrofóbico necessário à interação de
Gag e Gag−Pol com a membrana celular, facilitando a montagem do vírus, antes mesmo de
sofrerem processamento proteolítico (GOTTLINGER; SODROSKI; HASELTINE, 1989; BRYANT;
RATNER, 1990; SPEARMAN et al., 1997).
Vpu e Env são traduzidos no retículo endoplasmático rugoso, de um transcrito pouco
processado e bicistrônico, sendo Env produzido quando o códon de início de Vpu é
contornado durante a síntese (SCHWARTZ et al., 1990). As poliproteínas Env são
trasportadas para o Complexo de Golgi, onde são altamente glicosiladas e clivadas por
proteases do hospedeiro nas glicoproteínas do envelope gp41 e gp120. As proteinas
restantes Vif e Vpr são traduzidas em ribossomos livres a partir de RNAm com pouco splicing
(CULLEN, 1991).
1.3.5 Brotamento e Maturação viral
Após a síntese dos componentes virais, tem início a montagem do vírion na
membrana plasmática. Este processo envolve principalmente as poliproteínas Gag e Gag−Pol,
25
que se acumulam na face externa da membrana, as glicoproteínas do envelope, ancoradas
na membrana plasmática e o RNA viral genômico, incorporado no virion através da interação
com as regiões zinc fingers localizadas no domínio NC da poliproteína Gag (FREED, 2003).
O brotamento viral tem início com a ubiquitinação da região C−terminal de Gag, p6, o
que recruta os componentes dos corpos multivesiculares celulares, que possibilitam a
liberação eficiente das partículas virais da membrana da célula infectada (STRACK et al.,
2000; GARRUS et al., 2001). Quando deixam as células, as poliproteínas Gag e Gag−Pol estão
intactas, e o vírion possui uma morfologia imatura. A protease viral torna−se ativa a partir da
formação de um dímero nos precursores Gag−Pol, e se auto cliva antes de iniciar o processo
de clivagem das duas poliproteínas para produzir as proteínas estruturais e enzimas de
replicação, conferindo uma morfologia madura para a partícula viral (DEBOUCK et al., 1987).
Figura 5- Maturação viral: A poliproteína Gag, composta pela MA, CA, NC e P6, além dos pequenos
peptídeos espaçadores, p2, entre CA e NC, e p1, entre NC e p6 é processada pela PR do HIV−1,
formando as estruturas internas do vírion maduro (VON SCHWEDLER et al., 1998)
A protease do HIV−1, pertencente à família das aspartil proteases, é composta por
dois monômeros idênticos (homodímero), cada um com 99 aminoácidos, associados não
covalentemente (PEARL; TAYLOR, 1987). No centro da enzima, existe uma cavidade
formando a fenda de ligação ao substrato e o sítio ativo da enzima encontra−se no fundo da
fenda (WLODAWER; ERICKSON, 1993). A enzima possui um único sítio ativo, composto por
resíduos dos dois monômeros, com a presença dos aminoácidos ácido aspártico, treonina e
glicina, localizados nas posições 25, 26 e 27, respectivamente originando uma tríade. Os dois
resíduos Asp25 (um de cada cadeia) agem como resíduos catalíticos. As regiões amino e
carboxi terminal dos monômeros são as responsáveis pela estabilização da estrutura
26
dimérica da PR do HIV. Estas regiões apresentam−se na forma de folhas β, que se entrelaçam
de forma antiparalela. Além disso, a parte superior da fenda é recoberta por duas abas
móveis “flaps“, que permitem a entrada ou saída do substrato da fenda (Figura 6).
Figura 6- Estrutura da protease do HIV: A protease é um dímero de subunidades idênticas, mostradas
em azul e amarelo. Os resíduos de ácido aspártico no sítio ativo, um de cada cadeia, são mostradas
como estruturas de haste e esfera. As abas irão fechar na fenda deligação após a ligação com o
substrato (BERG et al., 2002)
Com o processamento das poliproteínas e liberação das proteínas estruturais e
enzimáticas individuais, a estrutura do capsídeo em forma de cone é formada, característica
da partícula de HIV madura e os vírions maduros resultantes são capazes de infectar novas
células (BRIGGS et al., 2003).
1.4 Variabilidade Genética
A alta variabilidade genética do HIV−1 é determinada pelas elevadas taxas de
replicação e de mutação por ciclo replicativo, ocasionadas por erros na incorporação de
nucleotídeos e ausência de mecanismos de correção da TR, ou por recombinação durante o
processo de transcrição reversa (PRESTON; POIESZ; LOEB, 1988; BEBENEK et al., 1989; HO et
al., 1995).
A ocorrência de inúmeras mutações em todo o genoma do HIV resulta em
populações geneticamente relacionadas, porém distintas, em cada indivíduo infectado,
denominadas quasispecies (COFFIN; VARMUS, 1997). Este processo pode resultar em
mutações deletérias ou que diminuam a replicação destas variantes, porém, na presença de
uma pequena proporção de mutações funcionais que proporcionam vantagens, como o
27
escape de pressões exercidas pelo sistema imune e pelos antirretrovirais (ARV), estas
variantes superam competitivamente outras quasispecies, tornando−se a variante viral
dominante na população (COFFIN, 1995; KORBER et al., 2001).
As mutações, incluindo mutações pontuais, deleções e inserções, podem ser
introduzidas no genoma durante a síntese do DNA viral pela transcriptase reversa, que
também atua no processo de recombinação em células infectadas com subtipos diferentes
do HIV−1, onde a enzima pode saltar aleatoriamente de uma fita de RNA para a outra
durante a replicação viral, trocando segmentos de informações genéticas entre os genomas
virais, produzindo as formas recombinantes circulantes (CRF − Circulating Recombinant
Jorms) (ZHUANG et al., 2002).
A formação de vírus recombinantes requer que dois vírus diferentes (variantes do
mesmo subtipo ou subtipos diferentes) infectem a mesma célula, simultaneamente ou
sequencialmente (Figura 7). Além disso, é necessário o empacotamento dos dois RNAs
genômicos derivados de cada vírion, levando à produção de partículas virais heterozigotas
que, no ciclo de infecção seguinte, podem formar um genoma recombinante, pela leitura
alternada das fitas pela TR (NAJERA et al., 2002).
Figura 7- Representação esquemática do processo de geração da recombinação do HIV. Pela infecção
sequencial ou simultânea por duas variantes (rosa e azul) origina−se um vírus heterozigoto (roxo), o
qual ao infectar nova célula hospedeira pode conduzir a geração de um genoma recombinante
(NAJERA et al., 2002)
28
Baseado na análise completa do genoma do HIV−1, as variantes são divididas em três
grupos distintos: grupo M (major), composto por nove subtipos (A−D, F−H, J e K) e por sub−
subtipos (A1, A2, A3, F1 e F2) (ROBERTSON et al., 2000), grupo O (outlier) (GURTLER et al.,
1994) e N (new) (SIMON et al., 1998). Mesmo dentro de subtipos de HIV−1, a diversidade
genética pode chegar a 15−20%, e entre os subtipos, é de 25 a 30% (TAYLOR; HAMMER,
2008).
A maioria das infecções por HIV−1 no mundo é causada por vírus do grupo M, sendo
os grupos O e N, responsáveis por uma pequena minoria de infecções na África Central.
Além destas, mais de 40 formas CRFs circulam no mundo (LOS ALAMOS NATIONAL
LABORATORY, 2009). Esta diversidade possui grandes implicações para a compreensão da
transmissão viral, patogênese e diagnóstico, assim como nas estratégias para o
desenvolvimento de drogas e vacinas (BUONAGURO; TORNESELLO; BUONAGURO, 2007).
Os subtipos do HIV−1 possuem diferente distribuição mundial. O subtipo C tem
predominância na pandemia mundial, uma vez que este é o mais prevalente na África
subsaariana e no Sudeste asiático, locais onde se concentram a maioria dos casos de HIV
entre adultos e crianças (UNAIDS, 2007; 2009)
O subtipo B do HIV−1, principal forma genética na Europa ocidental e central, nas
Américas e na Austrália (BUONAGURO; TORNESELLO; BUONAGURO, 2007), representa o
principal subtipo circulante no país, predominando nas regiões Sudeste, Centro Oeste e
Nordeste, seguido pelo subtipo F, considerado o principal subtipo não−B circulante
(MORGADO et al., 1994; SABINO et al., 1996; BRINDEIRO et al., 2003; CERQUEIRA et al.,
2004; COUTO−FERNANDEZ et al., 2005; CAVALCANTI et al., 2007; CASEIRO et al., 2008;
WALERIA−ALEIXO et al., 2008). No entanto, na região Sul do Brasil, a prevalência do subtipo C
é maior que no restante do país, podendo ultrapassar 50% dos casos (MORGADO;
GUIMARAES; GALVAO−CASTRO, 2002; BRINDEIRO et al., 2003; SOARES et al., 2005). Algumas
formas recombinantes também têm sido constantemente relatadas (SABINO et al., 1994;
BONGERTZ et al., 2000; SOARES et al., 2003).
1.5 Epidemiologia do HIV/AIDS
Em 2008, aproximadamente 33,3 milhões de pessoas viviam com HIV em todo o
mundo, sendo 2,5 milhões de crianças e 30,8 milhões de adultos, com 2,6 milhões de novas
infecções e 1,8 milhões de mortes relacionadas à aids (Figura 7). A África subsaariana é a
29
região mais afetada, habitada por 68% de todas as pessoas que vivem com HIV no mundo
(UNAIDS, 2010).
Figura 8- Estimativa de adultos e crianças vivendo com HIV no mundo em 2009 (UNAIDS, 2010)
Na América Central e do Sul, aproximadamente 1,4 milhões d
de 0,5% da população adulta) viviam com HIV em 2009, com um
pessoas (prevalência
número estimado de
92.000 novas infecções. O Brasil, devido a sua grande população, possui quase um terço de
todas as pessoas vivendo com HIV/AIDS na América Central e do Sul, com aproximadamente
630.000 mil pessoas infectadas (UNAIDS, 2010). A taxa de incidência é menor nas regiões
Norte e Nordeste do país e maior no Sudeste e nas regiões do Sul (BRASIL, 2010b).
1.6 Acompanhamento e Tratamento
Apesar dos amplos progressos nos campos de diagnóstico, monitoramento e
tratamento do paciente infectado, a infecção pelo HIV ainda constitui um problema de
saúde pública, sendo de grande relevância após o diagnóstico, o monitoramento do paciente
infectado, visando identificar o momento ideal para a introdução do esquema terapêuticoou
a necessidade de modificação da terapia (UNAIDS, 2007).
A progressão da infecção pelo HIV passa por diferentes etapas e, na ausência de uma
terapia efetiva, a grande maioria dos indivíduos infectados pelo HIV passa por uma redução
progressiva de células T CD4+, na presença de elevados níveis de replicação viral, que
conduzem finalmente a doenças oportunistas e neoplasias, características da Síndrome da
30
Imunodeficiência Adquirida, a aids (MOIR; CHUN; FAUCI, 2010). Deste modo, a contagem de
linfócitos T CD4+ e a quantificação da carga viral plasmática do HIV são marcadores
utilizados para monitorar a evolução da doença, estimar o prognóstico, avaliar a indicação
de início do tratamento, e estabelecer o risco de progressão para aids e morte (MELLORS et
al., 1997; MURRI et al., 2006; ZACCARELLI et al., 2009).
No Brasil, o acompanhamento dos pacientes infectados pelo HIV−1 é realizado sob
coordenação do Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais do Ministério da Saúde pelas
Redes Nacionais de Laboratórios para a Contagem de Linfócitos T CD4+/CD8+, a qual avalia o
estado imunológico dos indivíduos infectados; de Carga Viral, que realiza a quantificação
plasmática do RNA do HIV−1 (carga viral); e de Genotipagem (Rede Nacional de Genotipagem
− RENAGENO), que pesquisa mutações em códons específicos associados à resistência aos
antirretrovirais. Esses parâmetros são utilizados no prognóstico dos indivíduos infectados,
monitoramento da resposta a terapia antirretroviral (TARV), avaliação da progressão da
doença para aids, e a resistência aos ARV durante a falha terapêutica, utilizada para orientar
a terapia de resgate (BRASIL, 2010a).
O acesso gratuito aos ARVs, garantido a todas as pessoas que vivem com HIV no
Brasil e com indicação da terapia, desde 1996 pela Lei9.313, melhorou significantemente os
indicadores de morbidade, mortalidade e qualidade de vida dos pacientes, pela supressão da
replicação viral, levando a recuperação ou preservação da função imune e, consequente
redução da frequência de infecções e neoplasias oportunistas. No entanto, contribuiu para o
desenvolvimento do perfil crônico−degenerativo assumido pela doença e para o
aparecimento de variantes virais resistentes ao tratamento (BRASIL, 2008).
A melhoria do acesso ao tratamento antirretroviral tem grande impacto, ajudando a
reduzir as taxas de mortalidade relacionadas à aids em vários países e regiões. Em todo o
mundo, a cobertura da terapia passou de 7% em 2003 para 42% em 2008 (UNAIDS, 2009).
Atualmente, no Brasil existem aproximadamente 197 mil pessoas que vivem com HIV
recebendo tratamento gratuito na rede pública de saúde, o que corresponde a 95% de todos
os pacientes diagnosticados como HIV positivos e elegíveis ao tratamento no Brasil (BRASIL,
2010e).
As atividades e armazenamento de informações geradas pelas redes do
Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais são realizados pelos sistemas SISCEL (Sistema
de Controle de Exames Laboratoriais), utilizado na solicitação de exame, emissão de laudos,
31
além da criação de um banco de dados das redes de Contagem de Linfócitos T CD4+/CD8+ e
Carga viral, e pelo SISGENO (Sistema de Informação para Rede de Genotipagem), utilizado
no armazenamento de informações dos pacientes com falha terapêutica, esquema de
terapia e mutações de resistência, gerando um banco de dados da RENAGENO (BRASIL, 2006;
2010d).
1.7 Antirretrovirais
1.7.1 Classes de drogas
Os ARV são capazes de reduzir a replicação viral, retardando a progressão da doença
e a mortalidade, aumentando a sobrevida dos pacientes. As drogas antirretrovirais, agem
nas etapas do ciclo replicativo do HIV−1, bloqueando a ligação, fusão, entrada na célula
hospedeira, replicação e maturação viral (FAUCI, 1988; HASELTINE, 1991; HUTCHINSON,
2001).
O inibidor de entrada, Maraviroc, age como antagonista de correceptor, se ligando
seletivamente ao receptor de quimiocina humana CCR5, ocupando o local de ligação do
vírus, bloqueando a interação entre o CCR5 e a gp120 do HIV−1 e prevenindo a entrada do
vírus nas células (HUGHES; BARBER; NELSON, 2008).
Os inibidores de fusão são peptídeos homólogos ao segmento da região HR2 da gp41;
ligam−se a região HR1 da gp41, bloqueando a ligação entre elas e as mudanças
conformacionais necessárias à fusão entre a membrana celular e viral. O antirretroviral
Enfuvirtida (T−20) é o único inibidor de fusão autorizado pelo FDA (Jood and Drug
Administration) (MOORE; DOMS, 2003; IDEMYOR, 2005).
Os antirretrovirais que atuam na transcrição reversa são divididos em Inibidores de
Transcriptase Reversa Análogos de Nucleosídeos (ITRN) e Inibidores de Transcriptase
Reversa Não−análogos de Nucleosídeos (ITRNN) (WARNKE; BARRETO; TEMESGEN, 2007).
Esta classe de drogas foi a primeira a ser autorizada para o tratamento do HIV, sendo o AZT
(Zidovudina), o primeiro medicamento antirretroviral aprovado pelo FDA, em 1987(MITSUYA
et al., 1985).
Os ITRNs agem no sítio de ligação ao substrato (sitio catalítico) da enzima TR como
substratos competitivos (Figura 9). Possuem estrutura similar aos nucleotídeos, substrato
natural da TR, porém com ausência do grupamento hidroxila (OH) na posição 3', tornando−se
ativos após três etapas de fosforilação, realizada por cinases intracelulares, exceção do
32
análogo de adenosina Tenofovir−TDF (análogo de nucleotídeo) que requer duas etapas de
fosforilação, e incorporados durante a transcrição reversa. São eles análogos de: timidina
(Estavudina−d4T e Zidovidina−AZT), citosina (Lamivudina−3TC e Emtricitabina−FTC), adenosina
(Didadosina−ddI) e guanosina (Abacavir−ABC) (FDA, 2010). Quando utilizados pela TR e
incorporados no DNA viral, promovem a parada do processo de formação do DNA viral, pela
ausência do grupo hidro ila, necessário à ligação fosfodiéster com outros nucleotídeos
durante a elongação, atuando como terminadores de cadeia e inibindo a replicação viral
(Figura 10) (GOODY; MULLER; RESTLE, 1991; BASAVAPATHRUNI; ANDERSON, 2007).
Figura 9 - Posição relativa dos sítios de ligação dos ITRNs (círculo vermelho) no sítio ativo da TR, e dos
ITRNNs (círculo azul) na região do bolso hidrofóbico. A subunidade p51 é representada em cinza
enquanto os subdomínios de p66 são codificados por cores: dedos em amarelo, polegar em laranja,
palma em azul claro, conexão em verde e RNAseH em roxo (FREISZ et al., 2010)
Os ITRNNs ligam−se não competitivamente a TR, em um sítio alostérico, no bolso
hidrofóbico (Figura 9), produzindo mudanças conformacionais no sítio ativo da enzima e
diminuindo sua afinidade pelos nucleotídeos, o que acarreta em uma drástica redução da
eficiência da enzima (Figura 10). Diferentes dos ITRNs, não requerem fosforilação
intracelular para se tornarem ativos. Existem quatro ITRNNs aprovados: Delavirdina (DLV),
Nevirapina (NVP), Efavirenz (EFV) e o ITRNN de segunda geração Etravirina (ETR) (SPENCE et
al., 1995; ZAPOR et al., 2004; FDA, 2010).
33
ITRNN
A Cadeiade DNA viralterminada
Transcriptase
Reversa B Bolso
Hidrofóbico
Transcriptase
Reversa
Análogo de
Nucleosídeo
DNA DNA
RNA RNA
Transcriptase
Reversa
ITRNN
Ligado
ATP
DNA
Polimerização
do DNA
bloqueada
RNA
Figura 10- Mecanismo de ação dos inibidores de transcriptase reversa. ITRN (A): a incorporação do
análogo de nucleosídeo resulta na terminação da cadeia de DNA e mostra a resistência do vírus
selvagem à excisão do análogo mediada pelo ATP. ITRNN (B): a ligação da droga no bolso hidrofóbico
bloqueia a polimerização pela TR (CLAVEL; HANCE, 2004)
O Raltegravir (RAL), único inibidor de integrase aprovado pelo FDA, atua inibindo a
atividade catalítica da integrase e a inserção do genoma do HIV no genoma da célula,
impedindo a produção de novas partículas infecciosas virais (POMMIER; JOHNSON;
MARCHAND, 2005; TEMESGEN; SIRAJ, 2008).
Os Inibidores de Protease (IP) são inibidores competitivos (a maioria
peptidomiméticos dos locais de clivagem da poliproteína), que ao se ligarem ao sítio ativo da
protease (Figura 11), produzem importantes alterações conformacionais na enzima que são
acompanhadas pelo dobramento das abas ”flaps” em uma conformação fechada sobre o
sítio ativo, impedindo a entrada do substrato e bloqueando a clivagem das poliproteínas Gag
e Gag−Pol, e evitando a maturação das partículas virais, o que resulta na produção de vírions
não−infecciosos (WLODAWER; ERICKSON, 1993; WLODAWER; VONDRASEK, 1998; PETTIT et
al., 2005).
34
Figura 11- Local de ligação dos IPs. Representa a protease ligada ao Lopinavir (amarelo) (STANFORD,
2010)
Os IPs de primeira geração aprovados pelo FDA são: Saquinavir (SQV), Indinavir (IDV),
Ritonavir (RTV) e Nelfinavir (NFV); os de segunda geração, projetados para inibir variantes
resistentes aos inibidores de primeira geração, além de minimizar os efeitos colaterais são:
Atazanavir (ATV), Amprenavir (APV)/Fosamprenavir (FPV), Lopinavir (LPV), Darunavir (DRV) e
Tipranavir (TPV), sendo os dois últimos, inibidores não−peptídicos, que atuam
consideravelmente sobre variantes resistentes (WARNKE; BARRETO; TEMESGEN, 2007; FDA,
2010). A dosagem dos IPs sofreu melhorias pela administração concomitante de doses
baixas de Ritonavir como adjuvante farmacológico ou intensificador (booster),
proporcionado a estes ARVs uma elevação dos níveis plasmáticos, manutenção das
concentrações mais elevadas por longos períodos de tempo, além de diminuição do risco de
mutações e resistência viral (MOYLE; BACK, 2001; SCOTT, 2005).
1.7.2 Tratamento
No início, a monoterapia foi usada como forma de tratamento de pacientes com HIV,
com o uso do ITRN AZT, que aumentou a sobrevida dos pacientes, porém os seus benefícios
clínicos não foram sustentados em longo prazo (CREAGH−KIRK et al., 1988; MOORE et al.,
1991). Pouco depois, fo am introduzidos outros ARVs pertencentes à mesmaclasse,
Didanosina, Zalcitabina e Lamivudina, que permitiram o uso de terapias de combinação
dupla, e uma melhora na resposta clínica (COLLIER et al., 1993; KATLAMA et al., 1996;
SCHOOLEY et al., 1996). Entretanto, as monoterapias e terapias duplas apresentaram um
35
período relativamente curto de eficácia, principalmente devido à rápida seleção de variantes
resistentes do HIV (SHIRASAKA et al., 1995).
A terapia atual, após o desenvolvimento de outras classes de ARVs, principalmente
os inibidores de protease e, buscando melhorar a resposta clínica e virológica, é composta
por uma combinação de três ou mais ARVs, pertencentes à pelo menos duas classes de
drogas, sendo conhecida como terapia antirretroviral altamente ativa (Highly Active
Antiretroviral Therapy − HAART). A HAART pode levar a melhorias notáveis nos marcadoresde
doença, como a carga viral e contagem de células T CD4+, pela supressão da replicaçãodo
HIV para níveis indetectáveis, levando a um benefício clínico significativo, além da
diminuição da morbidade e mortalidade associadas ao HIV (PALELLA et al., 1998; LIU;
SHAFER, 2006).
O início da TARV para pacientes infectados pelo HIV no Brasil, estabelecido pelo
Ministério da Saúde, é indicado para pacientes sintomáticos, independentemente da
contagem de T CD4+; para assintomáticos com contagem de T CD4+ menor ou igual a 350
células/mm³; para gestantes, independente da presença de sintomas e da contagem de T
CD4+; e também deve ser considerado em casos onde a contagem de T CD4+ está entre 350
e 500 células/mm³ associado a situações como a coinfecção pelo Vírus da Hepatite C (VHC)
ou Vírus da Hepatite B (VHB), neoplasias, e carga viral elevada, superior a 100.000 cópias
RNA viral/mL. Para a terapia inicial, é indicado sempre incluir combinações de três drogas:
dois ITRNs associados a um ITRNN, de preferência o EFV, ou a um Inibidor de Protease
reforçado com ritonavir (IP/r), com prioridade para o LPV/r (BRASIL, 2008; 2010c).
O tratamento antirretroviral combinado é utilizado mundialmente e a resistência do
HIV aos ARVs tem emergido em todas as localidades, levando a falência da HAART (HOGG et
al., 2006; RICHMAN, 2006). A supressão viral completa é essencial para a longa efetividade
do tratamento e a supressão parcial leva à falha virológica mais precoce e emergência de
resistência viral (SHAFER et al., 1998).
1.7.3 Falha terapêutica
Durante o tratamento ARV, a evolução da carga viral plasmática do HIV, a contagem
de linfócitos T CD4+ e a ocorrência de eventos podem caracterizar a falha ou o sucesso
terapêutico. A falha virológica é definida por não−obtenção ou não−manutenção de carga
viral indetectável; a falha imunológica é caracterizada pelo declínio progressivo da contagem
36
de linfócitos T CD4+; e a falha clínica tem sido referenciada pela progressão clínica da
infecção expressa principalmente por meio de infecções oportunistas ou tumores (BRASIL,
2008; PANEL ON ANTIRETROVIRAL GUIDELINES FOR ADULTS AND ADOLESCENTS, 2009).
O monitoramento dos níveis plasmáticos de RNA do HIV (carga viral) durante o
tratamento antirretroviral é fundamental, pois possibilita a identificação da falha virológica o
mais cedo possível, prevenindo o acúmulo de mutações de resistência adicionais que podem
comprometer a eficácia de um novo esquema antirretroviral (LEDERGERBER et al., 1999;
HAMMER et al., 2006).
Durante a falha virológica, além dos prejuízos imunológicos, sobretudo resultando na
diminuição de linfócitos T CD4+, e clínicos, existe uma frequente associação entre a presença
da falha virológica e a resistência aos ARVs, sendo a persistência da replicação viral na
presença dos ARVs responsável por favorecer o acúmulo de mutações de resistência,
comprometendo opções futuras de drogas para o tratamento (HATANO et al., 2006). O
desenvolvimento de resistência do HIV−1 aos antirretrovirais é considerado um dos
principais fatores que contribuem para a perda da supressão plasmática do RNA do HIV−1
(falha virológica) em pacientes durante a HAART (HIRSCH et al., 2008).
Outros inúmeros fatores aumentam a possibilidade de falha virológica, como a
adesão inadequada (doses erradas ou faltando, com intervalos e recomendações
desrespeitados), potência subótima do esquema, fatores farmacológicos e metabólicos
(toxicidade levando à baixa adesão, efeitos colaterais, má absorção, eliminação acelerada),
interações com outros medicamentos, além de parâmetros do próprio paciente, como a
contagem anterior de carga viral e T CD4+ e comorbidades (LEDERGERBER et al., 1999;
LUCAS; CHAISSON; MOORE, 1999).
1.7.4 Resistência aos antirretrovirais
A resistência do HIV aos ARVs representa uma ameaça crescente para o sucesso e a
durabilidade dos regimes HAART. A emergência de variantes resistentes está diretamente
relacionada às altas taxas de replicação viral no hospedeiro, cerca de 10 bilhões de partículas
virais produzidas diariamente, aliados à ausência de mecanismos de correção da TR viral,
possibilitando a ocorrência de inúmeras mutações aleatórias no genoma viral (HO et al.,
1995).
37
Sem terapia Pressão Seletiva dos antirretrovirais
A resistência antirretroviral se desenvolve quando a replicação viral persiste na
presença da pressão seletiva da droga, selecionando variantes resistentes com a presença de
mutações de resistência (Figura 12), que uma vez selecionadas, podem rapidamente emergir
mediante o reinício do uso de esquemas terapêuticos utilizando drogas as quais são
resistentes. Alterações em qualquer um dos genes virais e seus produtos que desempenham
um papel fundamental no ciclo replicativo, podem afetar o fitness viral (capacidade
adaptativa e replicativa do vírus em um determinado ambiente). Entretanto, com a
supressão viral incompleta, na presença da droga, há o acúmulo de mutações, que levam a
recuperação do fitness, além de poder comprometer o uso futuro de outras drogas, pelo
desenvolvimento de resistência cruzada (LIU; SHAFER, 2006; VANMAARSEVEEN et al., 2006).
Figura 12- Pressão seletiva dos ARVs e emergência de variantes resistentes. As partículas virais em
azul claro representam o vírus selvagem, que durante a terapia são inibidos, havendo a emergência
de variantes resistentes (laranja); devido à replicação persistente, ocorre o acúmulo de mutações
(azul escuro), levando a uma recuperação do fitness e acentuada replicação (KURITZKES, 2004)
A presença de mutações que reduzem a suscetibilidade do vírus às drogas,
permitindo sua replicação na presença de uma concentração de determinada droga que
inibe a replicação de variantes sensíveis (vírus selvagem), define a resistência do HIV aos
ARVs (SHAFER, 2002; CARTER; SAUNDERS, 2007).
Existem dois tipos de resistência, primária e secundária. A resistência primária é
caracterizada pela presença de mutações no genoma viral que conferem resistência aos
ARVs em pacientes não tratados previamente. Pode ocorrer espontaneamente ou pela
transmissão de variantes resistentes, provenientes de indivíduos nos quais estes vírus estão
circulantes como população majoritária, e seu significado clínico é determinado pela sua
prevalência e implicações nas respostas virológicas e imunológicas (GRANT et al., 2002).
A resistência viral secundária, ou adquirida, é definida como a emergência de
mutações de resistência selecionadas durante a pressão seletiva exercida frente ao uso dos
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antirretrovirais. Além disso, a sobreposição de perfis de resistência aos ARVs pode resultar
em resistência cruzada entre membros da mesma classe de drogas, levando posteriormente
a uma resposta deficiente ao tratamento, mesmo que a droga não tenha sido utilizada pelo
paciente (BARBOUR et al., 2004).
1.7.5 Barreira Genética
A barreira genética é a distância evolutiva para o vírus desenvolver um número
suficiente de mutações de resistência em sua população para superar a eficácia das drogas
usadas para suprimir a replicação viral, ou seja, é a medida de quão rapidamente e
facilmente a resistência pode