7 -TP 5 - Desviaciones químicas-final

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QUÍMICA ANALÍTICA II AÑO 2018 
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TRABAJO PRÁCTICO Nº 5 
 
ESPECTROFOTOMETRÍA. LIMITACIONES DE LA LEY DE BEER 
SELECCIÓN DE CONDICIONES ÓTIMAS DE TRABAJO 
 
INTRODUCCIÓN 
El espectrofotómetro constituye una herramienta fundamental en los laboratorios 
clínicos y de control de calidad. El correcto desempeño del instrumento y del método 
aplicado son determinantes en la calidad analítica de los resultados que emite el 
laboratorio. 
Entre las variables comunes que influyen en el espectro de absorción de una sustancia 
se pueden mencionar: la naturaleza del solvente, el pH de la solución, la temperatura, 
las altas concentraciones de electrolito y la presencia de sustancias que interfieren en 
la señal. Los efectos de estas variables deben conocerse y elegir las condiciones de 
manera tal que las pequeñas e incontroladas variaciones no afecten la absorbancia. 
Por lo tanto, la elección de las condiciones apropiadas para un determinado método 
analítico es fundamental. Entre los criterios analíticos que se estudian, se encuentran 
la linealidad y sensibilidad. 
 
LINEALIDAD 
Para analizar este punto, se prepara la curva de calibrado a partir de una serie de 
soluciones patrón que abarquen el intervalo de concentración esperado en las 
muestras. 
El estudio de la linealidad fotométrica permite establecer el rango de absorbancias en 
el que el instrumento tiene respuestas proporcionales a los cambios de concentración. 
Para el cálculo de la linealidad se debe realizar un estudio de regresión lineal de la 
recta hallada al graficar las absorbancias obtenidas para concentraciones crecientes 
de analito: 
y = Ax + B 
 
Donde A es la pendiente de la recta y B la ordenada al origen. La pendiente A 
representa la linealidad fotométrica. La recta ideal sería y = x por lo cual la pendiente 
ideal es 1,00 que indica que el instrumento responde linealmente en el rango de 
absorbancias estudiadas. Por el método de cuadrados mínimos se deberán calcular A 
y B. 
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Además, existen distintas herramientas estadísticas para evaluar la linealidad de una 
curva de calibrado, como por ejemplo, la “Prueba F”, donde se evalúa este parámetro 
con los datos obtenidos experimentalmente y se lo compara con un Fteórico obtenido 
de tablas. 
La Ley de Beer-Lambert que sostiene la práctica de la espectrofotometría, establece la 
relación: 
 
 A = - log T = aλ.b.C 
 
 
Esta ley se cumple sólo bajo determinadas condiciones de trabajo, a saber: 
1) Haz de energía radiante incidente monocromático. 
2) Rayos paralelos. 
3) Incidencia en ángulo recto sobre los planos absorbentes. 
4) No debe existir ionización, asociación, disociación o solvatación del soluto. 
5) La concentración de la sustancia coloreada debe ser baja (0,01 M). 
 
De acuerdo a las condiciones antes mencionadas, podemos hablar de varios tipos de 
desviaciones: reales (limitantes de la Ley de Beer), instrumentales (medida de la 
transmitancia/absorbancia) y químicas (cambios químicos por modificaciones en la 
concentración). Estos fenómenos modifican una o varias condiciones para las cuales 
se cumple la Ley de Beer, provocando una desviación de la linealidad de la curva de 
calibrado. 
 
DESVIACIONES QUÍMICAS: 
Las desviaciones químicas se producen cuando existe un cambio en la estructura 
molecular del analito y por lo tanto en el modo en el que absorbe. Las causas de estas 
desviaciones son provocadas por: 
 Disociación 
 Asociación 
 Reacción con el solvente 
 
En este TP estudiaremos las desviaciones por disociación. 
Un ejemplo de desviaciones por disociación son las que se dan en los equilibrios 
químicos, como soluciones ácido-base o redox. 
A: absorbancia a λ 
T: transmitancia a λ. 
aλ: absortividad molar a λ 
b: camino óptico 
C: concentración 
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Cuando las dos especies del mismo analito en equilibrio presentan diferentes 
espectros de absorción, se genera un grave error si no se controlan estrictamente las 
condiciones de trabajo. 
Un ejemplo de este tipo de desviaciones se presenta cuando se pretende cuantificar 
ácido benzoico. 
 
 
pH=2,7 pKa= 4,76 pH=6,2 
 
Las dos especies tienen diferentes picos de absorción, por lo que se debe trabajar a 
pH extremos (medio ácido o alcalino). En la Figura 1 se representan los espectros de 
absorción de las dos especies, donde puede apreciarse el corrimiento de picos. 
Longitud de onda (nm)
220 240 260 280 300
A
b
so
rb
a
n
ci
a
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4 ác.benzoico(pH:2.7)
benzoato (pH:6.2) 
 
Figura 1. Espectros de absorción molecular de las dos especies del ác. benzoico. 
 
El PUNTO ISOSBÉSTICO se presenta a 220 nm, en este punto las absortividades de 
las dos especies son iguales. 
 
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Los colorantes como rojo de metilo o azul de bromotimol, son ácidos orgánicos débiles 
cuyas especies acida o básica presentan diferentes colores, lo que implica que 
también modifican sus espectros de absorción con el pH. El indicador rojo de metilo 
suele utilizarse en pruebas bioquímicas, ya que permite determinar la formación de 
ácidos que se producen durante la fermentación de un carbohidrato. Una reacción 
positiva indica que el microorganismo evaluado realiza una fermentación acido-láctica 
de la glucosa por la vía ácido-mixta. 
En la Figura 2 se muestra cómo varía la estructura de este indicador al cambiar el pH: 
 
 
 
 
pH: 4,4 - 6,3 
 
equilibrio químico 
 
 
Figura 2. Estructuras del rojo de metilo a diferentes pH. 
Como se puede observar, actúa variando desde rojo a amarillo a medida que aumenta 
el pH de la solución, siendo la zona de viraje entre 4,4 y 6,3, aproximadamente. Si la 
solución de indicador no es tamponada correctamente, puede ocurrir una desviación 
química a la Ley de Beer. 
 
SENSIBILIDAD 
El segundo punto a tener en cuenta cuando se seleccionan lascondiciones de trabajo 
es la sensibilidad del método (SEN). 
 
SEN = A (pendiente de la curva de calibrado) 
 
Debe considerarse que cuanto mayor sea la pendiente de la curva de calibrado, mejor 
discriminará pequeñas variaciones de concentración del analito. Como regla general, 
la longitud de onda de preferencia para un determinado análisis 
 
 
 
 
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PARTE EXPERIMENTAL 
“Determinación de las condiciones óptimas de trabajo. Curva de calibrado del 
indicador Rojo de Metilo” 
Preparación de dos curvas de calibrado del indicador rojo de metilo, a dos valores de 
pH diferentes. Determinación de parámetros y cifras de mérito. 
Soluciones provistas: 
 Solución Patrón (SP) de rojo de metilo 250 mg L-1 en etanol. 
 Solución HCl 0,005 mol L-1. 
 Solución Na2CO3 0,1mol L
-1. 
 
Técnica operatoria: 
1) Preparación de una curva de calibrado a pH ácido (pH=3). Preparar 6 soluciones 
por duplicado a partir de la SP. Agregar la cantidad necesaria de SP en matraces de 
25 mL, luego enrasar con HCL 0,005 M. 
2) Preparación de una curva de calibrado a pH alcalino (pH=12). Preparar 6 soluciones 
por duplicado a partir de la SP. Agregar la cantidad necesaria de SP en matraces de 
25 mL, luego enrasar con Na2CO3 0,1 M. 
 
En la Figura 3 se muestran los espectros de absorción molecular de soluciones de rojo 
de metilo, en medio ácido y alcalino, correspondientes a tres niveles de concentración: 
2, 4 y 6 ppm. 
 
Figura 3. Espectros de absorción molecular de la especie ácida (- -) y básica (—) del 
rojo de metilo, en tres niveles de concentración: 2, 4 y 6 ppm. 
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
320 370 420 470 520 570 620
A
b
so
rb
an
ci
a
Medio ácido
Medio alcalino
Longitud de onda (nm)
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En base a los espectros presentados en la Figura 3, elija: 
 pH= pH= 
Longitud de onda 
Rango de concentraciones**El rango de concentraciones debe seleccionarse teniendo en cuenta que para reducir 
el error al mínimo se deben buscar que la medida de A se encuentre en la región entre 
0,1 y 1,0 o bien, para que la T se encuentre respectivamente entre 0,8 y 0,1 (T% entre 
80 y 10%). 
 
CALCULOS 
Una vez obtenido todos los datos se procederá a la construcción de los gráficos 
A vs. Concentración. 
Realizar los cálculos para obtener la recta que mejor ajuste los puntos, junto 
con el cálculo de las cifras de mérito. 
Comparar ambas curvas de calibrado. 
 
 
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ANEXO 
Espectros de las soluciones de Rojo de Metilo de 6 pmm 
 
 Longitud de 
onda (nm) Medio ácido Medio alcalino 
 Longitud de 
onda (nm) Medio ácido Medio alcalino 
620 0,00462 0,0037 454 0,24994 0,36927 
618 0,00534 0,00365 452 0,23146 0,37506 
616 0,00616 0,00384 450 0,214 0,37986 
614 0,00714 0,00379 448 0,19769 0,38439 
612 0,00839 0,00389 446 0,18205 0,38759 
610 0,009939 0,00387 444 0,16752 0,39073 
608 0,01188 0,00398 442 0,15405 0,39309 
606 0,01423 0,00402 440 0,14144 0,3952 
604 0,01722 0,00411 438 0,12972 0,39665 
602 0,021 0,00419 436 0,11878 0,39766 
600 0,02563 0,00416 434 0,10885 0,39834 
598 0,03132 0,00422 432 0,09984 0,39893 
596 0,03849 0,00433 430 0,0913 0,39902 
594 0,04744 0,00419 428 0,08345 0,39896 
592 0,05863 0,00435 426 0,07629 0,39875 
590 0,07234 0,00436 424 0,069779 0,39823 
588 0,089109 0,00446 422 0,06405 0,39733 
586 0,10909 0,00432 420 0,05843 0,39595 
584 0,1328 0,00424 418 0,05376 0,39466 
582 0,16107 0,00442 416 0,04933 0,39271 
580 0,19354 0,00447 414 0,0454 0,39058 
578 0,23084 0,0044 412 0,04175 0,38765 
576 0,27255 0,00446 410 0,03855 0,38467 
574 0,31814 0,00439 408 0,03567 0,38093 
572 0,36696 0,00448 406 0,03328 0,37706 
570 0,41809 0,00456 404 0,03098 0,3723 
568 0,47056 0,00467 402 0,02903 0,36728 
566 0,52336 0,00469 400 0,02729 0,36144 
564 0,57562 0,00487 398 0,02591 0,35521 
562 0,62586 0,00494 396 0,02481 0,34819 
560 0,67381 0,00593 394 0,02387 0,34081 
558 0,71727 0,00349 392 0,02312 0,33257 
556 0,75837 0,00329 390 0,0228 0,32432 
554 0,79421 0,00579 388 0,02253 0,31514 
552 0,82512 0,00614 386 0,02268 0,30577 
550 0,85153 0,00651 384 0,02293 0,29564 
548 0,87415 0,00694 382 0,0229 0,28562 
546 0,89327 0,00749 380 0,02358 0,27511 
544 0,90969 0,00812 378 0,02418 0,26463 
542 0,92392 0,00897 376 0,0253 0,25346 
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540 0,93649 0,00978 374 0,02668 0,24306 
538 0,94795 0,01087 372 0,02781 0,23201 
536 0,95891 0,0121 370 0,02973 0,22126 
534 0,96919 0,01359 368 0,03164 0,21032 
532 0,97908 0,01537 366 0,03409 0,19947 
530 0,98832 0,01734 364 0,037 0,18894 
528 0,99646 0,01959 362 0,03998 0,17854 
526 1,00328 0,02225 360 0,04336 0,16855 
524 1,0082 0,02531 358 0,04716 0,15905 
522 1,01063 0,02886 356 0,05076 0,14954 
520 1,01054 0,03294 354 0,05439 0,14066 
518 1,0071 0,03736 352 0,05797 0,13224 
516 1,00075 0,04252 350 0,06106 0,12393 
514 0,99087 0,04806 348 0,06378 0,11653 
512 0,97823 0,05438 346 0,06635 0,10916 
510 0,96268 0,06121 344 0,06879 0,10281 
508 0,94504 0,06875 342 0,07108 0,0970 
506 0,92512 0,0769 340 0,07315 0,09245 
504 0,90351 0,085709 338 0,07513 0,08857 
502 0,88035 0,09517 336 0,07685 0,08646 
500 0,85602 0,10548 334 0,07803 0,08548 
498 0,83057 0,11637 332 0,07902 0,0861 
496 0,80426 0,12796 330 0,07932 0,08645 
494 0,7775 0,13974 328 0,0795 0,08717 
492 0,75005 0,15223 326 0,07938 0,08692 
490 0,7218 0,16506 324 0,07943 0,08704 
488 0,69315 0,17844 322 0,07913 0,0881 
486 0,663799 0,19187 320 0,078589 0,08942 
484 0,63465 0,20575 
482 0,60493 0,21942 
480 0,57583 0,23305 
478 0,54681 0,24625 
476 0,51832 0,2596 
474 0,48964 0,27225 
472 0,46178 0,28479 
470 0,4346 0,29685 
468 0,40833 0,30852 
466 0,38289 0,31927 
464 0,35843 0,32939 
462 0,33493 0,33878 
460 0,31241 0,34764 
458 0,29048 0,35548 
456 0,2697 0,3629