MEU 2 ED Cinética Enzimática_2021_2

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Departamento de Bioquímica – IQ 
 Bioquímica – IQB366 – 2º Estudo Dirigido – 2021/2 
 Cinética Enzimática 
 
 
Aqui está o 2º ED – Cinética Enzimática 
Contém dois ensaios: 
1) Determinação de Km e Vm 
2) Influência da natureza do catalisador e da temperatura na velocidade da 
reação de hidrólise da sacarose. 
 Pode ser feito em dupla ou individualmente. Não esqueçam de escrever a data e 
os nomes de vocês. 
 
Disponível no AVA – 7/1/2022 
Entrega para correção até dia 21/1/2022 às 23:59h 
Para entrega: lumcpaiva@gmail.com ou lpaiva@iq.ufrj.br 
 
Obrigada 
Cordialmente 
Prof Lucia 
 
 Departamento de Bioquímica – IQ 
 Bioquímica – IQB366 – 2º Estudo Dirigido – 2021/2 
 Cinética Enzimática 
 
Introdução 
A elucidação do mecanismo de ação enzimática é um evento de 
fundamental importância para compreensão de rotas metabólicas. A 
“escolha” de um caminho metabólico, em detrimento de outro, por 
um único intermediário, é um evento que pode ser elucidado pelo 
estudo do mecanismo de reação. 
Nesse sentido, o estudo cinético é uma ferramenta robusta. A 
velocidade de uma reação catalisada por enzimas é influenciada por 
diferentes fatores: temperatura, pH, concentração do catalisador e 
concentração do substrato. A natureza proteica das enzimas, a 
elucidação da região tridimensional do centro catalítico, região onde, 
efetivamente, ocorre a interação E e S e a natureza dessa interação, 
são eventos que podem ser evidenciados pelo estudo cinético. 
No início do século vinte, 1903, uma primeira proposta de estudo 
cinético de reações enzimáticas, foi feita por Victor Henri e em 1913, 
Leonor Michaelis e Maud Menten propuseram um modelo cinético, 
conhecido como modelo de Michaelis-Menten, traduzido no modelo: 
E + S ES E + P
k
kk1
2
3
 
Várias considerações foram feitas para a validade do modelo, e 
chegaram ao conceito de velocidade inicial e a uma equação 
hiperbólica, traduzindo a relação entre Vi e [S] como: 
][
][
SKm
SVm
v p 
 onde 
1
32 )(
k
kk
Km

 
Km é a relação entre as constantes de velocidade e expressa a 
afinidade entre E e S e Vm é a velocidade inicial máxima, quando a 
[S] for saturante. 
Em 1934, Hans Lineweaver e Dean Burk publicaram um artigo 
propondo um modelo para a determinação das constantes de 
dissociação de uma reação enzimática. A equação proposta 
apresentava uma relação linear entre 1/Vi e 1/[S] 
VmSVm
Km
SVm
SKm
vi
1
][
1
][
][1


 
Bom trabalho!! 
 Departamento de Bioquímica – IQ 
 Bioquímica – IQB366 – 2º Estudo Dirigido – 2021/2 
 Cinética Enzimática 
 
Determinação de Km e Vm de uma preparação de amiloglucosidase 
 de origem fúngica 
 
Determine Km e Vm da amiloglucosidase, que catalisa a reação de hidrólise de amido, tendo 
como produto glicose. O ensaio em laboratório seguiu o roteiro abaixo. 
 
amido glicose 
Soluções fornecidas 
 Amido: solução 4g/L em tampão 
 Enzima: 0,2 mg/mL em tampão 
 Tampão fosfato 0,1M, pH 4,5 
 Reagente: Ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) 
 
Procedimento 
1. Volume final de ensaio enzimático = 1,0 mL; 
2. Volume de Enzima = 0,2 mL; 
3. Volume de tampão: = 0,3mL 
4. Volume das soluções intermediárias de amido: 0,5mL 
5. Tempo de reação: 5 minutos 
6. Branco de reação: 0,3mL tampão, 0,2 mL de enzima, 1,0 mL DNS e 0,5mL da solução 
4g/L de amido, nessa ordem, obrigatoriamente. 
7. Preparar soluções intermediárias de concentrações adequadas, de modo que, ao pipetar 
0,5 mL dessas soluções intermediárias, as concentrações no volume final de ensaio, 1mL, 
sejam: 0,4;0,5;0,66;0,8;1,0 e 2,0 g/L 
Após o tempo de reação de 5 minutos, adicionou-se 1,0 mL de DNS e a glicose, produto 
da reação, foi dosada, obtendo-se as seguintes leituras de Abs a 540nm: 
Tabela 1 – Dosagem de glicose, por DNS, para diferentes [amido]. 
[amido] (g/L) 
Abs 
(540nm) 
0 0 
0,4 0,28 
0,5 0,31 
0,66 0,38 
0,8 0,41 
1 0,48 
 
Tabela 2 - Curva padrão de glicose dosada pelo método do DNS. 
Glicose padrão 0,010 M 
(mL) 
Abs 
(540nm) 
0,2 0,15 
0,4 0,31 
0,6 0,46 
0,8 0,59 
1,0 0,74 
 
amiloglucosidase 
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 Cinética Enzimática 
 
Pede-se: 
a) Explique a ordem dos reagentes na execução do branco 
b) Apresente o protocolo utilizado para obtenção das soluções intermediárias. 
c) Faça uma tabela que traduza o procedimento 
d) Faça uma tabela de resultados contendo: [S]; Abs; [P]; Vi; 1/Vi; 1/[S] com as 
respectivas unidades. INDIQUE OS CÁLCULOS 
e) Construa os gráficos Vi x [S] e 1/Vi x 1/[S]. Pode entregar em arquivo separado 
ou o gráfico anexado ao texto. 
f) Determine Km e Vm. 
g) Escreva a equação de Lineweaver-Burk com os dados obtidos. 
 
ATENÇÃO: É necessário obedecer, rigorosamente, o procedimento 
 
 Departamento de Bioquímica – IQ 
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 Cinética Enzimática 
 
INFLUÊNCIA DA NATUREZA DO CATALISADOR E DA TEMPERATURA 
NA VELOCIDADE DA REAÇÃO DE HIDRÓLISE DA SACAROSE 
 
MATERIAL 
* Sacarose 0,02 M 
* Invertase 0,02% em tampão acetato de sódio 0,05 M pH 4,7 
* Ácido Clorídrico (HCl) 0,1M 
* Hidróxido de Sódio (NaOH) 0,1M 
* Tampão acetato de sódio 0,05 M pH 4,7 
* Reagente 3,5 dinitro salicílico (DNS) em meio alcalino 
* Cuba de gelo (0ºC) 
* Becher com água (T ambiente) 
* Banhos a 37, 55, 70, 80 e 100oC 
* Espectrofotômetro 
* Solução padrão: glicose 0,01M 
 
OBJETIVO 
* Verificar a influência da natureza do catalisador e da temperatura na 
velocidade da reação de hidrólise da sacarose 
PROCEDIMENTO 
* Seguir os protocolos abaixo: 
 
A) Enzima Invertase como catalisador 
 
TUBOS Br 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
Sacarose 0,02 M (mL) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 
Tampão (mL) 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 0,30 
 
* Pré-incubar por 5 minutos os tubos numerados de 1 a 7 nas temperaturas indicadas 
na tabela 
* Após o tempo de pré-incubação adicionar 0,2 mL da solução de invertase aos tubos. 
Anotar para cada tubo a hora da adição. 
* Após exatamente 5 minutos, adicionar 1,0 mL de DNS em cada tubo. 
* No tubo Branco, adicionar 1,0 mL de DNS e, logo em seguida, 0,2 mL de invertase. 
* Transferir todos os tubos para banho à 100 oC. O tubo 5 poderá continuar em banho 
a 100o C e deverá ser incubado por outros 5 minutos. 
* Proceder a dosagem de açúcar redutor pelo método de DNS 
 
 
 
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 Cinética Enzimática 
 
 
Figura 1 – Influência da T na velocidade de hidrólise enzimática da sacarose 
 
B) HCl como catalisador 
 
TUBOS Br 1 2 3 4 5 6 7 8 
Sacarose 0,02 M 
(mL) 
0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 
Tampão (mL) 0,48 0,48 0,48 0,48 0,48 0,48 0,48 0,48 0,48 
 
* Pré-incubar por 5 minutos os tubos numerados de 1 a 8 nas temperaturas indicadas 
na tabela. 
* Após o tempo de pré-incubação adicionar 0,02 mL da solução de HCl 0,1M aos 
tubos. 
* Após exatamente 5 minutos, adicionar 1,0 mL de DNS nos tubos de 1 a 5 e nos 
tubos 6 a 8, adicionar 1,0 mL de NaOH 0,1M. Em seguida transferir 0,4 mL de cada 
tubo para dois tubos de ensaio, adicionar 0,6 mL de H2O, homogeneizar e adicionar 
1,0 mL de DNS. 
* No tubo Branco, adicionar 1,0 mL de DNS e, logo em seguida, 0,02 mL de HCl. 
* Proceder a dosagem de açúcar redutor pelo método de DNS 
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 20 40 60 80 100 120
Vi
 (m
M
/m
in
)
Temperatura (oC)
Hidrólise enzimática da sacarose
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 Cinética Enzimática 
 
 
Figura 2 – Influência da T na velocidade de hidrólise ácida da sacarose 
 
Pede-se: 
1) Analise o perfil de ambos os gráficos. Perceba as diferenças. Explique e 
justifique ambos os resultados obtidos. Enfatize os dois fenômenos que estão 
interferindo: a temperatura e a diferençada natureza dos catalisadores. 
2) Proponha um mecanismo de reação para a hidrólise da sacarose, catalisada por 
HCl. 
 
Bibliografia: 
1) Manual de Cursos Práticos em Bioquímica, 20ª ED, Cap 7. 
2) Lineweaver, H and Burk, D - Determination of Enzyme Dissociation Constants, J. Am. Chem. 
Soc. 1934,56,3, 658-666 
 
, 
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 20 40 60 80 100 120
V
el
o
ci
ad
ad
e
 (
m
M
/m
in
)
Temperatura (°C)
Hidrólise ácida da sacraose