Aula 2 - IdentificaÃÃo de cocos (Conflito de codificação Unicode 5)

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Curso: Biomedicina
 Análises Clínicas II	
Identificação de cocos Gram-positivos e negativos
Profª Dra. Francielli Licks
 
Tamanho, forma e arranjo.
Tamanho: microscópicas, necessitamos do microscópio óptico (eletrônico para estruturas)
Forma: cocos, bacilos e espirais
Arranjo: grupamentos
Morfologia bacteriana
Grupo homogêneo em relação ao tamanho, células menores (0,8 a 1,0 μm).
Formato esférico
Identificação de Cocos
Cocos
Gram positivos
Streptococcus
Enterococcus
Staphylococcus
Gram negativos
Neisseria
Moraxella
Cocos
Gram positivos
Streptococcus
Enterococcus
Staphylococcus
Gram negativos
Neisseria
Moraxella
Primeira etapa de identificação: 
presença da enzima catalase. A enzima catalase converte o Peróxido de Hidrogênio em Oxigênio e Água. A liberação do Oxigênio é observada através da formação de bolhas.
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Catalase
Negativa
Streptococcus sp.
Enterococcus sp.
Positiva
Staphylococcus sp.
Gênero Streptococcus
Cocos Gram positivos
Catalase negativos
Arranjo em pares ou cadeias
Anaeróbios facultativos
Microbiota
Patogênicos
GRAM +
alguns organismos são classificados como anaeróbios facultativos, pois, na presença de oxigênio, realizam respiração aeróbia e, na ausência desse gás, realizam os processos anaeróbios.
Bactérias fastidiosas são aquelas bactérias que exigem niveis de nutrientes altíssimos e específicos e temperaturas ótimas
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Total ou 
Beta-hemólise
Sem hemólise ou Gama-hemólise
Parcial ou 
Alfa-hemólise
GRAM +
Clara
Verde
Não muda
Hemolisina
α- Hemólise
Parcial
Streptococcus pneumoniae
Crescimento – circundado por descoloração esverdeada
 - Devido a ação sobre a hemoglobina 
Padrões de Hemólise
β- Hemólise
Hemólise TOTAL
 Streptococcus pyogenes
Streptococcus agalactiae
Clareamento
Padrões de Hemólise
Sugestivo..
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γ- Hemólise
SEM Hemólise 
Streptococcus viridans
Enterococcus sp.
Crescimento sem mudança na coloração
Padrões de Hemólise
Streptococcus viridans é um grupo heterogêneo composto por cerca de 20 espécies de bactérias estreptocócicas que são comensais, principalmente, da cavidade orofaríngea e do trato genital de mamíferos, de baixa patogenicidade e desprovidas de antígenos de Lancefield.
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Após a observação do padrão de hemólise, seguimos com o processo de identificação. 
A observação dos padrões de hemólise são importantes, visto que os testes subsequentes dependem dessa avaliação preliminar
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GRUPOS SOROLÓGICOS DE LANCEFIELD
Classificação de Streptococcus
Maior precisão 
Sorologia do tipo de Carboidrato C presente na superfície celular
Técnicas imunológicas
Um segundo tipo de designação, também muito empregado, baseia-se nas características antigênicas de um polissacarídeo de composição variável, chamado carbohidrato C, localizado na parede da célula, que pode ser detectado por diferentes técnicas imunológicas.
Tomando por base este polissacarídeo, os estreptococos foram divididos em 20 grupos sorológicos (grupos de Lancefield), designados por letras do alfabeto (A, B, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U e V).
NÃO ABRANGE TODAS!
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Baseado na existência de uma substância antigênica (um polissacarídeo denominado carboidrato C) existente na parede da bactéria. 
Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=CNeqmv55zX0
Rapid Latex Agglutination Test
GRUPOS SOROLÓGICOS DE LANCEFIELD
β- Hemolítico – Bacitracina sensível
γ- Hemolítico
β- Hemolítico – Bacitracina resistente
parcial
total
Lancefield não contempla
S agalactiae é resistente
parcial
total
Lancefield não contempla
S agalactiae é resistente
TESTE DA OPTOQUINA
- Halo maior ou igual a 14 mm (sensível)
 - Positiva para Streptococcus pneumoniae
parcial
total
Lancefield não contempla
S agalactiae é resistente
TESTE DA BACITRACINA
- Disco de bacitracina 0,04 U
Positiva para S. pyogenes
(sensível)
emear como antibiograma em ágar Müeller-Hinton ou ágar sangue de carneiro;
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RESISTENTE À BACITRACINA
RESISTENTE À OPTOQUINA
Streptococcus sp. 
α hemolítico
Teste CAMP
POSITIVO
Streptococcus agalactiae
NEGATIVO
Streptococcus sp. 
β hemolítico
SE FOR
SE FOR
Teste CAMP
Finalidade:
Identificação de cepas de S. agalactiae (grupo B). Estas cepas produzem o fator CAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen) que atua sinergicamente com a β-hemolisina produzida pelo Staphylococcus aureus em ágar sangue.
Procedimento:
-Semear um inóculo de Staphylococcus aureus ATCC 25923 de um ponto a outro da placa de ágar sangue;
-Semear perpendicularmente (90°) a colônia de Streptococcus β-hemolítico a ser testada, sem que haja o contato com a estria de S. aureus;
-Incubar a 35±2ºC em atmosfera de 5% de CO2 por 48 h.
Interpretação:
- A formação de uma seta ou meia-lua convergindo para o S. aureus na intersecção do crescimento das duas bactérias indica que o teste é positivo e indicativo de S. agalactiae;
- Se não houver formação de seta ou meia-lua, o teste é negativo e a cepa não pertence ao grupo B de Lancefield.
TESTE CAMP
Beta-hemolítico do grupo B
Beta-hemolítico do grupo A
Este teste é baseado na detecção de uma substância denominada fator Camp, a qual potencializa a ação lítica da beta-hemolisina do Staphylococcus aureus
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Teste CAMP
Vídeo: https://www.youtube.com/watch?v=0nVVM3wa0RU 
Gama Hemólise
Precisamos verificar se é 
Streptococcus sp. ou Enterococcus sp.
NaCl 6,5%
Bile esculina
Positiva
Enterococcus spp
Streptococcus do Grupo D
Negativa
Streptococcus spp. Não Hemolítico
BILE ESCULINA
Algumas bactérias hidrolisam a esculina na presença de bile. Essa hidrólise forma glicose e esculetina, que reage com íons férricos e resulta em um complexo de cor preta.
A presença de bile no meio inibe o crescimento de organismos Gram positivos e estreptococos à exceção dos enterococos e estreptococos grupo D. A hidrólise da esculina garante a diferenciação entre os dois gêneros.
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CALDO NACL 6,5%
A turvação do meio indica crescimento: Se for um coco Gram-positivo, catalase negativa, trata se de Enterococcus spp. Caso não ocorra a turvação do meio, trata-se de Streptococcus spp
O caldo BHI suplementado com 6,5% de NaCl é um meio enriquecido com a presença de cloreto de sódio que age como um agente seletivo. O NaCl interfere na permeabilidade de membrana celular, bem como no equilíbrio osmótico e eletrocinético em organismos intolerantes isso faz com que bactérias halotolerantes se desenvolvam no meio enquanto as outras não se desenvolvem.
Capacidade do microrganismo crescer em altas concentrações de sal. Tem por finalidade diferenciar Enterococcus spp. de Streptococcus spp.
Procedimento:
Inoculam-se 2 a 3 colônias a serem testadas em um caldo BHI suplementado com 6,0% de NaCl (com ou sem indicador);
Incubam-se a 35±2ºC por até 72 h.
Interpretação:
A turvação ou mudança de cor (no caso de adição de indicador) é indicativa de crescimento bacteriano.
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IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Escarlatina – manchas vermelhas no corpo
Erisipela – propagação bacteriana nos vasos linfaticos
Pioderma – necrose na pele
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IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Streptococcus pyogenes
Cocos gram +
Catalase –
Beta-hemolíticos (total)
Sorologia Grupo A
Bacitracina sensível
 
Escarlatina – manchas vermelhas no corpo
Erisipela – propagação bacteriana nos vasos linfaticos
Pioderma – necrose na pele
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IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Streptococcus pyogenes
Proteínas de adesão
Divisão celular
Escarlatina – manchas vermelhas no corpo
Erisipela – propagação bacteriana nos vasos linfaticos
Pioderma – necrose na pele
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IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Streptococcus pyogenes
Escarlatina – manchas vermelhas no corpo
Erisipela – propagação bacteriana nos vasos linfaticos
Pioderma – necrose na pele
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Positivo
Negativo
Lembrando que S. pyogenes é beta-hemolítico
IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Streptococcus pyogenes
Fatores de Virulência
 
- Capa de ácido hialurônico: “foge” da fagocitose
- Proteína M na superfície: muita recidiva (mais de 150 tipos)
Hialuronidase:destrói o tecido conjuntivo da derme
Estreptolisina: destrói hemácias
Super antígenos: resposta imunológica exacerbada
Escarlatina – manchas vermelhas no corpo
Erisipela – propagação bacteriana nos vasos linfaticos
Pioderma – necrose na pele
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IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Streptococcus pyogenes
Escarlatina – manchas vermelhas no corpo
Erisipela – propagação bacteriana nos vasos linfaticos
Pioderma – necrose na pele
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Erisipela
Escarlatina
mpetigo é uma infecção cutânea, altamente contagiosa
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IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Streptococcus pyogenes
Escarlatina – manchas vermelhas no corpo
Erisipela – propagação bacteriana nos vasos linfaticos
Pioderma – necrose na pele
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“Bactéria comedora de carne”
mpetigo é uma infecção cutânea, altamente contagiosa
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IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Streptococcus agalactiae
Cocos gram +
Catalase –
Beta-hemolíticos (total)
Sorologia Grupo B
Bacitracina resistente
 
Escarlatina – manchas vermelhas no corpo
Erisipela – propagação bacteriana nos vasos linfaticos
Pioderma – necrose na pele
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IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Streptococcus agalactiae
Trato genito-urinário
 - Sepse e meningite no RN
 - Infecções pós parto
 
IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Streptococcus pneumoniae
Cocos gram +
Catalase –
Alfa-hemolíticos (parcial)
Sem classificação Lancefield
Optoquina resistente
 
Geralmente aos pares
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IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Streptococcus pneumoniae
Contém capsula polissacarídea – fator de virulência
Principal agente da pneumonia comunitária
Meningite 
Geralmente aos pares
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IMPORTÂNCIA CLÍNICA
Infecções Respiratórias - Comunidade
 
 - Otites
 - Sinusites
 - Pneumonias
10% adultos
20% crianças 
Integrante da microbiota
Streptococcus pneumoniae
IMPORTÂNCIA CLÍNICA
 Streptococcus viridans
Cocos gram +
Catalase –
Alfa e gama hemolíticos 
Sem classificação Lancefield
 
Streptococcus viridans é um grupo heterogêneo composto por cerca de 20 espécies de bactérias estreptocócicas que são comensais, de baixa patogenicidade e desprovidas de antígenos de Lancefield.
IMPORTÂNCIA CLÍNICA
 Streptococcus viridans
Microbiota
 - Cavidade oral
 - Trato gastrointestinal
Patógenos oportunistas
 - Associado a endocardite 
 - Dano às válvulas cardíacas 
 
Gênero Enterococcus
Cocos Gram positivos
 - Isolados ou em cadeias curtas
 - CATALASE NEGATIVA - Pseudocatalase
Microbiota Normal
 - Trato gastrointestinal
 - Trato genito-urinário
Crescem em caldo com 6,5% de NaCl
Hidrolisam a esculina em meio com 40% de bile
Comum em ITU e Infecções Hospitalares
 
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Gama hemólise
Enterococcus
- Geralmente sem hemólise
Enterococcus são gama ou alfa hemolíticos. Pode-se maximizar a detecção da hemólise com incubação 5-7% CO2 
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Gênero Enterococcus
14 espécies 
Enterococcus faecalis: constituem 85 a 90% dos Enterococcus spp. identificados, sendo essa espécie a menos propensa ao desenvolvimento de resistência. 
Enterococcus faecium: é o menos prevalente, de 5 a 10%, mas apresenta maior propensão ao desenvolvimento de resistência.
 
Clinicamente Importantes
NaCl 6,5%
Bile esculina
Positiva
Enterococcus spp
Streptococcus do Grupo D
Negativa
Streptococcus spp. Não Hemolítico
Positivo
Negativo
Lembrando que S. pyogenes é beta-hemolítico e Enterococcus é gama!
Gênero Enterococcus
Enterococcus 
Resistência à Vancomicina
Foi reconhecido pela 1° vez em 1986
 
 - 30 anos após a introdução da Vancomicina
Pacientes Críticos
 - UTI
 - Oncologia
 - Renais
 - Deficiências Imunológicas
 
 
PROBLEMA!
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Gênero Staphylococcus
Cocos Gram positivos
 - Arranjos aos pares
 - Cachos de uva
Bactérias mais isoladas após enterobactérias
Microbiota
Isolado correlacionado com a amostra e quadro clínico
Anaeróbios Facultativos
CATALASE POSITIVA
 
CATALASE +
CATALASE -
Cocos Gram positivos
Micrococcus
Staphylococcus
Família Streptococcaceae
Streptococcus
Enterococcus
Gênero Staphylococcus
NÃO PINGAR NA PLACA
2 H2O2
2 H2O + O2 
Finalidade:
A presença da catalase permite separar os estreptococos catalase negativa de outros cocos Gram-positivos produtores de catalase, por exemplo, estafilococos. A enzima catalase converte o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. A liberação do oxigênio se observa pela formação de bolhas.
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Gênero Staphylococcus
Coloração branco-porcelana ou cinzas
Podem ter pigmento amarelo ou amarelo-alaranjado (aureus)
Os micrococos em geral crescem mais lentamente, e com freqüência são necessárias 48 h de incubação antes que a morfologia típica das colônias possa ser diferenciada
Degradação do manitol com a produção de ácido muda a cor do meio de rosado para amarelo.
Diferenciação entre Staphylococcus e Micrococcus
Disco de Bacitracina 
0,04 U
Resistente
Staphylococcus
Sensível
Micrococcus
Semear como antibiograma em ágar Müeller-Hinton ou ágar sangue de carneiro;
Colocar um disco de bacitracina 0,04 U;
Incubar a 35 a 37ºC por 18 - 24 h.
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Gênero Staphylococcus
Diferentes abordagens terapêuticas. 
Detecção de Staphylococcus aureus
Teste da Coagulase (positivo)
Coagulase
 - Enzima presente em todos os S. aureus
 
Coagulase Test - YouTube
Fibrinogenio do plasma é convertido em fibrina, resultando na coagulação do plasma
Lamina – Formação de grumos
https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo4/id_sta2.htm
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Staphylococcus COAGULASE NEGATIVA
Microbiota Normal
 - Pele/ mucosas
Principal espécie
 - Staphylococcus epidermidis
Mais de 40 espécies clinicamente importantes
Frequentemente resistente a penicilina e meticilina
Causa mais frequente de bacteremia
Infecções associadas a metais/ plásticos
 
Susceptibilidade à Novobiocina
- S. saprophyticus é resistente a novobiocina com halos de inibição, em geral, inferiores a 12 mm.
- Infecções do trato urinário
https://www.laborclin.com.br/wp-content/uploads/2019/06/Discos_de_novobiocina_640627.pdf
https://www.anvisa.gov.br/servicosaude/controle/rede_rm/cursos/boas_praticas/modulo4/id_sta7.htm
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Caso Clínico 1
Paciente com 78 anos é admitido em um Serviço de Emergência com história de tosse e febre há 3 dias. Tinha hemograma compatível com infecção bacteriana. Corroborando com o exame físico, a CT de tórax evidenciou compatível com quadro de pneumonia. Foi introduzido ceftriaxone. Devido a não evolução favorável, paciente foi submetido a broncoscopia com coleta de lavado broncoalveolar.
Coloração de Gram
Catalase
Coagulase
Com base nas provas de identificação, qual o provável diagnóstico?
S. Aureus
Gram +, staphylo, coagulase positiva
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Caso Clínico 2
Uma paciente de 56 anos após ser submetida a cirurgia ginecológica, no pós-operatório apresentou disúria e um quadro febril. Foi solicitada a urocultura.
Coloração de Gram
Catalase
Bile esculina
Com base nas provas de identificação, qual o provável diagnóstico?
Crescimento positivo em NaCl 6,5%
Enterococcus
Cocos gram +, catalase negativo, bile e nacl+
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Cocos
Gram positivos
Streptococcus
Enterococcus
Staphylococcus
Gram negativos
Neisseria
Moraxella catarrhalis
Gênero Neisseria
Diplococos Gram negativos
 - Geralmente aos pares
 - Laterais achatadas – grão de feijão
Microbiota – vias respiratórias
OXIDASE POSITIVA* – enzima citocromo C oxidase
 - reagente p-aminodimetilanilina
Catalase Positiva*
Aeróbios/ Fastidioso
Ágar chocolate e Ágar Thayer Martin
 
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Gênero Neisseria
Diplococos Gram negativos
Ágar chocolate e Ágar Thayer Martin
Agar Thayer Martin é um meio rico e superior a outros meios de cultivo, destinados ao isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, pois contém em sua fórmula antibióticos que inibem o crescimento de outras bactérias. 
Apesarde propiciar um bom desenvolvimento para bactérias do gênero Neisseria spp., existem algumas cepas que não crescem no Agar Thayer Martin, crescendo entretanto em Ágar Chocolate. Por esta razão, recomenda-se o uso conjunto dos dois tipos de meio no isolamento de neissérias. 
 
Ágar Thayer Martin/ Chocolate Colônias pequenas com pigmento creme. Podem ser mucoides. Extremamente aderidas ao meio de cultura (pilus)
72h / 35-37°C
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Vídeo Oxidase:
https://www.youtube.com/watch?v=ebzuCGoyMLA
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Maltose
Diplococos Gram Negativos
Oxidase +
Neisseria
gonorrhoeae 
Neisseria meningitidis 
Maltose
A identificação das espécies de neisseria baseia-se na utilização de açúcares: glicose, maltose, lactose, sacarose e frutose. Como as neisserias utilizam carboidratos por via oxidativa, a base Ágar Cistina Tripticase (CTA) adicionada de 1% de cada um dos açucares e com indicador vermelho de fenol tem sido utilizado.
Gênero Neisseria
Neisseria gonorrhoeae (gonococo) 
 
 - Sempre considerado patógeno
 - Possui Pilus
 - Transmissão: Quase sempre contato sexual
 - Gonorreia 
 
 
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Gênero Neisseria
Neisseria meningitidis (meningococo) 
 - Coloniza orofaringe de indivíduos saudáveis
 
 - Possui cápsula
 - Divididos em 13 grupos sorológicos - antigenicidade dos polissacarídeos capsulares 
 - A,B,C,D,H,I,K,L,X,Y,Z,W135 e 29E
 - Meningite – complicação mais comum
 - Pneumonia/ Uretrite
 
Transmissão: gotículas disseminadas pelo ar
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Gênero Moraxella
Moraxella catarrhalis
- Diplococo – semelhante ao gênero Neisseria
Microbiota normal do trato respiratório superior
- Pode causar infecções TRI/ áreas adjacentes 
 - otite, sinusite, bronquite e pneumonia
- Importância clínica em imunocomprometidos 
 - Pneumonia
 
Espécie de maior importância clinica 
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Gênero Moraxella
Moraxella catarrhalis
Oxidase Positiva
Catalase Positiva
Suscetibilidade à colistina – maioria sensível 
 
Meios indicados:
Ágar Sangue e Chocolate
Colônias cinza róseo-acinzetado
Geralmente sai inteira quando removida com a alça bacteriológica
Espécie de maior importância clinica 
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Caso Clínico 3
Paciente deu entrada ao pronto-socorro, com queixa de cefaleia intensa, febre de 38,8ºC, náuseas e vômitos. Apresentou- se letárgica e fotofobia. O início dos sintomas foi há 42 horas. Foi solicitada cultura do líquido cefalorraquidiano em ágar chocolate. Além dos parâmetros analisados abaixo, verificou-se a utilização de maltose pela via oxidativa.
Coloração de Gram
Oxidase
Com base nas provas de identificação, qual o provável diagnóstico?
Neisseria meningitidis 
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