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UNIVERSIDADE PAULISTA - UNIP 
FARMÁCIA 
TOXICOLOGIA 
 
 
 
 
SYMON DA COSTA CRUZ 
 
 
RELATÓRIO AULA PRÁTICA 
Determinação de Metemoglobina 
Determinação de Carboxihemoglobina 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MANAUS - AM 
2022 
 
DETERMINAÇÃO DE METEMOGLOBINA EM SANGUE 
INTRODUÇÃO 
A metemoglobina encontrada em sangues normais em quantidade inferior 
a 2% consiste em hemoglobina sob a forma oxidada. Nela o átomo de ferro, 
encontra-se sob a forma férrica (Fe3+) incapaz de se ligar ao oxigênio e realizar 
seu transporte, e é reconvertida a hemoglobina por substâncias redutoras 
formadas num metabolismo de eritrócitos. 
A metemoglobina pode estar aumentada em situações de exposição a 
substâncias químicas ou fármacos, que aumentam a oxidação, como por 
exemplo, anilinas, nitratos e nitritos, na deficiência de enzimas metemoglobinas 
redutase, que promovem a redução da metemoglobina à hemoglobina e em 
casos de presença de hemoglobina anormal hereditária. 
A metemoglobina tem um pico de absorção a 630nm. Quando se adiciona 
KCN na amostra de sangue, ocorre a formação de cianometemoglobina, qual vai 
ter absorção mínima em 630 nm. É realizada uma leitura da amostra antes (AI) 
e depois (AII) de adicionar KCN e a diferença entre elas é diretamente 
proporcional a concentração de metemoglobina. Quando se acrescenta 
ferricianeto de potássio ao sangue, a hemoglobina total é convertida em 
metemoglobina (AIII), quando se adiciona o KCN nesta amostra a 
metemoglobina é convertida em cianometemoglobina (AIV), a diferença entre 
AIII e AIV é diretamente proporcional à metemoglobina formada. Portanto se tem 
uma relação entre a metemoglobina presente no sangue e a metemoglobina 
formada pela adição de ferricianeto de potássio. 
Quanto se tem 15% ou menos de concentração de Metemoglobina no 
sangue, não se tem sintomas. De 15% a 20% apresenta Cianose leve, com 
sintomas leve (fadiga e dor de cabeça). De 20 a 45% se tem uma cianose 
evidente com sintomas moderados como fadiga, dor de cabeça, dispneia, 
síncope, incapacidade de se exercitar, tontura e fraqueza. De 45% a 70% 
apresenta cianose grade com sintomas graves como taquipnéia, acidose 
metabólica, disritmias, convulsão, depressão do SNC e coma. Mais que 70% têm 
se uma hipóxia grave, usualmente letal. 
 
 
OBJETIVO 
Determinar a concentração da metemoglobina presente em amostras de 
sangue utilizando a heparina como ferramenta anticoagulante. 
 
AMOSTRA 
Sangue com heparina. A amostra deve ser coletada no final da jornada de 
trabalho, usando heparina como anticoagulante. 
 
REAGENTES E SOLUÇÕES 
• Solução de ferricianeto de potássio (K3Fe(CN)6) 5% (p/v): conservar em 
frasco escuro e preparar mensalmente. 
• Solução tampão fosfato 0,5M, pH 7,2. 
• Preparo: misturar 7,0 mL de NaOH 0,5 M e 10 mL de KH2PO4 0,5 M. 
• Solução de ferricianeto tamponada 
• Preparo: misturar 0,2 mL da solução de K3Fe(CN)6 a 5% e 2,5 Ml da 
solução tampão-fosfato 0,5 M, pH 7,2 e completar para 10 mL com água 
destilada. Preparar diariamente. 
• Solução de NaCN a 10% Preparo recente. 
• Solução de ácido acético a 12% (v/v) 
• Preparo recente. 
• Solução de cianeto neutralizada 
• Preparo: misturar 1,0 mL da solução de NaCN a 10% com 0,9 mL da 
solução de ácido acético a 12%. Usar esta solução dentro de 6 horas. 
• Triton X-100. 
 
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
Em tubo de ensaio adicionar 0,8 mL de sangue, 2,2 mL de água destilada, 
1,0 mL de tampão fosfato e 1 gota de Triton X 100. Agitar e centrifugar (3.000 
rpm / 5 min.). 
Transferir 2,4 mL do sobrenadante para uma cubeta (I) e 0,2 mL do 
sobrenadante para a cubeta (II), esta última contendo 2,2 mL de reativo 
ferricianeto-fosfato (II). 
Efetuar as leituras das duas cubetas (AI e AII) em 632 nm, contra ar. 
Adicionar 80 µL de solução de cianeto neutralizada às duas cubetas e, 
após 1 minuto, efetuar novamente a leitura das absorbâncias, obtendo-se AIII e 
AIV. 
Calcular a % de MeHb na amostra, expressando em percentagem de 
metemoglobina total, a partir da seguinte fórmula: 
 
% MeHb = __AI – AIII x 100 
 (AII – AIV) x 12 
 
DADO: 12 é o fator de diluição. 
 
 
 
INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS 
O valor de referência de metemoglobina é até 2,0% e o IBMP é igual a 5%, 
segundo a NR7. 
 
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 
HEGESH, E; GUENE, N; COHEN, S.; BOCHEKOVSKY, R.; SHUVAL, H.I. – A 
sensitive micromethod for the determination of methemoglobin in blood. 
Clin.Chim.Acta., Amsterdam, 30:679-82, 1970. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DETERMINAÇÃO DE CARBOXIHEMOGLOBINA 
INTRODUÇÃO 
Existe uma série de substâncias químicas lançadas na atmosfera, entre 
elas o que é lançada em maior quantidade é o gás chamado monóxido de 
carbono (CO). Ele quando inalado, se difunde através da membrana 
alveolocapilar e pode ser medido pelo nível de carboxihemoglobina (COHb) na 
corrente sanguínea. Quando se aspira a fumaça do cigarro, o CO, combina-se 
reversivelmente com a Hb para formar a COHb, não transportando o O2 para as 
células, causando anóxia tecidual, aumentando a curva de dissociação do 
sangue para esquerda resultando em menor quantidade de sangue para 
os tecidos, levando a problemas respiratórios e cardíacos. Fumantes passivos 
(convivem com fumantes) são os mais prejudicados com essa fumaça. 
 
OBJETIVO 
Determinar os níveis de Carboxiemoglobina de amostras biológicas para 
verificar se estão dentro dos limites máximos permitidos. 
 
AMOSTRA 
Sangue total. Deve ser colhido no final da jornada de trabalho em 
vacutainer heparinizado e conservado a 4ºC por no máximo, uma semana. Para 
os fumantes devem ser colhidas duas amostras, antes e após a jornada de 
trabalho. 
 
REAGENTES E SOLUÇÕES 
• Sol. Tampão pH= 6,85: KH2PO4 (fosfato monobásico de potássio) 
/K2HPO4 (fostato dibásico de potássio) 0,1M. 
• Sol. Hemolisante: diluir o tampão com água de 1:10. Preparar 
semanalmente. 
• Sol Diluente: dissolver 25 mg de hidrossulfito de sódio em 20 mL de sol. 
Tampão. Preparar antes do uso. 
 
 
 
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
Em tubo de ensaio com tampa, colocar 0,1 mL de sangue (amostra) e 12 
mL de solução hemolisante. Agitar; deixar em repouso por 10 minutos. 
Diluir 0,2 mL do hemolizado com 2,3 mL de solução diluente. Tampar. 
Deixar a temperatura ambiente por 10 minutos. Ler a absorvâncias a 420 
e 432 nm, usando como branco a solução diluente. 
 
CÁLCULO DA CARBOXIEMOGLOBINA 
 
Leitura da Abs em espectrofotômetro 
Filtro 420 – 0,140 
Filtro 432 – 0,019 
Com os resultados das leituras, realizamos os cálculos de percentagem de 
acordo com a fórmula abaixo. 
 
% COHb = _____1 – ( AR . F1) x 100 
 AR ( F2 – F1 ) – F3 + 1 
 
SENDO: AR = Abs. 420 
 Abs. 432 
 
 F1 = Abs. Hb 432 
 Abs. Hb 420 
 
 F2 = Abs. HbCO 432 
 Abs.HbCO 420 
 
 F3 = Abs. HbCO 420 
 Abs. Hb 420 
 
ONDE: 
AR= A 420/ A 432 
F1= A Hb red 432 / A Hbred 420 (1,3330) 
F2= A HbCO 432 / A Hb red 420 (0,4787) 
F3= A HbCO 420 / A Hb red 432 (1,9939) 
 
RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO 
% COHb = _____1 – ( 7,36. 0,13) x 100 
 ( 7,36 – 0,13 ) – 7,36 + 1 
% COHb = _____1 – 0,9568 x 100 
 7,23 – 7,36 + 1 
% COHb = _____0,0432 x 100 = 3,7584 
 0,87 
O valor encontrado na amostra coletada foi de 3,7584 valor relativamente 
acima do Índice Biológico Permitido (IBMP) que é de 3,5% e o Valor de 
Referência (VR) é < 1%, ambos para não fumantes. 
 
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 
BEUTLER, E & WEST. C. – Simplified determination of carboxihemoglobin. Clin. 
Chem, 30(6):871-4. 1984. 
 
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