biologia molecular

Prévia do material em texto

BIOLOGIA 
MOLECULAR
 Carolina Saibro Girardi
Reação em cadeia da 
polimerase (PCR)
Objetivos de aprendizagem
Ao final deste texto, você deve apresentar os seguintes aprendizados:
 � Avaliar a reação em cadeia da polimerase: princípio, objetivo e 
metodologia.
 � Identificar as etapas da técnica de PCR.
 � Reconhecer as variações da técnica de PCR e suas aplicações.
Introdução
Os processos de geração de cópias idênticas de moléculas de DNA, que 
tem como aplicações práticas o desenvolvimento de testes diagnósticos 
e a identificação genética de indivíduos, por exemplo, fazem uso, de 
forma geral, da própria maquinaria de replicação de DNA. 
Em alguns casos, essa reação de síntese de DNA ocorre in vivo, de 
forma dependente de um organismo hospedeiro: a sequência de inte-
resse é inserida na célula de uma bactéria, por exemplo, e a replicação 
do genoma bacteriano propiciará a síntese de cópias da sequência de 
interesse. Em outros casos, a reação ocorre inteiramente in vitro, em um 
tubo de ensaio: a cópia de uma sequência de interesse ocorre pela incu-
bação com a enzima DNA-polimerase e com os substratos para a síntese. 
Essa última estratégia, independente de organismos hospedeiros para a 
síntese de DNA, é chamada de reação em cadeia da polimerase (PCR). 
Neste capítulo, você receberá as ferramentas necessárias para reco-
nhecer os princípios do método de PCR, seus objetivos e os detalhes da 
sua metodologia. Além disso, você reconhecerá algumas adaptações 
que agregaram novas aplicações práticas à técnica.
U N I D A D E 2
Princípios da reação de PCR
A técnica de PCR é, essencialmente, bastante simples: moléculas de DNA são 
amplificadas em milhares ou milhões de novas cópias, por meio de uma reação 
in vitro muito mais rápida que a técnica de clonagem de DNA em organismos 
hospedeiros (ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014; WILSON; WALKER, 
2010). A técnica é sensível o suficiente para amplificar fragmentos de DNA 
em uma quantidade mínima de amostra, e o DNA gerado é suficiente para 
análises posteriores. Além disso, o método permite a síntese de cópias idênticas 
de sequências específicas de DNA. 
A cada ciclo de reação da PCR, o fragmento contendo a sequência-alvo 
dará origem a uma nova molécula com sequência complementar. Quando 
consideramos a duplicação de uma dupla-fita, as duas fitas de DNA poderão 
dar origem a novas fitas complementares, ou seja, o número de moléculas de 
DNA dobra a cada ciclo quando a eficiência da reação é máxima. 
O que permite, por sua vez, que a técnica forneça um número tão grande 
de cópias é o fato de que ela é uma reação em cadeia: são realizados vários 
ciclos consecutivos, dessa forma, não apenas o DNA original servirá como 
molde a cada ciclo de PCR, mas também o DNA que foi sintetizado em todos 
os ciclos anteriores, de forma que o número de cópias de DNA cresça exponen-
cialmente (Figura 1). Depois de apenas 20 ciclos de reação, a amplificação pode 
dar origem a 1 milhão de cópias (ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014).
A PCR permite a amplificação exponencial das sequências-alvo. Quando a reação é 
eficiente o suficiente para dobrar o conteúdo da sequência-alvo a cada ciclo, o número 
de moléculas N contendo a sequência-alvo ao fim da reação será:
N = N0 × 2
c
Onde N0 é o número inicial de moléculas e c é o número de ciclos da reação.
Dessa forma, a amplificação ocorre de forma exponencial; no entanto, a reação da PCR 
não costuma ocorrer com mais que 35 a 40 ciclos. Em torno desse estágio, a cinética 
enzimática já não é mais favorável e a amplificação atinge um platô, no qual o número 
de cópias permanece constante, independentemente do número de ciclos da reação.
Reação em cadeia da polimerase (PCR)2
Figura 1. Amplificação exponencial da sequência-alvo de DNA por meio da PCR. No 
primeiro ciclo, uma molécula de DNA dá origem a uma nova molécula, dobrando o con-
teúdo da sequência-alvo. No segundo ciclo, tanto a molécula original quanto a molécula 
recém-sintetizada são utilizadas como molde para a reação, que dobra mais uma vez o 
conteúdo da sequência-alvo.
Fonte: Adaptada de Watson et al. (2015, p. 159).
3Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Em se tratando de uma reação química de síntese, a técnica exige a pre-
sença dos substratos e das condições adequadas à replicação de DNA pela 
DNA-polimerase. 
DNA com uma sequência-alvo
Uma alíquota do DNA amostral (template de DNA) é utilizada, na qual está 
presente a sequência-alvo da amplificação. A reação é capaz de amplificar 
fragmentos presentes em baixíssimas concentrações nas amostras, mas depende 
de a amostra estar em bom estado de conservação e sem a presença de impu-
rezas (como proteínas, lipídios e reagentes químicos utilizados na extração). 
Além disso, a presença de contaminação com DNAs exógenos pode levar à 
amplificação de produtos inespecíficos na reação da PCR.
DNA polimerase
A DNA polimerase é a enzima responsável pela síntese de DNA a partir de 
substratos de desoxirribonucleotídeos (dNTPs) sobre um molde de DNA 
fita-simples. Ela adiciona nucleotídeos a uma extremidade 3’-OH de uma fita 
iniciadora anelada ao molde, estendendo a fita complementar (WATSON et 
al., 2015). Utiliza-se na reação da PCR termoestável as versões da enzima que 
são capazes de suportar as altas temperaturas da reação.
Oligonucleotídeos iniciadores
Os iniciadores (ou primers) caracterizam as fitas iniciadoras necessárias à 
síntese pela polimerase, disponibilizando a extremidade 3’-OH necessária à 
extensão das cópias de DNA. Sintetizados quimicamente, esses iniciadores 
podem ter sequências randômicas, permitindo a amplificação da amostra de 
DNA como um todo. Além disso, eles permitem o reconhecimento e a ampli-
ficação de fragmentos específicos em uma amostra complexa de DNA: uma 
dupla de iniciadores com sequência complementar às regiões flanqueadoras 
da sequência-alvo delimita a sequência que deve ser amplificada na reação 
da PCR (WILSON; WALKER, 2010) (Figura 2). 
Reação em cadeia da polimerase (PCR)4
Figura 2. A reação da PCR pode amplificar sequências específicas no DNA. Com a utilização 
de um par de oligonucleotídeos iniciadores com sequências complementares às regiões 
flanqueadoras de uma sequência-alvo, regiões específicas de uma mistura complexa de DNA 
podem ser amplificadas na reação da PCR. O desenho de iniciadores para regiões específicas 
no DNA, no entanto, depende do conhecimento prévio da sequência na região de interesse.
Fonte: Adaptada de Wilson e Walker (2010, p. 179).
Desoxirribonucleotídeos
Os dNTPs são os substratos da síntese, os quais são adicionados à cadeia de 
DNA por pareamento de bases durante a extensão. Eles são compostos por 
dATP, dTTP, dGTP e dCTP e adicionados à reação em iguais concentrações.
5Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Tampão de reação
A composição da solução-tampão tem como intuito propiciar a melhor eficiência 
da reação. Essa solução contém o reagente MgCl2, que atua doando cofatores 
indispensáveis à atividade da polimerase: os íons Mg2+. Além disso, a solução 
tampão contém íons diversos que estabilizam o pH da reação e agentes estabi-
lizantes que auxiliam na manutenção das fitas-simples de DNA desnaturadas.
Estágios do ciclo de PCR
A cada ciclo de reação, as etapas necessárias à síntese de DNA complementar, 
a partir do DNA-molde, são a desnaturação das duplas-fitas, o anelamento 
dos iniciadores à sequência-alvo e a extensão da fita complementar de DNA. 
(Figura 3). A repetição de vários ciclos de desnaturação, anelamento e extensão 
(de 30 a 40 ciclos, em média) possibilita a amplificação eficiente do DNA de 
interesse. 
Figura 3. O ciclo da reação da PCR consiste em três estágios: desnaturação, anelamento 
e extensão. 
Fonte: Adaptada de Wilson e Walker (2010, p. 180).
Reação em cadeia da polimerase (PCR)6
Desnaturação
Na desnaturação, o aquecimento da amostra a cerca de 95°C é suficiente 
para desfazer as ligações de hidrogênio que unem as fitas-duplas, separando 
umas das outras. Com isso, essaetapa promove a conversão de uma solução 
de DNA fita-dupla para uma solução de fita-simples. Essa etapa é importante 
para tornar as sequências acessíveis para a reação.
Anelamento
No anelamento, a temperatura é reduzida até a faixa de 45 a 65°C para possibi-
litar a interação do iniciador com a sequência de interesse e o seu anelamento 
(ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014). Da mesma forma que temperaturas 
acima de 90°C desfazem o pareamento de bases entre a fita-dupla, elas também 
impedem o pareamento de bases entre o iniciador e a sequência de interesse. 
Sendo assim, é necessária a redução significativa na temperatura. 
Nessa etapa, os iniciadores têm como função reconhecer as regiões flan-
queadoras da sequência de interesse e, ao se anelarem a estas, eles fornecem a 
extremidade 3’-OH livre necessária para a síntese de uma fita complementar 
pela polimerase.
A temperatura específica de anelamento dependerá de características do 
iniciador, como a sua sequência. Quanto maior o conteúdo de bases citosina e 
guanina (conteúdo G/C), maior a temperatura de anelamento, já que o parea-
mento de bases G-C é estável em temperaturas maiores que o pareamento A-T. 
Extensão
Por fim, na etapa de extensão das fitas, a temperatura é aumentada a cerca de 
70°C, sendo esta a temperatura ótima da polimerase que realizará a síntese. Na 
extensão, a fita complementar à sequência de interesse poderá ser sintetizada 
pela enzima por meio da incorporação dos dNTPs. O tempo necessário para 
a etapa varia de acordo com o tamanho da região de interesse: quanto maior 
o fragmento a ser sintetizado, maior o tempo da etapa de extensão.
Como cada um dos processos necessários à reação ocorre em uma tempe-
ratura específica, as etapas de incubação em temperaturas distintas permitem 
que determinados fenômenos ocorram de forma isolada e consecutiva ao logo 
do ciclo de reação. Inicialmente, as transições entre as etapas de incubação 
eram realizadas à mão, hoje em dia, os tubos de ensaio contendo os reagentes 
7Reação em cadeia da polimerase (PCR)
e a enzima polimerase são incubados em um termociclador, no qual as tempe-
raturas e o período de tempo de cada etapa dos ciclos pode ser automatizada.
Modificações na DNA-polimerase que facilitaram a otimização da PCR
As primeiras PCRs apresentavam um problema prático: a temperatura necessária para 
a desnaturação das fitas-duplas de DNA acabava também desnaturando a enzima 
DNA polimerase que seria responsável pela reação nas etapas seguintes. Lembre-se 
que o aquecimento a 90°C não desfaz apenas as pontes de hidrogênio que mantêm 
a estrutura da dupla-hélice, mas também aquelas que estruturam a conformação 
nativa de proteínas. Assim, a cada passo de desnaturação, a enzima era inativada e 
mais enzimas precisariam ser adicionadas para a próxima etapa de extensão (ZAHA; 
FERREIRA; PASSAGLIA, 2014).
Com a descoberta e o isolamento de versões da enzima presentes em bactérias 
termofílicas Thermus aquaticus, a reação se tornou muito mais eficiente. Essas enzimas 
termoestáveis têm temperatura ótima de funcionamento em 72°C (muito mais alta 
que a temperatura de 35 a 40°C fisiológica para a maior parte dos organismos) e é 
capaz de suportar períodos prolongados de exposição a 95°C (WILSON; WALKER, 
2010). Assim, ela permanece ativa mesmo ao longo de várias repetições de etapa de 
desnaturação da reação da PCR. 
Desde a sua descoberta, diversas otimizações foram realizadas nessa enzima por 
meio de melhoramento genético para facilitar os protocolos da PCR. Atualmente, 
algumas enzimas são capazes, inclusive, de estender a fita complementar de DNA 
nas temperaturas da etapa de anelamento, excluindo a necessidade de uma etapa 
isolada de extensão.
Variações na técnica de PCR
A reação da PCR é amplamente utilizada nas análises de biologia molecular 
para os mais diferentes fins. Algumas adaptações na técnica foram fundamen-
tais para isso, permitindo que métodos clássicos de Biologia Molecular fossem 
suplantados pela PCR e aumentando significativamente as possibilidades de 
aplicação da técnica. 
Reação em cadeia da polimerase (PCR)8
PCR convencional
Nas técnicas convencionais de PCR, a análise dos produtos da amplificação 
ocorre ao final da reação. Encerrados os ciclos, a solução enriquecida com 
uma sequência-alvo de DNA pode ser submetida à eletroforese e os fragmen-
tos podem ser observados no gel. Na comparação com um padrão de peso 
molecular de DNA, as bandas formadas podem ser analisadas quanto ao seu 
tamanho e à intensidade das bandas (Figura 4A).
A reação convencional de PCR é muito utilizada como primeiro passo de 
diversas outras técnicas de análise de DNA, já que permite o enriquecimento 
de uma sequência de interesse em soluções que, originalmente, continham 
apenas uma mistura complexa de DNA amostral. Essa solução enriquecida 
pode ser utilizada para sequenciamento, genotipagem e até mesmo inserção 
de sequências exógenas em organismos hospedeiros. 
Como método de análise, a reação da PCR é comumente utilizada, por 
exemplo, em testes de impressão digital de DNA. A análise de sequências-
-alvo por PCR convencional é útil principalmente quando os resultados são 
qualitativos (presença ou ausência de sequências). Em análises quantitativas, 
no entanto, a técnica apresenta algumas falhas: a relação entre a quantidade 
de cópias e a quantidade do alvo original varia ao longo dos ciclos da reação 
e é difícil estabelecer essa relação na técnica convencional de PCR.
PCR quantitativa (qPCR)
Um avanço importante na técnica de PCR foi o desenvolvimento de meto-
dologias que possibilitam o acompanhamento da amplificação ao longo da 
reação, e não apenas ao fim do processo, como na PCR convencional (ZAHA; 
FERREIRA; PASSAGLIA, 2014). 
A PCR quantitativa, também chamada de PCR em tempo real, adota 
sistemas de detecção dos produtos da reação a cada ciclo de PCR e, com 
isso, permite a sua quantificação. Esses sistemas de detecção empregam 
marcadores fluorescentes das cópias de DNA (WILSON; WALKER, 2010). 
Com a utilização de termocicladores capazes de detectar esses marcadores, 
a amplificação pode ser monitorada pelo nível de fluorescência ao longo dos 
ciclos da reação (Figura 4).
Por ser um método quantitativo e significativamente mais sensível que o 
PCR convencional, ele é o mais indicado em testes de detecção de sequências 
presentes em baixíssimas concentrações, como na detecção de genomas virais 
em amostras biológicas e em testes que têm como intuito estabelecer uma 
9Reação em cadeia da polimerase (PCR)
relação quantitativa entre a presença de sequências em amostras — é o caso 
das análises de expressão gênica e de variação no número absoluto de cópias. 
Figura 4. Análise dos produtos de amplificação da PCR convencional e da PCR quantitativa. 
(a) Se analisarmos duas sequências-alvo distintas (alvo 1 e alvo 2) nas amostras 1 (A1) e 
2 (A2) por PCR convencional, os produtos da amplificação dos alvos podem ser observados 
após a amplificação por meio de eletroforese. Assim, sabemos com o resultado da PCR 
convencional que os alvos 1 e 2 estão presentes nas amostras 1 e 2. É possível também 
observar que o alvo 1 está presente em maior quantidade na amostra 2 que na amostra 1, 
por exemplo, mas é difícil determinar o quanto. (b) Se analisarmos os mesmos alvos 1 e 2 
nas amostras 1 (A1) e 2 (A2) por PCR quantitativo, os produtos da amplificação podem ser 
acompanhados durante a reação, dando origem aos gráficos de fluorescência versus ciclo 
exemplificados. Quanto menor o ciclo em que ocorre a amplificação, maior a quantidade 
inicial de amostra. A análise das curvas de amplificação nos estágios de crescimento expo-
nencial possibilita a quantificação relativa das sequências-alvo entre as amostras.
PCR com transcrição reversa (RT-PCR)
As técnicas de PCR descritas até o momento permitem a amplificação de 
moléculas de DNA. No entanto, em muitos os casos se deseja amplificar uma 
sequência presente em moléculas de RNA. É o caso de técnicasde análise 
de expressão de mRNA e de análise de sequências de RNAs regulatórios, por 
exemplo. Nesses casos, é realizada uma reação prévia de transcrição reversa 
(RT do inglês reverse transcription): as moléculas de RNA de interesse pre-
sentes em uma mistura complexa de RNAs dão origem a moléculas de DNA 
com sequência complementar (cDNA) por meio da enzima transcriptase 
Reação em cadeia da polimerase (PCR)10
reversa (ZAHA; FERREIRA; PASSAGLIA, 2014), a mesma enzima que 
catalisa a conversão do genoma de RNA de alguns vírus em DNA para a sua 
incorporação no genoma do hospedeiro. 
Essa reação ocorre de forma bem similar à reação da PCR com a DNA 
polimerase, mas adaptada às condições necessárias à síntese de cDNA a partir 
de um molde de RNA pela transcriptase reversa. Além disso, a etapa de RT 
envolve apenas um ciclo de amplificação: ao fim da transcrição reversa, é 
obtida uma cópia de cDNA para cada molécula de RNA de interesse.
Para a amplificação em si da sequência de interesse, a reação é acoplada 
à reação da PCR convencional (RT-PCR) ou à PCR quantitativa (RT-qPCR). 
Assim, a solução é enriquecida com cópias do cDNA.
WATSON, J. D. et al. Biologia molecular do gene. 7. ed. Porto Alegre: Artmed, 2015.
WILSON, K.; WALKER, J. (Ed.). Principles and techniques of biochemistry and molecular 
biology. 7. ed. Cambridge: Cambridge University Press, 2010. Disponível em: <https://
www.kau.edu.sa/Files/0017514/Subjects/principals%20and%20techiniques%20of%20
biochemistry%20and%20molecular%20biology%207th%20ed%20wilson%20walker.
pdf>. Acesso em: 24 out. 2018.
ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M. P. (Org.). Biologia molecular básica. 4. ed. 
Porto Alegre: Artmed, 2014.
11Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Conteúdo: