2 MECANISMOS IMUNOLÓGICOS APLICADOS AO DIANÓSTICO MOLECULAR DAS DOENÇAS

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2 - Métodos e Técnicas em 
Análises Clínicas (MTANC)
Métodos de Diagnóstico Sorológico mais usados 
na rotina laboratorial
Imunologia 
 É o estudo das respostas imunológicas do organismo, ou seja, como o 
corpo se defende e responde à ação de agentes patogênicos. 
 Essa resposta se dá pela ação de células do sistema imune, que 
produzem anticorpos. 
 O sistema imunológico baseia-se nas relações Antígeno-Anticorpo.
ANTÍGENO - ANTICORPO
 Antígeno (Ag) - Substância estranha que induz uma resposta imune. 
 Anticorpo (Ac) - Proteína do soro que reage especificamente a uma 
substância estranha (antígeno); são também chamados de 
imunoglobulinas.
IMUNOGLOBULINAS
 IgA - predominante nas 
lágrimas, saliva, leite 
materno, secreções 
respiratórias e trato 
gastrointestinal. Fornece 
proteção contra organismos 
que invadem estas áreas.
 IgG - também chamada de 
gama globulina. Fornece 
imunidade a longo prazo. É 
a única que atravessa a 
placenta e fornece ao 
recém nascido a imunidade 
que vai durar vários meses.
 IgM - primeira produzida em 
resposta a um antígeno, 
mas não fornece imunidade 
a longo prazo.
 IgE - está envolvida nas 
reações alérgicas e nas 
infecções parasitárias. 
O principal uso do exame sorológico é para indicar se o organismo já teve contato com algum 
dos determinados agente infecciosos:
 IgG negativo (não reagente) e IgM negativo (não reagente): indicam que o paciente nunca 
entrou em contato com o agente patogênico (agente causador da doença), ou seja, nunca 
foi nem vacinado nem contaminado.
 IgG negativo (não reagente) e IgM positivo (reagente): indicam infecção aguda (ou seja, 
iniciada há dias ou semanas).
 IgG positivo (reagente) e IgM negativo (não reagente): indicam infecção antiga (com meses 
ou anos) ou que a pessoa foi vacinada e o organismo teve sucesso na produção de 
anticorpos.
 IgG positivo (reagente) e IgM positivo (reagente): infecção recente (semanas ou meses).
Reações Sorológicas
 Os testes sorológicos ou imunoensaios são técnicas para detecção e a 
quantificação de Ag-Ac, ou outras substancias que desempenham o 
papel do Ag no ensaio : drogas, hormônios, ácidos nucleicos, receptores 
de células, etc.
 Métodos de Reagentes não marcados
 Métodos de Reagentes marcados
Introdução
- Os testes sorológicos ou imunoensaios são técnicas
para a detecção de antígenos, anticorpos ou
substâncias que desempenhem papel de
antígenos - drogas, hormônios, ácidos nucléicos
- Utilizam reagentes não marcados (precipitação
aglutinação, floculação e complemento) ou
reagentes marcados (fluorescência,
radioimunoensaio, imunoenzimáticos)
- Cada técnica apresenta vantagens, desvantagens,
aplicação específica
- Podem ser manuais ou semi ou totalmente
automatizadas
Métodos de Imunoensaios
Reagentes não-marcados
 Precipitação
 Aglutinação
Reagentes marcados
 Radioativos
 Enzimáticos
 Fluorescentes
Quimioluminescentes
- Quantidades de Ag solúvel são adicionadas a uma
quantidade fixa de soro contendo o Ac.
Precipitado visível
Reação de precipitação
- A medida que a quantidade de Ag aumenta, a
quantidade de precipitado também aumenta até
um máximo, para depois diminuir.
Reação de precipitação em gel
Imunodifusão radial (Método de 
Mancini)
 Quantificação do Ag ou Ac-> 
utilização :dosagem de 
proteínas séricas 
 Ac incorporado ao ágar-
>diluições do Ag padrão são 
colocadas nos orifícios-
>incubação em câmara 
úmida ->precipitação-> 
formação de halos
Mede o diâmetro do halo após 
a incubação (48/72h)
Reação de precipitação 
- MANCINI
- diâmetro do halo de precipitação formado relaciona-se com a 
concentração do antígeno
- construção de curva padrão permite determinar a concentração do 
antígeno
Reação de precipitação em gel
Imunodifusão dupla
 eletroforese do Ag e do Ac, 
simultaneamente, que migram 
em direções opostas a partir 
de orifícios separados do gel.
 Utilizado para identificação 
rápida de Ag de bactérias 
associadas a meningite, 
septcemia, pneumonia, etc.
Ag e o Ac colocados nos orifícios do ágar e 
ocorre a precipitação na região de 
equivalência após a corrente eletroforética
Métodos de Reagentes não 
marcados
 Reação de Aglutinação: formação de agregados visíveis, como resultado 
da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contem 
determinantes antigênicos na sua superfície.
Reações de aglutinação
 A ligação cruzada com produção de agregados ocorre
quando um anticorpo reage com um antígeno multivalente
presente em uma partícula (insolúvel).
 A partícula insolúvel pode ser um antígeno insolúvel nativo,
antígenos expressos em células (por exemplo, antígenos
eritrocitários) ou partículas cobertas com antígenos (por
exemplo, partículas de látex)
Tipos de reação de aglutinação:
 • Aglutinação direta
 • Aglutinação indireta
Reações de aglutinação direta
 Nesta reação utilizam-se partículas antigênicas insolúveis em sua forma
íntegra ou fragmentada: hemácias, bactérias, fungos e protozoários
podem ser aglutinados diretamente por anticorpo.
 São realizadas diluições em série do anticorpo frente a uma quantidade
constante do antígeno. Após um período de incubação a aglutinação se
completa e o resultado é geralmente expresso como a máxima diluição
em que ocorre a aglutinação.
 Exemplos de reações de aglutinação direta: tipagem de grupos
sanguíneos antígenos específicos), Teste de Widal para salmoneloses,
teste de aglutinação para toxoplasmose e tripanossomíase.
A B AB O
Tipagem de Sangue – direto
(pesquisa de antígeno)
Reação de Aglutinação Passiva ou 
Indireta
 Nas reações de aglutinação passiva ou indireta, as hemácias e as
partículas inertes (bentonita, látex, leveduras, gelatina) podem ser
sensibilizadas por adsorção passiva.
 Devido à grande diversidade de antígenos que podem se ligar às células
ou partículas, a aplicação dos testes de aglutinação passiva é muito
variada.
 A prova de Waaler-Rose é uma técnica de hemaglutinação que usa uma
suspensão de hemácias de carneiro como antígeno.
 O teste do látex baseia-se na aglutinação das partículas de látex
recobertas com gamaglobulina humana quando misturadas com soro de
pacientes contendo fator reumatoide.
Aglutinação em látex
 Partículas de látex são esferas de poliestireno utilizadas como suportes na 
adsorção de proteína solúvel e antígenos polissacarídicos, funcionando 
como sistema indicador da reação antígeno-anticorpo.
 O teste pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou anticorpos. A 
aplicação mais comum é na detecção de fator reumatóide IgM, dirigido 
contra isotipos de IgG, IgA1, IgM ou IgE.
Aglutinação indireta ou passiva
- Ag solúveis adsorvidos na superfície da partículas inertes
- hemácias – hemaglutinação - um dos melhores suportes
- outros suportes: látex, carvão, gelatina e sepharose
- detecta IgG e IgM
- lâmina ou microplaca em “V” ou “U”
Uso: diagnóstico da toxoplasmose, doença de Chagas, fator reumatóide
(FR), proteína C reativa (PRC), ASLO
AGLUTINAÇÃO INDIRETA OU PASSIVA
Ac do soro
Ag solúvel 
adsorvido ao 
suporte
aglutinação
Diagnóstico da sífilis
 Testes treponêmicos
 São testes que detectam anticorpos contra antígenos do Treponema 
pallidum.
 Estes testes são qualitativos. Eles definem a presença ou ausência de 
anticorpos na amostra.
Diagnóstico da sífilis
 Testes não treponêmicos
 São testes que detectam anticorpos não treponêmicos, anteriormente
denominados anticardiolipínicos, reagínicos ou lipoídicos. Esses anticorpos não
são específicos para Treponema pallidum, porém estão presentes na sífilis. Os
testes não treponêmicos podem ser:
 qualitativos – rotineiramente utilizados como testes de triagem para determinar
se uma amostra é reagente ou não;
 quantitativos – são utilizados para determinar o título dos anticorpos presentes
nas amostras que tiveram resultado reagente no teste qualitativo e para o
monitoramentoda resposta ao tratamento. O título é indicado pela última diluição
da amostra que ainda apresenta reatividade ou floculação visível.
Apresentamos a seguir as diferentes metodologias utilizadas nos testes existentes para o 
diagnóstico da sífilis:
 Pesquisa direta do T. pallidum:Técnica Testes
Microscopia A fresco em campo escuro
Coloração (Fontana-Tribondeaux ou 
Imunfluorescência Direta)
Nos testes não treponêmicos: 
Técnica Testes
Floculação VDRL (Venereal Disease 
Laboratory) RPR (Rapid Test 
Reagin)
USR (Unheated Serum Reagin)
TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test)
Aglutinação Testes Rápidos –TR
Imunoenzimáticos (ELISA) ELISA (Enzyme – linked immunossorbent assay)
Imunocromatográficos Testes Rápidos –TR
Apresentamos a seguir as diferentes metodologias utilizadas nos testes existentes 
para o diagnóstico da sífilis:
 Nos testes treponêmicos:
Técnica Testes
Imunofluorescência indireta FTA-abs (Fluorescent treponemal antibody 
absorption)
Hemaglutinação MHA-TP (microhemaglutinação para Treponema 
pallidum)
Aglutinação departículas TPPA(Treponema pallidum particle agglutination
assay)
Imunoenzimáticose
suas variações
ELISA (Enzyme-linked immunossorbent assay),
CMIA (Ensaio imunológico 
quimioluminescente magnético)
Imunocromatografia Testes rápidos
Testes moleculares Reação de amplificação do DNA da bactéria como
a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
Aglutinação/Hemaglutinação
Quando o antígeno é um eritrócito é usado o termo
hemaglutinação.
Teste de inibição de hemaglutinação direta
Teste de aglutinação passiva ou indireta
Hemaglutinação (HA) 
 Reação que gera agregação de eritrócitos devido à presença de
anticorpos (ou vírus ou lecitinas).
 Hemácias sensibilizadas por antígenos específicos para um patógeno são
usadas para testar o soro do paciente.
 Quando na ausência de agente hemaglutinante (anticorpo), as
hemáceas sedimentam na forma de botão e quando há aglutinação as
hemáceas sedimentam na forma de tapete (difusa).
Teste de inibiça ̃o de hemaglutinaça ̃o direta
 A inibiça ̃o da hemaglutinação direta baseia-se na capacidade que certos
anti ́genos virais têm de, espontaneamente, aglutinar certos tipos de hema ́cias.
 Os anticorpos, se presentes na amostra, revestem as parti ́culas virais, o que
resulta na inibição da aglutinação, indicando teste positivo para a presença
de anticorpos.
 Esses testes não distinguem entre IgG e IgM. Esse método é usado para
detectar anticorpos contra os vi ́rus da rubéola, sarampo, influenza e certos
enterovi ́rus.
Teste de aglutinaça ̃o passiva ou indireta
 Para o teste de aglutinação passiva, as hemácias e as parti ́culas inertes, como látex
(poli ́mero de poliestireno), bentonita, sepharose, colódio, charcoal, leveduras etc. podem
ser sensiblizadas por adsorção passiva, devida ao contato direto com os anti ́genos
solúveis, por adsorc ̧ão via agentes qui ́micos, como ácido tânico e cloreto de cromo, e
por conjugação do anti ́geno por meio de ligações qui ́micas covalentes, fornecendo
reagentes estáveis.
 Devido à grande diversidade de anti ́genos que podem se ligar às células ou parti ́culas, a
aplicação dos testes de aglutinação passiva e ́ muito variada.
 Há vários sistemas comerciais para a pesquisa de anticorpos que utilizam essa técnica,
entre eles, os sistemas de Trypanosoma cruzi, Treponema pallidum, Toxoplasma gondii etc.
HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA
Ac do soro
Ag solúvel 
adsorvido ao 
suporte 
(hemácia)
aglutinação
Métodos de Reagentes marcados
 Detectam e quantificam diretamente a ligação Ag-Ac
 Radioimunoensaio (RIA)
 ELISA
 Imunofluorescência
 Imunoblotting (Western Blott)
Métodos de Reagentes marcados
Sensível para análise quantitativa das 
reações Ag-Ac. 
Moléculas marcadas com Isótopo 
(hormônio, proteínas séricas, 
drogas)
Detecção de insulina
 O radioimunoensaio e ́ um dos 
me ́todos mais sensi ́veis para a 
análise quantitativa das reac ̧ões
anti ́geno-anticorpo.
 Radioimunoensaio (RIA)
 O radioimunoensaio tem
aplicação muito ampla na toxico-
logia, farmacologia,
endocrinologia, imunologia etc.
Pode ser utilizado para quantificar
hormônios, fármacos, substâncias
ilícitas, marcadores tumorais,
alergênios e anticorpos associa-
dos a ̀ alergia, e anti ́genos e
anticorpos em infecções por vi ́rus,
bactérias etc. Há muitas
variações, mas o princi ́pio é o
mesmo: a quantidade de
reagente marcado (anti ́geno ou
anticorpo) quantifica o anti ́geno
ou o anticorpo não marcado na
amostra.
Radioimunoensaios
Utilizam Ac conjugados com radioisótopos para quantificar os ensaios.
• Vantagens:
– Alta sensibilidade
– Permite medidas rápidas e precisas
• Desvantagens:
– Custo
– Vida média dos reagentes
– Risco operacional (radiação)
RIA
 Radioimunoensaios (RIA) são ensaios baseados na medição da
radioatividade associada com complexos imunes. Em um teste particular,
o marcador pode ser tanto o antígeno como anticorpo.
 Trata-se de uma técnica com alta especificidade e sensibilidade, porém
com elevado custo e grande risco operacional por manipular material
radioativo.
Esquema mostrando como funciona o 
Radioimunoensaio
Fluorescência e Imunoflorescência (IF)
Fluorescência e Imunoflorescência (IF)
Fluorescência é um processo onde um elemento
chamado fluorocromo absorve energia na forma de
espectro luminoso, tornando-se eletricamente
“excitado”; ao liberar essa energia emitem luz num
comprimento de onda específico. A
imunofluorescência é uma técnica baseada na
ligação de anticorpos com fluorocromos.
Fluorescência e Imunoflorescência (IF)
 A imunofluorescência pode ser direta ou indireta.
 Na IF direta detecta-se o antígeno pesquisado propriamente dito:
coloca-se a amostra a ser analisada numa placa especifica para
fluorescência, a seguir, adiciona-se o conjugado (anticorpo específico
marcado com fluorocromo).
 Na IF indireta a placa de fluorescência já vem com antígenos
específicos, testa-se o soro do paciente e depois adiciona-se um anti-
anticorpo marcado com fluorocromo.
 Na imunofluorescência indireta, o anticorpo específico para o
antígeno não é marcado e um segundo anticorpo anti-imunoglobulina
dirigido ao primeiro anticorpo é marcado com o fluorocromo.
 Fluorescência indireta é mais sensível do que a imunofluorescência
direta, uma vez que há amplificação do sinal.
RevelaçãoIFD - Amostra a ser pesquisada adição do anticorpo marcado
(biópsia de tumor por exemplo) 
Revelação
Adição do
anti-
anticorpo
IFI
adição do soro contendo anticorpos
do paciente
Placa contendo antígenos específicos
Revelação
Imunofluorescência
- Utilizam-se Ac ou Ag conjugados a moléculas reveladoras
chamadas fluorocromos.
- Visualização em microscópio de fluorescência
Imunofluorescência Direta
Aplicações:
- Detecção direta de microrganismos 
(secreções, urina, cortes de tecidos); 
- Identificação de subpopulações de 
linfócitos;
- Fenotipagem de células tumorais
Ex.: Detecção de Chlamydia trachomatis
em secreção uretral
A principal aplicação da imunofluorescência direta ocorre 
na imunocitoquímica, na demonstração de vários
antígenos de células e tecidos, principalmente nas 
doenças imunológicas renais e de pele.
Ex.: Detecção de Ac anti- T. cruzi
Aplicações:
- Detecção de anticorpos específicos contra 
diversos microrganismos; 
- Diagnóstico de doenças auto-imunes; 
Detecção de Ac anti-nuclear
Imunofluorescência Indireta
QUIMIOLUMINESCENTE AUTOMATIZADO
 Necessidade da introdução de um novo teste na triagem sorológica,
deve-se ter assegurado a disponibilidade de aquisição no mercado,
registro no Ministério da Saúde, equipamentos e treinamentos necessários.
Imunoensaio de micropartículas (MEIA)
 A tecnologia MEIA , caracteriza-se por um ensaio imunoenzimático com a
fase sólida sendo constituída de partículas de látex revestidas com
molécula de captura específica para o analito a ser determinado.O
conjugado marcado com fosfatase alcalina catalisa a hidrólise do
substrato 4-metilumbeliferil fosfato (MUP) em produto fluorescente 4 metil-
umbeliferona após excitação por fonte de luz, com captação pelo
sistema óptico do equipamento, proporcional à quantidade do analito da
amostra. O complexo imune fica retido em uma célula-matriz de fibra de
vidro onde ocorrem todas as etapas de lavagem, adição do substrato e
leitura.
 Exemplo: As amostras de rotina foram submetidas aos ensaios de triagem
sorológica para detecção de HBsAg, anti-HBc, anti-HCV e HIV
Imunoensaio Quimioluminescente de 
Micropartículas (CMIA)
 A reação CMIA envolve a interação de micropartículas magnéticas
revestidas com molécula de captura do analito desejado (antígeno ou
anticorpo), conjugado rotulado com acridina – um composto
quimioluminescente - e soluções ativadoras de H2O2 (pré-ativador) e
NAOH (ativador) que promovem a reação química com liberação de
fóton captado pelo equipamento.
 
Química Seca
 Processo em que não existe despejo de resíduos contaminados no meio 
ambiente, pois não utiliza água na execução dos exames. 
 Os reagentes ficam dispostos em 6 camadas numa placa de vidro e à 
medida que a amostra vai passando por elas, as reações químicas vão se 
procedendo. Os dejetos produzidos ficam contidos nas placas de vidro 
que podem ser autoclavados pós uso. 
 Requer pequena quantidade de amostra (cerca de 10 mL), calibragem 
reduzida (apenas 2 por ano), alta taxa de precisão e rapidez e cobre cerca 
de 95% dos testes laboratoriais em bioquímica.
 A análise se dá por reflectância (processo luminoso): os reagentes são 
dispostos em multicamadas nas lâminas de vidro e à medida que a amostra 
entra em contato com as lâminas, ocorrem reações em multicamadas e a 
luz incidida é transformada em voltagem que gera o resultado solicitado. 
 O Sistema Vitros da Johnson & Johnson Produtos Profissionais é um dos 
mais utilizados no processo.
Colorimetria
 Método de análise quantitativa que se baseia na comparação da cor
produzida por uma reação química com uma cor padrão. De acordo com a
intensidade da cor produzida, infere-se a concentração do determinado
analito (substância que se quer analisar).
 O método mais seguro de se verificar a coloração de uma reação é
através do uso do espectrofotômetro, que compara a intensidade de cor
com uma cor padrão, chamada de “branco” (solução padrão em que o
espectrofotômetro é zerado).
 É o método mais usado em análises laboratoriais de bioquímica clínica.
 EX:CREATININA, soro Método: Cinético colorimétrico

Nefolometria
 A Nefelometria é uma técnica para medir as concentrações de Ig A, Ig M e Ig
G e outras proteínas plasmáticas de uma amostra. Um aparelho específico que
mede a turbidez é utilizado e mede a difração (desvio) da luz ao passar por
uma solução contendo complexos imunológicos.
 Já a Imunoturbidimetria mede a diminuição da luz ao passar por um complexo
antígeno-anticorpo, em outras palavras, a turbidimetria mede o quanto a
solução antígeno-anticorpo absorve da luz e o quanto ela deixa passar. Essa
técnica, assim como a nefelometria, é usada para medir a concentração
plasmática de diversas proteínas.
 Na nefelometria a luz difundida ou seja aquela que atravessa a solução é
medida, enquanto que na turbidimetria a luz não difundida (a absorvida) é
medida.
 muito usada em laboratórios de análises clínicas/ proteína C reativa
ultrassensível e fator reumatóide.
Princípio
partículas em suspensão – desvio de luz incidida
dispersão de luz incidente quantificada por um detector
Fonte de luz
Suspensão de Ac 
e Ag diluídos
Raios de luz 
focados
Raios de luz 
desviados e 
refletidos
Detector
Técnicas Imunoenzimaticas
 São baseadas na utilização de Ag ou Ac marcados com enzimas e
permitem a detecção, titulação e quantificação de substancias de
interesse biológicos.
Eletroquimioluminescência
 Utiliza a emissão de luz através da aplicação de potenciais de oxidação
ou redução a um eletrodo imerso em soluções que emitem radiação (em
geral compostos de rutênio).
 Por fim, há uma aplicação de corrente elétrica no eletrodo que induz uma
emissão quimioluminescente, medida por um fotomultiplicador.
 baseados na força da ligação de um anticorpo com o antígeno ("alvo")
que ele reconhece. E a maneira que esses testes utilizam para detectar a
ocorrência dessa ligação é através de um sistema que permita gerar
luminosidade (daí o nome "luminescência")
 Quanto mais positiva for amostra (vamos entender assim), mais ligações
ocorrerão entre os anticorpos e seus antígenos ali presentes, e com isso,
mais luminosidade será gerada.
 na Eletroquimioluminescência, a emissão de luz é deflagrada mediante a
aplicação de uma corrente elétrica sobre a amostra.
 EX: FERRITINA, soro Método: Eletroquimioluminométrico
 HORMONIO TIROESTIMULANTE (TSH), soro 
Método: Ensaio eletroquimioluminométrico
Eletroquimioluminescência
Imunoblot (Western Blot)
 O teste é utilizado como um valioso recurso na caracterização de frações
antigênicas imunodominantes e identificação da reatividade específica de
anticorpos detectados por um teste de triagem utilizando múltiplas frações
antigênicas (teste confirmatório ou suplementar).
 Para a detecção da interação antígeno-anticorpo é necessário em primeiro
lugar a obtenção da membrana com as frações da misturantigênica, onde as
proteínas são separadas de acordo com o seu tamanho, através de eletroforese
em gel de poliacrilamida .
 Depois de separadas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose
onde ficam inertes e posteriormente serão utilizadas como suporte para a
detecção da interação antígeno-anticorpo.
Imunoblot (Western Blot)
 Cultiva em células o agente viral >> as proteínas do HIV-1 são fracionadas 
de acordo com seu peso molecular (eletroforese) >> as proteínas 
separadas são eletrotransferidas do gel para membrana de nitrocelulose.
Reação de Imunoblot com a tira de nitrocelulose 
mostrando bandas (positividade para o anticorpo 
pesquisado)
PADRÃO INTERPRETAÇÃO
Ausência da bandas Negativo 
Presença de alguma 
banda sem atender ao 
critério de POSITIVO 
Indeterminado 
Duas ou mais bandas das 
seguintes alternativas: 
p24, gp41 e gp120/160. 
Cada banda com 
reatividade maior ou 
igual ao padrão positivo. 
Comumente a banda 
para gp41 ou gp160 é 
difusa. Outras bandas 
poderão ou não estar 
presentes. 
Positivo 
Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
 • Primeiro exame amplamente empregado para diagnóstico. 
 • Alta sensibilidade (triagem) acima de 98%. 
 • Uma placa à 96 amostras. 
 • Método: Baseia-se na ligação do anticorpo (soro) com o antígeno da 
placa usando enzimas.
 Ensaios enzimáticos de Imunoabsorção (ELISA) são aqueles que são 
baseados na medição de uma reação enzimática associada com 
complexos imunes. Em um teste em particular, a enzima deve esta ligada 
ao antígeno ou ao anticorpo. 
ELISA (Enzyme Linked Immuosorbet
Assay) 
 O princípio básico do ELISA é a imobilização de um dos reagentes em uma
fase sólida (placa), enquanto outro reagente é ligado a uma enzima, com
preservação da atividade enzimática e da atividade imunológica do
anticorpo.
 O teste pode detectar quantidades pequenas de antígenos ou anticorpos
e tem elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do teste forem
bem padronizados. No final do processo, o resultado positivo é revelado
pela cor.
 Método
 • Baseia-se na ligação do anticorpo (soro) com o antígeno da placa
USANDO ENZIMA
• Baseia-se na identificação de anticorpos e/ou
antígenos, por anticorpos marcados com uma
enzima, de maneira que esta enzima age sobre
um substrato e a reação faz com que o
cromógeno mude de cor
➢ Tipos de ELISA:
indireto, direto,
ELISA
O antígeno é imobilizado em uma superfície sólida e 
depois forma-se o complexo com um anticorpo que está 
ligado a uma enzima. A detecção é realizadaavaliando a 
atividade da enzima conjugada pela incubação com um 
substrato que produza um produto mensurável.
Etapas 
 O teste de ELISA começa na etapa de revestimento, na qual a primeira 
camada com um antígeno ou anticorpo alvo é adsorvida em uma placa 
de poliestireno de 96 poços.
 A segunda etapa é a de bloqueio, na qual todos os locais não ligados são 
revestidos com um agente de bloqueio.
 Após uma série de lavagens, a placa é incubada com um anticorpo 
conjugado a uma enzima.
 Outra série de lavagens remove todos os anticorpos não ligados.
 Um substrato é adicionado, produzindo um sinal calorimétrico.
 Finalmente, o teste na placa está pronto para ser lido.
Bancada no laboratório com amostras 
sendo preparadas para sorologia
Avaliação dos resultados
 O teste de ELISA pode produzir três tipos diferentes de resultados:
 Quantitativo: os dados podem ser interpretados em comparação com 
uma curva padrão (uma diluição em série de um antígeno purificado) 
para calcular com precisão as concentrações de antígeno em várias 
amostras.
 Qualitativo: para indicar se um antígeno específico está presente em uma 
amostra, em comparação com uma cavidade que não contenha 
antígeno, por exemplo.
Métodos de Biologia Molecular
 A) métodos que amplificam a sequencia alvo, aumentando a 
probabilidade de hibridização com a sonda específica e resultados em 
maior sensibilidade ( PCR, NASBA ou LCR)
 B) Métodos que amplificam o sinal obtido após ter ocorrido a hibridização 
com a sonda específica (b-DNA, captura híbrica)
• PCR, Nested PCR, multiplex PCR
• RT-PCR
• Real-time PCR
• Sequenciamento
• Alia alta sensibilidade e especificidade
• Rápida e automatizável
Detecção de ácidos nucleicos
PCR – Reação em Cadeia de 
Polimerase
 PCR: milhões de cópias de um segmento específico de DNA
na presença da enzima DNA polimerase. Um ciclo de PCR
envolve 3 etapas: desnaturação, anelamento e extensão.
 Desnaturação ( dupla fita de DNA é desnaturada a temp. Î
94ºC, originando 2 fitas de DNA)->Anelamento temperatura é
reduzida (os primers se hibridizam com sua sequencia
complementar, localizadas no DNA alvo->Extensão (
temperatura é elevada a 72ºC, enzima DNA polimerase ela
faça a extensão desse primers e adicione nucleotídeos
utilizando como molde a sequencia do DNA alvo, fazendo
cópias dessa sequencia.
Etapas gerais (simplificada) do PCR. 
PCR (Reação em cadeia da polimerase)
Técnica de amplificação do DNA que mimetiza o que ocorre no nosso corpo.
DNA → DNA → RNA → PROTEÍNA
Replicação Transcrição Tradução
PCR Convencional
Receita:
 Primers (Foward e Reverse)
 dNTPs (Desoxirribonucleotídeos fosfatados)
dATPs, dTTPs, dGTPs, dCTPs
 Taq polimerase
 Cofator da Taq (MgCl2)
 Água
 DNA
PCR Convencional
● Ciclagem
Desnaturação inicial 95ºC - 10min
Desnaturação 95ºC - 45seg
Anelamento X - 45seg 40x
Extensão 72ºC - 45seg
Extensão final 72ºC - 10min
Manutenção 4ºC - ∞
Eletroforese em gel de agarose
Eletroforese em gel de agarose
Eletroforese em gel de agarose
• Detecção da amplificação associada a 
cada ciclo durante a PCR
• Quantificação do DNA ou RNA viral 
(cDNA)
• Ciclos ultra-rápidos (30 min a 2 horas)
• Nenhuma análise no final da reação de 
PCR
Real time PCR
RT-PCR/ covid
 Considerado o “padrão ouro” ou “padrão de referência”, o RT-PCR é o
exame que identifica o vírus e confirma a covid-19. Para isso, o teste busca
detectar o RNA do vírus através da amplificação do ácido nucleico pela
reação em cadeia da polimerase.
entre o 3º e 4º do inicio do sintomas
7 dias após a primeira coleta
10 dias da primeira coleta
 RT-PCR para SARS-CoV-2 em swab combinado de naso/orofaringe ou nasofaringe: é um teste molecular,
ou seja, baseado na pesquisa do material genético do vírus (RNA) em amostras coletadas por swab da
nasofaringe e orofaringe. É considerado o exame laboratorial padrão-ouro para diagnóstico da infecção.
Ele pode ser encontrado nas versões convencional (prazo de realização de pelo menos 24h) e na versão
POCT (point of care testing, com prazo de realização de poucas horas).
 RT-LAMP para SARS-CoV-2: é outro teste molecular, ou seja, que pesquisa o RNA do vírus, mas este por
amplificação isotérmica. A coleta também é realizada por swab de nasofaringe e sua sensibilidade é
ligeiramente inferior ao RT-PCR de nasofaringe (variável entre 76-97%, sendo mais elevada nos dias
iniciais dos sintomas). A principal vantagem é a rapidez do resultado, sendo o método atual de análise
mais rápida.
 RT-PCR para SARS-CoV-2 em saliva: é o teste de RT-PCR, porém em amostra de saliva. Sua principal
vantagem é a facilidade da coleta, o que permite sua realização de maneira recorrente ou por pessoas
com restrição para coleta de nasofaringe. Sua sensibilidade é um pouco inferior ao RT-PCR de
nasofaringe: a sensibilidade geral é de 78%, variando nos 7 primeiros dias de sintomas entre 84-92% em
comparação com o RT-PCR de nasofaringe.
 Pesquisa do Antígeno de SARS-CoV-2: é um teste imunológico baseado no reconhecimento do antígeno
(uma parte da estrutura do vírus) em amostras coletadas por swab de nasofaringe. Sua principal
vantagem é apresentar resultados rapidamente, por um custo mais baixo. Sua sensibilidade é inferior ao
RT-PCR de nasofaringe com sensibilidade geral variando entre 74-85%. Se utilizada na primeira semana
de sintomas (idealmente primeiros dias), a sensibilidade alcança 90%, comparada ao RT-PCR de
nasofaringe.
Biomedico - cetesb
 A cada ciclo da reação em polimerização em cadeia (PCR) ocorre 
sequencialmente: 
 (A) detecção, desnaturação e mutação. 
 (B) polimerização, restrição e desnaturação.
 (C) mutação, detecção e pareamento. 
 (D) restrição, polimerização e detecção. 
 (E) desnaturação, pareamento e polimerização.
Biomedico - cetesb
 A cada ciclo da reação em polimerização em cadeia (PCR) ocorre 
sequencialmente: 
 (A) detecção, desnaturação e mutação. 
 (B) polimerização, restrição e desnaturação.
 (C) mutação, detecção e pareamento. 
 (D) restrição, polimerização e detecção. 
 (E) desnaturação, pareamento e polimerização.
Biomedico - cetesb
 Sobre o teste imunoenzimático chamado ELISA, é correto afirmar que
 (A) requer como reagente um anticorpo anti-imunoglobulina ligado
covalentemente ao substrato enzimático.
 (B) trata-se de uma técnica que permite a dosagem de anticorpos, mas
não de antígenos.
 (C) trata-se de uma técnica que dispensa a construção de curva padrão.
 (D) no caso de uma reação negativa, todos os anticorpos secundários são
removidos do poço pela solução de lavagem.
 (E) requer um aparelho leitor de ELISA, que é um polarímetro
especializado para ler placas multipoços, para a etapa final da técnica.
Biomedico - cetesb
 Sobre o teste imunoenzimático chamado ELISA, é correto afirmar que
 (A) requer como reagente um anticorpo anti-imunoglobulina ligado
covalentemente ao substrato enzimático.
 (B) trata-se de uma técnica que permite a dosagem de anticorpos, mas
não de antígenos.
 (C) trata-se de uma técnica que dispensa a construção de curva padrão.
 (D) no caso de uma reação negativa, todos os anticorpos secundários são
removidos do poço pela solução de lavagem.
 (E) requer um aparelho leitor de ELISA, que é um polarímetro
especializado para ler placas multipoços, para a etapa final da técnica.
Biomedico-alagoas
 O teste de imunofluorescência é muito utilizado no diagnóstico de laboratório para 
pesquisa de anticorpos e, com anticorpos monoclonais, para pesquisa de micro-
organismos e seus componentes em espécimes clínicas. Sobre as reações de 
imunofluorescência, assinale a alternativa correta. 
 A) A imunofluorescência indireta detecta somente antígenos. 
 B) A técnica de imunofluorescência é pouco reprodutível e pouco específica. 
 C) É necessário o uso de um quartoanticorpo associado ao composto fluorescente 
na imunofluorescência direta. 
 D) É necessário o uso de um segundo anticorpo associado ao composto 
fluorescente na imunofluorescência indireta. 
 E) A imunofluorescência direta é não muito empregada, pois não possui 
comparação com a imunofluorescência indireta.
Biomedico-alagoas
 O teste de imunofluorescência é muito utilizado no diagnóstico de laboratório para 
pesquisa de anticorpos e, com anticorpos monoclonais, para pesquisa de micro-
organismos e seus componentes em espécimes clínicas. Sobre as reações de 
imunofluorescência, assinale a alternativa correta. 
 A) A imunofluorescência indireta detecta somente antígenos. 
 B) A técnica de imunofluorescência é pouco reprodutível e pouco específica. 
 C) É necessário o uso de um quarto anticorpo associado ao composto fluorescente 
na imunofluorescência direta. 
 D) É necessário o uso de um segundo anticorpo associado ao composto 
fluorescente na imunofluorescência indireta. 
 E) A imunofluorescência direta é não muito empregada, pois não possui 
comparação com a imunofluorescência indireta.
Biomedico alagoas
 A distribuição do HIV-1 e HIV-2 apresenta-se de forma distinta. O HIV-1 encontra-
se distribuído por todos os países do mundo, enquanto o HIV-2 tem sido isolado,
principalmente, na África Ocidental. Estudos epidemiológicos sugerem que o
período de incubação do HIV-2 é maior do que o HIV-1, havendo maior dificuldade
de transmissão do HIV-2 quando comparado com o HIV-1. Assinale, a seguir, as
formas de diagnóstico laboratorial para confirmação da infecção por HIV
amplamente utilizadas.
 A) PCR e NASBA-QT.
B) Western blot e ELISA.
C) Elisa e imunocromatografia.
 D) Western blot e imunocromatografia.
 E) Testes imunocromatográficos rápidos.
Biomedico alagoas
 A distribuição do HIV-1 e HIV-2 apresenta-se de forma distinta. O HIV-1 encontra-
se distribuído por todos os países do mundo, enquanto o HIV-2 tem sido isolado,
principalmente, na África Ocidental. Estudos epidemiológicos sugerem que o
período de incubação do HIV-2 é maior do que o HIV-1, havendo maior dificuldade
de transmissão do HIV-2 quando comparado com o HIV-1. Assinale, a seguir, as
formas de diagnóstico laboratorial para confirmação da infecção por HIV
amplamente utilizadas.
 A) PCR e NASBA-QT.
B) Western blot e ELISA.
C) Elisa e imunocromatografia.
 D) Western blot e imunocromatografia.
 E) Testes imunocromatográficos rápidos.
Biologista-bauru
 “Prova usada para o diagnóstico da artrite reumatoide, pela aglutinação
de hemácias de carneiro, sensibilizadas: o soro de paciente com artrite
reumatoide é capaz de aglutinar hemácias de carneiro sensibilizadas com
hemolisina, devido a um fator, chamado de fator reumatoide”. Nesse
contexto, assinale a alternativa que se relaciona a essa prova:
 A) Prova de Waaler-Rose.
 B) Prova de Middlebrook Dubos.
 C) Prova do látex.
 D) Prova em papel de filtro.
 E) Prova de inibição da hemaglutinação.
Biologista-bauru
 “Prova usada para o diagnóstico da artrite reumatoide, pela aglutinação
de hemácias de carneiro, sensibilizadas: o soro de paciente com artrite
reumatoide é capaz de aglutinar hemácias de carneiro sensibilizadas com
hemolisina, devido a um fator, chamado de fator reumatoide”. Nesse
contexto, assinale a alternativa que se relaciona a essa prova:
 A) Prova de Waaler-Rose.
 B) Prova de Middlebrook Dubos.
 C) Prova do látex.
 D) Prova em papel de filtro.
 E) Prova de inibição da hemaglutinação.
Referências Bibliográficas
FERREIRA, AW & ÁVILA, SL Diagnóstico Laboratorial 
das Principais Doenças Infecciosas e Auto-
Imunes, 2001.Cap 2 e3 
Diagno ́stico Laboratorial das Principais Doenc ̧as
Infecciosas e Autoimunes. Autores:Antonio
Walter Ferreira e Sandra do Lago Moraes. Minha 
biblioteca (ava)
OBRIGADA!