Expressão e purificação do alvo molecular

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Autor: Lucas Luiz Vieira 
Orientadora: Prof
a
. Dra. Maria Sueli Soares Felipe 
Co-orientadora: Prof
a
. Dra. Ana Karina Rodrigues Abadio 
 
Brasília - DF 
2016 
 
 
 
Pró-Reitoria Acadêmica 
Escola de Saúde e Medicina 
Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e 
Biotecnologia 
 
 
EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DO ALVO MOLECULAR RIM8 
VISANDO O DESENVOLVIMENTO DE NOVAS DROGAS 
ANTIFÚNGICAS 
 
 
 
 
LUCAS LUIZ VIEIRA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DO ALVO MOLECULAR RIM8 VISANDO O 
DESENVOLVIMENTO DE NOVAS DROGAS ANTIFÚNGICAS 
 
 
 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação Stricto Sensu em Ciências 
Genômicas e Biotecnologia da Universidade 
Católica de Brasília como requisito parcial 
para a obtenção do título de mestre em 
Ciências Genômicas e Biotecnologia. 
 
Orientadora: Prof
a
. Dra. Maria Sueli Soares 
Felipe 
 
Co-orientadora: Prof
a
. Dra. Ana Karina 
Rodrigues Abadio 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Brasília 
2016 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ficha elaborada pela Biblioteca Pós-Graduação da UCB 
 
V658e Vieira, Lucas Luiz. 
Expressão e purificação do alvo molecular Rim8 visando o 
desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. / Lucas Luiz Vieira – 2016. 
115 f.; il.: 30 cm 
 
Dissertação (Mestrado) – Universidade Católica de Brasília, 2016. 
Orientação: Profa. Dra. Maria Sueli Soares Felipe. 
Coorientação: Profa. Dra. Ana Karina Rodrigues Abadio 
 
1. Micoses sistêmicas. 2. Paracoccidioides spp. 3. Alvo molecular Rim8. 
4. Drogas antifúngicas. 5. Produção de proteínas recombinantes. I. Felipe, 
Maria Sueli Soares, orient. II. Abadio, Ana Karina Rodrigues, coorient. III. 
Título. 
 
 
CDU 606 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabalho à minha família, que 
sempre acreditou em mim e me encorajou a 
perseguir meus sonhos. Em especial ao meu 
avô, Fernando, o qual demonstrava, com seu 
jeito brincalhão, grande admiração e felicidade 
em cada uma de minhas conquistas 
acadêmicas. 
 
 
AGRADECIMENTO 
 
 
Agradeço primeiramente a Deus, que me ama incondicionalmente, me deu forças e me 
segurou em Suas mãos para enfrentar situações nas quais minhas limitações humanas não me 
permitiam avançar. É Ele o meu socorro na hora da angústia, o alimento da minha alma e o 
meu sustento. 
Também agradeço à minha família, especialmente minha mãe, pai e irmão... Amo 
vocês! Conscientemente, sacrifiquei por este trabalho acadêmico o tempo que poderia ter 
dedicado a vocês, mas acredito ter sido uma boa causa. Mãe, o seu amor, cuidado, as palavras 
de apoio, as nossas conversas e risadas foram essenciais para a minha formação e foram, por 
muitas vezes, combustível para a minha vontade de continuar nessa empreitada. Obrigado por 
ser esse exemplo de determinação e superação, mãezinha. Pai, agradeço a preocupação 
comigo, o incentivo durante toda a vida e, principalmente, agradeço por ter aceitado tão bem 
os vários “nãos” que tive de dar aos convites de viagens e momentos de lazer em família. 
Espero estar mais perto de você de agora em diante. Lipe, meu “rimão”, obrigado por sempre 
estar comigo, me defender, me apoiar, me fazer sorrir e até por me irritar. Agradeço por se 
importar comigo e com meu trabalho, por se esforçar para entender meus experimentos e 
achar tudo interessante mesmo sendo tão longe da sua realidade. Mesmo com toda minha 
chatice e esquisitice, você sempre foi um exemplo pra mim. 
Diane, meu amor e melhor amiga, você é um presente de Deus para a minha vida. 
Agradeço a você pelo carinho, paciência, afeto, colo, companheirismo, preocupação, 
discussões acadêmicas e pelas conversas engrandecedoras. Você é uma pessoa maravilhosa e 
cativa todos à sua volta com sua amabilidade, além de ser uma excelente cientista. Saiba que 
você me motiva a me tornar uma pessoa melhor a cada dia e que esse trabalho não seria o 
mesmo sem o seu apoio. Estar com você me traz paz mesmo nos momentos de desespero. 
Espero compartilhar muitos e muitos anos de minha vida com você. Agradeço também à sua 
família, que sempre me acolheu e me faz sentir como parte dela. Um obrigado especial à Rosa 
pelos conselhos, puxões de orelha e o cuidado maternal que tem por mim. 
Agradeço a todos os meus amigos e colegas, que me incentivaram, apoiaram, 
aguentaram minhas lamentações e também ouviram muitos “não, hoje não dá” de minha 
parte, mas ainda assim, torciam muito por mim nessa jornada. Não vou citar nomes para não 
cair nas armadilhas de minha memória, mas cada um de vocês, sejam do colégio, faculdade, 
dos laboratórios da UCB, UnB ou HUB, tiveram sua parcela de contribuição para tornar esse 
 
 
trabalho possível. Tanto as discussões quanto os momentos de descontração com vocês foram 
essenciais para o meu crescimento e lucidez durante essa caminhada. Peço perdão pelos 
momentos de descontrole que posso ter tido com qualquer um de vocês... Obrigado por não 
desistirem de mim! 
Agradeço às professoras Maria Sueli e Ana Karina pela paciência na orientação, pelos 
ensinamentos, as discussões e a confiança em meu trabalho, tornando possível a sua 
realização. 
Agradeço também a todos os professores que, de alguma forma, ajudaram na minha formação 
acadêmica e na realização deste trabalho. Um obrigado especial aos membros participantes da 
banca de defesa (prof.
as
 Cristine, Patrícia e Rosângela) por terem aceitado participar desse 
momento especial. Ao prof. André Nicola por diversos experimentos, aulas, sugestões e pelas 
conversas bastante enriquecedoras; à prof.
a
 Larissa Matos pelas análises de DNA, conselhos 
profissionais, conversas amigáveis e até pelos puxões de orelha quando mereci; aos profs.
 
Beatriz, João Alexandre e Napoleão pela ajuda e pelos “pitacos” para a melhora do trabalho. 
Agradeço à Universidade Católica de Brasília por ter me dado a oportunidade de 
continuar aprendendo e poder vislumbrar novos horizontes. Seus colaboradores sempre foram 
muito solícitos e, em certos momentos, companheiros noturnos de trabalho. À Universidade 
de Brasília, onde pude realizar a maior parte de meus experimentos e conhecer pessoas 
maravilhosas. Finalmente, agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e 
Tecnológico (CNPq), Fundação de Apoio à Pesquisa do DF (FAP-DF) pelo apoio financeiro 
sem o qual este trabalho não teria sido desenvolvido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Bem-aventurado o homem que acha sabedoria, 
e o homem que adquire conhecimento; pois 
melhor é o lucro que ela dá do que o da prata, 
e melhor a sua renda do que o ouro mais fino. 
Mais preciosa é do que os rubis, e tudo o que 
mais possas desejar não se pode comparar a 
ela. 
Provérbios 3:13-15 
 
 
RESUMO 
 
 
Referência: VIEIRA, Lucas Luiz. EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DO ALVO 
MOLECULAR RIM8 VISANDO O DESENVOLVIMENTO DE NOVAS DROGAS 
ANTIFÚNGICAS. 2016. 115 folhas. Dissertação (Mestrado em Ciências Genômicas e 
Biotecnologia). Universidade Católica de Brasília, Brasília-DF, 2016. 
 
Infecções fúngicas invasivas são um problema de saúde pública no mundo, já que aumentam a 
morbidade e o tempo de internação de pacientes. A micose sistêmica com o maior índice de 
mortalidade no Brasil, onde é considerada endêmica, é a paracoccidioidomicose, causada pelo 
fungo dimórfico Paracoccidioides spp. A tendência global de aumento da resistência aos 
agentes antifúngicos disponíveis comercialmente, o espectro limitado de atividade contra 
alguns fungos patogênicos e a preocupação com a toxicidade são evidências da necessidade 
de novas estratégias terapêuticas, sobretudo dodesenvolvimento de novas drogas 
antifúngicas. Nesse sentido, o gene essencial rim8 foi identificado por genômica comparativa 
como uma sequência ortóloga no genoma de fungos patogênicos humanos e ausente em 
humanos. Em fungos filamentosos e leveduras, a regulação da expressão gênica pelo pH 
envolve componentes de uma via de sinalização que levam à ativação proteolítica do fator de 
transcrição PacC/Rim101 em resposta à alcalinização do pH externo. O gene rim8 em 
leveduras ou palF em fungos filamentosos possui um papel essencial nessa cascata de 
sinalização, sendo importante para a interação patógeno-hospedeiro, aumento de virulência e 
sobrevivência do patógeno. Por isso, Rim8 é um alvo molecular promissor e bastante 
interessante para o desenvolvimento de drogas. O objetivo deste trabalho é otimizar a 
expressão heteróloga e purificação da proteína Rim8 de P. lutzii, visando realizar a 
caracterização estrutural e funcional da proteína para futuramente utilizá-la como alvo 
molecular para o desenvolvimento de drogas. O gene rim8 foi sintetizado quimicamente com 
cauda de histidinas e foi clonado em vetor pET-21a. A expressão heteróloga do gene foi 
padronizada usando duas estirpes de E. coli, obtendo as melhores condições para purificação 
com o uso de meio LB contendo 0,5% de glicose a 30°C por 2 h e 0,25 mM de IPTG e 
coquetel de inibidores de proteases. Os resultados da expressão e purificação foram analisados 
por SDS-PAGE e/ou confirmados por western blot. Realizou-se a imunização de 
camundongos BALB/c com a proteína purificada para obtenção de anticorpos anti-Rim8. A 
produção dos anticorpos foi confirmada por ELISA. A imunocitolocalização em células de P. 
lutzii mostrou que a proteína se encontra associada à membrana plasmática de forma difusa 
em pH ácido, em seguida apresenta focos localizados em resposta a um pH próximo da 
neutralidade e, por fim, migra para o interior da célula em pH alcalino. Sendo assim, pode-se 
inferir que o trabalho apresenta contribuições para o desenvolvimento de novas drogas 
antifúngicas, além de auxiliar o entendimento do processo biológico no qual a proteína RIM8 
está envolvida. 
 
Palavras-chaves: Micoses sistêmicas; Paracoccidioides spp.; Alvo molecular Rim8; Drogas 
antifúngicas; Produção de proteínas recombinantes; 
 
 
ABSTRACT 
 
 
Invasive fungal infections are a major public health problem in the world, since they increase 
morbidity and patients’ hospitalization time. In Brazil, the highest mortality rate among the 
systemic mycoses is caused by an endemic disease named paracoccidioimycosis, which the 
etiologic agent is the dimorphic fungus Paracoccidioides spp. The worldwide increased 
resistance to the commercially available antifungal agents, their limited spectrum of activity 
against some fungal pathogens and concerns with their toxic side effects are reasonable 
evidence of the necessity of novel therapeutic strategies, especially the development of new 
antifungal agents. Thus, the essential gene rim8 was identified by comparative genomics as an 
orthologous sequence in the genome of human pathogenic fungi absent in the human genome. 
In filamentous fungi and yeasts, gene expression regulation by the ambient pH involves 
components of a signaling pathway that mediate proteolytic activation of the transcription 
factor PacC/Rim101 in response to alkaline environmental pH. The rim8 gene in yeasts, also 
called palF in filamentous fungi, performs an essential step in this signaling pathway. It is 
important for host-pathogen interaction, leading to increased virulence and pathogen survival. 
Thus, Rim8 is a very interesting and promising drug target. The aim of this work is to 
optimize heterologous expression and purification of Rim8 protein from P. luzii to further 
perform its structural and functional characterization and also, to use it as a molecular target 
for drugs development. The rim8 gene was chemically synthesized with a histidine tag and 
cloned into a pET-21a vector. Heterologous expression of the gene was made using two 
strains of E. coli, obtaining the best conditions using LB medium with 0.5% glucose at 30 °C 
for 2 hours and 0.25 mM IPTG and adding protease inhibitor cocktail. The Rim8 heterologous 
protein was purified using a nickel affinity chromatography column. Expression and 
purification results were analyzed by SDS-PAGE and in some cases, confirmed by western 
blot. Immunization of BALB/c mice was performed with the purified protein to obtain anti-
Rim8 antibodies. The antibody production was confirmed by ELISA test. The protein 
immunocitolocalization in P. lutzii cells showed a difuse protein-plasma membrane 
association at acidic pH. At neutral pH the fluorescence pattern is showed as localized foci in 
plasma membrane and later, with extracellular alcalinization, it migrates into the cytosol. 
Thus, it can be inferred that this work gives some contribution to the development of new 
antifungal drugs, but still must undergo further production steps, proteolysis reduction and 
protein purification to allow structural and functional characterization of Rim8. 
 
Keywords: Systemic fungal diseases; Paracoccidioides spp.; Molecular target Rim8; 
Antifungal drugs; Recombinant protein production; 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 
 
Figura 1- Distribuição geográfica dos grupos filogenéticos de Paracoccidioides spp. ........... 24 
Figura 2- Mecanismo de ação de drogas antifúngicas. ............................................................. 30 
Figura 3- Alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos de Rim8 de fungos 
patogênicos humanos. ............................................................................................................... 34 
Figura 4- Modelo de recrutamento da maquinaria ESCRT mediada por Rim8 ....................... 37 
Figura 5- Mapa do vetor de expressão bacteriano pET-21a (+) ............................................... 44 
Figura 6- Esquema da produção em larga escala da proteína em sistema heterólogo. ............. 47 
Figura 7- Ilustração esquemática do mapa do vetor pET-21a::rim8. ....................................... 63 
Figura 8- Eletroforese em gel de agarose dos experimentos de digestão enzimática e PCR. .. 63 
Figura 9- Relatório resumido da qualidade das reações de sequenciamento. .......................... 64 
Figura 10- Alinhamento entre a sequência contígua obtida com o sequenciamento e a 
sequência desenhada antes da síntese gênica. .......................................................................... 65 
Figura 11- Cinética de indução de expressão gênica das estirpes de E. coli em SDS-PAGE. . 65 
Figura 12- Gel de SDS-PAGE acompanhado de revelação por western blot representativos da 
melhor condição de expressão do gene rim8. ........................................................................... 66 
Figura 13- Gel de SDS-PAGE e western blot de Rim8 purificada por cromatografia por 
afinidade ao níquel.................................................................................................................... 67 
Figura 14- Cromatograma de purificação em Äkta por IMAC. ................................................ 70 
Figura 15- Western blot das alíquotas de eluição de IMAC por Äkta. ...................................... 71 
Figura 16- Cromatograma da purificação em Äkta por exclusão molecular. ........................... 72 
Figura 17- Western blot após cromatografia por exclusão molecular. ..................................... 72 
Figura 18- Western blot de alíquotas de expressão usando os inibidores de protease apontados 
após análise do mapa de proteólise........................................................................................... 75 
Figura 19- Cinética de produção de anticorpos anti-Rim8 no camundongo 3. ........................ 75 
Figura 20- Imagens de leveduras de P. lutzii em DIC e MF após ligação deanticorpo anti-
Rim8 à célula. ........................................................................................................................... 76 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1- Dados estatísticos das dez infecções fúngicas invasivas mais frequentes. ............... 21 
Tabela 2- Exemplos de fungos dimórficos e fatores desencadeantes da transição dimórfica. . 23 
Tabela 3- Genes selecionados como potenciais alvos de novas drogas antifúngicas. .............. 34 
Tabela 4- Enzimas de restrição utilizadas nas reações de digestão enzimática........................ 45 
Tabela 5- Iniciadores utilizados para amplificação e sequenciamento de rim8. ...................... 46 
Tabela 6- Parâmetros para otimização da produção de Rim8. ................................................. 48 
Tabela 7- Parâmetros para otimização da produção e purificação da proteína Rim8. ............. 52 
Tabela 8- Concentração dos inibidores de proteases utilizados após montagem do mapa de 
proteólise de Rim8. ................................................................................................................... 61 
Tabela 9- Otimização da produção de proteína Rim8. ............................................................. 65 
Tabela 10- Otimização da produção/purificação da proteína Rim8 em conformação nativa. . 68 
Tabela 11- Análise da proteólise de Rim8 em sistema heterólogo em E. coli e enzimas 
envolvidas nesse processo. ....................................................................................................... 73 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE SIGLAS 
 
 
AEBSF - Cloridrato de 4-fluoreto de 2-aminoetilbenzenossulfonil 
AMPc - Adenosina monofosfato cíclico 
BCIP - 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato 
C-terminal – Extremidade carboxi-terminal 
DETAPAC – Ácido dietileno triamino pentacético 
DIC - Microscopia de contraste de interferência diferencial 
DIFP - Diisopropil fluorofosfato 
E-64 - N-(trans-Epoxisuccinil)-L-leucina 4- guanidinobutilamida 
EDTA - Ácido etileno diamino tetracético 
EGTA - Ácido etileno glicol tetracético 
ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay 
ESCRT - Complexo endossomal de distribuição necessário para transporte 
HIV – Vírus da imunodeficiência humana 
HTS - Triagem biológica automatizada em larga escala (high throughput screening) 
IFI – Infecção fúngica invasiva 
IMAC – Cromatografia por afinidade a metal imobilizado 
IPTG - Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo 
LB - Luria-Bertani 
Log - Função logarítmica 
MF - Microscopia de fluorescência 
 
 
MWCO - Limite de peso molecular (molecular weight cut-off) 
NA - Abertura numérica 
N-terminal – Extremidade amino-terminal 
NBT - Nitroblue tetrazólio 
NCBI - National Center for Biotechnology Information 
OD600 - Densidade óptica a 600 nm 
Pb – Pares de bases 
PBS - Tampão fosfato-salino 
PCM - Paracoccidioidomicose 
PCR – Reação em cadeia da polimerase 
pH – Potencial hidrogeniônico 
pNPP - p-nitrofenil fosfato 
PMSF - Fluoreto de fenilmetilsulfonil 
PS2 - Espécie filogenética 2 (do complexo Paracoccidioides brasiliensis) 
PS3 - Espécie filogenética 3 (do complexo Paracoccidioides brasiliensis) 
PS4 - Espécie filogenética 4 (do complexo Paracoccidioides brasiliensis) 
PVDF - Fluoreto de polivinilideno 
Rf - Razão da distância percorrida por uma banda de proteína no gel separador de SDS-PAGE 
pelo comprimento total deste gel 
S1 – Espécie 1 (do complexo Paracoccidioides brasiliensis) 
SDS - Dodecil-sulfato de sódio 
SDS-PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS 
SIDA - Síndrome da imunodeficiência adquirida 
 
 
TB - Terrific Broth 
TBE – Tampão Tris-borato-EDTA 
TBS - Solução salina tamponada com Tris 
Th1 - Resposta imunológica de linfócitos T auxiliares 1 
Th2 - Resposta imunológica de linfócitos T auxiliares 2 
TMD - Domínios transmembrana 
UniProtKB - Universal Protein Resource Knowledge base 
UHTS - Triagem biológica automatizada em ultra larga escala (ultra high throughput 
screening) 
UV280 – Luz ultravioleta em comprimento de onda de 280 nm 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
1 INTRODUÇÃO --------------------------------------------------------------------------------------- 17 
2 REVISÃO DE LITERATURA -------------------------------------------------------------------- 20 
2.1 INFECÇÕES FÚNGICAS INVASIVAS ----------------------------------------------------- 20 
2.2 FUNGOS DIMÓRFICOS ----------------------------------------------------------------------- 21 
2.3 O GÊNERO PARACOCCIDIOIDES E A PARACOCCIDIOIDOMICOSE ------------ 23 
2.4 TRATAMENTO DA PCM ---------------------------------------------------------------------- 26 
2.5 DIFICULDADES TERAPÊUTICAS --------------------------------------------------------- 27 
2.6 ALTERNATIVAS TERAPÊUTICAS -------------------------------------------------------- 32 
2.7 VIA RIM/PAL DE REGULAÇÃO DO PH -------------------------------------------------- 35 
2.8 PROTEÍNA RIM8 -------------------------------------------------------------------------------- 39 
3 JUSTIFICATIVA ------------------------------------------------------------------------------------ 42 
4 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------ 43 
4.1 OBJETIVO GERAL ----------------------------------------------------------------------------- 43 
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ------------------------------------------------------------------- 43 
5 MATERIAL E MÉTODOS ------------------------------------------------------------------------ 44 
5.1 SÍNTESE QUÍMICA E CLONAGEM GÊNICA -------------------------------------------- 44 
5.2 PREPARO DE CÉLULAS BACTERIANAS COMPETENTES E 
TRANSFORMAÇÃO POR CHOQUE TÉRMICO ---------------------------------------------- 45 
5.3 CONFIRMAÇÃO DA CLONAGEM MOLECULAR DE RIM8 ------------------------- 45 
5.4 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA ------------------------------------------------------ 46 
5.5 OTIMIZAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA ------------------------------------------------ 47 
5.6 PREPARAÇÃO DA AMOSTRA E PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA-ALVO -------- 48 
5.6.1 Cromatografia por afinidade em aparato manual ---------------------------------- 50 
5.6.2 Otimização da purificação manual ----------------------------------------------------- 51 
5.6.3 Cromatografia por afinidade em Äkta ------------------------------------------------- 52 
5.6.4 Diálise, renaturação e concentração da proteína ------------------------------------ 53 
5.6.5 Cromatografia por exclusão molecular ------------------------------------------------ 54 
5.7 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA CONTENDO SDS ------------ 55 
5.8 WESTERN BLOTTING -------------------------------------------------------------------------- 56 
5.9 IMUNOCITOLOCALIZAÇÃO DA PROTEÍNA RIM8 ----------------------------------- 57 
5.9.1 Produção de anticorpos policlonais ---------------------------------------------------- 57 
5.9.2 Localização intracelular da proteína Rim8 ------------------------------------------- 58 
 
 
5.10 CONSTRUÇÃO DO MAPA DE PROTEÓLISE DA PROTEÍNA RIM8 ------------- 58 
5.11 INIBIDORES ESPECÍFICOS PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNA RIM8 ------- 60 
6 RESULTADOS --------------------------------------------------------------------------------------- 62 
6.1 ANÁLISE DO VETOR RECOMBINANTE ------------------------------------------------- 62 
6.2 EXPRESSÃO GÊNICA ------------------------------------------------------------------------- 65 
6.3 PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA RIM8 ------------------------------------------------------ 67 
 6.3.1 Cromatografia por afinidade - método manual ------------------------------------- 67 
 6.3.2 Cromatografia por afinidade - método automatizado ----------------------------- 69 
 6.3.3 Cromatografia por exclusão molecular ----------------------------------------------- 716.4 MAPA DE PROTEÓLISE ---------------------------------------------------------------------- 73 
6.5 PRODUÇÃO DE PROTEÍNA RIM8 COM USO DE INIBIDORES ESPECÍFICOS - 74 
6.6 PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-RIM8 E IMUNOCITOLOCALIZAÇÃO --- 75 
7 DISCUSSÃO ------------------------------------------------------------------------------------------ 87 
8 CONCLUSÃO ---------------------------------------------------------------------------------------- 87 
9 PERSPECTIVAS ------------------------------------------------------------------------------------- 88 
10 REFERÊNCIAS ------------------------------------------------------------------------------------ 89 
11 APÊNDICE ----------------------------------------------------------------------------------------- 113 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
As infecções fúngicas invasivas (IFIs) têm emergido como problema de saúde pública 
em todo o mundo. Isso se deve ao alto índice de morbi-mortalidade, capacidade de elevar o 
tempo/custo de internação dos pacientes, e principalmente, pelo aumento de relato de IFIs 
como infecções nosocomiais e em indivíduos imunossuprimidos (Murray et al., 2009; 
Kauffman et al., 2011; Metin et al., 2011; Pfaller et al., 2011). As IFIs vêm se desenvolvendo 
de forma acentuada nesse grupo de indivíduos que, além de desenvolverem formas clínicas 
mais severas das micoses e estarem mais susceptíveis às infecções por fungos oportunistas, 
apresentam índices de mortalidade mais elevados (Prado et al., 2009; Ribeiro et al., 2009). 
Dentre os fungos causadores de micoses sistêmicas estão os oportunistas e os 
primários e, dentro deste último grupo está enquadrado o fungo termodimórfico causador da 
paracoccidioidomicose, Paracoccidioides spp. Esta doença, restrita à América Latina, é 
considerada a oitava maior causadora de morte entre as doenças infecciosas e parasitárias 
predominantemente crônicas ou recorrentes. Ela possui caráter granulomatoso e é adquirida 
através da instalação da levedura após a inalação de conídios encontrados na forma sapróbica 
no solo e vegetação (Shikanai-Yasuda et al., 2006; Koneman et al., 2008; Brasil, 2009). 
Há certo tempo o aumento constante da resistência a agentes antifúngicos vem sendo 
observado e há poucas possibilidades terapêuticas efetivas, como polienos, fluoropirimidinas, 
azólicos e equinocandinas (Baddley e Moser, 2004; Da Matta et al., 2007; Mikulska et al., 
2011; Cuenca-Estrella, 2014). O desenvolvimento de novas drogas pode ser bastante 
dispendioso, demorado e apresenta grandes chances de falha. Apesar disso, nota-se a 
necessidade de investigar novos métodos de controle da doença ou o desenvolvimento de 
novas drogas antifúngicas. Nesse sentido, os métodos in silico têm se mostrado alternativas 
promissoras (Wills et al., 2000; Kontoyiannis e Lewis, 2002; Saidani et al., 2009; Paul et al., 
2010; Kauffman et al., 2011). 
Em trabalho realizado por Abadio et al. (2011) foram encontrados, através de buscas 
realizadas na literatura, 57 genes considerados essenciais ou importantes para a viabilidade de 
Aspergillus fumigatus, Candida albicans e/ou Paracoccidioides lutzii (Roemer et al., 2003; 
Felipe et al., 2005; Hu et al., 2007). Estes genes foram utilizados como base para a realização 
de uma análise por genômica comparativa, visando identificar genes conservados em 
patógenos e ausentes no genoma humano. Foi realizado o alinhamento das sequências gênicas 
com o genoma de oito fungos patogênicos, sendo identificado, dentre outros, o gene essencial 
rim8 como um possível alvo de novas drogas antifúngicas. A sequência da proteína Rim8 foi 
18 
 
utilizada para a realização de alinhamento múltiplo, o que mostrou a presença de domínios 
conservados em todas as sequências fúngicas (Abadio et al., 2011). 
 O gene rim8 codifica para uma proteína envolvida na transdução de sinal, dependente 
do pH, o que provoca a ativação proteolítica de um fator transcricional em resposta ao pH 
alcalino (Herranz et al., 2005; Herrador et al., 2010). Esta via de sinalização é aparentemente 
conservada entre os fungos e regula várias respostas ao ambiente alcalino. Além disso, está 
envolvida na patogênese, é importante para interação patógeno-hospedeiro, sendo apontada 
como possível alvo de novos antifúngicos (Davis, 2003; Peñalva e Arst, 2004; Bastidas et al., 
2008; Davis, 2009; Cornet e Gaillardin, 2014). 
Considerando o exposto e tendo como base o amplo conhecimento dos aspectos 
biológicos e moleculares de P. lutzii pelo grupo, além do trabalho anterior realizado para a 
escolha de potenciais genes-alvo de novos antifúngicos, percebe-se a potencialidade de rim8 
como alvo molecular de agentes antimicóticos. Assim, este trabalho visou expressar e 
purificar a proteína Rim8, além de fornecer suporte para futuras análises físico-químicas da 
proteína por técnicas biofísicas. Para isso, buscou-se produzir e purificar a proteína 
recombinante em sistema heterólogo e identificar sua citolocalização. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 
 
2 REVISÃO DE LITERATURA 
 
2.1 INFECÇÕES FÚNGICAS INVASIVAS 
 
As micoses podem ser subdivididas em superficiais, subcutâneas e sistêmicas (também 
chamadas disseminadas ou invasivas) (Molinaro et al., 2009; Murray et al., 2009; Kavanagh, 
2011). Nas duas últimas décadas, as infecções fúngicas invasivas (IFIs) evidenciaram-se de 
forma mais proeminente nas nações pouco desenvolvidas. Isso porque elas exigem maior 
precaução clínica, principalmente, devido ao crescente número de indivíduos com a 
imunidade prejudicada. Nesses casos, as micoses sistêmicas e oportunistas são achados 
frequentes que geram agravamento dos quadros clínicos, aumento da mortalidade e dos custos 
hospitalares (Vaz et al., 2007; Prado et al., 2009; Kauffman et al., 2011; Kim et al., 2011; 
Metin et al., 2011). O desenvolvimento de diferentes alternativas terapêuticas é claramente 
capaz de elevar o tempo de sobrevivência da população. Em contrapartida a isso está o 
crescimento do número de imunossuprimidos, tais como indivíduos em antibioticoterapia de 
amplo espectro prolongada, transplantados, pacientes oncológicos e portadores do vírus da 
imunodeficiência humana (HIV) (Vaz et al., 2007; Ribeiro et al., 2009; Kauffman et al., 
2011). No Brasil estima-se que 3,8 milhões de pessoas apresentem infecções fúngicas severas, 
com uma incidência que pode chegar a 249 casos por ano a cada cem mil habitantes 
(Giacomazzi et al., 2015). 
As IFIs são causadas predominantemente pelos fungos Blastomyces dermatitidis, 
Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides spp., Penicillium marneffei, 
Sporothrix schenckii, além dos oportunistas Aspergillus spp., Candida spp., Cryptococcus sp., 
Fusarium spp., Pneumocystis spp. e zigomicetos (também oportunistas) como Mucor sp. e 
Rhizopus sp. (Tabela 1) (Severo et al., 2010; Colombo et al., 2011; Kauffman et al., 2011; 
Brown et al., 2012; Sifuentes-Osornio et al., 2012; Brasil., 2013; Sirignano et al., 2014). 
Embora ainda sejam negligenciadas, deve-se levar em consideração que essas 
infecções apresentam altos índices de morbidade e mortalidade, têm diferentes níveis de 
severidade, além de gerarem altos custos hospitalares. Segundo Ashley et al. (2012), o custo 
de tratamento de uma IFI é de aproximadamente $ 32.000, podendo chegar a cerca de $ 
80.000 excluindo-se desse número as comorbidades e possíveis complicações posteriores 
(Prado et al., 2009; Ribeiro et al., 2009; Kim et al., 2011). Sendo assim, algumas medidas 
devem ser adotadas para minimizar essas infecções, como a prevenção por meio de 
campanhas educativas, combate a fatores de risco, melhoramento de métodos diagnósticos e o 
20 
 
desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas (Kauffman et al., 2011; Ashley et al., 
2012). 
 
Tabela 1- Dados estatísticos das dez infecções fúngicas invasivas mais frequentes. 
* A maior partedos dados é estimada em dados disponíveis na literatura. Micoses endêmicas podem ocorrer em 
várias regiões do mundo, porém os dados são bastante limitados. Para esse tipo de micose, os autores realizaram 
uma estimativa das infecções por ano e a mortalidade em um local específico, onde há bastantes dados 
disponíveis. 
Doença (espécie mais frequente) Localização 
Infecções com risco de 
morte/ano* 
Taxa de mortalidade (% 
na população infectada)* 
IFIs oportunistas 
 
Aspergilose 
(Aspergillus fumigatus) 
Global > 200.000 30 – 95 
Candidíase 
(Candida albicans) 
Global > 400.000 46 – 75 
Criptococose 
(Cryptococcus neoformans) 
Global > 1.000.000 20 – 70 
Mucormicose 
(Rhizopus orizae) 
Global > 10.000 30 – 90 
Pneumocistose 
(Pneumocystis jirovecii) 
Global > 400.000 20 – 80 
Micoses endêmicas por fungos dimórficos* 
 
Blastomicose 
(Blastomyces dermatitidis) 
Centro-oeste e meio-
atlântico dos EUA 
~ 3.000 < 2 – 68 
Coccidioidomicose 
(Coccidioides immitis) 
Sudoeste dos EUA ~ 25.000 < 1 – 70 
Histoplasmose 
(Histoplasma capsulatum) 
Centro-oeste dos 
EUA 
~ 25.000 28 – 50 
Paracoccidioidomicose 
(Paracoccidioides spp.) 
Brasil ~ 4.000 5 – 27 
Peniciliose 
(Penicillium marneffei) 
Sudeste asiático > 8.000 2 – 75 
Fonte: Adaptado de Brown et al. (2012). 
 
2.2 FUNGOS DIMÓRFICOS 
 
Sendo adaptados a diversos ambientes, os fungos são conhecidos por serem ubíquos 
na natureza. Conquanto tenham sido identificadas menos de 100.000 espécies de fungos (até o 
ano de 2011), estima-se a riqueza fúngica global em 1,5 a 5,1 milhões de espécies 
(Hawksworth, 2001; O'brien et al., 2005; Kavanagh, 2011). Dentre as espécies conhecidas, 
cerca de 200 a 500 estão relacionadas a infecções em humanos. No entanto, somente cem 
espécies são capazes de causar doenças em indivíduos hígidos e apenas uma pequena parcela 
destas é responsável por causar a maior parte das infecções (Kauffman et al., 2011; 
Kavanagh, 2011). 
Os fungos patogênicos humanos são didaticamente divididos em patógenos primários, 
quando o organismo é capaz de causar infecção em indivíduos saudáveis, e patógenos 
21 
 
oportunistas, quando há a necessidade de imunossupressão do hospedeiro (Murray et al., 
2009; Kavanagh, 2011). Em uma classificação microscópica básica, os fungos são designados 
como: 
 (a) multicelulares ou filamentosos, quando apresentam estruturas ramificadas (hifas), 
crescimento apical e os esporos produzidos sendo chamados de conídios; 
(b) leveduriformes, quando apresentam apenas uma única célula com multinucleações, 
crescimento por brotamento e esporos sendo chamados de blastoconídios; 
(c) dimórficos, quando apresentam a habilidade de apresentarem tanto a forma 
filamentosa (em geral, saprofítico) quanto a leveduriforme (normalmente infecciosa) em 
diferentes fases do ciclo de vida. 
O dimorfismo permite ao organismo a adaptação ambiental, o desempenho de certas 
funções relacionadas ao desenvolvimento, e a capacidade de infectar o hospedeiro (Koneman 
et al., 2008; Murray et al., 2009; Ruiz-Herrera, 2012). 
Todos os agentes fúngicos patógenos primários causadores de infecções invasivas são 
dimórficos. Eles são conhecidos por ocasionarem infecções respiratórias através da inalação 
de partículas infectantes que, ao entrarem em contato com a mucosa respiratória, usam o 
dimorfismo como fator de virulência e adquirem sua forma infecciosa (Koneman et al., 2008; 
Murray et al., 2009). 
Sabe-se que a transição dimórfica gera, além da mudança na forma da célula, alteração 
na atividade metabólica, da estrutura e composição da parede celular, formação de moléculas 
antigênicas e expressão de características relacionadas à virulência (Felipe et al., 2005; Ruiz-
Herrera, 2012). Os principais agentes desencadeantes dessa transição são a temperatura, pH, 
nutrientes (por exemplo, a fonte de carbono ou nitrogênio), além de condições internas 
capazes de induzir fatores morfogenéticos (Ruiz-Herrera, 2012). Exemplos de fungos 
dimórficos com seus agentes desencadeantes da transição dimórfica são exibidos na Tabela 2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
Tabela 2- Exemplos de fungos dimórficos e fatores desencadeantes da transição dimórfica. 
Espécie Fator desencadeante Exigência para formação de micélio 
Candida albicans Mudança na temperatura Aumento de temperatura 
 pH Neutro 
 Fonte de Carbono N-acetilglicosamina (GlcNAc) 
 Outro Soro humano 
Coccidioides immitis Mudança na temperatura Diminuição de temperatura 
Paracoccidioides spp. Mudança na temperatura Diminuição de temperatura 
Blastomyces dermatitidis Mudança na temperatura Diminuição de temperatura 
Histoplasma capsulatum Mudança na temperatura Diminuição de temperatura 
Mucor rouxii Oxigênio Alta tensão 
 Fonte de Carbono Não fermentável 
Mucor racemosus Atmosfera Aeróbica 
 Fonte de Carbono Não fermentável 
Fonte: Adaptado de Ruiz-Herrera (2012). 
 
2.3 O GÊNERO PARACOCCIDIOIDES E A PARACOCCIDIOIDOMICOSE 
 
Tanto os fungos termodimórficos do gênero Paracoccidioides spp. quanto a infecção 
causada por eles, a paracoccidioidomicose (PCM), foram descritos primeiramente por 
Adolpho Lutz (1908). Anos mais tarde, Almeida (1930) estudou a morfologia fúngica de 
forma mais aprofundada, descreveu o gênero Paracoccidioides e manteve a espécie 
brasiliensis como já havia denominado Splendore (1912). Até o ano de 2006 acreditava-se 
que essa era a única espécie do fungo, porém estudos filogenéticos alteraram esse preceito. 
Matute et al. (2006) estudaram 65 isolados do fungo e sugeriram a existência de, no mínimo, 
três espécies filogenéticas crípticas que formam o complexo Paracoccidioides brasiliensis: 
espécie 1 (S1), espécie filogenética 2 (PS2), espécie filogenética 3 (PS3). Carrero et al. (2008) 
analisaram sequências codificadoras e não codificadoras de 21 isolados do fungo. Desses, 20 
isolados foram classificados como pertencentes a um dos três grupos descritos por Matute et 
al. (2006) e um isolado (Pb01) foi classificado como uma nova espécie filogenética, nomeada 
Pb01-like. Então, Teixeira et al. (2009) estudaram 88 isolados e identificaram 17 deles como 
pertencentes ao grupo Pb01-like. A partir de análises de recombinação, esse mesmo estudo 
demonstrou alta divergência entre Pb01-like e os outros grupos, sendo proposto que ele fosse 
classificado como uma nova espécie, chamada P. lutzii (Teixeira et al., 2009). Esses 
resultados foram corroborados por outros estudos (Salgado-Salazar et al., 2010; Desjardins et 
al., 2011). Por fim, Salgado-Salazar et al. (2010) apontaram que, por haverem diferenças 
importantes dentro do grupo, alguns isolados dentro de S1 devessem ser classificados como 
outra espécie filogenética pertencente ao complexo P. brasiliensis, sugerindo a existência da 
23 
 
espécie filogenética 4 (PS4), o que também é apontado por Theodoro et al. (2012) e Teixeira 
et al. (2014). 
Alguns estudos foram feitos para tentar correlacionar as diferenças filogenéticas com 
aspectos geográficos, genômicos, proteômicos e resistência a drogas, por exemplo (Ruiz-
Herrera, 2012). Assim, descobriu-se que o grupo S1 é o mais bem distribuído, sendo 
encontrado na Argentina, Brasil, Paraguai, Peru, Uruguai e Venezuela; PS2 está presente no 
Brasil e Venezuela; PS3 é restrito à Colômbia; PS4 encontrado somente na Venezuela; e P. 
lutzii é encontrado predominantemente nas regiões norte e centro-oeste brasileira, apesar de 
não ser restrito a ela (Figura 1) (Richini-Pereira et al., 2009; Teixeira et al., 2009; Theodoro et 
al., 2012; Teixeira et al., 2014). 
Com relação à genômica, foi descoberto que P. lutzii possui um genoma maior (39,2 
Mb) que isolados de S1 e PS2 (30 e 29 Mb, respectivamente), apresentando também maior 
quantidade de genes, menor similaridade de sequência com os outros isolados e contém 
aproximadamente o dobro da quantidade de elementos transponíveis no genoma (Desjardins 
et al., 2011). Nos aspectos bioquímicos,foram demonstrados perfis proteômicos diferentes 
entre representantes dos quatro grupos e que estão de acordo com a distância filogenética 
encontrada (S1 sendo considerada um grupo independente, PS3 mais próxima de S1 que de 
PS2, e P. lutzii demonstrando maior divergência entre todas). Dados relacionados à 
quantidade de proteínas envolvidas na glicólise e fermentação alcoólica apontam uma maior 
utilização do metabolismo anaeróbico em P. lutzii (Felipe et al., 2005; Pigosso et al., 2013). 
Outros estudos apontaram diferentes alterações entre as espécies, como o fato de isolados P. 
lutzii serem mais sensíveis à associação trimetoprim com sulfametoxazol, terem menor 
abundância do antígeno gp43 (tem papel na modulação da resposta imune e também é muito 
usado para o diagnóstico sorológico), e terem os conídios mais alongados que os de isolados 
de P. brasiliensis, corroborando o fato de serem espécies distintas (Hahn et al., 2003; Teixeira 
et al., 2009; Desjardins et al., 2011; Theodoro et al., 2012; Pigosso et al., 2013; Teixeira et 
al., 2014). Embora haja necessidade de estudos mais aprofundados, essas alterações podem 
trazer até mesmo manifestações clínicas diferentes, como virulência e tropismo por certos 
órgãos (Molinari-Madlum et al., 1999; Teixeira et al., 2014; Siqueira et al., 2016). 
 
 
 
 
24 
 
Figura 1- Distribuição geográfica dos grupos filogenéticos de Paracoccidioides spp. 
 
Fonte: Adaptado de Teixeira et al. (2009) 
 
No ambiente, a cerca de 25°C, este fungo ascomiceto vive saprofiticamente no solo, 
onde exibe sua forma filamentosa contendo propágulos infectantes (conídios) que são inaladas 
pelo hospedeiro ou, raramente, pela inoculação de esporos através da pele (Shikanai-Yasuda 
et al., 2006; Bocca et al., 2013; Góes et al., 2014). Ao atingir os bronquíolos e alvéolos 
pulmonares (36-37°C) o fungo adquire a forma de levedura e estabelece o complexo primário. 
Desta forma ele está apto a causar infecções profundas em órgãos e disseminar pelo corpo 
através da via hematogênica ou linfática. Embora algumas vezes o fungo permaneça em 
estado quiescente no hospedeiro (paracoccidioidomicose infecção), muitas vezes ele é 
reativado, gerando lesões em mucosas, pele, linfonodos, pulmões e outros órgãos (Shikanai-
Yasuda et al., 2006; Koneman et al., 2008; Brasil, 2009; Molinaro et al., 2009; Da Costa e Da 
Silva, 2014; Fabris et al., 2014; Góes et al., 2014). 
A PCM é uma patologia de caráter granulomatoso que tem evolução progressiva. 
Ainda que variem em cada indivíduo, as manifestações clínicas podem ser divididas em: 
(a) forma aguda/subaguda (ou juvenil), com média a elevada severidade e presente em 
3-5% dos pacientes. Comum em crianças, adolescentes e adultos jovens de ambos os sexos; 
25 
 
(b) crônica (ou adulta), com diferentes graus de severidade, com lesões uni- ou 
multifocais, encontrada em mais de 90% dos casos. Mais comum em homens de 30 a 60 anos; 
(c) sequelar (ou residual), que se caracteriza pela fibrose gerada em resposta ao 
processo inflamatório granulomatoso e está presente em 30,3% dos casos na forma crônica e 
6,3% na aguda (Paniago et al., 2003; Shikanai-Yasuda et al., 2006; Brasil, 2009; Bocca et al., 
2013). 
Os casos autóctones da PCM estão restritos à América Latina, com uma faixa que vai 
do México à Argentina. No Brasil ocorrem 80% dos casos, sendo considerada a micose 
sistêmica mais prevalente, porém Argentina, Colômbia e Venezuela também apresentam 
grande quantidade de casos (Koneman et al., 2008; Brasil, 2009; Da Costa e Da Silva, 2014; 
Fabris et al., 2014; Coutinho et al., 2015; Martinez, 2015). Ela afeta homens e mulheres 
principalmente de 30 a 50 anos de idade numa proporção de 5-15 homens para cada mulher. 
Essa diferença parece ocorrer devido à influência do hormônio feminino 17-β-estradiol na 
diminuição do crescimento das células leveduriformes e da habilidade de transição dimórfica 
do fungo; da diferença entre as respostas imunológicas relacionadas ao gênero sexual; ou 
ainda, à maior exposição do homem ao solo nas áreas rurais (Brasil, 2009; Murray et al., 
2009; Pinzan et al., 2010; Shankar et al., 2011; Sifuentes-Osornio et al., 2012; Bernin e 
Lotter, 2014). A PCM uma doença endêmica nas zonas rurais e afeta principalmente 
agricultores, indivíduos que trabalham diretamente com o solo e trabalhadores da construção 
civil. Ela é considerada um grave problema de saúde pública, visto que gera manifestações 
clínicas na fase mais produtiva da vida, tem longo tempo de tratamento, alta possibilidade de 
incapacitar o indivíduo, altas taxas de recidivas, elevada taxa de mortalidade em indivíduos 
jovens e pela importância social e econômica da doença (Brasil, 2009; Pinto et al., 2012; Da 
Costa e Da Silva, 2014; Fabris et al., 2014). 
Visando avaliar a prevalência da paracoccidioidomicose infecção (subclínica), 
Magalhães et al. (2014) verificaram a taxa de positividade de testes intradérmicos em uma 
região rural de Alfenas-MG em 542 indivíduos sem manifestações clínicas, radiológicas ou 
sinais sorológicos de doença ativa. Foi avaliado que quase a metade (46,67%) das pessoas 
havia entrado em contato com o P. brasiliensis, um resultado semelhante ao encontrado em 
estudos parecidos feitos no estado do Paraná e em Ibiá-MG (Silva-Vergara e Martinez, 1998; 
Fornajeiro et al., 2005; Magalhães et al., 2014). 
No Brasil, segundo Prado et al. (2009), as micoses sistêmicas causaram 3583 mortes 
entre os anos de 1996 e 2006, com média anual de aproximadamente 325 óbitos. No estudo, a 
PCM foi considerada a mais fatal IFI e a décima infecção crônica mais letal, com uma média 
26 
 
anual correspondente a cerca de 50% das mortes (Prado et al., 2009). Coutinho (2002), após 
estudar 3181 mortes no Brasil durante 15 anos, classificou a PCM como a oitava mais comum 
causa de morte entre as doenças infecciosas e parasitárias predominantemente crônicas ou 
recorrentes. Um estudo feito entre 1998 e 2006 com dados de todo o Brasil mostrou que a 
PCM correspondeu a 50% das admissões em hospitais ocorridas por micose sistêmica. 
Revelou também que a doença é a micose sistêmica mais prevalente, tendo hospitalizações 
reportadas em todos os estados brasileiros durante o período de estudo (Coutinho et al., 
2015). Estima-se que a incidência no Brasil seja de 7,99 casos para cada 100 mil habitantes 
por ano, embora estudos apontem que esse número seja de até 39,1 casos em regiões 
hiperendêmicas (Shikanai-Yasuda et al., 2006; Vieira et al., 2014; Giacomazzi et al., 2015; 
Martinez, 2015). Ainda que esses dados por si só já apresentem grande relevância, os números 
podem ser ainda mais significativos, levando em consideração a ocorrência de subnotificação 
no Brasil e principalmente em áreas rurais, onde as IFIs são mais frequentes (Prado et al., 
2009; Coutinho et al., 2015). A doença possui notificação compulsória apenas em alguns 
estados brasileiros, a despeito da tentativa de alguns fóruns em reverter essa posição da 
vigilância epidemiológica brasileira. Por esse motivo, os dados epidemiológicos obtidos são 
baseados apenas em inquéritos e relatos clínicos (Brasil, 2009; Da Costa e Da Silva, 2014). 
 
2.4 TRATAMENTO DA PCM 
 
 De modo ideal, o tratamento para doenças que exigem antibioticoterapia deveria ser 
feito apenas após a identificação do agente patogênico. Na prática, essa análise prévia 
geralmente não é realizada e a terapêutica empírica é iniciada no momento em que há a 
suspeita da infecção. Além disso, em alguns casos a adoção de tratamento profilático é 
preferível, sobretudo em indivíduos com depressão do sistema imune, nos quais as infecções 
podem evoluir de forma muito rápida (Brasil, 2010). 
Os fármacos de primeira escolha contra IFIs como a aspergilose invasiva, candidíase 
disseminada, meningite criptococócica/criptococose e histoplasmose são a anfotericina B, 
fluconazol, itraconazol (Brasil, 2010). Para a PCM,o tratamento é feito de forma que sejam 
minimizados os sintomas de fase aguda (uso de drogas mais intensas) e, em seguida, o uso de 
medicamentos de uso prolongado até que a doença seja controlada (Shikanai-Yasuda, 2015). 
Ainda que haja a necessidade de avaliar a severidade da doença e dar suporte às complicações 
clínicas e às comorbidades existentes em alguns casos, os antifúngicos mais usados e 
aprovados para a terapêutica no Brasil são a anfotericina B, os derivados azólicos (fluconazol, 
27 
 
cetoconazol, itraconazol, posoconazol e voriconazol), terbinafina e sulfamídicos (sulfadiazina 
e associação de sulfametoxazol com trimetoprim). Nas manifestações clínicas leves a 
moderadas é usado o itraconazol por um período de até 18 meses, ou a associação de 
sulfametoxazol com trimetoprim (alternativa mais usada nos ambulatórios brasileiros), que 
pode ser usada por até 24 meses ou até a melhora clínica em casos de maior severidade. Nos 
casos considerados graves, a anfotericina B é bastante usada em regime hospitalar e o 
voriconazol tem sido a escolha principal para casos de neuroparacoccidioidomicose, já que 
apresenta maior facilidade de ultrapassar a barreira hematoencefálica (Lutsar et al., 2003; 
Shikanai-Yasuda et al., 2006; Brasil, 2009; 2010; Shikanai-Yasuda, 2015). 
Embora não sejam de indicação clínica pelo Ministério da Saúde ou Vigilância 
Epidemiológica no Brasil, outros antifúngicos podem ser usados na PCM e/ou outras IFIs, 
como as fluocitosinas, griseofulvina, posaconazol, sulfadoxina, sulfametoxipiridazina e 
cotrimazina (Shikanai-Yasuda et al., 2006; Brasil, 2009; 2010; Rang et al., 2012; Katzung et 
al., 2014). 
 
2.5 DIFICULDADES TERAPÊUTICAS 
 
 Levando em consideração que o tratamento da PCM é longo e que as próprias drogas 
contra o fungo podem, em certos aspectos, debilitar os pacientes, é importante salientar os 
problemas gerados pelas opções terapêuticas disponíveis atualmente (Shikanai-Yasuda et al., 
2006; Brasil, 2010). Entre os maiores problemas do tratamento da PCM estão o abandono da 
terapêutica pelo paciente, os efeitos adversos das drogas disponíveis atualmente, e as sequelas 
causadas pela fibrose. Além disso, a resistência in vitro e in vivo aos antifúngicos vem sendo 
observada nos últimos tempos e ainda, há a disponibilidade de apenas cinco classes de 
antifúngicos contra micoses sistêmicas (Wills et al., 2000; Kontoyiannis e Lewis, 2002; 
Baddley e Moser, 2004; Da Matta et al., 2007; Amaral et al., 2009; Mikulska et al., 2011; 
Bocca et al., 2013). 
 O uso de agentes antimicóticos para o tratamento da PCM é um fator capaz de 
intensificar a resposta inflamatória do hospedeiro. Isso pode levar à formação de fibrose, 
causando dano tecidual e disfunção do órgão afetado, podendo gerar sequelas graves ou até o 
óbito do paciente (Benard et al., 2012; Bocca et al., 2013). Por essa razão, em casos onde há 
PCM disseminada é necessária a utilização de corticosteróides e/ou antifibróticos em 
associação ao antifúngico (Shikanai-Yasuda et al., 2006; Brasil, 2009; Naranjo et al., 2011; 
Benard et al., 2012). 
28 
 
 Os antibióticos derivados de sulfonamidas são análogos do ácido para-aminobenzóico 
e atuam na inibição competitiva de sintetase de dihidropteroato, necessária para a síntese de 
ácido fólico, essencial para a biossíntese de aminoácidos e ácidos nucleicos (Rang et al., 
2012). Algumas das suas desvantagens são a resistência fúngica e a posologia (necessidade do 
uso de cerca de seis comprimidos ao dia por longos períodos), além de poder causar lesões no 
sistema nervoso central, causar hipersensibilidade, anemia e trombocitopenia. Embora sejam 
largamente utilizados no tratamento da PCM, podem falhar por conta de rápida acetilação da 
droga, não aderência ao tratamento e dosagem insuficiente (Shikanai-Yasuda, 2015). 
A anfotericina B é um antifúngico natural do grupo dos polienos descoberto em 
meados de 1950 e aprovado para uso em 1960. Ele possui amplo espectro e, por ser altamente 
anfotérico, pode ser encontrado na forma deoxicolato ou lipídica. Apresenta ação no 
ergosterol presente na membrana celular de fungos (Figura 2), alterando a realização de 
transporte, permeabilidade da célula e estresse oxidativo (Arnold et al., 2010; Kauffman et 
al., 2011; Vandeputte et al., 2012; Katzung et al., 2014). É o agente fungicida de escolha em 
casos de infecções fúngicas potencialmente fatais. No entanto, sobretudo na formulação 
deoxicolato, apresenta desvantagens importantes, como a nefrotoxicidade (observa-se redução 
da função renal em 80% dos pacientes), anemia, hepatotoxicidade, neurotoxicidade em caso 
de infecções intratecais e tromboflebite. Embora apresente menos reações adversas, o alto 
custo das apresentações lipossomais inviabiliza o seu uso em países menos desenvolvidos 
(Amaral et al., 2009; Brasil, 2010; Restrepo et al., 2012; Katzung et al., 2014). Relatos de 
desenvolvimento de resistência à anfotericina B não são frequentes. Ainda assim ela pode 
ocorrer em casos de modificação do ergosterol alvo na membrana celular fúngica (redução da 
afinidade do fármaco), por uma menor exposição da molécula relacionada à alteração na 
composição dos fosfolipídeos, ou por aumento das enzimas antioxidativas (Baddley e Moser, 
2004; Kauffman et al., 2011; Cuenca-Estrella, 2014; Katzung et al., 2014). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
29 
 
Figura 2- Mecanismo de ação de drogas antifúngicas. 
 
Legenda: Seta com sinal negativo indica inibição do processo apontado pelas classes de antifúngicos mostradas. 
Fonte: Katzung et al. (2014). 
 
Os antimicóticos derivados triazólicos, são fungistáticos sintéticos de amplo espectro de ação. 
Tem como alguns integrantes da classe o itraconazol, posaconazol, ravuconazol, voriconazol 
e fluconazol, sendo que este último não é uma boa alternativa para o tratamento da PCM 
devido à necessidade de altas doses e tempo terapêutico. Embora cada fármaco possua suas 
próprias características farmacológicas, o grupo como um todo atua na enzima lanosterol 
demetilase do citocromo p450, inibindo a conversão de lanosterol a ergosterol (Figura 2), o 
que afeta a função de enzimas ligadas à membrana e interfere a replicação celular (Arnold et 
al., 2010; Kauffman et al., 2011; Kathiravan et al., 2012; Restrepo et al., 2012; Vandeputte et 
al., 2012; Katzung et al., 2014). Além da resistência intrínseca de certas espécies fúngicas, 
nos últimos anos tem sido observado o desenvolvimento de resistência adquirida aos azóis, o 
que pode se dever ao seu uso como tratamento profilático. Ela ocorre principalmente em 
Candida spp., e se dá através do aumento de efluxo da droga ou mutações que alteram a 
afinidade da molécula-alvo, por exemplo (Kontoyiannis e Lewis, 2002; Baddley e Moser, 
2004; Kauffman et al., 2011; Cuenca-Estrella, 2014; Xie et al., 2014). Outras desvantagens 
dos triazóis são a sua ação teratogênica, alteração de enzimas hepáticas (hepatite em casos 
raros), grande espectro de interações medicamentosas e o fato de a apresentação oral (melhor 
30 
 
absorvida) não estar disponível no Brasil (Arnold et al., 2010; Kauffman et al., 2011; 
Kavanagh, 2011; Vandeputte et al., 2012; Katzung et al., 2014). 
As equinocandinas fazem parte do grupo de antifúngicos semissintéticos. A classe foi 
descoberta na década de 1970 e tem como fármacos integrantes a anidulafungina, 
caspofungina e micafungina. Ela atua na inibição não competitiva da síntese de 1,3-β-D-
glucano sintetase, que compõe a parede celular dos fungos, levando a instabilidade osmótica e 
sua ruptura (Figura 2) (Sable et al., 2008; Kauffman et al., 2011; Kathiravan et al., 2012; 
Katzung et al., 2014). É a única classe de antimicóticos a atuar num alvo inexistente na célula 
de mamíferos, levando à redução dos efeitos colaterais. Pelo fato de terem mecanismo de ação 
diferenciado, não há resistência cruzada de polienos e azóis com as equinocandinas.Apesar 
disso, a resistência clínica à classe já foi relatada e, como possível mecanismo, está a mutação 
nos genes que codificam a enzima-alvo. Outro problema das equinocandinas se encontra no 
espectro de ação, atuando apenas em Candida spp., Aspergillus spp. e Penicilium spp. 
Apresenta baixa ação em Paracoccidiodes spp. devido à alteração da composição da parede 
fúngica de β-1,3-glucana para α-1,3-glucana na transição dimórfica de micélio para levedura 
(Kontoyiannis e Lewis, 2002; Baddley e Moser, 2004; Park et al., 2005; Singh et al., 2009; 
Kauffman et al., 2011; Pfaller et al., 2011; Kathiravan et al., 2012; Cuenca-Estrella, 2014; 
Xie et al., 2014). 
A fluocitosina, um antifúngico sintético descoberto na década de 1950, faz parte do 
grupo das fluoropirimidinas, que são análogos de pirimidina. Seu mecanismo de ação baseia-
se na inibição da síntese de ácidos nucléicos (Figura 2). Ao entrar na célula, a fluocitosina é 
convertida a 5-fluorouracila que, por sua vez, é convertida a trifosfato de fluorouridina 
(integra-se ao RNA e interfere na tradução) ou a monofosfato de 5-fluorodeoxiuridina (inibe 
enzima envolvida na síntese do DNA) (Kauffman et al., 2011; Kathiravan et al., 2012; 
Katzung et al., 2014). Apesar de a enzima que permite a entrada do antimicótico na célula ser 
encontrada apenas em fungos, a microbiota intestinal humana é capaz de realizar a conversão 
a 5-fluorouracila, que possui a toxicidade à medula óssea como o efeito adverso de maior 
relevância desta classe. Apesar disso, possui limitado espectro de ação, e não é indicada para 
uso em monoterapia devido ao acelerado desenvolvimento de resistência (é usada combinada 
com azóis ou anfotericina B), e não há liberação para uso clínico no Brasil (Severo et al., 
2009; Kavanagh, 2011; Kathiravan et al., 2012; Xie et al., 2014). 
 
 
31 
 
2.6 ALTERNATIVAS TERAPÊUTICAS 
 
Tendo em vista as dificuldades encontradas no tratamento das IFIs utilizando 
antifúngicos tradicionais, as limitadas opções terapêuticas e a diminuição de avanços 
substanciais nos últimos anos, nota-se a necessidade de criar alternativas terapêuticas viáveis 
para a prática clínica (Wills et al., 2000; Ostrosky-Zeichner et al., 2010; Kavanagh, 2011; Xie 
et al., 2014). Nesse sentido, podem ser destacadas a utilização de tecnologias in silico para 
identificação de alvos moleculares e desenvolvimento de novas drogas antifúngicas, as drogas 
nanoestruturadas e o desenvolvimento de imunoterapias profiláticas ou terapêuticas 
combinadas com agentes antimicóticos (Ostrosky-Zeichner et al., 2010; Kavanagh, 2011; 
Bocca et al., 2013; Xie et al., 2014). 
O uso de partículas nanoestruturadas desenvolvidas para a entrega de drogas é uma 
técnica bastante estudada nos últimos anos. Por realizar a liberação do fármaco de forma lenta 
e gradual, é capaz de minimizar a toxicidade, aumentar solubilidade, biodisponibilidade e 
diminuir a quantidade de aplicações. Exemplos de uso dessa técnica são o cetoconazol 
nanoestruturado, anfotericina B lipossomal, nanoestruturas de prata e ouro (Bocca et al., 
2013; Tang et al., 2013; Jebali et al., 2014). A terapia imunomodulatória atua na tentativa de 
adequação da resposta imunológica do indivíduo após compreender a interação patógeno-
hospedeiro. Com isso, é capaz de estimular uma resposta efetiva contra o agente infeccioso 
em si e/ou diminuir respostas inflamatórias que gerem consequências indesejáveis (como é o 
caso da fibrose na PCM). Como exemplo, pode-se citar o uso de pentoxifilina, interferon-
gama e terapias gênicas (Dignani et al., 2005; Sable et al., 2008; Ribeiro et al., 2010; Safdar, 
2010; Lopera et al., 2015). 
A pesquisa e o desenvolvimento de drogas são abrangentes, dispendiosos, consomem 
muito tempo e apresentam altos riscos. Estima-se que o tempo necessário para o 
desenvolvimento de uma nova droga desde as pesquisas laboratoriais até a sua chegada ao 
mercado seja de cerca de 15 anos. E ainda, que requer um investimento estimado de 800 
milhões a 1,8 bilhões de dólares, dependendo do alvo terapêutico e levando em consideração 
a alta porcentagem de falha nos ensaios clínicos (Adams e Brantner, 2010; Paul et al., 2010; 
Csermely et al., 2013). No passado, várias drogas foram descobertas de forma acidental, por 
modificação de moléculas e estratégias in vivo. No entanto, métodos in silico surgiram com o 
avanço da tecnologia computacional e, juntamente com o progresso da biologia molecular, 
tornou-se possível o sequenciamento, construção e anotação de genomas (Lima, 2007). Esses 
avanços levaram à criação de banco de dados essenciais para a identificação de alvos 
32 
 
moleculares, triagem de bibliotecas de moléculas fármaco-similares (virtual screening), 
triagem biológica automatizada em larga escala (high throughput screening - HTS) ou ultra 
larga escala (UHTS), facilitando o desenvolvimento e aprimoramento de novas drogas de 
forma mais eficiente e vantajosa (Reddy et al., 2007; Saidani et al., 2009; Ferreira et al., 
2011; Thiel et al., 2012; Wang et al., 2013). 
Uma estratégia bastante promissora para o descobrimento de alvos de drogas 
antifúngicas é a identificação de genes conservados essenciais para o crescimento do 
patógeno, avaliando a capacidade de genes e/ou seus produtos de serem alvos de drogas. É 
indiscutível que o papel dos bancos de dados alimentados com o genoma humano e de fungos 
patogênicos é essencial para essa avaliação (Hu et al., 2007; Birkholtz et al., 2008; Choi et 
al., 2013). Nesse sentido, Abadio et al. (2011) revisaram a literatura e encontraram 57 genes 
considerados essenciais ou importantes para a viabilidade de Aspergillus fumigatus, Candida 
albicans e/ou Paracoccidioides lutzii (Roemer et al., 2003; Felipe et al., 2005; Hu et al., 
2007). Essa apreciação inicial serviu como ponto de partida para a análise desses genes 
através de genômica comparativa. Assim, Abadio et al. (2011) identificaram genes ortólogos 
ausentes no genoma humano e presentes em fungos patogênicos humanos de grande 
relevância (Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitides, Candida albicans, Cryptococcus 
neoformans, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides lutzii e dois 
isolados de P. brasiliensis dos grupos S1 e PS2). Esta análise apontou dez genes não 
auxotróficos conservados nas espécies analisadas (Tabela 3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
Tabela 3- Genes selecionados como potenciais alvos de novas drogas antifúngicas. 
* Estrutura ausente no PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home.do). 
Gene Processo biológico Citolocalização 
Molde 
PDB 
Organismo 
E-
value 
Identidade de 
sequência 
(%) 
trr1 
Homeostase redox 
celular 
Citoplasma 3ITJ 
Saccharomyces 
cerevisiae 
3e-115 65 
 
1VDC Arabidopsis thaliana 1e-94 57 
aur1 Metabolismo celular 
Complexo de Golgi e 
membrana plasmática 
* * * * 
mak5 Biogênese do ribossomo Nucléolo 1HV8 
Methanocaldococcus 
jannaschii 
7e-42 30 
chs1 
Biogênese/degradação 
da parede celular 
Membrana plasmática * * * * 
tom40 Transporte de proteína 
Membrana 
mitocondrial 
2QK9 Homo sapiens 0,8 34 
kre6 
Biogênese/degradação 
da parede celular 
Membrana do 
complexo de Golgi 
2VY0 Pyrococcus furiosus 6e-4 32 
fhs1 
Organização/biogênese 
da parede celular 
Membrana plasmática 1R1M 
Neisseria 
meningitidis 
0,3 32 
kre2 
Manosilação de 
proteínas 
Membrana do 
complexo de Golgi 
1S4N 
Saccharomyces 
cerevisiae 
6e-96 50 
erg6 
Biossíntese do 
ergosterol 
Membrana do retículo 
endoplasmático 
3BUS 
Lechevalieria 
aerocolonigenes 
5e-18 32 
rim8 
Regulador de resposta 
ao pH 
Citoplasma 3G3L Bacteroides fragilis 3,9 38 
Fonte: Adaptado de Abadio et al. (2011). 
 
Para seleção dos melhores alvos desta lista, os seguintes critérios foram aplicados: ser 
essencial ou importante para a viabilidade da célula fúngica; não ser auxotrófico; codificar, 
preferencialmente, umaenzima; e possuir localização celular potencialmente acessível a 
drogas, tendo prioridade as proteínas com estrutura tridimensional conhecida. Assim, foram 
selecionados quatro candidatos a alvo molecular de drogas, são eles: trr1 (codifica enzima 
essencial), rim8 (codifica proteína não enzimática predita como essencial), kre2 e erg6 
(codificam enzimas importantes para a viabilidade celular) (Roemer et al., 2003; Hu et al., 
2007; Abadio et al., 2011). Estes genes alvos foram divididos entre os alunos componentes do 
projeto Pronex “Pós-genoma de fungos patogênicos humanos visando o desenvolvimento de 
novas drogas antifúngicas” e, portanto, estão sendo mais bem estudados de forma 
independente por cada membro do grupo. Esta dissertação trata especificamente sobre o gene 
rim8. De modo a demonstrar a presença de domínios conservados em todas as sequências 
fúngicas, as sequências polipeptídicas codificadas pelos alvos foram utilizadas para a 
34 
 
realização de alinhamento múltiplo (Abadio et al., 2011). O alinhamento das sequências de 
proteína Rim8/PalF (homólogas) é apresentado na Figura 3. 
 
Figura 3- Alinhamento múltiplo das sequências de aminoácidos de Rim8 de fungos 
patogênicos humanos. 
O resíduo de aminoácido Ser-86 de C. albicans na região N-terminal, responsável pela sinalização de pH através 
da interação entre PalF e Pal-H, foi alterado de forma semiconservativa por Cys-75 em B. dermatitidis, H. 
capsulatum e P. brasiliensis, por Cys-76 em C. immitis e por Cys-77 em A. fumigatus. O resíduo Ile-331 de C. 
albicans encontrado na região C-terminal, relacionada à interação entre PalF e PalH, estava conservado em todos 
os fungos analisados, embora localizado na posição 320 em P. brasiliensis. 
 Legenda: Af: Aspergillus fumigatus, Bd: Blastomyces dermatitidis, Ca: Candida albicans, Ci: Coccidioides 
immitis, Cn: Cryptococcus neoformans, Hc: Histoplasma capsulatum, Pb01: Paracoccidioides brasiliensis 
isolado 01, Pb3: P. brasiliensis isolado 3, Pb18: P. brasiliensis isolado 18. Asteríscos (*) indicam posições de 
identidade; dois pontos (:) sugerem substituições conservadas; e pontos (.) identificam substituições 
semiconservadas. 
Fonte: Adaptado de Abadio et al. (2011). 
 
2.7 VIA RIM/PAL DE REGULAÇÃO DO PH 
 
As arrestinas são proteínas adaptadoras importantes para a regulação do transporte 
intracelular de receptores, canais e transportadores de membrana através da facilitação de 
endocitose (Lefkowitz e Shenoy, 2005; Moore et al., 2007; Alberts et al., 2010; Becuwe et 
al., 2012; Herrador et al., 2015). O tráfico endocítico, que ocorre da membrana plasmática 
para o endossomo, envolve a transdução de sinal dependente do pH (Peñalva e Arst, 2004; 
Herranz et al., 2005). Embora possuam algumas diferenças, esta via de sinalização é 
conservada entre os fungos deuteromicetos, ascomicetos e basidiomicetos. Ela já foi bem 
caracterizada em Aspergillus nidulans (Orejas et al., 1995; Andersen et al., 2009; Bignell, 
35 
 
2012), Saccharomyces cerevisiae (Denison et al., 1998; Lamb et al., 2001; Obara et al., 
2012), Candida albicans (Porta et al., 1999; Davis et al., 2000; El Barkani et al., 2000; Davis, 
2003; Li et al., 2007) e Yarrowia lipolytica (Lambert et al., 1997; Gonzalez-Lopez et al., 
2006; Blanchin-Roland et al., 2008; Blanchin-Roland, 2011). 
A existência de um gradiente de pH na membrana plasmática é cessada quando o pH 
fora da célula se assemelha ao intracelular, podendo ocorrer deficiência na captação de íons e 
nutrientes e, por conseguinte, dificuldade na manutenção da parede e membrana celular 
(Lamb et al., 2001). A via RIM/PAL regula várias respostas ao ambiente alcalino, incluindo a 
ativação de genes de resposta alcalina, reprimindo os genes de resposta ao ambiente ácido. Os 
genes regulados pelo pH incluem os que codificam para enzimas secretadas, permeases, 
enzimas intracelulares que participam da síntese de produtos exportados, como toxinas e 
antibióticos. Além disso, estes genes possuem relação com biossíntese de parede/membrana, 
dimorfismo, esporulação, metabolismo de ferro, cobre, homeostase iônica, adesão, formação 
de biofilme, invasão de tecidos e formação da cápsula de C. neoformans (Davis et al., 2000; 
Davis, 2003; Bignell et al., 2005; Herranz et al., 2005; Peñalva et al., 2008; Davis, 2009; 
O'meara et al., 2010; Bertuzzi et al., 2014; Cornet e Gaillardin, 2014; Marques et al., 2015). 
 Em leveduras, os genes que estão envolvidos na cascata, rim20, rim13, rim23, rim8, 
rim21, rim9 e rim101 são homólogos, respectivamente, a palA, palB, palC, palF, palH, palI, e 
pacC em A. nidulans (Peñalva e Arst, 2004; Peñalva et al., 2008; Bignell, 2012; Cornet e 
Gaillardin, 2014). Em C. albicans, dois homólogos da via RIM foram identificados, rim101 e 
rim8, também conhecidos como prr2 e prr1, respectivamente (Porta et al., 1999; El Barkani 
et al., 2000). PalF (para fungos filamentosos) ou sua ortóloga Rim8 (para leveduras), contém 
os domínios amino-terminal (N-terminal) e carboxi-terminal (C-terminal) similares à 
arrestina. A proteína, também chamada de ART9 (por ser um adaptador de tráfego 
relacionado à arrestina), liga-se fortemente a duas regiões diferentes no domínio C-terminal 
da cauda citoplasmática do receptor com sete domínios transmembrana (TMD) PalH/Rim21 
(uma proteína de sensibilidade ao pH do ambiente) (Lin et al., 2008; Becuwe et al., 2012; 
Herrador et al., 2013; Herrador et al., 2015). Assim, ela funciona como um conector entre o 
receptor 7TMD Rim21 e a subunidade Vps23 do complexo endossomal de distribuição 
necessário para transporte (ESCRT, do inglês endosomal sorting complex required for 
transport). O recrutamento de ESCRT cria uma plataforma de sinalização para a ativação 
proteolítica do fator transcricional Rim101 na via de sinalização RIM/PAL de sensibilidade 
ao pH alcalino (Herrador et al., 2010; Hervas-Aguilar et al., 2010; Maeda, 2012). 
36 
 
 De forma mais detalhada, já foi descrito que em Y. lipolytica e S. cerevisiae a via RIM 
(Figura 4) é ativada pela percepção de neutralização/alcalinização do pH pela maquinaria de 
sensibilidade ao pH. Essa maquinaria está presente na membrana plasmática, e dela fazem 
parte as proteínas 7TMD Rim21 (sensor putativo) com seu parálogo Dfg16, 3TMD Rim9, 
Rim23 e Rim8 (Calcagno-Pizarelli et al., 2007; Galindo et al., 2012; Obara et al., 2012; 
Smardon e Kane, 2014). Ao ocorrer, em pH neutro-alcalino, a ligação de Rim8 na região C-
terminal da Rim21, ocorre a ubiquitinação de Rim8 pela E3 ubiquitina ligase Rsp5 (Herranz 
et al., 2005; Lefkowitz e Shenoy, 2005; Hervas-Aguilar et al., 2010; Herrador et al., 2015). O 
motivo SXP de Rim8 ubiquitinado medeia a ligação aos domínios Bro1 de Rim23 e ao 
domínio variante E2 de ubiquitina de Vps23 (componente do ESCRT-I). Essa interação é 
responsável por gerar a endocitose do complexo (embora estudos mais recentes apontem que 
toda a via ocorre em sítios pontuais da própria membrana plasmática) (Xu et al., 2004; 
Herrador et al., 2010; Galindo et al., 2012; Obara e Kihara, 2014; Lucena-Agell et al., 2015). 
As proteínas Vps dos complexos ESCRT se relacionam para a formação do corpo 
multivesicular do endossomo. O sinal gerado pelas proteínas do ESCRT, juntamente com a 
cascata ativada pela alteração do pH, leva ao recrutamento das proteínas citosólicas Rim23, 
Rim20, Rim13 para o endossomo, onde se associam (Lefkowitz e Shenoy, 2005; Peñalva et 
al., 2008; Herrador et al., 2010; Blanchin-Roland, 2011; Galindo et al., 2012). Rim23 e 
Rim20 interagem com o subcomplexo Vps20/Vps32/Snf7, proteínas chave do ESCRT-III, 
enquanto Vps24 recruta e provavelmente, ativa a protease sinalizadora Rim13 (Herrador et 
al., 2010; Maeda, 2012; Cornet e Gaillardin, 2014; Obara e Kihara, 2014). Rim13, Rim20 e 
Rim23 formamo complexo de sinalização endossomal, realizando o recrutamento de Rim101. 
Rim20 medeia a interação entre Snf7, Rim13 e Rim101, o que gera a ativação do fator de 
transcrição Rim101 por proteólise citoplasmática. Ao ser ativado ele é translocado ao núcleo, 
onde reprime o gene nrg1 (Herranz et al., 2005; Peñalva et al., 2008; Cornet et al., 2009; 
Herrador et al., 2010; Subramanian et al., 2012; Ost et al., 2015). Como resultado da 
repressão do gene nrg1, um repressor de genes de resposta alcalina, ocorre a ativação destes 
genes (Lamb e Mitchell, 2003). É importante salientar que foi demonstrado que a porção N-
terminal é essencial para ativação da cascata e interação entre Rim8 e Rim21 (Herranz et al., 
2005). Além disso, por ser uma arrestina, Rim8 é regulada por ubiquitinação (recrutamento de 
ESCRT) e fosforilação (Becuwe et al., 2012). Em S. cerevisiae, foi proposto que o papel da 
fosforilação da proteína (por caseína quinase 1) é de evitar o acúmulo de Rim8 na membrana 
plasmática e inibir a via de sinalização RIM na ausência de estímulo por alcalinização 
extracelular (Herrador et al., 2015). 
37 
 
Figura 4- Modelo de recrutamento da maquinaria ESCRT mediada por Rim8 
Em pH alcalino o receptor PalH/Rim21-Dfg16 é ativado, transmitindo um sinal para a fosforilação e 
ubiquitilação de Rim8/PalF pela ligação na região C-terminal de Rim21/PalH. Rim8/PalF ubiquitilada se liga a 
Vps23 e a Rim23/PalC, sendo todo este complexo endocitado (possivelmente) e recrutando toda a maquinaria 
ESCRT do corpo multivesicular endossomal, além das proteínas Rim13/PalB e Rim20/PalA. Rim23/PalC e 
Rim20/PalA se ligam a Vps32 e Vps20, enquanto Rim13/PalB se liga a Vps24, o que leva ao recrutamento de 
Rim101/PacC. Este fator de transcrição é ativado proteoliticamente por Rim13/PalB e é levada ao núcleo, onde 
atua sob genes de resposta ao pH (não mostrado na ilustração). Em A. nidulans toda a sinalização ocorre na 
membrana plasmática e o processo de proteólise consiste em duas etapas; em C. albicans Rim8 é 
hiperfosforilado e acredita-se que ele interaja com Rim21 e Rim101 de forma direta, não sendo conhecido o 
papel da Vps23. 
 
Legenda: Ub – ubiquitinação; P – fosforilação; interrogação (?) – processo ainda não confirmado. 
Fonte: Adaptado de Cornet e Gaillardin (2014). 
 
As diferenças dessa via em A. nidulans (no qual a via é chamada PAL – Figura 4) 
encontram-se no fato de a proteólise possuir uma segunda etapa de processamento; de os 
parálogos Rim21-Dfg existirem como apenas uma proteína (PalH); de alguns componentes da 
cascata possuírem função parecida, mas não idêntica à encontrada nas leveduras 
hemiascomicetas; e de o fator de transcrição PacC/Rim101 atuar diretamente em “genes 
ácidos e alcalinos” (Orejas et al., 1995; Galindo et al., 2007; Peñalva et al., 2008; Hervas-
38 
 
Aguilar et al., 2010; Bignell, 2012; Galindo et al., 2012; Lucena-Agell et al., 2015). Em C. 
albicans (Figura 4), uma das maiores diferenças é que Rim8 é hiperfosforilada ao invés de 
ubiquitinada, sendo que os mesmos fatores requeridos para fosforilação de Rim8 são 
necessários para ativação de Rim101. Outra variação é que a importância de Vps23 para a via 
ainda não foi descoberta, sendo que a associação do complexo de sinalização é feita com a 
Vps32 (que também realiza o recrutamento de Rim20, Rim13 e Rim101). Além disso, foi 
demonstrado que Rim8 pode se associar com Rim21 e Rim101, sendo sugerido que Rim8 
forma uma “ponte” entre o complexo de sinalização e a proteólise de Rim101 (Porta et al., 
1999; Davis et al., 2000; Davis, 2003; Cornet et al., 2009; Gomez-Raja e Davis, 2012). Os 
estudos desta via ainda são incipientes no basidiomiceto C. neoformans, mas indicam que não 
possui homólogos para o complexo sensorial presente na membrana de ascomicetos; e que a 
proteólise ocorre em duas etapas, sendo dependente da via de adenosina monofosfato cíclico 
(AMPc) e proteína quinase A. Apesar de não terem sido encontradas sequências similares 
entre as proteínas de sinalização de C. neoformans e de ascomicetos, a estrutura preditiva 
demonstrou a presença de 7TMD, sugerindo similaridade a Rim21/PalH. Além disso, 
evidenciou-se que a via ocorre na membrana plasmática e que a mesma está relacionada com 
a regulação da cápsula (O'meara et al., 2010; Ost et al., 2015). 
Estudo realizado com mutantes de componentes da via RIM/PAL (Vps28 e Vps32) em 
C. albicans demonstrou hipersensibilidade das cepas a antifúngicos com ação na parede 
celular (como as equinocandinas). Também foi verificada a diminuição da resistência a 
triazóis em todos os mutantes, sendo que a mutação levou os compostos a possuírem ação 
fungicida ao invés de fungistática (Cornet et al., 2006). Em cepas de A. fumigatus mutantes da 
via Pal, foi demonstrada maior suscetibilidade a azóis e anfotericina B pela instabilidade de 
membrana gerada e perda da homeostase de cátions pela alteração em transportadores 
catiônicos (Haas, 2012). 
 
2.8 PROTEÍNA RIM8 
 
A proteína não enzimática Rim8, também conhecida como PalF, Prr1 ou Art9, é 
essencial na via de sinalização de pH. Estudos demonstram que mutações em Rim8 e Rim101 
levam à redução da virulência, de lesão histológica e da capacidade danosa ao endotélio em C. 
albicans (Davis et al., 2000; Bignell et al., 2005). Estudos recentes apontam que Rim8 e Rsp5 
também estão envolvidas na ubiquitinação de Pma1 (bomba de exportação de prótons) em 
leveduras deficientes da bomba H
+
-ATPase vacuolar (responsável pela acidificação de 
39 
 
organelas). A associação dessa deficiência a mutações em Rim8 levaram à geração de 
leveduras com crescimento bastante lento, sendo a proteína considerada um componente 
crítico desta via (Smardon e Kane, 2014; Kane, 2016). 
Essa cascata de sinalização é considerada importante alvos de novas drogas 
antifúngicas, visto que a mudança de pH é uma causa de estresse extracelular à qual o 
microrganismo deve se adaptar muito rapidamente para realizar a interação patógeno-
hospedeiro, desenvolver doença e aumentar sua virulência (Davis et al., 2000; Bahn et al., 
2007; Bastidas et al., 2008; Davis, 2009; Bertuzzi et al., 2014; Cornet e Gaillardin, 2014). 
A partir de buscas na base de dados de nucleotídeos GenBank
®
 do National Center for 
Biotechnology Information (NCBI) é possível identificar a sequência gênica de rim8 de 
Paracoccidioides lutzii (número de acesso XM_002791656.1) (Benson et al., 2009; Sayers et 
al., 2009; Desjardins et al., 2011). A região codificadora possui 2.343 pb e gera a proteína 
“pH-response regulator protein palF/RIM8” de 780 aminoácidos, que possui 86.316,8 Da de 
massa molecular e ponto isoelétrico de 6,57, de acordo com a ferramenta Protparam 
(ExPASy) (Gasteiger et al., 2005). 
 Ao avaliar a predição de sítios conservados na Conserved Domains Database 
(NCBI) obtêm-se duas regiões arrestin-like nos domínios N-terminal e C-terminal (Marchler-
Bauer et al., 2015), corroborando os dados obtidos por Abadio et al. (2011). Na base de dados 
do Universal Protein Resource Knowledgebase (UniProtKB) a proteína foi depositada com a 
entrada C1H6Q0, porém é relatado apenas o domínio arrestin-like N-terminal (Magrane e 
Consortium, 2011). Essa base de dados reúne informações de diversas outras e dentre elas, a 
STRING 10, que apresenta como possíveis parceiros funcionais as proteínas Rim21, Rim101, 
E3 ubiquitina-ligase Rsp5, Rim13, Vps-Bro1, Rim20 e Vps-Snf7 (Szklarczyk et al., 2015). 
 É possível prever ortólogos e função gênica a partir do programa OrthoDB 
(Kriventseva et al., 2015), cujos dados são integrados aos de outras bases de dados, como o 
Uniprot. A proteína Rim8 de P. lutzii está contida no grupo EOG8ZCRKW (análise em todos 
os fungos) contendo 190 genes ortólogos em 161 espécies fúngicas, dos quais 163 possuem o 
domínio arrestin-like N-terminal, 127 possuem immunoglobulin E-set e 122 possuem 
arrestin-like C-terminal. Dentre os