Investigação citogenômica do impacto dos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no aparecimento de doenças autoimunes pós COVID-19 (2022)

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENFERMAGEM
MARINA CARAVANTE DA SILVA
INVESTIGAÇÃO CITOGENÔMICA DO IMPACTO DOS POLIMORFISMOS
DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO (SNPs) NO APARECIMENTO DE DOENÇAS
AUTOIMUNES PÓS COVID-19
SÃO PAULO
2022
MARINA CARAVANTE DA SILVA
INVESTIGAÇÃO CITOGENÔMICA DO IMPACTO DOS POLIMORFISMOS
DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO (SNPs) NO APARECIMENTO DE DOENÇAS
AUTOIMUNES PÓS COVID-19
Monografia apresentada à Escola de
Enfermagem da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Bacharela em
Enfermagem.
Área de concentração: Cuidado em saúde.
Orientadora: Profª Drª Leslie Domenici
Kulikowski
Coorientador: Doutorando Gleyson Francisco da
Silva Carvalho
São Paulo
2022
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Assinatura: _____________________________
Data:___/___/______
Catalogação-na-publicação (CIP)
Biblioteca Wanda de Aguiar Horta
Escola de Enfermagem da Universidade de São Paulo
Ficha catalográfica automatizada.
Bibliotecária responsável: Fabiana Gulin Longhi (CRB-8: 7257)
Nome: Marina Caravante da Silva
Título: Investigação citogenômica do impacto de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs)
no aparecimento de doenças autoimunes pós COVID-19.
Monografia apresentada à Escola de Enfermagem da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Bacharela em Enfermagem.
Aprovado em: ____ / ____ / ____
Banca Examinadora
Orientadora: Profª Drª ______________________________________________
Instituição: _________________________ Assinatura: ____________________
Prof Dr __________________________________________________________
Julgamento: ________________________ Assinatura: ____________________
Prof Dr __________________________________________________________
Julgamento: ________________________ Assinatura: ____________________
Prof Dr __________________________________________________________
Julgamento: ________________________ Assinatura: ____________________
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, Priscila e Alexander, que estiveram presentes em todos os
momentos da minha vida, pelo seu apoio, incentivo, dedicação e carinho, que me deram
estrutura e coragem para buscar alçar vôos cada vez mais altos, em especial nos últimos
quatro anos pelo suporte para minha formação acadêmica.
À minha família, que me encoraja e incentiva meus sonhos desde muito pequena,
principalmente aos meus avós, Maria Cristina e Jidevaldo, e às minhas tias, Kátia e Patrícia.
Ao meu namorado, William, pelo apoio durante os momentos mais difíceis da minha
graduação e pela leitura e ajuda na elaboração de todas as versões deste trabalho, desde o
projeto de pesquisa.
Às minhas amigas Ariani, Vitoria e Sheila, por estarem ao meu lado desde o primeiro dia da
graduação e terem tornado os últimos anos mais leves.
Aos pacientes participantes deste projeto de pesquisa e todos aqueles que desenvolveram
doenças autoimunes ou faleceram em decorrência da COVID-19, que este trabalho auxilie na
compreensão destas doenças.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Profª Drª Leslie Domenici Kulikowski, pelo apoio durante toda a
elaboração desta pesquisa, além da ajuda e incentivo em cada etapa e confiança em meu
trabalho.
Ao grupo de pesquisadores do Laboratório de Citogenômica do Hospital das Clínicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo: Amom, Beatriz, Lucas, Sâmar,
Vanessa, Yanca e em especial ao doutorando Gleyson, pelos ensinamentos, suporte e
dedicação em todos os passos para a elaboração desta pesquisa.
Aos pacientes participantes deste projeto, que doaram amostras de seu sangue para o
desenvolvimento deste trabalho e aprimoramento da pesquisa no Brasil.
Ao Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica do Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (PIBIC-CNPq) pelo apoio financeiro que
possibilitou a realização deste trabalho.
Conheça todas as teorias, domine todas as técnicas, mas ao tocar uma alma
humana, seja apenas outra alma humana.
(Carl Jung)
Silva MCS. Investigação Citogenômica do impacto dos polimorfismos de nucleotídeo único
(SNPs) no aparecimento de doenças autoimunes pós COVID-19 [monografia]. São Paulo:
Escola de Enfermagem, Universidade de São Paulo; 2022.
RESUMO
Introdução: Em 2019 surgiu um novo tipo de coronavírus, responsável por causar a doença
COVID-19, intitulado SARS-CoV-2. No entanto, a doença tem sido relatada também como
possível desencadeadora de doenças autoimunes, que são caracterizadas por uma reação
adversa do sistema imunológico às células saudáveis do próprio indivíduo. Estas doenças
possuem um mecanismo complexo de ativação que inclui fatores genéticos associados à uma
maior suscetibilidade de alguns indivíduos que pode estar relacionada à presença de
polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) específicos. Nesse estudo, avaliamos a presença
de SNPs associados às doenças artrite reumatóide, asma, diabetes mellitus tipo 1, esclerose
múltipla, lúpus eritematoso sistêmico e tireoidite de Hashimoto; que representam seis das
principais doenças autoimunes. Objetivos: Identificar os SNPs de suscetibilidade específicos
associados ao aparecimento dessas doenças autoimunes no pós COVID-19. Método: Foram
analisadas 48 amostras de DNA de pacientes previamente contaminados pelo vírus
SARS-CoV-2 utilizando a técnica de SNP-array com uso do Infinium ImmunoArray-24 v2
BeadChip. A análise e interpretação dos SNPs e das regiões genômicas foi realizada
utilizando o programa BlueGenome e a linguagem de programação R, as variantes foram
avaliadas por meio dos seguintes bancos de dados: GWAS Catalog, dbSNP, Database of
Genomic Variants (DGV) e UCSC Genome Bioinformatics. Resultados: Os resultados do
estudo de associação nos permitiram filtrar e identificar 15 SNPs com os menores valores-P,
para cada doença de interesse, na casuística selecionada, portanto, estatisticamente mais
associadas com o fenótipo apresentado. Além disso, também foi possível identificar dois
pacientes, que desenvolveram esclerose múltipla após a infecção pelo vírus SARS-CoV-2, que
possuem compatibilidade alélica para seis SNPs previamente associadas na literatura à
esclerose múltipla e um paciente, que desenvolveu asma pós COVID-19, com
compatibilidade alélica para cinco SNPs associadas a doença. Discussão: Os resultados
obtidos a partir do experimento possibilitaram a identificação de SNPs previamente
associados na literatura com as doenças de asma e esclerose múltipla e confirmar, em uma
casuística brasileira, essa associação. Além disso, foi possível identificar a predisposição em
pacientes que, de fato, apresentaram os primeiros sintomas após a COVID-19. Assim, a
investigação de SNPs específicos pode contribuir diretamente para aprimorar o entendimento
de variantes genômicas consideradas como um possível gatilho para doenças autoimunes de
impacto importante na população, como a esclerose múltipla, encontrada no nosso estudo.
PALAVRAS-CHAVE: Doenças autoimunes. COVID-19. SNP-array.
Silva MCS. Cytogenomic investigation of single nucleotide polymorphisms (SNPs) as a
trigger of autoimmune diseases after COVID-19 [monography]. São Paulo: School of
Nursing, University of São Paulo; 2022.
ABSTRACT
Introduction: In 2019 transmission cases of a new type of coronavirus were reported, entitled
SARS-CoV-2, responsible for causing the COVID-19 disease. However, the disease has been
also reported as a trigger of autoimmune diseases, which are characterized by an abnormal
reaction from the immune system against the body’s healthy cells. These diseases have a
complex activation mechanism including genetic factors associated with a higher
susceptibility in some individuals which can be related to the presence of specific single
nucleotide polymorphisms (SNPs). In this study, we evaluated the presence of SNPs
associated with the diseases rheumatoid arthritis, asthma, diabetes mellitus type 1, multiple
sclerosis, systemic lupuserythematosus and Hashimoto’s thyroiditis; which represent six of
the most common autoimmune diseases. Objectives: Identify specific susceptibility SNPs
associated with the appearance of this autoimmune diseases after COVID-19. Methods: Were
evaluated 48 DNA samples from patients previously infected by the SARS-CoV-2 virus using
the SNP-array technique with the Infinium ImmunoArray-24 v2 BeadChip. The analyses and
interpretation of the SNPs and genomic regions were performed using the BlueGenome
software and R programming language, while the variants were evaluated using the following
databases: GWAS Catalog, dbSNP, Database of Genomic Variants (DGV) e UCSC Genome
Bioinformatics. Results: The results of the genome association study allowed us to filter and
identify 15 SNPs, for each disease of interest, with the lowest P-values in the selected
samples, and therefore, statistically more related to the presented phenotype. Besides that, we
also identified two patients, who developed multiple sclerosis after the infection by the
SARS-CoV-2 virus, with allelic compatibility for six SNPs previously reported in literature as
associated with the disease, and a patient, who developed asthma after COVID-19, with
allelic compatibility for five SNPs associated with the disease. Discussion: The results
obtained from the experiment allowed us to identify SNPs previously reported in literature as
associated with asthma and multiple sclerosis diseases and confirm, in a brazilian population,
this association. Additionally, it was possible to identify this predisposition in patients who, in
fact, showed the firsts autoimmune symptoms after COVID-19. Thus, the investigation of
specific SNPs can directly contribute to improve the understanding of genomic variants
considered as a possible trigger for autoimmune diseases with an important impact on the
population, such as multiple sclerosis and asthma, found in our study.
KEY-WORDS: Autoimmune diseases. COVID-19. SNP-array.
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 01 - Fenótipo apresentado pelos participantes do estudo. 25
Gráfico 02 - Manhattan dos SNPs para artrite reumatóide. 28
Gráfico 03 - Manhattan dos SNPs para asma. 28
Gráfico 04 - Manhattan dos SNPs para diabetes mellitus tipo 1. 28
Gráfico 05 - Manhattan dos SNPs para esclerose múltipla. 29
Gráfico 06 - Manhattan dos SNPs para lúpus eritematoso sistêmico. 29
Gráfico 07 - Manhattan dos SNPs para tireoidite de Hashimoto. 29
Gráfico 08 - Análise de coordenadas principais (PCoA) considerando a distribuição dos 30
SNPs pelos fenótipos.
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 - Bancos de dados e referências online usados no direcionamento e busca de 23
artigos científicos e informações.
Tabela 02 - Quantificação das amostras em ng/µl. 26
Tabela 03 - SNPs selecionadas para as doenças de interesse. 27
Tabela 04 - Resultados alélicos obtidos para as variantes relacionadas a artrite reumatóide. 31
Tabela 05 - Resultados alélicos obtidos para as variantes relacionadas a asma. 31
Tabela 06 - Resultados alélicos obtidos para as variantes relacionadas a diabetes mellitus 32
tipo 1.
Tabela 07 - Resultados alélicos obtidos para as variantes relacionadas a esclerose múltipla. 32
Tabela 08 - Resultados alélicos obtidos para as variantes relacionadas a lúpus. 33
Tabela 09 - Resultados alélicos obtidos para as variantes relacionadas a tireoidite de 33
Hashimoto.
Tabela 10 - SNPs com menor valor-P identificados para as doenças de interesse. 35
Tabela 11 - Resultados encontrados para os pacientes CV215, G3493 e G3494. 36
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 13
1.1. CONSIDERAÇÕES SOBRE A COVID-19 14
1.2. CONSIDERAÇÕES SOBRE AS DOENÇAS AUTOIMUNES 14
1.3. INFECÇÕES VIRAIS E DESENCADEAMENTO DE DOENÇAS 15
AUTOIMUNES
1.4. OS POLIMORFISMOS DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO - SNPS 16
1.5. INVESTIGAÇÃO DE SNPS PELA CITOGENÔMICA 16
1.6. JUSTIFICATIVA 17
2. OBJETIVOS 18
2.1. OBJETIVO GERAL 19
2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO 19
3. MATERIAIS E MÉTODOS 20
3.1. CASUÍSTICA 21
3.2. ESTUDO CITOGENÔMICO 21
3.3. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE SANGUE PERIFÉRICO 21
3.4. TRIAGEM GENÔMICA POR ARRAY 22
3.5. ANÁLISE DOS RESULTADOS 22
4. RESULTADOS 24
4.1. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO E QUANTIFICAÇÃO DO 25
MATERIAL
4.2. TRIAGEM GENÔMICA POR MÉTODO DE ARRAY 26
4.3. ANÁLISE DOS DADOS 26
4.3.1. Seleção de SNPs para as doenças de interesse 26
4.3.2. Resultados obtidos 27
4.3.3. Interpretação dos resultados obtidos 34
5. DISCUSSÃO 38
6. CONCLUSÃO 42
7. REFERÊNCIAS 44
https://docs.google.com/document/d/1l4Sr_YsGf683ITSx3X7bH9t0DmtcrC0T/edit#heading=h.77ayjme6jy2x
https://docs.google.com/document/d/1l4Sr_YsGf683ITSx3X7bH9t0DmtcrC0T/edit#heading=h.s3qjou26cij
https://docs.google.com/document/d/1l4Sr_YsGf683ITSx3X7bH9t0DmtcrC0T/edit#heading=h.s3qjou26cij
1. INTRODUÇÃO
14
1. INTRODUÇÃO
1.1. CONSIDERAÇÕES SOBRE A COVID-19
Em dezembro de 2019, foram registrados casos de transmissão de um novo vírus
intitulado SARS-CoV-2, causador da COVID-191. A família dos coronavírus já era conhecida
por causar infecções como a MERS-CoV e a SARS-CoV responsáveis, respectivamente, pela
Síndrome Respiratória do Oriente Médio e Síndrome Respiratória Aguda Grave de
Coronavírus2. Por sua vez, o SARS-CoV-2 destaca-se por sua vasta capacidade de
contaminação, transmissão e amplo espectro clínico. Devido a sua simples forma de
transmissão, o vírus foi capaz de percorrer o mundo, tornando-se uma pandemia. Além disso,
os indivíduos infectados possuem manifestações clínicas que variam de uma infecção
assintomática a quadros graves3.
Frente a isso, observou-se que o fenótipo clínico da maioria dos indivíduos são
sintomas leves e inespecíficos como tosse seca, febre baixa ou dores no corpo, o que dificulta
o diagnóstico clínico da doença, sendo necessária a realização de testes diagnósticos como o
teste RT-qPCR2. Entretanto, além dos sintomas e complicações no trato respiratório, a doença
tem sido relatada também como possível desencadeadora de doenças autoimunes, dentre elas:
lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Guillain-Barré e esclerose múltipla4. Acredita-se
ainda que mais doenças autoimunes desencadeadas pela COVID-19 venham a ser relatadas no
futuro5.
Assim, o aparecimento de doenças autoimunes encontrada em alguns indivíduos após
a infecção por COVID-19 representa um desafio para a compreensão dos mecanismos que a
desencadeiam, exigindo que novas metodologias de pesquisa, como por exemplo, o estudo do
impacto dos polimorfismos de nucleotídeos únicos neste processo, proposto nesse projeto,
ajudem a estabelecer novas formas de compreender este desencadeamento.
1.2. CONSIDERAÇÕES SOBRE AS DOENÇAS AUTOIMUNES
As doenças autoimunes caracterizam-se por uma falha que provoca uma reação das
células imunes, devido à perda da tolerância imunológica, aos antígenos de células saudáveis
do indivíduo6. Em consequência, há a produção de autoanticorpos que promovem a
manutenção de reações inflamatórias e progressivo dano tecidual, o que pode evoluir para
uma destruição completa do tecido afetado7. A incidência e prevalência destas doenças não
são concretamente estabelecidas, no entanto, estima-se que cerca de 8-10% da população
ocidental possui doenças autoimunes8. No Brasil, são poucos os dados epidemiológicos
15
oficiais relativos às doenças autoimunes, apesar disso, hipotetiza-se que esteja ocorrendo um
aumento significativo da prevalência destas doenças no país9.
Assim, um estudo realizado com usuários do Sistema Único de Saúde da microrregião
de Águas Formosas, em Minas Gerais, identificou dentre as 15 com maior prevalência as
doenças: tireoidite de Hashimoto, artrite reumatóide, diabetes mellitus tipo 1, lúpus
eritematoso sistêmico e esclerose múltipla9. Desta maneira, foram selecionadas as doenças
citadas anteriormente em conjunto com a asma para a realização da presente pesquisa devido
à sua relevância clínica e prevalência.
Estas doenças possuem um mecanismo complexo de ativação, ainda não
completamente compreendido, que envolve a relação entre fatores reguladoresde vias
moleculares e celulares. Quando estas vias são comprometidas, há uma falha do organismo
em manter a tolerância aos componentes próprios, o que pode acontecer por fatores que
incluem a genética e fatores ambientais como a exposição a patógenos6.
Os fatores genéticos estão especialmente relacionados à uma maior suscetibilidade de
alguns indivíduos a desenvolver uma doença autoimune10, o que pode estar relacionado à
presença de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) em alguns genes destes indivíduos
que os tornem mais suscetíveis, em conjunto, a exposição a patógenos, como o vírus
SARS-CoV-2, pode contribuir para o início da autoimunidade em indivíduos geneticamente
predispostos11.
1.3. INFECÇÕES VIRAIS E DESENCADEAMENTO DE DOENÇAS
AUTOIMUNES
As doenças autoimunes podem ser desencadeadas, em indivíduos suscetíveis, em
resposta a infecções virais. No caso do SARS-CoV-2, acredita-se que isso ocorra por meio do
processo de mimetismo molecular5, o que promove a perturbação da tolerância imunológica
por exposição a determinantes antigênicos virais, que induzem anticorpos de reação cruzada
contra antígenos próprios e a manutenção da resposta imune12.
Na infecção pelo SARS-CoV-2 ocorre uma reação imunológica similar a das doenças
autoimunes, os danos teciduais são causados por uma resposta imune descontrolada,
caracterizada pela produção excessiva de citocinas e super ativação do sistema imune. Com a
quebra da tolerância imunológica ocorre a produção de autoanticorpos, assim, a COVID-19
pode desencadear uma reação cruzada provocando fenômenos autoimunes5.
Em pacientes com COVID-19, a produção excessiva de citocinas pró-inflamatórias e
quimiocinas pode causar dano severo aos tecidos em casos críticos, o que também ocorre nas
16
doenças autoimunes, assim, de maneira semelhante a estas doenças, os padrões moleculares
associados ao dano também participam da patogênese da COVID-19 e estão relacionados ao
desfecho da doença5.
1.4. OS POLIMORFISMOS DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO - SNPS
Os SNPs são variações do DNA em que a base nucleotídica varia na população, de
maneira que são as formas mais frequentes de variação encontradas no genoma humano e
também a forma mais simples de mutação em uma base única13. Acredita-se que estas
variações ocorram aproximadamente uma vez a cada 1.000 nucleotídeos, podendo ser
variações únicas ou ocorrer em certos grupos populacionais.
Os SNPs podem ser encontrados em regiões intergênicas e assim atuar como
marcadores biológicos auxiliando a localizar genes associados a doenças, ou ainda, ocorrer no
meio dos genes ou em regiões regulatórias próximas, neste caso podem desempenhar papel
mais direto na doença ao afetar a função gênica, e assim, impactar na resposta individual a
doenças, infecções etc14. Desta maneira, consideramos que a investigação do impacto dos
SNPs no desencadeamento de doenças autoimunes fornece uma abordagem promissora na
compreensão do desenvolvimento destas doenças pós COVID-19.
1.5. INVESTIGAÇÃO DE SNPS PELA CITOGENÔMICA
Os SNPs, por serem variações muito pequenas no genoma, não são possíveis de serem
identificados por meio de técnicas citogenômicas clássicas15, assim, devem ser utilizadas
técnicas como hibridização de sondas em arranjos (SNP array), ligação de oligonucleotídeo
baseado em PCR e por sequenciamento16. Os ensaios realizados utilizando técnicas de
sequenciamento, apesar de possibilitarem uma análise muito mais detalhada do genoma ao
determinar a sequência completa das bases nucleotídicas de um indivíduo, possuem
limitações como o elevado custo do equipamento e de kits de reações, além da complexidade
para análise dos resultados15.
Assim, a técnica utilizada foi o SNP array, que permite investigar alterações
cromossômicas de perda e ganho de material genético submicroscópicas, incluindo
microdeleções e microduplicações e também dissomias uniparentais, o que permite a
realização de uma análise mais completa15. Nesta tecnologia são utilizados BeadChips, nos
quais milhares a milhões de genótipos podem ser analisados de uma vez por meio de micro
grânulos de sílica alojados em micropoços gravados e revestidos com várias cópias de uma
sonda de oligonucleotídeos visando um locus específico no genoma17. Para este estudo
utilizamos a plataforma Infinium ImmunoArray-24 v2 BeadChip Kit projetado para realizar
17
um mapeamento preciso de locus de suscetibilidade nos principais distúrbios mediados pelo
sistema imunológico.
1.6. JUSTIFICATIVA
Por ser um vírus de surgimento recente, ainda não foram amplamente analisados os
impactos da infecção pelo SARS-CoV-2, de maneira que ainda não existem muitos estudos
que o relacionem com o possível aparecimento de outras condições que afetam o organismo
humano após a contaminação.
Deve-se considerar ainda a relação entre infecções virais e o desencadeamento de
doenças autoimunes em indivíduos suscetíveis e a presença de relatos que evidenciam este
desencadeamento após a COVID-19. Além disso, as doenças autoimunes são consideráveis
causas de morbidade e mortalidade e possuem grande relevância sócio-econômica e de saúde
pública devido aos indivíduos afetados serem, frequentemente, adultos jovens, o que se
agrava ao considerar que existem dados insuficientes da prevalência dessas doenças no
Brasil9.
Portanto, torna-se relevante a busca por variantes genéticas que evidenciem esta maior
suscetibilidade, o que pode ser realizado por meio da busca e análise de SNPs em genes
associados ao desenvolvimento destas doenças, o que permite ainda posterior aconselhamento
dos indivíduos identificados como suscetíveis
2. OBJETIVOS
19
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
O objetivo geral desta pesquisa é, a partir de uma análise citogenômica, investigar o
impacto de SNPs em genes que aumentem a suscetibilidade para o desenvolvimento de
doenças autoimunes em indivíduos após infecção pela COVID-19.
2.2. OBJETIVO ESPECÍFICO
Identificar os SNPs de suscetibilidade associados a seis doenças autoimunes em
indivíduos previamente infectados pelo vírus SARS-CoV-2, sendo estas doenças: artrite
reumatóide, asma, diabetes mellitus tipo 1, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico e
tireoidite de Hashimoto.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
21
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. CASUÍSTICA
Neste projeto foram estudados 48 pacientes previamente infectados pelo vírus
SARS-CoV-2, sendo 28 pacientes que relataram o aparecimento de ao menos uma das
doenças autoimunes selecionadas para este estudo após a infecção pelo SARS-CoV-2 e 20
amostras controle. Todos os pacientes possuíam idade igual ou superior a 18 anos e tiveram
resultado “detectado” em teste RT-qPCR para COVID-19, considerado o método padrão-ouro
de diagnóstico da doença.
O estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética sob CAAE nº
57722722.7.0000.0068 sendo emitido parecer nº 5.392.133.
3.2. ESTUDO CITOGENÔMICO
Todos os experimentos descritos a seguir foram realizados no Laboratório de
Citogenômica do LIM 03, associado ao Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina
da Universidade de São Paulo e localizado no Bloco 12 do 2º andar do prédio dos
ambulatórios do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo.
3.3. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE SANGUE PERIFÉRICO
Após coleta das amostras de sangue, isolamos o DNA dos pacientes utilizando o
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) (Qiagen, Alemanha), de acordo com o protocolo do
fabricante. Assim, para que houvesse a ruptura da membrana plasmática das células contidas
nas amostras, foi adicionado 180 µl de Buffer ATL e realizada incubação por dez minutos a
85ºC, em seguida foi adicionado 20 µl de Proteinase K e incubado a 56°C por uma hora. Após
este período, para garantir a completa lise celular, foi adicionado 200 µl de Buffer AL e
realizada incubação à 70°C por dez minutos. Posteriormente, foi adicionado 200 µl de etanol
96-100%, realizada homogeneização e transferência do material para uma coluna de
purificação, quefoi centrifugado por um minuto a 8.000 rpm, após centrifugação a coluna de
purificação foi transferida para um novo tubo e o filtrado foi descartado, a partir deste
momento, a cada lavagem este processo de troca do tubo foi realizada novamente.
Em seguida, iniciamos a primeira lavagem ao adicionar 500 µl de Buffer AW1 e
centrifugamos por um minuto a 8.000 rpm, para a segunda lavagem foi adicionado 500 µl de
Buffer AW2 e centrifugado por três minutos a 14.000 rpm. Após realização das lavagens, a
coluna de purificação foi transferida para um tubo de 1,5 ml e realizada eluição com 150 µl de
22
Buffer AE e incubado por um minuto em temperatura ambiente e então centrifugado por um
minuto a 8.000 rpm. Após extraído, o DNA obtido das amostras de sangue foi quantificado
em ng/µL pelo fluorômetro Qubit e diluído, quando necessário, para obter a concentração
mínima de 50 ng/µL, exigida para realização do experimento.
3.4. TRIAGEM GENÔMICA POR ARRAY
A investigação genômica foi realizada conforme protocolo para o Infinium
ImmunoArray-24 v2 BeadChip, que consiste em inicial amplificação do DNA extraído a
partir da desnaturação e neutralização das amostras, ao adicionar 20 µl do reagente MA1 à
placa, na qual foram colocados 4 µl de DNA e 4 µl do reagente 0.1N NaOH, em seguida foi
incubado e adicionado 34 μl do reagente MA2 e 38 μl do reagente MSM por poço. Neste
momento a placa foi incubada entre 20 e 24 horas, o que promove uma amplificação uniforme
do genoma e gera quantidade suficiente de DNA para ser utilizado. Em seguida realizamos a
fragmentação enzimática, que garante que as amostras tenham sido fragmentadas nos pontos
de quebra, prevenindo a excessiva fragmentação, nesta etapa foi adicionado 25 μl do reagente
FMS e realizada incubação em banho-seco por uma hora.
A partir da fragmentação foi realizada a precipitação ao adicionar 50 μl do reagente
PM1 e 155 μl do reagente 2-propanol 100% após incubação, homogeneizada e incubada
novamente, centrifugada, removido o excesso de líquido e aguardo da secagem completa.
Para a ressuspensão do DNA precipitado foi adicionado 23 µl do reagente RA1 e incubado.
Após este procedimento foi realizada a hibridização do DNA ao Infinium ImmunoArray-24
v2 BeadChip, que consistiu na desnaturação do DNA em banho-seco, montagem das câmaras
de hibridização, dispensação de 14 µl de cada amostra no BeadChip e nova incubação. Por
fim, foram realizadas as lavagens do BeadChip com reagente PB1, extensão de única base e
coloração das bases para leitura do chip no array scanner iScan®.
3.5. ANÁLISE DOS RESULTADOS
Após a obtenção dos dados genômicos brutos por meio da leitura do Infinium
ImmunoArray-24 v2 BeadChip pelo equipamento iScan®, os resultados obtidos foram
compilados, sendo organizados e subsequentemente submetidos à análise e interpretação. Os
SNPs associados às doenças de interesse foram filtrados, utilizando o programa
GenomeStudio e por linguagem de programação R, além disso, as variantes foram avaliadas
por meio de informações obtidas no banco de dados GWAS Catalog, que proporciona a
investigação do impacto de variantes comuns em doenças de origem complexa.
23
Por meio do GWAS Catalog foram selecionadas de cinco a dez SNPs, para cada uma
das doenças autoimunes escolhidas, que possuíam simultaneamente os menores valores-P e
estudos significativos e, portanto, sendo as variantes com maior potencial de relação com o
fenótipo estudado. Em conjunto, utilizamos também informações dos bancos de dados:
Database of Genomic Variants (DGV), UCSC Genome Bioinformatics e dbSNP, para
obtenção de informações adicionais, tais como incidência populacional das variantes e demais
relatos clínicos em bancos de dados como o ClinVar, conforme tabela a seguir.
Tabela 1 - Bancos de dados e referências online usados no direcionamento e busca de artigos científicos e
informações.
Banco de dados e
referências Descrição
GWAS Catalog Catálogo público que compila dados de estudos de associação em todo ogenoma disponível em: <https://www.ebi.ac.uk/gwas/>.
Database of Genomic
Variants (DGV)
Catálogo público de alterações genômicas estruturais disponível em:
<http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home>.
UCSC Genome
Bioinformatics
Software que permite a visualização de porções específicas do genoma
disponível em: <https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway>.
dbSNP Catálogo público de SNPs disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/>.
ClinVar Banco de dados público que relaciona variantes genéticas a fenótiposhumanos disponível em: <https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/>.
Online Mendelian Inheritance
in Man (OMIM)
Catálogo online de genes humanos e doenças genéticas disponível em:
<https://www.omim.org>.
PubMed Site para busca de referências bibliográficas mundiais em saúdedisponível em: <https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov>.
4. RESULTADOS
25
4. RESULTADOS
Realizamos a seleção de 48 pacientes atendidos no Hospital das Clínicas da Faculdade
de Medicina da Universidade de São Paulo, com idade igual ou superior a 18 anos,
previamente contaminados pelo vírus SARS-CoV-2 que tiveram resultado ‘‘detectado’’ em
teste RT-qPCR.
Dos quais, 28 pacientes relataram apresentar ao menos uma das doenças autoimunes
selecionadas para este estudo após terem sido diagnosticados com COVID-19, de acordo com
o gráfico a seguir.
Gráfico 1 - Fenótipo apresentado pelos participantes do estudo.
Após seleção dos pacientes, foi realizada a coleta de cerca de 4 ml de sangue
periférico e extraído o DNA das amostras para realização da triagem genômica por método de
array com uso do Infinium ImmunoArray-24 v2 BeadChip. A triagem por método de array
foi dividida em dois experimentos com 24 amostras em cada. A avaliação e interpretação dos
dados brutos foi completada e detalhada no item 4.3.
4.1. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO E QUANTIFICAÇÃO DO MATERIAL
Após seleção das amostras, foi realizada extração de DNA genômico e quantificação
do material para realização do experimento, com uso do QIAamp DNA Blood Mini Kit (250),
seguindo o protocolo do fabricante.
Após extraído, o DNA genômico obtido das amostras de sangue foi quantificado em
ng/µL com uso do fluorômetro Qubit, conforme demonstrado na tabela a seguir. Todas as
26
amostras apresentaram níveis adequados ou aceitáveis em seus parâmetros de qualidade para
utilização na técnica de array.
Tabela 2 - Quantificação das amostras em ng/µL.
Amostra Quantificação Amostra Quantificação Amostra Quantificação
C-6 57.2 ng/µL C-120 166 ng/µL C-229 55.9 ng/µL
C-7 59.2 ng/µL C-129 56.6 ng/µL C-230 139 ng/µL
C-8 72.6 ng/µL C-133 52 ng/µL C-232 56.4 ng/µL
C-14 187 ng/µL C-135 57.3 ng/µL C-236 114 ng/µL
C-27 70.2 ng/µL C-149 54.6 ng/µL C-237 55.8 ng/µL
C-29 79.6 ng/µL C-150 116 ng/µL C-241 51.4 ng/µL
C-45 52.3 ng/µL C-162 56.1 ng/µL C-243 56.3 ng/µL
C-47 57.2 ng/µL C-163 70.6 ng/µL C-244 55.3 ng/µL
C-49 52.2 ng/µL C-167 52.6 ng/µL C-247 65.4 ng/µL
C-63 241 ng/µL C-184 104 ng/µL C-259 55.7 ng/µL
C-70 251 ng/µL C-189 68 ng/µL C-261 50.6 ng/µL
C-71 98.3 ng/µL C-198 59.2 ng/µL C-287 56.4 ng/µL
C-72 135 ng/µL C-206 55.6 ng/µL C-291 65.1 ng/µL
C-75 201 ng/µL C-212 191 ng/µL C-321 130 ng/µL
C-81 54 ng/µL C-215 120 ng/µL C-323 51.4 ng/µL
C-86 114 ng/µL C-219 50.5 ng/µL C-370 57 ng/µL
C-90 76.7 ng/µL C-220 70 ng/µL C-375 105 ng/µL
C-94 107 ng/µL C-221 58.7 ng/µL C-378 210 ng/µL
C-95 53.6 ng/µL C-222 60.1 ng/µL C-384 56.3 ng/µL
C-102 54.2 ng/µL C-223 52.2 ng/µL G-3493 117 ng/µL
C-105 151 ng/µL C-225 53.2 ng/µL G-3494 67.8 ng/µL
C-107 51.4 ng/µL C-226 56.9 ng/µL G-3510 53.5 ng/µL
C-110 135 ng/µL C-227 54.2 ng/µL G-3511 57 ng/µL
C-119 190 ng/µL C-228 50.4 ng/µL P-798 54.4 ng/µL
4.2. TRIAGEM GENÔMICA POR MÉTODO DE ARRAY
Depois da extração e quantificação das amostras selecionadas, foi realizada a triagem
genômica utilizando o método de array com uso do chip Infinium ImmunoArray-24 v2
BeadChip, em três dias de experimento. A partir da leitura dos chips, foi possível identificar
as variantes presentes nas amostras selecionadas, apresentadasno item 4.3.3.
4.3. ANÁLISE DOS DADOS
4.3.1. Seleção de SNPs para as doenças de interesse
27
Por meio do banco de dados GWAS Catalog, foram selecionadas dez SNPs para as
seguintes doenças: asma, esclerose múltipla e lúpus eritematoso sistêmico, nove SNPs para as
doenças artrite reumatóide e diabetes mellitus tipo 1, e cinco SNPs para a doença tireoidite de
Hashimoto, que possuíam simultaneamente os menores valores-P e estudos significativos, a
fim de compará-los com os resultados obtidos após a triagem genômica das amostras
selecionadas neste projeto. Assim, foram selecionados os SNPs expostos na tabela a seguir.
Tabela 3 - SNPs selecionadas para as doenças de interesse.
4.3.2. Resultados obtidos
Posteriormente à seleção dos SNPs específicos para as doenças estudadas neste
projeto, apresentados na tabela 3, e obtenção dos dados genômicos brutos por meio da
realização da triagem genômica por método de array, os resultados obtidos foram
compilados, sendo organizados e subsequentemente submetidos à análise e interpretação. Os
SNPs associados às doenças de interesse, encontrados no genoma dos pacientes estudados,
foram filtrados utilizando o programa Bluefuse e pela linguagem de programação R, assim,
foi possível realizar um estudo de associação genômica na casuística selecionada.
Para interpretação dos SNPs encontrados neste estudo, elaboramos os seguintes
gráficos de Manhattan, que nos permitem comparar os SNPs encontrados em todo o genoma
da população estudada a partir dos valores-P a que cada SNP está associado, nestes gráficos é
apresentado, no eixo vertical, o -log10 do valor-P encontrado e, no eixo horizontal, os
cromossomos nos quais cada SNPs está localizado, de forma que cada ponto representa uma
variante analisada. A linha vermelha nos gráficos representa o threshold, ou seja, o limiar de
28
significância estatística apropriada que nos permite diferenciar os SNPs verdadeiramente
representativos, assim, os pontos mais altos acima deste limiar representam os SNPs
significativamente associados ao fenótipo analisado e, portanto, com menor valor-P18.
Gráfico 2 - Manhattan dos SNPs para artrite reumatóide
Gráfico 3 - Manhattan dos SNPs para asma
Gráfico 4 - Manhattan dos SNPs para diabetes mellitus tipo 1
29
Gráfico 5 - Manhattan dos SNPs para esclerose múltipla
Gráfico 6 - Manhattan dos SNPs para lúpus eritematoso sistêmico
Gráfico 7 - Manhattan dos SNPs para tireoidite de Hashimoto
30
Assim, a partir dos resultados anteriormente apresentados, realizamos uma análise das
coordenadas principais (PCoA), apresentada a seguir, que considera a distribuição dos SNPs
encontrados pelos fenótipos de interesse, a partir do qual é possível comparar graficamente os
resultados encontrados nos fenótipos e nos controles e entender se há uma dissimilaridade
entre eles. Na figura observamos pouca segregação entre os resultados encontrados para cada
fenótipo entre si e também em comparação aos controles, o que demonstra uma
homogeneização dos resultados encontrados, que pode ocorrer em estudos de associação
genômica principalmente devido à baixa casuística.
Gráfico 8 - Análise de coordenadas principais (PCoA) considerando a distribuição dos SNPs pelos fenótipos
Ademais, a partir dos dados obtidos também foi possível identificar os alelos presentes
no genoma dos pacientes e relacioná-los com os alelos de impacto descritos na literatura para
os fenótipos estudados associados a cada SNP previamente selecionado e apresentado no item
4.3.1, de maneira que a presença deste alelo de impacto no genoma do paciente representa a
relação de suscetibilidade para o fenótipo associado a cada SNP.
Com isso, para as SNPs previamente relatadas na literatura, investigamos o perfil
alélico em relação aos alelos de impacto mencionados, como é exemplificado nas tabelas 4 a
9, em que, destacadas em verde, estão os marcadores em homozigose e, em amarelo, os
marcadores em heterozigose.
31
Tabela 4 - Resultados alélicos obtidos para as variantes relacionadas a artrite reumatóide.
Tabela 5 - Resultados alélicos obtidos para as variantes relacionadas a asma.
32
Tabela 6 - Resultados alélicos obtidos para as variantes relacionadas a diabetes mellitus tipo 1.
Tabela 7 - Resultados alélicos obtidos para as variantes relacionadas a esclerose múltipla.
33
Tabela 8 - Resultados alélicos obtidos para as variantes relacionadas a lúpus.
Tabela 9 - Resultados alélicos obtidos para as variantes relacionadas a tireoidite de Hashimoto.
34
4.3.3. Interpretação dos resultados obtidos
Desta forma, por meio da análise dos dados apresentados nos gráficos da Manhattan,
foi possível filtrar e identificar 15 SNPs, para cada uma das doenças autoimunes selecionadas
para este projeto, em que encontramos o menor valor-P apresentado na casuística selecionada.
O valor-P nos permite investigar de maneira estatística a associação das variantes na
população de casos e de controles, de forma que quanto menor seu valor, estatisticamente
mais relacionado ao fenótipo apresentado é a variante. Assim, os SNPs identificados foram
compilados e apresentados na tabela 10.
35
Tabela 10 - SNPs com menor valor-P identificados para as doenças de interesse.
36
Além disso, por meio da análise dos dados alélicos demonstrados nas tabelas 5 e 7, foi
possível identificar também, um paciente, cuja amostra foi identificada por CV215, que
desenvolveu asma após a infecção pelo vírus SARS-CoV-2, em que observamos, após
interpretação dos dados genômicos, compatibilidade alélica para cinco das dez variantes
genômicas previamente selecionadas associadas a doença desenvolvida (rs10197862,
rs1837253, rs3771166, rs744910 e rs9273349). Sendo que, dois destes SNPs apresentaram-se
em homozigose para o alelo de impacto (rs10197862 e rs9273349), conforme apresentado na
tabela 11.
Além deste, identificamos também outros dois pacientes, cujas amostras foram
identificadas por G3493 e G3494, que desenvolveram esclerose múltipla pós COVID-19 e,
após interpretação dos dados genômicos, apresentaram compatibilidade alélica para seis das
dez variantes genômicas previamente selecionadas associadas à esta doença (rs1077667,
rs12927355, rs1323292, rs1738074, rs1800693 e rs2104286). Assim, o paciente G3493
possui dois destes SNPs em homozigose para o alelo de impacto (rs1800693 e rs2104286),
enquanto o paciente G3494, possui quatro destes SNPs em homozigose para o alelo de
impacto (rs1077667, rs1323292, rs178074 e rs2104286), conforme apresentado na tabela a
seguir.
Tabela 11 - Resultados encontrados para os pacientes CV215, G3493 e G3494.
(continua)
Paciente SNP Gene Alelo deImpacto Zigosidade
Coordenada Genômica
(GRCh38)
CV215
rs10197862 IL1RL1 A Homozigose Chr2: 102350089
rs1837253 Intergênica C Heterozigose Chr5: 111066174
rs3771166 IL18R1 G Heterozigose Chr2: 102369762
rs744910 SMAD3 G Heterozigose Chr15: 67154447
rs9273349 HLA-DQB1-AS1 C Homozigose Chr6: 32658092
G3493
rs1077667 TNFSF14 G Heterozigose Chr19: 6668961
rs12927355 CLEC16A C Heterozigose Chr16: 11100914
rs1323292 LOC105371664 A Heterozigose Chr1: 192571891
rs1738074 TAGAP C Heterozigose Chr6: 159044945
rs1800693 TNFRSF1A C Homozigose Chr12: 6330843
rs2104286 IL2RA T Homozigose Chr10: 6057082
G3494
rs1077667 TNFSF14 G Homozigose Chr19: 6668961
rs12927355 CLEC16A C Heterozigose Chr16: 11100914
rs1323292 LOC105371664 A Homozigose Chr1: 192571891
37
Tabela 11 - Resultados encontrados para os pacientes CV215, G3493 e G3494.
(continuação)
Paciente SNP Gene Alelo deImpacto Zigosidade
Coordenada Genômica
(GRCh38)
G3494
rs1738074 TAGAP C Homozigose Chr6: 159044945
rs1800693 TNFRSF1A C Heterozigose Chr12: 6330843
rs2104286 IL2RA T Homozigose Chr10: 6057082
(conclusão)
Assim, identificamos que o paciente CV215 apresenta homozigose alélica para as
variantes rs10197862 no gene IL1RL1 e rs9273349 no gene HLA-DQB1-AS1, enquanto
ambos pacientes G3493 e G3494 possuem homozigose alélica para a mesma variante
rs2104286 no geneIL2RA, o que pode demonstrar uma associação genótipo-fenótipo mais
forte para esta variante, tendo em vista o valor-P associado, p=2,16x10-7, que a define como
estatisticamente significante ao fenótipo encontrado e estudos anteriores que demonstram sua
relação com a doença de esclerose múltipla19.
Os resultados obtidos a partir do experimento possibilitaram identificar SNPs de
suscetibilidade estatisticamente relacionados aos fenótipos estudados e também uma
descoberta a respeito da relação genótipo-fenótipo ao considerar as relações de homozigose e
heterozigose para o alelo de impacto associado a cada SNP, pois estas relações de zigosidade
podem afetar ainda as relações de suscetibilidade de forma ainda desconhecida.
5. DISCUSSÃO
39
5. DISCUSSÃO
Neste trabalho, realizamos uma triagem genômica a fim de identificar a presença de
variantes genômicas conhecidas como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em
indivíduos que desenvolveram determinadas doenças autoimunes, sendo estas: artrite
reumatóide, asma, diabetes mellitus tipo 1, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico e
tireoidite de Hashimoto, após a infecção pelo vírus SARS-CoV-2. Para isso, filtramos e
identificamos quinze SNPs, que apresentaram os menores valores-P na casuística selecionada
e, portanto, que podem estar associadas a uma suscetibilidade genética para o
desenvolvimento destas doenças.
A partir dos dados obtidos por meio da triagem genômica, identificamos os valores-P
associados a cada variante e geramos gráficos que nos permitiram analisar a significância dos
SNPs encontrados com base em seus valores-P e também correlacionar os resultados
apresentados pelos casos e pelos controles. Os resultados apresentados nos gráficos de
Manhattan nos permitiram observar, mesmo com a limitação de uma casuística relativamente
pequena, a existência de marcadores significativamente associados aos fenótipos estudados.
Além disso, identificamos de forma relevante na casuística estudada duas variantes,
em especial, relacionadas a fenótipos de interesse para o estudo, previamente relatadas na
literatura, sendo: rs11745587, no gene IRF1-AS1, relacionada à asma severa, e a variante
rs988739, no gene ITGAM, relacionada ao lúpus eritematoso sistêmico. O SNP rs11745587 apesar
de se encontrar dentro de uma região não traduzida, conhecida por 3'UTR de C5orf56, está próximo
dos genes da citocina Th2 IL4 e IL13, e RAD50, região previamente relatada para associação sugestiva
com asma grave, o que pode indicar uma relação com o fenótipo20.
Já o gene ITGAM, em que se localiza a variante rs988739, codifica a cadeia de integrina
alfa M, que são proteínas integrais de membrana, o domínio contendo a integrina alfa
combina com a cadeia beta 2 para formar uma integrina específica de leucócitos referida
como receptor 1 de macrófagos. A integrina alfa M beta 2 é importante na adesão de
neutrófilos e monócitos ao endotélio estimulado, e também na fagocitose de partículas
revestidas de complemento21,22. Ademais, vários estudos demonstraram variações no gene
ITGAM como um fator de risco relacionado à suscetibilidade à doença e provavelmente a
manifestações graves de lúpus eritematoso sistêmico, assim, uma variante como a rs988739
pode alterar a função deste gene, possivelmente desencadeando doenças como o lúpus23.
Também selecionamos cinco a dez SNPs, com os menores valores-P, previamente
associadas a estudos que evidenciam uma maior relação de suscetibilidade entre estas
40
variantes e as doenças autoimunes de interesse para este projeto. A partir desta seleção,
realizamos uma triagem genômica a fim de identificar a presença destes SNPs de
suscetibilidade em indivíduos que desenvolveram estas doenças após a infecção pelo vírus
SARS-CoV-2.
Nossa análise permitiu identificar relações de homozigose para as variantes
rs10197862 no gene IL1RL1 e rs9273349 no gene HLA-DQB1 em um paciente (CV215) que
relatou o aparecimento e diagnóstico de asma após infecção pelo vírus SARS-CoV-2. O gene
IL1RL1 codifica uma proteína membro da família de receptores de interleucina 1, que faz
parte de um agrupamento de genes de receptores de citocinas, alguns estudos sugerem ainda
que este gene esteja relacionado com estímulos pró-inflamatórios, e pode estar envolvido na
função de células T auxiliares, assim, uma variante neste gene pode alterar seu funcionamento
gerando doenças, tal como a asma24.
Já o gene HLA-DQB1, faz parte de uma família de genes chamada complexo de
antígeno leucocitário humano (HLA), que ajuda o sistema imunológico a distinguir as
proteínas do próprio corpo das proteínas produzidas por organismos invasores como vírus e
bactérias. O gene HLA-DQB1 pertence a um grupo de genes que codificam proteínas
presentes na superfície de certas células do sistema imunológico, essas proteínas se ligam a
fragmentos de proteínas (peptídeos) fora da célula e exibem esses peptídeos ao sistema
imunológico, desencadeando uma resposta do sistema imune para o combate de organismos
invasores, no entanto, uma variante como a rs9273349, pode alterar a função deste gene de
maneira a confundir os peptídeos apresentados, gerando reações de autoimunidade25.
Além deste, identificamos também relações de homozigose para a variante rs2104286,
no gene IL2RA, em dois pacientes estudados (G3493 e G3494) que relataram o
desenvolvimento e diagnóstico da doença esclerose múltipla após contrair COVID-19 em
entrevista realizada após coleta das amostras e triagem genômica.
O gene IL2RA, em que se localiza a variante rs2104286, codifica a subunidade alfa do
receptor de superfície celular para o fator de crescimento de células T interleucina-2, que
desempenha um papel vital na manutenção do sistema imunológico, ao ser expresso em
células T reguladoras que estão envolvidas tanto na regulação da tolerância quanto na
expansão das células T26, com isso, esta variante pode alterar a função do gene, o que pode
gerar uma doença autoimune ao modificar a função de tolerância das células T reguladoras.
Além disso, um estudo de associação genômica realizado no Reino Unido e nos
Estados Unidos identificou dois SNPs, rs12722489 e rs2104286, no íntron 1 do gene IL2RA,
que foram fortemente associados à esclerose múltipla e possuíam, respectivamente, os
41
seguintes valores-P: p=2,96x10-8 e p=2,16x10-7, sendo o segundo um dos SNPs de interesse
deste projeto, a evidência encontrada neste estudo de que certos alelos codificando o gene
IL2RA, dentre eles os relacionados ao SNP rs2104286, estão associados com a doença
esclerose múltipla apoia a ideia de que polimorfismos em genes relacionados à regulação da
resposta imune são fatores importantes na esclerose múltipla19.
Ademais, na literatura também foram encontradas associações entre a doença
esclerose múltipla e a variante genômica rs2104286 em 211 pacientes e 521 parentes não
afetados de 43 famílias, ou seja, famílias que apresentam mais de um indivíduo afetado, para
a doença de esclerose múltipla27.
No cenário atual, a doença COVID-19 representa um desafio global para as políticas
de saúde, incluindo as diversas doenças relatadas após a doença. Além disso, a investigação
de SNPs específicos pode contribuir diretamente para aprimorar o entendimento de variantes
genômicas consideradas como um possível gatilho para importantes doenças autoimunes.
6. CONCLUSÃO
43
6. CONCLUSÃO
Foi possível identificar SNPs em genes que aumentam a suscetibilidade para o
desenvolvimento de doenças autoimunes em indivíduos após infecção por COVID-19 por
meio da técnica de SNP-array com uso do Infinium ImmunoArray-24 v2 BeadChip. Além
disso, também foi possível identificar os SNPs de suscetibilidade associados às seis doenças
autoimunes, selecionadas para este projeto, sendo estas doenças: artrite reumatóide, asma,
diabetes mellitus tipo 1, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico e tireoidite de
Hashimoto, em indivíduos infectados pelo vírus SARS-CoV-2.
Ademais, identificamosesta predisposição em pacientes que, de fato, apresentaram os
primeiros sintomas após a COVID-19. Assim, a investigação de SNPs específicos pode
contribuir diretamente para aprimorar o entendimento de variantes genômicas consideradas
como um possível gatilho para doenças autoimunes de impacto importante na população,
como a esclerose múltipla, encontrada no nosso estudo.
7. REFERÊNCIAS
45
7. REFERÊNCIAS
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