Prospecção de moléculas de interesse farmacológico nos canais da família K 2P

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Prospecção de moléculas de interesse farmacológico nos canais da 
família K2P 
 
João Antonio Alves Nunes1, Leonardo Cirqueira Pimentel1, Werner Leopoldo Treptow1 
 
1 – Laboratório de Biofísica Teórica e Computacional, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, 
Universidade de Brasília, Brasília, DF, Brasil. 
 
Resumo 
A família de canais iônicos de potássio Two-Pore-Domain (K2P) é responsável pela 
regulação do potencial de repouso da membrana, sendo importantes para a repolarização 
celular e para fenômenos de transmissão nervosa e excitabilidade neuronal. Os K2P são 
modulados por muitas classes de agentes farmacológicos, como antidepressivos, anestésicos, 
antipsicóticos e anti-inflamatórios, e por esses motivos esses canais são importantes alvos 
terapêuticos. Muitas moléculas com potencial farmacológico já demonstraram possuir 
interação com esses canais, dentre elas o TKDC, que é um potencial antidepressivo com ação 
inibitória sobre essa família, porém a busca por novas moléculas que interajam com esses 
canais ainda é fundamental para o desenvolvimento de novos fármacos. Tendo isso em vista, 
o objetivo desse trabalho foi prospectar moléculas de interesse farmacológicas, análogas ao 
TKDC, no canal TREK-1 da família K2P. Para isso, foram utilizados métodos computacionais, 
como a dinâmica molecular para obter um sistema em equilíbrio, e o docking molecular, que 
realiza os testes de interação entre os ligantes e o canal. Por fim, a energia de ligação e outros 
parâmetros como frequência dos contatos e pose de ligação foram avaliadas para determinar 
os potenciais ligantes. Foram identificadas 3 moléculas que apresentaram uma maior 
afinidade, quando comparada com a energia de ligação do TKDC. Além disso, essas mesmas 
moléculas apresentaram uma alta frequência dos contatos conhecidos e pose de ligação muito 
similar ao da molécula controle, sendo assim candidatos novos fármacos. 
 
 
 
Palavras-chave: canal iônico, canal de potássio, K2p, docking molecular, TREK-1, TKDC. 
 
 
Introdução 
Os canais iônicos de potássio são proteínas de membrana que permitem o fluxo desse 
cátion para dentro ou para fora da célula de forma altamente seletiva. Esse transporte de íons 
segue um gradiente eletroquímico pré-estabelecido e é indispensável para diversas funções 
celulares, como por exemplo: a contração muscular, a liberação de neurotransmissores e o 
controle da excitabilidade neuronal1,2. 
Alguns dos canais de potássio pertencem a família Two-Pore-Domain (K2P) sendo essa 
família majoritariamente expressa no sistema nervoso central (SNC), porém ocorrendo 
também em órgãos como os pulmões, rins, coração e trato gastrointestinal3,4. Essa família é 
composta por canais de repouso que são responsáveis pelo fluxo iônico de vazamento ou de 
fundo e consequentemente regulam o potencial de repouso da membrana, além de serem 
importantes para a repolarização celular após o potencial de ação2,5. 
Os membros da família K2P são canais independentes de voltagem e homodiméricos 
sendo que cada monômero possui 4 hélices transmembrânicas (M1-M4) que formam o poro, 
duas hélices extracelulares formando uma coifa (EC1-EC2), um filtro de seletividade (SF) 
com a sequência conservada de aminoácidos T-X-G-X-G e duas hélices (PH1-PH2) que 
sustentam o SF6–9 (Figura 1A). Na região transmembrânica, entre as hélices M2-M4, existem 
fenestras laterais que estão associadas com a regulação desses canais por lipídeos insaturados 
da membrana plasmática, além de serem importantes sítios de ligação de drogas7. Ainda, em 
alguns canais da família, é descrito um sítio entre as hélices M4-PH1 com importante papel na 
interação com moléculas que estabilizam a conformação ativa desses canais8. 
Mais recentemente foi descrito, através de métodos computacionais, o primeiro sítio 
de ligação na coifa extracelular, onde ocorre a interação do canal com a molécula TKDC10 
(Figura 1B). Essa molécula atua como inibidor de alguns canais da família K2P, através de um 
mecanismo de modificação conformacional, que ocorre quando o TKDC ocupa o sítio 
proteico promovendo o deslocamento da hélice EC2 e a obstrução do poro do canal10. Além 
disso, testes experimentais realizados com camundongos demonstraram um potencial efeito 
antidepressivo dessa molécula10. Outras classes de agentes farmacológicos que interagem com 
os canais K2P são: antidepressivos
7,11,12, antipsicóticos13, anti-inflamatórios14, agentes 
neuroprotetores15,16, antiarrítmicos17 e anestésicos gerais e locais2,18–20. 
 
Figura 1 – A) Arquitetura do canal humano TRAAK, pertencente à família K2P. Figura retirada de Brohawn (2015).9 
B) Estrutura química da molécula de TKDC. 
 
Por esse motivo é cada vez maior o interesse nos canais K2P como alvos terapêuticos e, 
portanto, faz-se necessário entender seu funcionamento molecular, os sítios de interações 
entre proteína-ligante e descobrir potenciais moléculas de interesse farmacológico que 
interajam com esses canais. 
Tendo isso em vista, o presente estudo teve como objetivo realizar a prospecção de 
moléculas de interesse farmacológico, análogas ao TKDC, no canal TREK-1 da família K2P, 
por meio de ferramentas computacionais, como o docking molecular, com a finalidade de 
encontrar possíveis novos fármacos, com alta afinidade por esses canais, que possam vir a ter 
uma aplicação na indústria farmacêutica. 
 
Materiais e Métodos 
Construção do sistema molecular 
O cristal do canal TREK-1 foi obtido do banco de dados RCSB PDB21, onde possui a 
entrada 6CQ68. Os resíduos de aminoácidos S35-K43, G113-S125 e E316-V321 que não 
foram resolvidos por cristalografia foram adicionados através do programa Modeller22. Para a 
construção do sistema foi utilizado um plugin do Visual Molecular Dynamics (VMD)23, o 
psfgen, que utiliza parâmetros do campo de força CHARMM3624 para unir vários arquivos 
com o formato .pdb em um único arquivo, além de criar um arquivo .psf, que é o formato 
compatível com os programas das etapas seguintes. Esse plugin também é capaz de inserir os 
átomos de hidrogênio que não são resolvidos pela cristalografia de raio X. 
Dessa forma, a proteína foi inserida em uma bicamada lipídica, composta por 
palmitoil-oleil-fosfatidilcolina (POPC), e solvatada em uma solução salina contendo 0,15M 
de KCl. 
Dinâmica Molecular 
Com o intuito de equilibrar o sistema molecular foram realizadas simulações por meio 
do programa Nanoscale Molecular Dynamics (NAMD)25 e com a utilização do campo de 
força CHARMM3624 como parâmetro de cálculo para proteína, lipídeos, água e íons. 
Essas simulações foram conduzidas a temperatura constante de 300K e pressão 
constante de 1 atm. Também foi utilizada as condições periódicas de contorno nos eixos X, Y 
e Z com a finalidade de evitar os efeitos de borda no sistema. A trajetória de equilíbrio do 
sistema teve seu tempo calculado para 45 ns, sendo que nos primeiros 5 ns foram aplicadas 
restrições na movimentação da proteína, com a finalidade de evitar desnaturação da sua 
estrutura terciária. 
Docking Molecular 
O docking molecular foi realizado por meio do programa AutoDockVina26, que 
apresenta as soluções com baixa energia de ligação. Para considerar possíveis flutuações 
durante a simulação de equilíbrio, os cálculos utilizaram 180 quadros retirados aleatoriamente 
dos últimos 35 ns da trajetória de equilíbrio. 
Para os procedimentos do docking foi utilizado o composto TKDC e outras 6 
moléculas similares, que foram escolhidas a partir do banco de dados PubChem27. Essa 
escolha foi pautada em critérios de: similaridade com a estrutura química do TKDC, peso 
molecular, área polar e número de átomos pesados. O docking de todas as moléculas foram 
realizados no mesmo sítio proteico composto pelos resíduos Q76, T79, I80, Q83, L102, Q105 
e localizado na coifa extracelular, mais especificamente entre as hélices EC1 e EC2, sendo 
esseo sítio de ligação descrito para o TKDC10. 
Os cálculos de docking para todas as moléculas foram realizados separadamente, 
portanto apresentaram soluções independentes, além disso foi considerado o caráter flexível 
dessas moléculas. 
Visualização e validação dos resultados 
O cálculo do desvio da raiz quadrática média (RMSD) foi realizado via script próprio 
com a finalidade de analisar a estabilidade do canal durante a simulação de equilíbrio. Para 
esse cálculo foi considerado apenas a cadeia principal da proteína. 
Os resultados do docking foram analisados via script feito manualmente para a 
obtenção das energias de ligação, dos contatos entre a proteína e os ligantes e das 
porcentagens de contatos descritos entre a proteína e os ligantes. Além disso, a visualização 
gráfica dos centros da nuvem de resultados do docking é possível através do programa VMD. 
 
Resultados e Discussão 
O sistema molecular final (Figura 2) foi equilibrado por 45 ns. A trajetória da 
simulação apresentou-se estável, tendo em vista a baixa variação nos valores de RMSD do 
canal (Figura 3). 
 
 
Figura 2 – Visualização do sistema embebido em bicamada lipídica (verde), com as camadas de solvatação (azul) e com o 
canal TREK-1 (roxo). 
 
 
Figura 3 – RMSD do esqueleto proteico do canal TREK-1 durante os 45 nanosegundos da trajetória de equilíbrio. 
Da trajetória de equilíbrio foram selecionados 180 quadros para a realização dos 
cálculos de docking com o TKDC e com as 6 moléculas análogas, que foram nomeadas nesse 
trabalho de TKDC like e numeradas de 1 a 6 (Figura 4). 
 
 
Figura 4 – Estrutura química das moléculas utilizadas para o cálculo de docking molecular; A) TKDC like 1; B) TKDC like 
2; C) TKDC like 3; D) TKDC like 4; E) TKDC like 5; F) TKDC like 6. 
 
Para o docking realizado com o TKDC, o sítio 21 foi o que melhor se assemelhou ao 
descrito na literatura10, apresentando um total de 21 soluções e uma energia de ligação de 
-7,1476 kcal/mol (Tabela 1). Como forma adicional de validar o resultado para essa molécula 
controle foi calculado a frequência dos contatos conhecidos, com base nos resíduos de 
aminoácidos: Q76, T79, I80, Q83, L102 e Q105, descritos por Luo et al (2017)10 como 
fazendo parte do sítio de interação do canal com o TKDC. Sendo assim, é possível observar 
que o sítio 21 apresentou uma frequência maior que 75% para todos esses resíduos de 
aminoácidos (Tabela 1), com destaque para os resíduos Q76, T80 e L102 que são os mais 
importantes para a interação proteína-ligante10. 
Os dockings para as outras 6 moléculas foram realizados, tomando como referência a 
energia de ligação encontrada para o TKDC, sendo que o TKDC like 1, like 3 e like 5 
apresentaram menor energia de ligação que a molécula de referência, com os respectivos 
valores de: -7,2170 kcal/mol, -7,4029 kcal/mol e -7,2944 kcal/mol, portanto essas moléculas 
tornam-se atrativas por serem potenciais ligantes com maior afinidade pelo canal TREK-1. 
Por outro lado, o TKDC like 2, like 4 e like 6 apresentaram valores maiores que a molécula de 
referência, sendo esses respectivamente: -7,0231 kcal/mol, -6,6593 kcal/mol e -7,0761 
kcal/mol (Tabela 1), não sendo tão interessantes para o objetivo proposto. 
 
Tabela 1 - Características e resultados das moléculas utilizadas nos cálculos de docking. 
Ligante Peso 
Molecular 
(g/mol) 
PubChem 
ID 
Área 
Polar 
(A²) 
Átomos 
Pesados 
Sítio do 
Docking 
Energia 
do 
Docking 
(kcal/mol) 
Nº de 
Soluções 
do 
Docking 
Frequência dos 
contatos 
conhecidos 
TKDC 378.871 985356 66.1 25 21 -7,1476 21 80: 100%, 83: 
90,47%, 102: 
76,19%, 105: 100%, 
76: 95,23%, 79: 
76,19% 
TKDC like 1 434.979 631978 66.1 29 22 -7,2170 47 80: 100%, 83: 100%, 
102: 87,23%, 105: 
100%, 76: 100%, 79: 
55,31% 
TKDC like 2 358.456 583404 66.1 25 21 -7,0231 13 80: 100%, 83: 
92,30%, 102: 
76,92%, 105: 100%, 
76: 100%, 79: 
92,30% 
TKDC like 3 344.429 701634 66.1 24 23 -7,4029 35 80: 100%, 83: 100%, 
102: 97,14%, 105: 
100%, 76: 97,15%, 
79: 65,71% 
TKDC like 4 280.371 2389159 23.6 21 20 -6,6593 59 80: 100%, 83: 
98,30%, 102: 
66,10%, 105: 
96,61%, 76: 69,69%, 
79: 62,71% 
TKDC like 5 362.419 1085937 66.1 25 20 -7,2944 18 80: 100%, 83: 100%, 
102: 88,88%, 105: 
100%, 76: 94,44%, 
79: 72,22% 
TKDC like 6 423.325 1000632 66.1 25 20 -7,0761 142 80: 94,36%, 83: 
100%, 102: 96,47%, 
105: 100%, 76: 
31,69%, 79: 16,90% 
 
Com relação a frequência dos contatos conhecidos, as moléculas que apresentaram 
uma menor energia de ligação obtiveram uma maior frequência dos resíduos Q76, I80 e L102 
quando comparados com o TKDC, com a única exceção do contato 76 com o TKDC like 5 
que foi aproximadamente 1% menos frequente que na molécula de referência. Esse aumento 
na frequência dos contatos conhecidos pode ser um dos fatores que influenciaram a menor 
energia de ligação obtida para essas moléculas, demonstrando assim a grande importância 
desses contatos para a interação com os ligantes e concordando com o proposto por Luo et al 
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/985356
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/631978
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/583404
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/701634
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/2389159
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/1085937
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/1000632
(2017)10. De acordo com o mesmo raciocínio, a redução drástica da frequência do contato 76 
no TKDC like 4 e 6 representa uma possível explicação para o aumento da energia de ligação. 
Com relação ao aspecto estrutural, a pose de ligação das moléculas TKDC like 1, 3 e 5 
se assemelham consideravelmente a pose de ligação do TKDC (Figura 5B, C, E, G), onde o 
grupo sulfonil está exposto ao ambiente extracelular, enquanto os grupos bicíclico e clorofenil 
estão inseridos em cavidades formadas pelos resíduos de aminoácidos contactantes, 
concordando também com os resultados de Luo et al (2017), que encontrou a mesma posição 
para o TKDC no cristal 4TWK do banco PDB10. 
 
Figura 5 – Interação entre os ligantes e o sítio de ligação, localizados entre as hélices EC1 e EC2 (branco), na 
estrutura do canal TREK-1. É possível visualizar as cadeias laterais dos contatos do sítio, com suas respectivas 
nuvens indicando o tipo do resíduo de aminoácido: polar neutro (verde), hidrofóbico (branco), carregados 
positivos (azul) e carregados negativos (vermelho). A) Sítio de ligação sem o ligante, e com os contatos descritos 
na literatura (76, 79, 80, 83, 102 e 105). B-H) Sítio de ligação preenchido respectivamente com os ligantes: 
TKDC, TKDC like 1, 2, 3, 4, 5 e 6. 
 
Em contrapartida, o TKDC like 2 encontrou uma pose de ligação diferente, onde o 
grupo tolueno está exposto ao ambiente extracelular ao invés de estar inserido em uma 
cavidade proteica (Figura 5D), isso ocorre possivelmente pela ausência de um átomo 
eletronegativo que promoveria a interação com os resíduos polares Q76 e T79 e pelo 
impedimento estérico ocasionado pelo grupo metil. Da mesma forma, o TKDC like 6 
apresentou a pose de ligação invertida (Figura 5H), com o grupo bicíclico inserido na 
cavidade, e todo resto do ligante exposto ao ambiente extracelular na direção oposta ao 
encontrado para todas as outras moléculas, esse fato pode ser atribuído ao grupo bromofenil, 
que apresenta uma eletronegatividade menor que os grupos clorofenil e fluorofenil, esse 
último presente no TKDC like 5, além de oferecer um maior impedimento estérico devido ao 
tamanho do átomo de Bromo. Por sua vez, o TKDC like 4 apresentou-se totalmente inserido 
na cavidade proteica de tal forma que o sítio bicíclico ficou deslocado de sua cavidade 
habitual (Figura 5F), onde há grande presença de resíduos hidrofóbicos, isso ocorreu devido a 
ausência do grupo sufonil, e demonstra a importância desse grupo na estabilização do ligante 
durante sua interação com o canal, corroborandotambém com o modo de interação descrito 
por Luo et al (2017)10. 
 
Conclusão 
Os canais da família K2P são importantes alvos terapêuticos e conhecidos por serem 
modulados por uma grande quantidade agentes farmacológicos, porém ainda é necessário que 
haja a busca por novas moléculas que sejam capazes de interagir e modular esses canais, 
representando assim potenciais novos fármacos com características distintas dos já existentes. 
O presente trabalho demonstra o potencial de 3 moléculas (TKDC like 1, 3 e 5) como 
agentes farmacológicos com alta afinidade pelo canal TREK-1, devido a baixa energia de 
ligação apresentado nos cálculos de docking, a alta frequência dos contatos conhecidos e a 
pose de ligação muito similar ao do TKDC. No entanto outras 3 moléculas testadas (TKDC 
like 2, 4 e 6) não apresentaram resultados que demonstram a priori uma alta afinidade dessas 
pelo canal. Apesar disso, vale destacar aspectos como, os falsos positivos apresentados pela 
metodologia de docking, além dos parâmetros levados em conta por esse programa para o 
cálculo da interação entre o ligante e a proteína. Sendo assim, é importante considerarmos os 
potenciais novos fármacos, porém outros testes computacionais, além de testes experimentais 
in vitro e in vivo necessitam de serem realizados com a finalidade de validar ou não os 
resultados aqui encontrados. 
 
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