APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS de leveduras

Prévia do material em texto

APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS 
DE LEVEDURAS
Elisabete José Vicente
ICB/USP - bevicent@usp.br
Profa. Elisabete Vicente/
Dep. Microbiologia ICB/USP
bevicent@usp.br
APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS DE LEVEDURAS
Instituto de Ciências 
Biomédicas USP 1. Saccharomyces cerevisiae
- Ciclo de vida
- Genética clássica
- Como hospedeira em Biologia molecular
2. Leveduras não S. cerevisiae
- Pichia pastoris e outras
3. Questões
• 5 µm diâmetro 
•3-4 µm diâmetro; 7-15 µm comprimento
Leveduras
http://saturn.roswellpark.org/huberman/BIR572/YeastGeneticsLectureNotes.htm l
Algumas leveduras importantes em Biotecnologia 
1. Saccharomyces cerevisiae
• Reino Fungi
• Organismo unicelular
• Incorporam alimento por absorção
• Encontrados em solo, frutas, plantas etc
• Podem realizar respiração ou fermentação
Açúcar álcool etílico + CO2
bebidas
Glicose + 2ADP + 2Pi  2 etanol + 2 dióxido de carbono + 2ATP + 2H2O 
C6H12O6 2 C2H5OH 2 CO2
Ciclo de vida
CICLO DE VIDA de S. cerevisiae
MAT a/
(2n)X
MAT a 
(n)
MAT 
(n)
a
a

 dissecção asco com
4 esporos (n)
MITOSEMITOSE
geminação
MEIOSE
e
ESPORULAÇÃO
Célula haplóide – brotamento
Células haplóides em cruzamento 
– “shmoos” – zigotos
Zigoto – brotamento - diplóides
Diplóide brotando
Diplóide esporulando – formação de asco 
(meiose) – esporulação – esporos haplóides
Saccharomyces cerevisiae: diferentes tipos de células
CARACTERÍSTICAS RELEVANTES -
• Contêm membrana nuclear – eucarioto
• Células n ou 2n estáveis (condições de laboratório)
• Formação de colônias isoladas
• Facilidade de cultivo em
• Versatilidade comparável à bactéria E. coli
• Crescimento rápido (~90 min /geração)
• Genética bem conhecida (16 cromossomos)
• Célula n= ~7 µm diâmetro
• Célula 2n= ~12 µm diâmetro
• 12,1 Mpb de DNA e apenas 5.800 ORFs
laboratório
fermentadores
Saccharomyces cerevisiae
Genoma de Saccharomyces cerevisiae
• Tamanho: 12.052 Mpb
• 16 cromossomos entre 200 e 2.200 kb
• 6.183 ORFs > 100 pb
• 5.800 codificam proteínas
• Inúmeras ORF’s < 100 pb
• Conteúdo de G+C: ORF’s 39,6% e 
regiões intergênicas 35,1%
• Centrômeros pequenos (~120 bp)
• Telômeros (TG1-3)n [Obs: telômero
humano é (TTAGGG)n] 
• Origens de replicação (elementos ARS) 
100-150 bp
Cariótipo eletroforético de Saccharomyces cerevisiae:
Pequenos “plugs” contendo células são posicionados em
cada poço de corrida. Após tratamento com enzimas líticas, o
DNA é liberado. O gel é submetido uma corrida eletroforética
em um campo elétrico pulsado “Pulsed Field Gel
Eletoforosis”. Para a visualização das bandas de DNA, o gel é
submetido a coloração com brometo de etídio.
Elementos extra-cromossomais de S. cerevisiae 
• Mitocôndria 
• Como a levedura cresce tanto em aerobiose como em 
anaerobiose, a mitocôndria não é essencial,
• Mutantes mitocondriais petite (ρ+ e ρ-) crescem, mesmo 
que pouco, em glicose (que pode ser fermentada), mas 
não em glicerol (que só pode ser metabolizada por 
respiração aeróbica). 
• Plasmídeo 
Círculo 2 µm de 6.3 kb
• 60-100 cópias/célula
• células cir+ e cir0
Genética Clássica -
Ensaios de complementação gênica 
• Usado para verificar se duas mutações que produzem o
mesmo fenótipo estão no mesmo grupo de
complementação ou não, ou seja, se são os mesmos
genes.
• Assim:
• Duas mutações se complementam se estiverem em genes diferentes. 
Raramente há complementação no mesmo gene.
• Mutantes que, quando combinados num diplóide apresentam o mesmo fenótipo mutante 
das linhagens mutantes haplóides, estão no mesmo grupo de complementação. 
• Mutante que, quando combinados num diplóide apresentam um fenótipo selvagem 
diferente, estão em grupos de complementação diferentes
Cruzamento de leveduras 
• S. cerevisiae tem 
dois tipos de 
acasalamento 
(“mating types”):
- MF 
- MF a
outra forma 
de escrever:
• S. cerevisiae tem 
dois tipos de 
acasalamento 
(“mating types”):
- MF 
- MF a
1. Saccharomyces cerevisiae
- Como hospedeira em Biologia molecular
CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES PARA APLICAÇÃO 
EM BIOLOGIA MOLECULAR
• Capaz de realizar modificações pós-traducionais (típicas de 
eucariotos)
- Formação de ponte de dissulfeto
- Glicosilação
- Fosforilação
- Processamento proteolítico
• Organismo considerado “GRAS” (¨generally regarded as safe¨) -
seguro pelo FDA americano
CARACTERÍSTICAS IMPORTANTES PARA 
APLICAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR
(cont.)
• Excreta proteína para o meio –
quando se acrescenta à sequencia do gene que se deseja
expressar uma “sequência sinal”
• Proteína com estrutura tridimensional autêntica
• Adaptado aos processos industriais: produção de cerveja,
vinho, pão, etanol combustível
FERRAMENTAS PARA BIOLOGIA 
MOLECULAR
transformação genética
fatores importantes:
1) Introdução de uma molécula de DNA exógeno;
2) Seleção do evento;
3) Manutenção da informação adicional no hospedeiro.
1) protoplasto (1978)
2) tratamento com sais de lítio (1983)
3) eletroporação (1990)
Técnicas para introdução do DNA na 
célula
Saccharomyces cerevisiae –
A) Métodos de Transformação Genética
Métodos de seleção:
B) Marcadores de seleção dos 
transformantes
1. complementação → síntese de 
aminoácido ou nucleotídeo
2. resistência a antibiótico de 4ª geração 
(higromicina ou geneticina)
Marcas de seleção
Todos são plasmídeos bifuncionais
( se replicam e tem marcadores para a bactéria E. coli e para levedura:
- Integrativos → baixa eficiência de transformação (103-104
transformantes/μg DNA), baixo nº de cópias, estável 
(0,1%/geração)
- Epissômicos → 2 μ, alta eficiência, alto nº de 
cópias, instável (1%/geração)
- Centroméricos → centrômero
- YACs → alta estabilidade, capacidade de 
introduzir fragmentos grandes
- outros... .... ....
Saccharomyces cerevisiae –
B) Vetores de transformação genética
Diferentes tipos de vetores para
transformação de S. cerevisiae:
Todos estes vetores são bi-
funcionais, ou seja, assim que são
construídos in vitro, são empregados
na transformação genética de E. coli.
DNA plasmidial é extraído dos clones,
analisado e o que for selecionado é
empregado na transformação
genética de S. cerevisiae.
Vetores Integrativos → baixa eficiência de 
transformação (103-104 transformantes/μg
DNA), baixo nº de cópias, estável 
(0,1%/geração)
Vetores Integrativos → baixa eficiência de 
transformação (103-104 transformantes/μg
DNA), baixo nº de cópias, estável 
(0,1%/geração)
Diferentes tipos de vetores para transformação de S. cerevisiae:
YI - (Yeast Integrative plasmids), YR (Yeast Replicative Plasmids), YC (Yest Centromeric Plasmids)
São empregados para expressão gênica de proteínas heterólogas:
Há de vários tipos: 
- Promotor Constitutivo – ex.: PGK (fosfoglicerato quinase)
- Promotor Regulável – ex.: ADH2 (álcool desidrogenase 2)
ADH1: A expressão do um gene clonado sob a regulação do 
promotor ADHI será máxima quando a célula de levedura 
recombinante for incubada na presença de alta concentração de 
glicose. (GLICOSE  ETANOL - “Níveis de expressão elevados na presença 
de acúmulo de etanol” ).
ADH2: A máxima expressão do gene clonado sob a regulação de 
ADH2 será máxima quando a célula de levedura recombinante for 
incubada na ausência de glicose. O gene ADH2 é reprimido por 
glicose. (ETANOL  GLICOSE)
Exemplos:
Thomson et al 2005, Nature 630-5
Saccharomyces cerevisiae –
C) Promotores de Expressão genética
Promotores
Saccharomyces cerevisiae –
Promotores de Expressão genética
APLICAÇÃO IMPORTANTE
Vacina Hepatite B:
1ª vacina recombinante aprovada para uso humano
Nature 298, 347 - 350 (22 July 1982)
Synthesis and assembly of hepatitis B virus surface antigen particles in yeast
Pablo Valenzuela*†, Angelica Medina*, William J. Rutter*, 
Gustav Ammerer & Benjamin D. Hall
*Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, 
California 94143, and †Chiron Corporation, 4560 Horton, Emeryville, California 94608, 
USA
Department of Genetics, SK-50, University of Washington, Seattle, Washington98195, 
USA
The surface antigen of hepatitis B virus (HBsAg) has been synthesized in the yeast 
Saccharomyces cerevisiae by using an expression vector that employs the 5'-
flanking region of yeast alcohol dehydrogenase I as a promoter to transcribe surface 
antigen coding sequences. The protein synthesized in yeast is assembled into 
particles having properties similar to the 22-nm particles secreted by human cells.
4. Inovações: Alguns produtos derivados da Engenharia Genética bacteriana
1) 1982 – Expressão de Insulina humana em E. coli
Foi o primeiro produto comercial obtido pela Tecnologia do
DNA recombinante (TDR) e aprovado para uso em humanos
em 1982 pelo Departamento FDA Americano (“USA Food
and Drug Administration”).
Bristow, A.F. Recombinant-DNA-derived insulin analogues as
potentially useful therapeutic agents. Trends in Biotechnology
11: 301-305, 1993. Fg.: Representação esquemática de estratégias usadas para produzir
insulina para fins terapêuticos.
Hormônio Insulina
Os diabéticos não possuem insulina, que regula a quantidade de glicose
no sangue.
Em 1978, a insulina era produzida a partir de pâncreas congelados de
porcos e gado. Para isto, uma linha de vagões cheios chegavam a uma
fábrica em Indiana/EUA. Para produzir 453 g (1 libra) de insulina, eram
necessários 3.630 kg (8.000 libras) de glândulas de pâncreas de
23.500 animais.
O fabricante, Eli Lilly precisava de 56 milhões de animais por ano para
atender à crescente demanda dos EUA. Então, buscaram uma nova
alternativa para a produção de insulina.
A Genentech tinha o conhecimento necessário para fabricar insulina
humana sintética - em laboratórios, a partir de bactérias, usando sua
tecnologia de DNA recombinante recentemente comprovada.
1. 1982 – Expressão de Insulina humana em E. coli.
Plasmídeo bifuncional (bactéria - levedura) integrativo que 
contem o Promotor e o Terminador de Transcrição PGK
Saccharomyces cerevisiae –
D) Promotores Expressão e Secreção de Proteínas
2. Leveduras não Saccharomyces cerevisiae
- Pichia pastoris 
- Hansenula polymorpha 
- Schizosaccharomyces pombe
- Candida
- Kluyveromyces lactis
- Yarrowia lipolytica
- Issatchenkia
- Torola, Torulopsis, Rhodotorula 
Apesar de S. cerevisiae ser uma 
ótima levedura hospedeira para a 
expressão de proteínas 
recombinantes, 
surgiram outras leveduras que 
oferecem diferentes vantagens 
adicionais. 
Por exemplo:
- Pichia pastoris: pode ser cultivada 
em alta densidade celular e em 
fonte de carbono metanol; 
- S. pombe: tem genética mais 
adequada para estudos de 
comparação com a genética 
humana;
- K. lactis: cresce em fonte de 
carbono de derivados de leite
Cultivo de Pichia
pastoris:
Esta levedura é
exclusivamente
aeróbica. O seu
cultivo em frascos
incubados em
”shaker” são
realizados em frascos
com aletas laterais
visando aumentar a
aeração.
Pichia pastoris –
cultivo em frascos com aletas ”baffled Flasks”
Pichia pastoris –
cultivo em alta densidade celular 
Pichia pastoris: pode ser cultivada em alta densidade celular e em fonte de carbono metanol.
Necessita de grande aeração e por isto alcança a elevadas concentrações celulares quando e
cultivada em biorreator. Esta é a melhor condição de cultivo quando se deseja expressar uma
proteína recombinante expresso por um clone recombinante construído com esta levedura.
Pichia pastoris - Vetores de transformação -
Plasmídeo vetor pHIL-S1 -
- Sítio de clonagem: Xho I, EcoR I, Sma I, BamH I
- PS do gene PHO1
- Clonar o gene heterólogo em fase com codon de iniciação
do PS 
- Marca de seleção HIS4
- Para inserção no locus AOX1 da cepas GS115 ou KM71
linearizar com Sac I (gera His+ Mut+ em GS115 ou 
His+ MutS em KM71) 
- Para inserção no locus HIS4 em GS115 ou KM71, 
linearizar com Sal I ou Stu I (gera His+ Mut+ em GS115 ou 
His+ MutS em KM71) 
- Para substituição do gene AOX1 em GS115, linearizar 
com Bgl II (gera His+ MutS) 
Sac I
Clones de P. pastoris recombinantes –
Secreção de proteínas recombinantes
Alfa-amilase Glicoamilase
Clones recombinantes
de
Pichia pastoris
excretando:
- -amilase,
- glicoamilase
Clones recombinantes de Pichia pastoris excretando proteínas
recombinantes. Observa-se que os clones recombinantes expressam -
amilase com diferentes intensidades. O mesmo ocorre com os
transformantes que expressam glicoamilase.
Obs: A revelação da expressão das proteínas recombinantes foi obtida semeando-se as colônias de
clones transformantes em meio solido contendo amido e , após o cultivo, submissão a vapor de iodo.
Instituto de Ciências 
Biomédicas USP
3. Questões (para estudo e para aguçar a sua curiosidade....) 
1. Cite duas leveduras que são empregadas como hospedeiras em “Biologia Molecular”.
2. Existem células de diferentes tipos de ploidia de Saccharomyces cerevisiae? Quais são elas?
3. E possível se fazer a separação dos cromossomos de células de levedura? Como se consegue fazer
isto e para que isto pode ser empregado?
4. Para se saber se um clone de S. cerevisiae é um mutante auxotrófico (por exemplo: deficiente na
no passo 2 da biossíntese de leucina = leu2 ), preciso recorrer a técnicas de Biologia molecular ou
posso conseguir esta informação com técnicas de “Genética Clássica”? Como se faz isto?
5. O que significa dizer que os vetores de transformação genética de leveduras são bi0funcionais?
6. A construção de recombinantes de levedura parece ser mais difícil do que a construção de
recombinantes de E. coli. Então, quais são as justificativas para se buscar por expressar proteínas
recombinantes em levedura?
7. Quais são as etapas que devem ser empregadas para a obtenção de um transformante da
levedura Saccharomyces cerevisiae ?
8. Obter transformantes da levedura Pichia pastoris é ainda mais complexo que obter
transformantes da levedura S. cerevisiae. Quais são as vantagens que os transformantes de P.
pastoris podem oferecer em relação aos transformantes de S. cerevisiae?
9. Há procedimentos especiais para o cultivo de leveduras diferentes de S. cerevisiae? Exemplifique.
10. Por que há varias leveduras diferentes de S. cerevisiae empregadas como hospedeiras em
Biologia molecular? Que vantagens elas oferecem?
APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS DE LEVEDURAS
ICB/USP
Profa. Elisabete Vicente
bevicent@usp.br
Desejo a todos, Muita, Muita 
Felicidade e muito sucesso!
bevicent@usp.br