Relatório 4 BioSyn

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Universidade de Brasília – Instituto de Ciências Biológicas Disciplina: Biologia Sintética
Professora Responsável: Cíntia Marques Coelho 
Relatório 4 
Título do artigo: Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems
· O título me sugere que os autores irão editar um genoma multiplex utilizando a ferramenta CRISPR/Cas
· Fator de Impacto/Revista: 37.205 (2016) / Science
· Autores principais: 
· Feng Zhang: Possui PhD em Engenharia Química e Biológica pela Universidade de Stanford e é conhecido pelo desenvolvimento da tecnologia por trás das técnicas de Optogenética e também pelo uso da ferramenta CRISPR/Cas em edições genômicas. Atualmente seu laboratório e sua linha de pesquisa é focada na área da Biologia Sintética, onde ele estuda técnicas de edição genômica e epigenômica para o estudo da Neurobiologia. 
· Introdução: 
· Justificativa para o trabalho: Há uma necessidade de desenvolver novas técnicas de edição genômica que sejam escalonáveis, acessíveis e de fácil projeto.
· Revisão da literatura: O locus CRISPR tipo II em Streptococcus pyogenes possui 4 genes que codificam para endonucleases Cas, sendo uma delas a Cas9 e regiões que codificam para o pre-crRNA e para o tracrRNA. Foi demostrado previamente, in vitro e em procariotos, que a expressão da Cas9, da RNAse III, do tracrRNA e do crRNA é necessária e suficiente para que ocorra a clivagem do DNA alvo. 
· Objetivo do trabalho: Desenvolver uma ferramenta de edição genômica precisa e eficaz, baseada no sistema CRISPR/Cas. 
· Figura 1 – A pergunta da figura 1A é: O uso de tags direcionadoras pro núcleo é eficaz em dirigir a Cas9 para o núcleo? Para realizar o teste os pesquisadores desenvolveram plasmídeos contendo a sequência da Cas9 fusionada com uma proteína verde fluorescente, flanqueada por NLS (nuclear localization signal) e com uma 3xFLAG que atua como rótulo para purificação, e da RNAse III fusionada a mCherry (proteína vermelha fluorescente), também flanqueada por NLS, e transfectaram as células humanas para avaliar a eficácia através de técnicas de microscopia de fluorescência. O resultado pode ser visto na figura 1A, onde a esquerda temos uma esquema da sequência do plasmídeo utilizado e a direita temos as imagens da microscopia de fluorescência, onde o DAPI, um corante para ácidos nucléicos, foi utilizado para marcar o núcleo das células com florescência azul, de tal forma que fica claro, para a Cas9, que a marca NLS no início e no final do gene foi eficaz para levar a proteína até o núcleo, porém quando era usada apenas uma marca NLS, o resultado não foi o mesmo, de tal forma que a proteína encontrava-se predominantemente no citoplasma, já para a RNAse III apenas uma tag no final da sequência foi necessário para direcionar a proteína pro núcleo. A figura 1B não possui pergunta científica e tem como objetivo apenas esquematizar os plasmídeos utilizados pelos pesquisadores nos experimentos seguintes. A sequência codificadora da Cas9 humanizada com o código genético humano, e da RNAse III foram marcadas com o NLS, da maneira mais eficaz como demonstrada no experimento passado, e colocadas sobre influência de um fator de elongação, que é um promotor forte e constitutivo que permite a transcrição dessas sequências, além disso o plasmídeo da Cas9 continua com a 3xFLAG e a RNAse III continua fusionada a mCherry. Já as sequências correspondentes ao pre-crRNA e ao tracrRNA foram colocadas sob a influência do promotor U6, que é parte da maquinaria do spliceossoma. A figura 1C também não possui pergunta científica e é apenas um esquema que demonstra o pareamento de bases do crRNA com a região alvo (EMX1) no DNA humano, além disso podemos ver a sequência PAM. As perguntas científicas da figura 1D e 1E é: A expressão heteróloga do Sistema CRISPR nas células de mamífero é capaz de induzir a clivagem do DNA alvo? Dessa forma os pesquisadores utilizaram os plasmídeos da figura anterior nas transfecções mediadas nas culturas celulares. Em células de mamíferos é normal que após a clivagem da dupla fita de DNA ocorra o reparo através de junção das extremidades não-homólogas (NHEJ) e consequentemente essa irá gerar mutações indel, afim de verificar se a clivagem realmente ocorreu os cientistas realizaram um Suveryor assay (explicada no S3 do material suplementar) que consiste em extrair todo o DNA das células transfectadas e realizar um PCR para amplificar a região alvo da Cas9 em uma população celular, onde algumas sofreram alterações e outras não. Posteriormente o produto da PCR (esse também é usado na 1E) é desnaturado e reanelado lentamente com a finalidade de formar heteroduplex entre sequências com indel e sequências WT, após isso a endonuclease Suveryor é utilizada de tal forma que essa apenas irá clivar os heteroduplex. O produto desse ensaio é submetido a uma eletroforese em gel de poliacrilamida e a eficácia da clivagem é mensurada através da intensidade das bandas no gel. Para o experimento 1D foram utilizadas diferentes combinações de plasmídeos, contendo as diferentes componentes do sistema, dessa forma o poço Cas9 + crRNA é o controle negativo, o poço Cas9 + tracrRNA + RNAse também é controle negativo, Cas9 + RNAse + crRNA também é controle negativo. Os resultados da figura podem ser observados nos últimos dois poços, aonde temos que Cas9 + tracrRNA + crRNA e todos os componentes do sistema presentes foram capazes de induzir a clivagem no DNA alvo, sendo essa representada por duas bandas de aproximadamente 300 nucleotídeos, a quantificação da eficácia é representada por um número abaixo do poço correspondente. Esse resultado indica que apenas a Cas9 + tracrRNA + crRNA são necessárias para induzir a clivagem no DNA alvo em uma expressão heteróloga, enquanto que a RNAse é dispensável para o processo, e apesar de as bandas não deixarem dúvidas quanto a clivagem, o método de quantificação dos autores através da intensidade da banda no gel não é um bom indicativo da eficácia dessa. Por fim, os produtos do PCR também foram sequenciados para verificar através de outro método se a clivagem e o NHEJ realmente ocorriam. O resultado pode ser visualizado na figura 1E aonde é possível ver a sequência alvo WT, e as diferentes mutações que ocorreram em alguns dos produtos clivados. 
· Figura 2 – A figura 2A não possui pergunta científica e apenas ilustra os diferentes protospacers no locus EMX1 que serão utilizados nos experimentos das figuras seguintes. Em azul temos a sequência do protospacer e em rosa o PAM correspondente. A figura 2B também não possui pergunta científica e ilustra a estrutura do complexo crRNA + tracrRNA e a estrutura do RNA quimérico que foi construído pelos autores e utilizado no experimento da figura seguinte. As perguntas da figura 2C é: A ferramenta de edição genômica, CRISPR, é generalizável em células eucarióticas? Qual estrutura de RNA guia é mais eficaz? Para testar isso, os pesquisadores alvejaram cinco protospacers diferentes (2A) utilizando para isso ambas as estruturas apresentadas na figura 2B e realizaram o Suveryor assay com a finalidade de testar a eficácia da clivagem guiadas pelo complexo de RNAs e pelo RNA quimérico nos cinco protospacers. Os resultados podem ser visualizados na figura 2C, que é um gel de poliacrilamida para a eletroforese realizada nos produtos do ensaio Suveryor, aqui o poço controle compreende o ensaio realizado com as células que não foram transfectadas com os plasmídeos do sistema CRISPR, logo não sofreram clivagem. Os outros poços compreendem os protospacers de 1 a 5 e qual a estrutura de RNA guia foi utilizada para isso. É possível observar que para os cinco protospacers a estrutura crRNA + tracrRNA apresentou clivagens sendo essas observadas através das bandas mais abaixo no gel. Porém a estrutura do RNA quimérico apresentou clivagens apenas nos protospacers 1 e 5. Como conclusão desse experimento podemos dizer que o sistema CRISPR é generalizável, portanto pode ter como alvo diferentes protospacers dentro de um mesmo locus a depender do RNA guia e também conclui-se quea estrutura formada pelo crRNA + tracrRNA é mais eficaz do que o RNA quimérico em induzir clivagem no DNA alvo, porém vale ressaltar, como na figura 1, que a quantificação de eficácia através de um gel que informa resultados qualitativos não é muito plausível, apesar disso o resultado qualitativo de clivagem por si só já demonstra que os dois RNAs guias são mais eficazes do que o RNA quimérico. No mais, acredito que tenha faltado aos autores informar o peso correspondente a cada banda de DNA completo e de DNA clivado. 
 
· Figura 3 – A figura 3A não possui pergunta científica e apenas ilustra todas as sequências de crRNA utilizadas no experimento da figura 3B, podemos então observar o protospacer 1, a sequência WT do crRNA e as 17 sequências de RNAs quiméricos com mutações pontuais. A pergunta da figura 3B é: O sistema CRISPR/Cas9 é específico para a sequência? Dessa forma foi realizado novamente um Suveryor assay, onde os RNAs quiméricos da figura 3A foram utilizados como guias, além da sequência de crRNA WT que foi usada como controle. O resultado do experimento pode ser visualizado no gel eletroforético de poliacrilamida, onde apenas as sequências m17, m15 e m13 apresentaram clivagens, além do WT. A conclusão dessa forma é de que as sequências mais próximas a região PAM são essenciais para que o reconhecimento do DNA alvo e a clivagem do mesmo, enquanto que as sequências mais distantes de PAM não são essenciais, dessa forma o sistema CRISPR não é estritamente específico a sequência alvo podendo até ser passíveis de gerar off-targets. Também é importante destacar a escolha dos autores pelo uso do RNA quimérico como guia para a clivagem, tendo em vista que esse RNA apresentou baixa eficácia nos experimentos realizados na figura 2C, sendo assim possivelmente seria melhor ter usado o complexo crRNA + tracrRNA já que esses possuem maior eficácia e produziria bandas mais visíveis no gel. A figura 3C não possuí uma pergunta científica e apenas ilustra o locus EMX1 com a sequência do protospacer 1, sua PAM e os sítios (a esquerda e direita) de uma endonuclease TALEN. Essas informações serão úteis para o próximo experimento. A pergunta da figura 3D é: O sistema CRISPR/Cas9 é eficiente em clivar a sequência alvo? Para verificar essa pergunta, os pesquisadores realizaram um Suveryor assay, onde a clivagem da sequência alvo foi mediada pelo complexo RNA guia crRNA + tracrRNA, RNA quimérico e a endonuclease TALEN que também possui sítio de clivagem no protospacer 1, como demonstrado em 3C. Os ensaios foram realizados em triplicata técnica. Os produtos dos ensaios foram submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida e pode ser visto na 3D onde o poço correspondente ao controle é o ensaio para as células não transfectadas. É possível notar que o sistema CRISPR (ambas as formas de RNAs guias) foi mais eficiente que a endonuclease TALEN em clivar a sequência alvo, e dentro do sistema CRISPR, novamente, o complexo com dois RNAs guias foi mais eficaz que o RNA quimérico, repetindo os resultados obtidos em 2C. Dessa forma a conclusão é de que o sistema CRISPR é eficiente em mediar as clivagens no DNA, porém novamente vale ressaltar o que já foi dito a respeito da quantificação de eficiência através de intensidade de banda em um gel. 
· Figura 4 – A figura 4A não possuí pergunta científica e apenas ilustra o plasmídeo utilizado nos experimentos seguintes. Nesse plasmídeo a sequência codificadora do RNA quimérico está sob a influência do promotor U6 e a sequência da Cas9 humanizada e com mutação D10A no sítio RuvC I está sob influência do fator EF1a e flanqueada por tags de direcionamento ao núcleo. A pergunta da figura 4B é: A clivagem de apenas uma fita do DNA alvo, pela Cas9 mutada, reduz a quantidade de mutações indel, por NHEJ e aumenta a quantidade de reparo por HDR? Os pesquisadores transfectaram as células humanas com o plasmídeo da figura 4A, com o plasmídeo contendo a sequência WT da Cas9 humanizada (plasmídeo esse que foi utilizado nos experimentos passados) e com um plasmídeo contendo apenas a sequência do RNA quimérico, após isso foi realizado um Suveryor assay com os produtos sendo posteriormente submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida. Todos os ensaios aqui foram realizados em triplicata técnica. O resultado pode ser visto na 4B onde os poços contendo apenas o RNA quimérico foram os controles negativo. Os poços contendo a hCas9 WT + RNA quimérico foram os controles positivo. É possível notar que a Cas9 mutada com o RNA quimérico não apresentou bandas de clivagem, isso quer dizer que apenas uma das fitas foram clivadas e que a célula foi capaz de reparar a região, através de HDR, não gerando mutações do tipo indel. A conclusão dessa figura é importante para o teste que é realizado na 4C, D e E, e novamente fica minha crítica ao uso do RNA quimérico que é pouco eficaz e produz bandas de clivagem quase não perceptíveis. A figura 4C não possuí pergunta científica e apenas ilustra a estratégia que será utilizada na figura 4D e 4E, de tal forma que a pergunta dessa figura é: É possível inserir uma região no genoma celular, através de HDR mediado por CRISPR? Para testar os pesquisadores realizaram a transfecção das células com os diferentes plasmídeos (hCas9 e Cas9 mutada) e também forneceram em todos os casos um template homólogo a região protospacer 1, esse template continha dois sítios de enzimas de restrição que em caso de HDR seriam inseridos no genoma da célula. Posteriormente o DNA das células era extraído e tratados com as enzimas de restrição específicas, os produtos desse tratamento foi então submetido uma eletroforese em gel de agarose. O resultado pode ser verificado na figura 4D, onde os poços contendo a hCas9 + template e o poço contendo Cas9 mutada + template apresentaram bandas que indicam que o reparo por HDR ocorreu da forma como esperada e que os sítios de restrição foram inseridos no genoma e posteriormente digeridos pela enzima de restrição, entretanto essas bandas são de dificílima visualização. O controle negativo (poço contendo apenas o template) não apresenta as mesmas bandas. Na figura 4E foi realizado o sequenciamento do DNA extraído após as transfecções e podemos analisar ambas as sequências de restrição inseridas no genoma. A conclusão aqui é que o fornecimento do template é eficaz em induzir a célula a utilizar a via de reparo de HDR, dessa forma o sistema CRISPR é utilizável com a intenção de realizar grandes inserções no genoma. A pergunta da figura 4F é: O sistema CRISPR é capaz de editar múltiplos alvos? Para realizar os devidos testes, os pesquisadores desenharam um plasmídeo contendo a sequência do pre-crRNA, onde nesse havia duas sequências alvos, para os loci EMX1 e PVALB, feito isso as células foram transfectadas com três diferentes plasmídeos sendo eles: alvo somente para EMX1, alvo somente para PVALB e alvo para ambos os loci, após as transfecções foi realizado um Suveryor assay e os produtos submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida. Os resultados do gel podem ser vistos na 4F, onde podemos visualizar que quando utilizado o plasmídeo com 2 alvos, ambos os loci apresentaram bandas que indicam clivagens, porém quando utilizado apenas os plasmídeos com 1 alvo, apenas o alvo apresentava banda que indica clivagem. Além disso os últimos 2 poços fazem parte do controle, que foram as células não-transfectadas. Aqui a conclusão dos autores é que o sistema CRISPR é capaz de editar múltiplos loci, desde que exista no pre-crRNA as regiões guias para os respectivos alvos. Por fim, a pergunta da figura 4G é: O CRISPR é capaz de induzir grandes deleções precisas no genoma? Para realizar o teste, os autores criaram um plasmídeo, onde a sequência do crRNA continha alvo para o protospacer 1 e protospacer 8 do locus EMX1, as células foram transfectadas com esse plasmídeo e posteriormente tiveram seu DNA extraído e sequenciado pelo método de Sanger. O resultado pode ser visto na figura 4G, onde é possível observar que a deleção de toda a região entre os protospacersalvo ocorreu. Dessa forma é possível concluir que o sistema CRISPR é de fato capaz de realizar deleções de grande porte no genoma alvo. 
· Conclusão: Os autores concluem que o sistema CRISPR/Cas9 é capaz de realizar clivagem no DNA alvo quando expresso de forma heteróloga em células de mamíferos, que a clivagem é eficiente e precisa, para a região próxima à sequência PAM, que a ferramenta pode ser utilizada para alvejar múltiplas regiões no genoma alvo e além disso pode também ser utilizada com a finalidade de inserir ou deletar grandes regiões no genoma alvo. Dessa forma os autores defendem o uso desse sistema como uma boa ferramenta em edições genômicas, porém os mesmos pontuam algumas limitações, como por exemplo a dependência da sequência PAM, as restrições causadas pela estrutura secundária do crRNA e a acessibilidade ao genoma condensado. Eu concordo com as conclusões dos autores, tendo em vista os dados apresentados, mesmo que eu tenha discordado de algumas técnicas e interpretações que esses tenham tomado. Por fim, eu concordo com o título e acredito que ele resume de forma clara tudo que foi de fato realizado e concluído no artigo.