meios_de_cultura

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Meios de cultura e colônia
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Roda de Conversa
O que uma célula precisa para sobreviver?
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Nutrientes
Transporte e conservação
Cary Blair
Salina Tamponada
Stuart
Ágar nutriente
Meios de crescimento e isolamento
Ágar chocolate
Ágar Thayer-Martin chocolate
Ágar Salmonella-shigella (SS)
Ágar Mac Conkey
Ágar sangue
Caldo BHI
etc
Meios para a identificação
Ágar Citrato Simmons
Ágar Dnase
Ágar TSI
Ágar Ágar Bile-Esculina
Etc
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Nutrientes
Procop et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 9788527733182.
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Nutrientes
Procop et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 9788527733182.
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Fase analítica
Escolher o meio de cultura primário apropriado ao espécime em questão
Determinar a temperatura, a atmosfera e o tempo de incubação para isolar microrganismos potencialmente significativos
Determinar quais isolados recuperados do meio primário precisam ser mais bem caracterizados
Determinar a necessidade de realizar testes de sensibilidade
aos antibióticos
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Nutrientes
Sólido líquido, semi-sólido e sólido
Habitat natural
Finalidade, importância, principais diferenças do diagnóstico microbiologico
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Meio de cultura primário
Inoculação em caldo – vem sendo abandonada
Quando usar (algumas espécies): não detectado crescimento em meio sólido ou quando observado no esfregaço direto microrganismos que não são isolados em ágar.
Pode utilizar meios seletivos ou inespecíficos
Ágar sangue de carneiro 5% (inespecífico – amplamente utilizado)
A maioria dos meios deve ser refrigerada para armazenamento
prolongado <> cultivo em temp. ambiente
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Meio de cultura primário
Incubação	- evitar oscilação de temperatura
Controle da umidade -70%
Monitorar a incubadora
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Inoculação
Alça de inoculação Nichrome ou platina ou descartáveis
Diferentes técnicas de inoculação
Procop et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 9788527733182.
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Inoculação
Alça de inoculação Nichrome ou platina ou descartáveis
Diferentes técnicas de inoculação
Procop et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 9788527733182.
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Inoculação em tubos
Líquidos, semissólidos (ágar a 0,3% a 0,5%) e
sólidos (ágar a 1% a 2%)
Semissólidos – mobilidade Líquidos – caldos Incubação a 35ºC
Procop et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 9788527733182.
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Nutrientes
Procop et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 9788527733182.
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Colônia bacteriana
Utilizam o carbono exclusivamente
Sintetiza carbono a partir de outras moléculas
Água, sais
inorgânicos e CO2
Litrotróficas (autotróficas)
Utilizam carbono + glicose
Parte dos compostos orgânicos de fonte de energia são usados para a metabolização
Organotróficas
(heterotróficas)
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Colônia bacteriana
Anaeróbios obrigatórios
Oxigênio é
tóxico
Anaeróbios aerotolerantes
Não são mortas pela exposição ao oxigênio
Anaeróbios facultativos
Crescem em condições aeróbias e anaeróbias
Microaerófilos
Crescem melhor em condições baixas de oxigênio
Glicose – superóxido = oxigênio e peróxido de hidrogênio (tóxico – água e oxigênio)
Aeróbios obrigatórios
Crescem somente na presença de oxigênio
Glicose – superóxido = oxigênio e peróxido de hidrogênio (tóxico – água e oxigênio)
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Colônia bacteriana
Nitrogênio:
íons amônio -> incorporado ao glutamato e glutamina
Redução de nitrato – assimilação e dissimilação (anaeróbia –
produto NO2 ou N2)
Síntese de aminoácidos e outros compostos
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Colônia bacteriana
Fatores de crescimento:
Vitaminas do complexo B – função catalítica
Sais minerais
Purinas e pirimidinas
Prototróficos – não necessitam de fonte externas para o
crescimento
Auxotróficos – requerem acréscimos de fator de crescimento ao meio de cultura
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Colônia bacteriana
Cinética do crescimento bacteriano
Semeadura periódica – manutenção das colônias
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Colônia bacteriana
Procop et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 9788527733182.
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Colônia bacteriana
Geração de energia:
Fermentação - > produto final é o ácido pirúvico ou piruvato
Homolática – ácido lático e em menor quantidade acetato, etanol e formato
Heterolática – acecetaldeído e CO2
Ácido mista – ácido acético, etanol, ácido succínio e ácido fórmico
Butanodiol – reduz a quantidade de ácido, grupo – Klebsiella – Enterobacter – Serratia – Hafnia diferencia da Escherichia coli (vermelho de metila)
Butanol – gênero Clostridium.
Ácido propiônico – redução do oxaloacetato. Bactérias como: gênero Bacteroides
e nas espécies Propionibacterium
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Colônia bacteriana
Geração de energia:
Na presença de oxigênio: ciclo de Krebs
Glicólise anaeróbica e o ciclo de Krebs = 38 moléculas de ATP
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Interpretação culturas
Primeira leitura -24 a 48h
Avaliar o tipo de colônia, contagem de cada tipo de colônia, pureza e a reatividade a coloração de Gram, alterações no meio.
*Contaminantes
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Interpretação culturas
Procop et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 9788527733182.
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Avaliação macroscópica - colônias
Inspeção do crescimento na superfície das placas com ágar
Uso de lupa de mão, lentes de aumento acopladas ou um microscópio de dissecção	- colônias iniciais
Odores**
Microrganismos de risco biológico
Isolados a partir de cultura mista
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Interpretação culturas
Staphylococcus coagulase negativa
Streptococcus com halos de hemólise
Procop et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 9788527733182.
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Interpretação culturas
Procop et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 9788527733182.
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Interpretação culturas – culturas mistas
Procop et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 9788527733182.
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Avaliação coloração - colônias
Avaliar:
Tamanho e forma
Disposição das bactérias
Existência ou inexistência de estruturas específicas
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Avaliação coloração - colônias
Bacilos Gram +. Coloração Gram
Bacilos Gram + com formação de esporos. Coloração Gram
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Avaliação coloração - colônias
Material exsudato purulento, sugestivo de Staphylococcus sp.. Coloração Gram
Material de mionecrose, sugestivo de
Streptoccocus sp.. Coloração Gram
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Avaliação coloração - colônias
Material escarro purulento, sugestivo
de Streptococcus pneumoniae.
Coloração Gram
Material de empiema supurativo agudo,	presença de bacilos Gram + claviformes ramificados (Bifidobacterium). Coloração Gram
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Avaliação coloração - colônias
Material sedimento urinário, sugestivo de bacilos Gram- disperso em neutrófilos. Coloração Gram
Material exsudato uretral purulento, sugestivo de diplococcos Gram-, Neisseria gonorrhoeae. Coloração Gram
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Avaliação coloração - colônias
Material escarro, neutrófilos segmentados com bacilos Gram -, Klebsiella pneumoniae. Coloração Gram
Gram +, Propionibacterium acnes
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Reações bioquímicas e espectrometria
de massa- colônias
Teste da catalase -	deferência estafilococos + X estreptococos -
/Bacillus + X Clostridium aerotolerantes –
Solubilidade em bile – alguns estreptococos são lisados após 30 min, utilizar um controle que não é lisado
Coagulase em lâmina: caso negativo, realizar em tubo
Teste direto de mancha de indol (Kovac)
Citocromo-oxidase – identifica a produção de citocromo-oxidase
Teste de MUG – beta-glicuronidase, triagem E. coli
Teste de PYR
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Reações bioquímicas e espectrometria
de massa- colônias
Bactérias desconhecidas – identificação através de sistema
enzimático
Espectrometria de massas – MALDI-TOF◤
Reações bioquímicas e espectrometria
de massa- colônias
Micobactérias:
Incubações mais longas
Técnicas moleculares
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Teste de sensibilidade aos
antimicrobianos
Procop et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 9788527733182.
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Colônia bacteriana
Forma da colônia
Elevação
Margem
tamanho
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Avaliação macroscópica - colônias
Procop et al. Koneman Diagnóstico Microbiológico, 7ª edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2016. 9788527733182.
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Controle de qualidade
Avaliar sistematicamente os meios de culturas e soluções quanto à qualidade de crescimento, seletividade, checagem de características bioquímicas diferenciais e características físicas.
Para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10% do lote preparado na estufa 35 ±1°C por 24 horas para
o controle de esterilidade.
Não deve haver mudança de cor nem crescimento de qualquer colônia.
Para o controle de crescimento, sempre que possível usar cepas ATCC, que são cepas de referências de origem e padrão definido de provas para a sua caracterização.
Usar cepas de micro-organismos de referência obtidas diretamente de uma coleção nacional ou internacional reconhecida ou culturas comerciais com propriedades equivalentes comprovadas para avaliação de desempenho dos meios de cultura e de outras soluções preparadas no laboratório.
Manter instrução de manutenção e preparo de cultura de trabalho no laboratório. (consultar ISO 11133-1 anexo B – guia de preservação e manutenção de cultura de referência).
Controlar a eficácia da autoclave ou estufa, realizando semanalmente teste biológicos para essa finalidade. Os testes biológicos para autoclaves a vapor são os que contem 106 Geobacillus stearothermophilus e os testes biológicos para estufa de calor seco contem 106 Bacillus subtilis.
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Controle de qualidade
Não usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados ou vencidos.
A validade dos meios preparados, mantidos nas condições definidas de armazenamento, deve ser determinada e controlada.
Observar com atenção para as instruções dos rótulos pois, dependendo do fabricante, podem ter o mesmo nome, mas composição diferente e portanto ser diferente a quantidade de meio a ser usada.
Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento rápido do meio (tamanho dos tubos utilizados geralmente são de 10X100 mm, 16x150mm e 20x150mm). A validade citada nesse documento e indicada para meios de cultura distribuídos em tubos com tampa de rosca.
As placas de Petri são de 50, 90 ou 150 mm de diâmetro.
Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome, data de fabricação, numero de lote interno do laboratório, data de validade e tipo de armazenamento.
Todos os meios em placa devem ser embalados na posição invertida e em pacote de filme plástico PVC transparente e de papel grau cirúrgico para evitar o ressecamento.
Evitar o uso de sacos plásticos para embalar as placas, pois a agua de condensação formada facilita a proliferação de fungos; para meios
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Obrigada!
Contato: thamiris.ramos@unitoledo.br