Espectrofotometria

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1
CEN 0260
Métodos instrumentais de análise química
Fábio R. P. Rocha 
(frprocha@cena.usp.br)
Espectrofotometria de absorção
molecular
 Qual o fundamento da técnica?
O que é importante saber?
 Qual a aplicabilidade para a análise de alimentos?
 Quais as vantagens/limitações?
 Como funcionam os equipamentos?
 Como a técnica se compara às demais?
 Como preparar as amostras?
TRINDADE DA QUÍMICA ANALÍTICA
amostra
problema
método
H. Bergamin Filho, 1996
Espectrofotometria de absorção
molecular
2
Aplicações em análises de alimentos
 digeridos sulfúricos
- NH4
+, PO4
3-
- digeridos nitro-perclóricos ou nítricos
- SO4
2-, Al3+, Fe3+, Mn2+, Zn2+, Cd2+, Pb2+, Ni2+, Cr2O7
2-
 extratos aquosos
- Cl-, NO3
-, NO2
-
-Taninos, flavonoides, anti-oxidantes, vitaminas, açúcares, 
ácidos graxos, edulcorantes, conservantes, corantes, toxinas 
 absorção molecularEspectrofotometriaEspectrofotometriaEspectrofotometria
 absorção em solução
UV-vis
Qual o fundamento da técnica?
A B
y
x
z campo elétrico
campo magnético

Radiação eletromagnética
E = h = hc

h  6,6 x 10-34 J s
c  3,0 x 108 m/s
radiação eletromagnética
3
raios X
raios 
ultravioleta
infravermelho
microondas
rádio
Espectro eletromagnético

400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
ultravioleta
infravermelho
região visível
visível
Espectrometria de absorção molecular
M + h  M* 
Moléculas
no estado fundamental
Radiação eletromagnética
Moléculas
excitadas
I0 It
absorção
4
y
x
z campo elétrico
campo magnético

Radiação eletromagnética
E = h = hc

h  6,6 x 10-34 J s
c  3,0 x 108 m/s
radiação eletromagnética
Absorção de radiação por
espécies moleculares
M + h  M*
 rotação
 vibração
 transições eletrônicas
Energia
Energia
Freqüência
Comprimento
de onda ()
Comprimento
de onda ()
Absorção de radiação eletromagnética
5
 / nm cor cor complementar
380-420 violeta
420-440
440-470
470-500
500-520
520-550
550-580
580-620
620-680
680-780
absorvida transmitida
verde-amarelo
verde-amarelo
amarelo
amarelo
violeta
violeta
violeta-azul
violeta-azul
azul
azul
azul-verde
azul-verde
verde
verde
laranja
laranja
vermelho
vermelho
púrpura
púrpura
0.5
1.0
1.5
Espectros de absorção de diferentes substâncias Absorção de radiação por
espécies moleculares
M + h  M*
 rotação
 vibração
 transições eletrônicas
Energia
6
E2
E0
E1
e1
e2
e3
e1
e2
e3
e1
e2
e3
ea
eb
ec
ed
Absorção de radiação eletromagnética
A

0.5
1.0
1.5
Espectros de absorção de diferentes substâncias 
I0 It
absorção
O
O
O
O
7
Aplicações em análises de alimentos
 digeridos sulfúricos
- NH4
+, PO4
3-
- digeridos nitro-perclóricos ou nítricos
- SO4
2-, Al3+, Fe3+, Mn2+, Zn2+, Cd2+, Pb2+, Ni2+, Cr2O7
2-
 extratos aquosos
- Cl-, NO3
-, NO2
-
-Taninos, flavonoides, anti-oxidantes, vitaminas, açúcares, 
ácidos graxos, edulcorantes, conservantes, corantes, toxinas 
A
tempo
A
400 500 600 700 800
 / nm

 
620 nm540 nm
420 nm
Analito + Reagente(s)  Produto
t
Derivação química
Analito + Reagente(s)  Produto
Derivação química
 sensibilidade
 Formação de espécies com maior ε
 Espécie não absorve radiação
 seletividade
 Formação de espécie que absorve em outra região espectral
0.5
1.0
1.5
Espectros de absorção de diferentes substâncias 
8
Análise quantitativa
amostra
adição de
reagente
branco amostrasoluções de referência
c1 c3 c4c2
cx  c2
desenvolvimento
da reação (t)
b
I0 It
 T = It / I0 (%T = 100 x T)
 A = log (1 / T) = log (I0 / It)
A = 0  T = 1  100% transmissão
A = 1  T = 0,1  10% transmissão
90% absorção 
Lei de Beer
 Lei de Beer: A = bc
[b] = cm; [c] = mol L-1  [] = L mol-1 cm-1
c
A
m = b
A
Io It
= log10 = 0,000Absorbância
Io
It
It = Io
Io It
= log10 = log1010 = 1,000Absorbância
Io
It
It = 10% Io
9
Io It
= log10 = log10100 = 2,000Absorbância
Io
It
It = 1% Io
b
I0 It
 T = It / I0 (%T = 100 x T)
 A = log (1 / T) = log (I0 / It)
A = 0  T = 1  100% transmissão
A = 1  T = 0,1  10% transmissão
90% absorção 
Lei de Beer
 Lei de Beer: A = bc
[b] = cm; [c] = mol L-1  [] = L mol-1 cm-1
c
A
m = b
A
Exercício
Uma solução contendo 1,00x10-5 mol/L de uma substância apresentou
absorbância de 0,540 em uma cela de 1 cm.
(a) Calcule a absortividade molar da substância;
(b) Qual a concentração da substância em uma solução que apresentou
40% de transmissão?
Análise quantitativa
 Exemplo: determinação de ferro com 1,10-fenantrolina
2Fe3+ + C6H8O6 2Fe2+ + C6H6O6 + 2H+
Fe2+ + 3 phen  [Fe(phen)3]2+ NN
phen = 
10 mg L-1branco 5 mg L-1
10
Ax = 0,296 
Ax
cx2,0 4,0 6,0 8,0 10
0
0,2
0,4
0,6
cFe / (mg L-1)
A
A = 0,0598 CFe (mg L-1)
Análise quantitativa
cFe / mg L-1 A
2,0 0,120
4,0 0,239
6,0 0,359
8,0 0,478
10 0,598
cx = 0,296 / 0,0598 L mg-1
cx = 4,95 mg L-1
Exercício
Para a determinação de ferro, uma amostra de espinafre (500 mg)
foi digerida em forno de micro-ondas com mistura de HNO3 e H2O2
e o volume do digerido foi ajustado para 20,0 mL. Após derivação
química, foi obtida a curva de calibração definida pela equação: A =
0,0142 CFe (mg/L) + 0,0002. Valores médios de absorbância de
0,0812 e 0,0015 foram medidos para o digerido e para a solução do
branco, respectivamente.
(a) O que é a solução do branco? Por que a medida de branco é
necessária?
(b) Explique como a equação da curva de calibração foi obtida.
(c) Calcule a quantidade de ferro na amostra em mg/kg.
Exercício
Para a determinação de ferro, uma amostra de espinafre (500 mg)
foi digerida em forno de micro-ondas com mistura de HNO3 e H2O2
e o volume do digerido foi ajustado para 20,0 mL. Após derivação
química, foi obtida a curva de calibração definida pela equação: A =
0,0142 CFe (mg/L) + 0,0002. Valores médios de absorbância de
0,0812 e 0,0015 foram medidos para o digerido e para a solução do
branco, respectivamente.
(a) O que é a solução do branco? Por que a medida de branco é
necessária?
(b) Explique como a equação da curva de calibração foi obtida.
(c) Calcule a quantidade de ferro na amostra em mg/kg.
Exercício
Para a determinação de ferro, uma amostra de espinafre (500 mg)
foi digerida em forno de micro-ondas com mistura de HNO3 e H2O2
e o volume do digerido foi ajustado para 20,0 mL. Após derivação
química, foi obtida a curva de calibração definida pela equação: A =
0,0142 CFe (mg/L) + 0,0002. Valores médios de absorbância de
0,0812 e 0,0015 foram medidos para o digerido e para a solução do
branco, respectivamente.
(a) O que é a solução do branco? Por que a medida de branco é
necessária?
(b) Explique como a equação da curva de calibração foi obtida.
(c) Calcule a quantidade de ferro na amostra em mg/kg.
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 radiação monocromática
 soluções diluídas
 condições reacionais
(excesso de reagente, pH)
 A < 1,0
Aplicação da lei de Beer
I0 It
absorção
I0
reflexão
ar ar
solução
vidro vidro
Ir (2 - 1)2
Io (2 + 1)2= I0
espalhamento
12
Efeito Tyndall
NaCl gelatina/água
amostra 
Espectrofotômetros
fonte de
radiação monocromador detector
amplificador
sinal
A = log (Io/It)
solvente
Io
amostra
It
Espectrofotômetros
fonte de
radiação monocromador detectoramostra
amplificadorsolvente
 feixe simples
fonte de
radiação monocromador detectoramostra
solvente
amplificador
motor
 feixe duplo
sinal
sinal
Espectrofotômetros com duplo feixe
13
Espectrofotômetros com duplo feixe
deutério
tungstênio
 / nm
In
te
ns
id
ad
e
Fontes de radiação
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
Lâmpadas de tungstênio
UV vis infravermelho
comprimento de onda (m)
deutério
tungstênio
 / nm
In
te
ns
id
ad
e
Fontes de radiação
200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
14
Sistema óptico
fenda de 
entrada
monocromadores
fenda de 
entrada
fenda de 
saída
espelhos
rede dedifração
fenda de 
saída
prismalente
lente
T 
(%
)
 / nm
400 450 500 550
80
60
40
20
filtro de
interferência
filtro de absorção
~ 50 nm
~ 10 nm

...
T 
(%
)
½ h
filtros
Fenda de
saída
Fenda de
entrada
Rede de 
difração
Espelho
côncavo
Espelho 
côncavo
Angulo da rede 
determina o 
comprimento de onda 
na fenda de saída
Fonte de
radiação
Espectros de absorção 
FeSCN2+
Fe[(phen)3] 2+
Ab
so
rt
iv
id
ad
e 
m
ol
ar
Celas de medida
material transparência aplicabilidade
quartzo 150-3000 nm UV, visível
vidro 375-2000 nm visível
plástico 380-800 nm visível
0,1 cm < b < 10 cm 
0,1 cm < b < 5 cm 
10 L < V < 200 L 
15
Celas de medida Detectores
 P sinal elétrico
(V, I, Q)
Transdutor ideal:
 sensibilidade  sinal / ruído
resposta rápida  
S = kP + k’
anodo
catodo
e-
radiação
amplificador
90 V
+-
fototubo
região p região n
Detectores
fotomultiplicadora fotodiodo
radiação
anodo
~ 107 e- / fóton
radiação
catodo
quartzo
(n1 x n2) e- / fóton
n1 e- / fóton
100% T 0% T
Espectrofotômetros
16
Espectrofotômetro multicanal
fonte de
radiação amostra
rede de difração
arranjo de
fotodetectores
espelho
Espectrofotômetro com fibras ópticas
Cubeta e 
porta-amostra Fonte de
radiação
Interface com
espectrofotômetro
Monocromador 
Ocean Optics Inc
Espectrofotômetros com fibra óptica
detector
fonte
filtro de
interferência
sonda
fibras ópticas
espelho
½ b

17
Espectrofotômetros portáteis
 diretas
 derivação química
 acoplamento com técnicas/processos
(FIA, cromatografia)
 titulações espectrofotométricas
Aplicações da espectrofotometria
Fe2+/Cr2O7
2-
Cu2+/EDTA
MnO4
-/H2C2O4
A
A
A
V
V
V



espectrofotômetro
Titulações espectrofotométricas
agitação
18
Espectrofotômetros com fibra óptica
detector
fonte
filtro de
interferência
sonda
fibras ópticas
espelho
½ b

Análises em fluxo
100
2,0
0,75
1,0
0,50
0,25
0,050
0,10
50
0
si
na
l a
na
lít
ic
o 
/ 
m
V
tempo
 Determinação de fosfato em águas
 
LED
fotodetector
tubo de 
vidro

amostra
C
R1
R2
D
50 cm 200 cm
detector
bomba
solventes
injetor
Detector em cromatografia líquida
tempo / min
ab
so
rb
ân
ci
a
DDT
o-cresol fenol
UV ( = 272 nm)
coluna
2 4 6 8 10
Referências 
 Harris, D.C., Análise Química Quantitativa, 6a ed.,
LTC, Rio de Janeiro, 2005.
 Skoog, D.A., Holler, F.J., Nieman, T.A., Princípios de
Análise Instrumental, 5a ed., Bookman, Porto Alegre,
1998.
 Apostila - espectrofotometria