Diagnóstico Sorológico

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Tema 4: Diagnóstico sorológico e controle de qualidade 
· Diagnóstico sorológico
Os métodos sorológicos são desenvolvidos a partir do reconhecimento antígeno-anticorpo. Os antígenos são qualquer molécula estranha ao organismo, como fungos, bactérias, vírus e protozoários, que estimulam a produção de imunoglobulinas. ( anticorpos capazes de eliminar antígenos) A ligação do anticorpo ao antígeno é altamente específica e ocorre em um sítio denominado epítopo. Assim, os testes sorológicos utilizados para detectar a presença de um anticorpo (anti-X) são desenvolvidos apresentando em sua composição o epítopo do antígeno específico (X), isso garante que a reação ocorra apenas quando o soro testado apresentar o anticorpo (anti-X) em investigação. Além de verificar a presença ou a ausência de um determinado anticorpo, esses testes foram adaptados para detectar um antígeno, a presença de enzimas e os hormônios. 
- Classificação dos testes sorológicos 
O método qualitativo indica a presença ou ausência de uma resposta, ou seja, apenas classifica aquela análise como positiva ou negativa, reagente ou não reagente. Os anticorpos da classe IgM são os primeiros a serem produzidos durante uma infecção, e indicam que o paciente está com a infecção ativa, ou seja, com a doença. Alguns tipos de testes sorológicos qualitativos são muito utilizados no ambiente laboratorial, como os testes rápidos para HIV, coronavírus, sífilis, zika, H. pylori, rotavírus, dentre outros.
É utilizado o método quantitativo quando desejamos que um resultado seja medido, ou seja, tenha um valor quantificado. Nesse tipo de método, a quantidade de antígenos, ou anticorpos, pode ser expressa das seguintes maneiras:
· No formato de cruzes (positivo +/++++; ++/++++; +++/++++; ++++/++++, onde 4 “+” indicam o máximo de positividade do método)
· Titulações (1:2, 1:4, 1:8; 1:16, dentre outros)
· Densidades ópticas de reações colorimétricas
· Unidades de medidas (UI/mL, % e mg/ mL) que apresentem o valor absoluto do analito
As metodologias quantitativas para o diagnóstico sorológico também possibilitam a identificação da quantidade de antígenos presentes ou o título de anticorpos. Para a determinação da titulação de anticorpos, podemos citar o teste sorológico VDRL, amplamente utilizado nas rotinas laboratoriais para a detecção da sífilis, doença causada pela bactéria Treponema pallidum.
- Processo de soroconversão 
 A soroconversão é o termo dado para indicar que um organismo produziu anticorpos após o contato com um antígeno. Durante uma resposta imunológica, o contato com um antígeno geralmente induz a produção de anticorpos, mas a detecção destes pelos métodos sorológicos disponíveis pode demorar semanas ou até meses. O período entre a produção e a detecção dos anticorpos pelos métodos é chamado de janela imunológica, janela sorológica ou janela de soroconversão. Nesse intervalo, mesmo que um paciente esteja infectado, a pesquisa de anticorpos será negativa. Dizemos que houve um processo de soroconversão quando o resultado de um primeiro teste sorológico para a detecção de anticorpos contra um antígeno hipotético X for negativo e o de um segundo exame, feito algum tempo depois, for positivo. 
- Fase clínica 
Fase inicial (ainda não há doença, mas existe risco de adoecer) > fase pré-clínica (o paciente apresenta doença, mas sem sintomas; há alterações patológicas > fase clínica (a doença apresenta graus de acometimento avançados) > fase de incapacidade residual (doença progride para a morte ou as alterações se estabilizam)
>>> IgM: INFECÇÃO IMEDIATA; INFECÇÃO AGUDA 
>>> IgG: INFECÇÃO TARDIA; INFECÇÃO CRÔNICA OU MEMÓRIA 
Ex.: Se um paciente apresenta um IgM positivo para o coronavírus com IgG negativo, então, encontra-se na fase aguda da doença, ou seja, a fase altamente transmissível, necessitando ficar em isolamento social. 
- Eficácia terapêutica 
Do ponto de vista imunológico, a eficácia terapêutica é a eficiência na produção de anticorpos protetores após uma infecção ou vacinação (imunização ativa, quando é oferecido ao organismo um vírus morto, ou atenuado, para estimular a produção de anticorpos do tipo IgG de memória)
- Diagnóstico sorológico na seleção de doadores e receptores de sangue e órgãos 
Os antígenos responsáveis pela rejeição dos transplantes são denominados aloantígenos, que são conhecidos como antígenos de histocompatibilidade e se dividem em: 
Complexo de histocompatibilidade principal (MHC)
· MHC I: encontrado em todas as células nucleadas 
· MHC II: constitui células apresentadores de antígeno como macrófagos, células dendríticas e linfócitos.
>> Principais tipos de rejeição de enxertos 
Rejeição hiperaguda: Ocorre minutos ou dias após o transplante, é causada pela ação de anticorpos IgM contra antígenos do sistema ABO, HLA ou antígenos expressos no endotélio vascular.
Rejeição aguda: Ocorre poucos dias ou semanas após o transplante, é mediada pelas células T e pelos anticorpos que respondem especialmente ao MHC.
Rejeição crônica: Ocorre seis meses a um ano após o transplante através da imunidade celular e humoral adquirida, que cria respostas contra o enxerto.
- Testes imunológicos para seleção de doadores e receptores de órgãos/sangue
	Tipagem sanguínea (ABO)
	Teste utilizado para identificar tipo sanguíneo e fator Rh
	Reatividade contra painel (PRA)
	Método utilizado para avaliar status imunológico do paciente, detecção de moléculas HLA reconhecida pelo paciente
	Prova cruzada
	Teste que verifica se o sangue do doador apresenta incompatibilidade com o receptor
	Tipagem de tecidos
	Detecta compatibilidade entre o HLA do doador e do receptor
- Diagnóstico coletivo 
A avaliação coletiva é importante em grandes surtos, pois possibilita uma fotografia do panorama da infecção na população e auxilia no acompanhamento, desenvolvimento de medidas de saúde pública, políticas e socioeconômica de combate ao surto.
Existem dois importantes termos relacionados ao diagnóstico coletivo: soroprevalência e soroepidemiologia.
	Soroprevalência: Refere-se ao número de pessoas que apresentam anticorpos detectáveis contra um agente infeccioso, ou seja, a reação de soropositividade desenvolvida a partir da soroconversão.
	Soroepidemiologia: Acompanha os pacientes, através dos exames de diagnóstico, que apresentaram marcadores sorológicos (anticorpos) contra algum microrganismo, associando esses dados aos fatores sociais, ambientais e econômicos; assim, é possível estudar as melhores estratégias para a saúde pública da população.
- Bancos de soros ou sorotecas 
Esses bancos são importantes porque garantem a rastreabilidade dos resultados encontrados, ou seja, possibilitam que uma análise seja repetida para a confirmação do resultado encontrado.
Normalmente, esses soros são separados pelo tipo de análise, ou seja, pelo tipo de agente infeccioso que se deseja investigar. Os tubos armazenados apresentam a identificação do paciente (nome completo ou iniciais e/ou o número do exame laboratorial), data da coleta da amostra e tipo de microrganismos investigados. Essas amostras então são acondicionadas em tubos por um período de 5 a 10 anos e mantidas em congelamento (-20 °C) até serem utilizadas e/ou descartadas futuramente. No caso de um laboratório de pesquisa, esses soros ficam separados de acordo com suas similaridades e podem ser importantes para estudos futuros, devendo ficar armazenados a uma temperatura de -80 °C.
Segundo a Resolução da diretoria colegiada (RDC N°34/ 2014), os bancos de sangue devem armazenar a plasmateca, ou soroteca, dos doadores por pelo menos 6 meses na temperatura de -20 °C.
- Avaliação dos métodos sorológicos 
A avaliação do desempenho dos testes sorológicos depende da ausência de desvios na análise (validade ou acurácia do método) e da precisão dos resultados. Desse modo, os métodos de diagnósticos têm que ser avaliados quanto à reprodutibilidade e à acurácia.
· Reprodutibilidade: representa a capacidade dos métodos de produzir resultados iguais, mesmo em condições distintas de análises, sendo precisose confiáveis. Um teste sorológico é de alta reprodutibilidade quando, após análises repetidas em uma mesma amostra ou amostras provenientes de um mesmo paciente, são encontrados resultados similares. 
· Acurácia (validade ou exatidão): A acurácia de um método é a sua capacidade de fornecer resultados verdadeiros, ou seja, quanto aquele método é útil para predizer ou diagnosticar um evento que se propôs de maneira qualitativa ou quantitativa. Para determinar a acurácia de um método, devemos comparar o resultado do teste com os resultados de um padrão, que pode ser a clínica do paciente, exames disponíveis ou um ensaio que possa servir como referência (considerado padrão-ouro).
· A precisão indica a reprodutibilidade de um método; já a exatidão aponta o quanto esse método apresenta resultados verdadeiros
- Teste sorológico ideal para cada tipo de análise 
Os resultados possíveis encontrados durante uma validação de um novo teste são:
	Resultados verdadeiramente positivos: Quando não há dúvida da positividade do teste
	Resultados falso positivos: Quando o teste é positivo, mas o paciente não apresenta a infecção
	Resultados verdadeiramente negativo: Quando não há dúvida da negatividade do teste
	Resultados falso negativo: Quando, apesar de o teste ser negativo, o paciente apresenta infecção
A partir dos resultados encontrados para a determinação da acurácia, podemos calcular alguns parâmetros para avaliar o desempenho do método.
- eficiência do teste, sensibilidade e especificidade 
	Eficiência do teste: Capacidade do teste detectar os pacientes que apresentam ou não a doença, ou seja, quantos indivíduos são verdadeiramente positivos e negativos dentro de uma população total. Mede quanto o teste apresenta resultados fidedignos.
	Sensibilidade: Indica quanto um teste consegue determinar em um grupo de indivíduos aqueles que realmente se encontram verdadeiramente positivos.
	Especificidade: Indica quanto o teste consegue determinar em um grupo de indivíduos aqueles que não estão doentes, os verdadeiramente negativos.
· Técnica Western blot: Técnica que detecta proteínas em amostras após a eletroforese, transferência para uma membrana de nitrocelulose, e o reconhecimento do antígeno e do anticorpo.
Um teste de diagnóstico ideal deve ter alta sensibilidade (evitar falso negativo) e alta especificidade (evitar resultados falso positivo). Os problemas encontrados durante a avaliação da sensibilidade ou especificidade de um teste estão relacionados a erros sistemáticos inerentes aos métodos. Os erros sistemáticos podem ser:
	Pré analíticos: Correspondem a toda fase anterior à análise e à chegada ao laboratório. Exemplos: problemas na coleta, no transporte, no armazenamento, na conservação e nas características da amostra (hemólise, lipídico, contaminado).
	Analíticos: Correspondem à análise em si, a erros de pipetagem, nos equipamentos (manutenção e calibração), nos reagentes disponíveis (validade, contaminação, diluição).
	Pós analíticos: Correspondem a erros na interpretação dos resultados. Exemplo: erros de cálculos, interpretação e transcrição.
- Valores de predição 
Esse parâmetro é avaliado pelos valores de predição (VP), que indicam a probabilidade de um determinado paciente que apresentar diagnóstico positivo ou negativo esteja verdadeiramente doente ou sadio. O VP é dividido em valor preditivo positivo e valor preditivo negativo.
	Valor preditivo positivo (VPP): É a probabilidade de um paciente com uma testagem positiva ter efetivamente a doença. Esse parâmetro é baseado na prevalência da doença na amostra estudada e na especificidade do teste. Quantificará a proporção de positivos que efetivamente tem a doença.
	Valor preditivo negativo (VPN): Quantifica a probabilidade de um resultado “verdadeiro negativo”. Esse parâmetro é baseado na prevalência da doença na amostra estudada, verificando a quantidade de sadios com um teste negativo.
· Quanto maior o valor do preditivo positivo, maior é a prevalência da doença em uma determinada população.
- Razão de verossimilhança 
Esse parâmetro indica quantas vezes é possível a detecção de um teste positivo ou negativo e é muito utilizado nas análises de pré-testes, quando queremos estabelecer um novo método de diagnóstico. Essa medida pode ser positiva ou negativa. Quando os dados são avaliados em sensibilidade, essa medida pode ser calculada a partir desses dois parâmetros:
	Razão de verossimilhança positiva (RV +): Verifica quantas vezes é mais provável encontrar um resultado positivo em pessoas doentes quando comparadas com não doentes. Quanto maior a RV +, melhor é o teste. Calculado como: 
rv (+) = sensibilidade/especificidade 
	Razão de verossimilhança negativa (RV -): Verifica quantas vezes é mais provável encontrar um resultado negativo em pessoas doentes, quando comparadas com não doentes. Calculado como: rv (-) = sensibilidade/especificidade 
Tema 6: Métodos laboratoriais