Exercícios em Bioinformatica - Principios da Biologia Molecular

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1. Considere a seguinte sequência de um fragmento de DNA isolado de bactéria:
5'-CTGATAAGGGATTTAAATTATGTGTCAATCACGAATGCTAATCGCTTAACACTTC-3'
a) Assumindo que esta seqüência corresponde a seqüência da fita codificadora, qual seria a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo produzido quando um mRNA transcrito deste gene for traduzido? Que características na seqüência do mRNA determinam qual é o códon iniciador? Considere a primeira base como o início da transcrição.
	A sequência do mRNA transcrita a partir do DNA fornecido será:
5'-AUGUACAUUUAAAUCCCATTATCAG-3'
O códon iniciador é o AUG, que é o único códon de iniciação presente em bactérias. Ele codifica o aminoácido metionina (Met).
A sequência de aminoácidos produzidos pela tradução do mRNA é:
Met - Tyr - Lys - Asn - Pro - His - Tyr - Ala - Ser - Asp - Leu
b) De acordo com o princípio de oscilação no pareamento de bases ("wobble"), qual o número mínimo de tRNAs necessário para decodificar os seis códons de leucina - UUA, UUG, CUU, CUC, CUA e CUG ? Explique.
	O princípio de oscilação de pareamento de bases ("wobble") permite que um tRNA reconheça mais de um códon. No caso dos códons de leucina, o códon UUA é reconhecido pelo tRNA com anticódon 5'-AAU-3', o códon UUG é reconhecido pelo tRNA com anticódon 5'-CAA-3', e os códons CUU, CUC, CUA e CUG são reconhecidos pelo tRNA com anticódon 5'-GAA-3'. Portanto, apenas dois tRNAs diferentes são necessários para decodificar os seis códons de leucina.
2. Em procariotos, a maioria da cadeias polipeptídicas são iniciadas com o aminoácido
metionina, cujo códon é AUG.
3. Num sistema de síntese de proteínas in vitro, que permita o início e término da síntese em qualquer seqüência de RNA, que peptídeo seria produzido pelo poli-ribonucleotídeo 5'- UUUGUUUUUGUU-3' ? Indique qual o aminoácido N-terminal e o C-terminal do polipeptídeo obtido.
	Para determinar qual polipeptídeo seria produzido a partir do poli-ribonucleotídeo dado, é preciso traduzi-lo em uma sequência de aminoácidos usando o código genético.
	O poli-ribonucleotídeo 5'- UUUGUUUUUGUU-3' tem uma sequência de bases UUU, que codifica para o aminoácido fenilalanina (Phe). Portanto, a sequência de aminoácidos produzida seria:
N-terminal: fenilalanina (Phe)
C-terminal: fenilalanina (Phe)
	Isso ocorre porque o códon de terminação da tradução (UAA, UAG ou UGA) não está presente na sequência do RNA. Em vez disso, a tradução continua até que o ribossomo atinja o final do RNA, resultando em uma cadeia polipeptídica com a mesma sequência de aminoácidos no N-terminal e C-terminal.
	Portanto, o polipeptídeo produzido seria uma cadeia de fenilalanina repetida.
4. O códon AUG funciona tanto para iniciar uma cadeia polipeptídica quanto para dirigir a incorporação de uma metionina em posições internas de uma proteína. Quais os mecanismos de seleção do códon AUG para a iniciação da tradução em procariotos?
	Em procariotos, o mecanismo de seleção do códon AUG para a iniciação da tradução ocorre por meio da interação entre o ribossomo, o RNA mensageiro (mRNA) e o iniciador de proteína (também conhecido como fMet-tRNAfMet). Esse processo envolve várias etapas, incluindo:
1. Reconhecimento do promotor: a região do DNA que contém o gene é transcrita em um mRNA. Antes do códon AUG, existe uma região não traduzida chamada região de Shine-Dalgarno (SD), que interage com o ribossomo para facilitar o posicionamento correto do AUG.
2. Ligação do ribossomo: o ribossomo se liga ao mRNA no local onde está localizado o códon AUG, que é reconhecido pela subunidade 16S do ribossomo.
3. Em procariotos, a seleção do códon AUG para iniciar a tradução ocorre por meio de um mecanismo de reconhecimento do ribossomo e de proteínas de iniciação da tradução.
4. O processo de iniciação da tradução em procariotos é iniciado pela ligação da subunidade menor do ribossomo ao códon de iniciação AUG localizado na região 5' do mRNA (mRNA líder). Em seguida, a proteína de iniciação IF3 se liga à subunidade menor do ribossomo, ajudando a evitar a união prematura da subunidade maior. A proteína de iniciação IF2-GTP se liga ao aminoacil-tRNA carregando a metionina e reconhece o códon AUG de início de tradução no sítio P do ribossomo. A energia liberada pela hidrólise do GTP pela IF2 promove a formação do complexo de iniciação 70S (subunidades menor e maior do ribossomo).
5. No que consiste a sequência de Shine Dalgarno? Ela é universal? Explique.
		A sequência de Shine Dalgarno é uma região específica de nucleotídeos localizada no RNA mensageiro (mRNA) próximos ao codão de início da síntese de proteínas em bactérias. Essa sequência se liga à sequência complementar presente no RNA ribossômico, permitindo a correta posição do ribossomo sobre o mRNA para iniciar a tradução. Essa sequência não é universal e é encontrada principalmente em bactérias e alguns vírus.
6. Explique como ocorre a ativação dos aminoácidos no processo de tradução.
		A ativação de aminoácidos é o processo pelo qual um aminoácido é ligado a um RNA de transferência (tRNA) específico em uma reação catalisada por uma enzima chamada aminoacil-tRNA sintetase. Esse processo ocorre em duas etapas: primeiro, o aminoácido é ativado pela ligação com uma molécula de ATP, formando um aminoacil-AMP. Em seguida, a enzima transfere o aminoácido ativado para o tRNA correspondente, formando o aminoacil-tRNA. Esse processo é essencial para a síntese correta de proteínas.
7. Explique os mecanismos de ação de antibióticos que agem inibindo a síntese protéica.
		Antibióticos que inibem a síntese proteica geralmente atuam impedindo a formação ou a ação do complexo ribossômico, inibindo a síntese de proteínas bacterianas. Por exemplo, a tetraciclina e a cloranfenicol impedem a associação do aminoacil-tRNA com o sítio A do ribossomo, enquanto a eritromicina e a azitromicina inibem a translocação do ribossomo ao longo do mRNA. Outros antibióticos, como a puromicina, imitam aminoacil-tRNA e se ligam ao ribossomo, levando à terminação prematura da síntese de proteínas.
8. O que se entende por chaperona?
		Chaperonas são proteínas especializadas que auxiliam na correta conformação e dobramento de outras proteínas. Essas proteínas são essenciais para garantir que as proteínas sejam corretamente formadas e desempenhem suas funções. As chaperonas também previnem a agregação e a agregação de proteínas mal dobradas, ajudando a proteger as células de danos e estresse celular.
9. Quais os eventos que podem acontecer com uma proteína depois de terminada a síntese?
		Após a síntese, uma proteína pode passar por diversas modificações, como dobramento para assumir sua conformação tridimensional funcional, clivagem de regiões específicas para gerar proteínas mais curtas, modificação pós-traducional (por exemplo, fosforilação, glicosilação ou acetilação) que pode afetar sua atividade ou localização celular, e montagem com outras proteínas para formar complexos proteicos.
10. Compare a síntese dos filamentos de leading (processivo) e lagging (retardatário) em DNA procarioto e DNA eucarioto.
	Na síntese de DNA, os filamentos leading e lagging são sintetizados de maneira diferente. Na replicação do DNA procariótico, a síntese do filamento leading começa em um único ponto de origem e continua em direção à replicação fork, enquanto a síntese do filamento lagging começa em vários pontos de origem e é sintetizada em fragmentos de Okazaki que são posteriormente ligados por ligases de DNA. Na replicação do DNA eucariótico, a síntese do filamento leading também começa em um único ponto de origem, mas a síntese do filamento lagging é mais complexa e requer a formação de um loop na molécula de DNA.
11. Qual a temperatura utilizada na PCR? A que temperatura ela sintetiza DNA? Porque sintetiza DNA a tão alta temperatura?
	Na PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), são utilizadas diferentes temperaturas em ciclos repetidos para amplificar o DNA. A temperatura utilizada na desnaturação do DNA é geralmente de 94-98 °C, enquanto a temperatura utilizada na annealing(pareamento) dos primers é geralmente de 50-65 °C e a temperatura utilizada na extensão do DNA é geralmente de 72-74 °C. A alta temperatura é necessária para separar as duas cadeias de DNA, permitindo que os primers se liguem especificamente à sequência-alvo e que a enzima polimerase possa estender o novo filamento.
12. O que diferencia o DNA procariótico (de E. coli) do DNA eucariótico, em relação à sua origem de replicação?
	O DNA procariótico geralmente tem um único ponto de origem de replicação, enquanto o DNA eucariótico tem vários pontos de origem de replicação. Além disso, o DNA procariótico geralmente é circular e não possui histonas associadas, enquanto o DNA eucariótico é linear e possui histonas associadas.
13. Cite as diferenças entre a PCR convencional e a de sequenciamento genômico.
		A PCR convencional é uma técnica que amplifica uma região específica do DNA. Ela envolve o uso de iniciadores de PCR (ou primers) que se ligam às sequências flanqueadoras da região-alvo do DNA e ampliam a região por meio de ciclos de aquecimento e resfriamento. A PCR convencional é amplamente utilizada em várias aplicações, como diagnóstico molecular, sequenciamento de DNA e análise de mutações genéticas.
		Por outro lado, a tecnologia de sequenciamento genômico é capaz de sequenciar todo o genoma de um organismo. Ela envolve a fragmentação do DNA em pequenos fragmentos, sequenciamento dos fragmentos individuais e, em seguida, o alinhamento e montagem dos fragmentos para gerar uma sequência completa do genoma. Existem várias tecnologias de sequenciamento genômico disponíveis, incluindo Illumina, PacBio, Oxford Nanopore e outras.
		As principais diferenças entre a PCR convencional e a de sequenciamento genômico são:
· Escala: a PCR convencional amplifica uma região específica do DNA, enquanto o sequenciamento genômico sequencia todo o genoma.
· Sensibilidade: a PCR convencional é altamente sensível e pode detectar pequenas quantidades de DNA, enquanto o sequenciamento genômico é menos sensível e requer quantidades maiores de DNA.
· Tempo: a PCR convencional é uma técnica rápida que pode produzir resultados em questão de horas, enquanto o sequenciamento genômico pode levar vários dias ou semanas para gerar resultados.
· Custos: a PCR convencional é geralmente mais barata do que o sequenciamento genômico.