Biologia Molecular e Genética

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Biologia Molecular e 
Análises Clínicas
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❖Foi demonstrado, em 1950, que a informação genética nas
células estavam codificadas em uma sequência de nucleotídeos
do DNA;
❖Essa informação é transmitida, de modo conservativo, de uma
célula aos seus descendentes pelo processo de replicação do DNA;
❖Essas instruções genéticas são representadas por apenas 4 letras:
A, C, G, T (U, no caso do RNA).
Relembrando
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❖ O DNA não dirige a síntese protéica;
❖ Células copiam o DNA em RNA (transcrição) e utilizam esta
informação presente no RNA para produzir
uma proteína (tradução);
❖ Variações – splicing do RNA – transcritos rearranjados antes
que as células eucarióticas os traduzam em ptns;
❖ Modifica o significado das moléculas de RNA e são essenciais
para compreender a decodificação do genoma pelas células.
Do DNA ao RNA
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-Química de produtos 
naturais
-Química fina
-Tecnologia das 
enzimas
-Microbiologia
-Cultura de células de 
plantas e animais
-Bioreatores e 
sistema de controle
-Bioquímica
-Biologia molecular 
-Genética
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BIOLOGIA MOLECULAR
➢Custo e facilidade de uso, permite estabelecer diferentes
técnicas em Laboratórios de Análises Clínicas.
Genética DNA
Produção 
de PTNS
Hereditariedade
Submicroscópico
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1975
Nathans e Smith purificaram enzimas de restrição
(ferramentas essenciais para manipulação in vitro do DNA)
Fundamental importância para o isolamento e amplificação 
de fragmentos específicos de DNA
1975
Uma nova tecnologia começou a ser usada para investigar a localização 
dos genes
SOUTHERN BLOTTING
Marcou o início da aplicação destas tecnologias no estudo 
de doenças genéticas
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1977
Técnicas de sequenciamento
Permitiram a identificação de alterações específicas na 
sequência de DNA e a associação destas com diferentes 
doenças genéticas
1987
Técnicas de reação em cadeia da polimerase
(PCR)
Marco no desenvolvimento das técnicas de diagnóstico 
molecular
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Desenvolvimento da bioinformática tem sido 
absolutamente essencial para a Biologia Molecular
Projeto liderado por James Dewey Watson, um dos maiores bioquímicos 
americanos, que pretende desvendar o código genético de um organismo 
(podendo ser animal, vegetal, de fungos, bactérias ou de um vírus) 
através do seu mapeamento 
( AACGTGTCGAA).
Determinar o completo manual de instruções do homem pela leitura da 
seqüência precisa de bases químicas (A, C, G e T) no DNA 
Início da década de 90
PROJETO GENOMA HUMANO 
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O Projeto Genoma (PGH) determinou a sequência dos 3 bilhões de bases na fita
dupla do DNA. Contudo, desse total, apenas 10% originam genes, ou seja,
segmentos que codificam proteínas. Os 90% restantes constituem o junk DNA
(DNA lixo), que não apresenta função conhecida, sendo interpretado como um
resíduo do processo evolutivo da espécie humana.
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Types of noncoding DNA sequences
Cis- and Trans-regulatory elements - Cis-regulatory elements are
sequences that control the transcription of a nearby gene. Cis-elements
may be located in 5' or 3' untranslated regions or within introns. Trans-
regulatory elements control the transcription of a distant gene.
Noncoding functional RNA - Noncoding RNAs are
functional RNA molecules that are not translated into protein. Examples
of noncoding RNA include ribosomal RNA, transfer RNA and microRNA.
Introns - Introns are non-coding sections of a gene, transcribed into the
precursor mRNA sequence, but ultimately removed by
RNA splicing during the processing to mature messenger RNA.
Many introns appear to be mobile genetic elements.
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Pseudogenes - Pseudogenes are DNA sequences, related to
known genes, that have lost their protein-coding ability or are
otherwise no longer expressed in the cell.
Repeat sequences, transposons and viral elements -
Transposons and retrotransposons are mobile genetic elements.
Telomeres - are regions of repetitive DNA at the end of a
chromosome, which provide protection from chromosomal
deterioration during DNA replication.
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No longer junk: Role of long noncoding RNAs in autism risk
long noncoding RNAs
(lncRNAs) - Previous work has
identified a subset of lncRNAs that
are important for regulating the
birth of new neurons, or
neurogenesis, and the process by
which synapses adapt to
experience, called synaptic
plasticity.
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Descreve todas as proteínas codificadas pelos 
genes presentes em cada cromossoma humano 
que atuam na determinação dos caracteres 
hereditários.
As características dos organismos dependem das 
proteínas sintetizadas em estruturas celulares 
conhecidas por ribossomos
PROTEOMA
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Utilização de técnicas de 
Biologia Molecular em 
exames diagnósticos
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Biologia 
Molecular
vs
Diagnóstico
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✓Sensibilidade
✓Precocidade
✓Especificidade
✓Pouco material
✓Múltiplas amostras
✓Contaminação
✓Presença de inibidores
✓Viabilidade (RNA)
✓Custo
✓Padronização
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SOUTHERN 
BLOTTING
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Fragmentos de DNA são separados em gel de agarose.
Transferidos para membranas por ação capilar.
DNA é desnaturado antes ou durante a transferência
Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na membrana
DETECTA POLIMORFISMOS DE DNA OU MUTAÇÕES
Aplicações:
Alterações em um único nucleotídeo; detecção de inserções; deleções
Com o advento da PCR seu uso tornou-se limitado
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WESTERN
BLOTTING
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Corrida de proteínas em gelde poliacrilamida.
Separação e caracterização das proteínas.
Transferência para membrana por força elétrica
Proteína alvo é identificada por anticorpo mono ou policlonal. 
Revelação do sistema com anticorpo secundário fluorescente ou radioativo
Informa o tamanho e a quantidade das proteínas
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HIV - WESTERN - BLOT 
Código .:WHIV
Material .: soro
Sinônimo .: Western Bloting
Volume .: 2.0 mL
Método .: Western blot
Resultado .: Após 48 horas
Temperatura .: Sob refrigeração
Coleta .: Jejum não obrigatório. Soro não pode ser hemolisado.
Código SUS .: 0202030296 / Código CBHPM .: 4.03.07.87-5
Interpretação .: Ver HIV 1 e 2 - Anticorpos (2 Métodos).
Referência .: Não Reagente : Ausência de bandas;
Reagente : Presença de, no mínimo, 2 (duas)
bandas dentre as: gp160/120; gp 41; p24.
Indeterminado: Qualquer outro padrão de bandas
diferente dos descritos acima
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HTLV I/II - WESTERN BLOT 
Técnica de Western Blot é útilizada para confirmar a positividade do teste
imunoenzimático (ELISA) e, a partir das bandas de proteínas detectadas,
identificar o tipo de infecção, se é pelo vírus HTLV-1 ou pelo HTLV-2.
Código .: HTLVW
Material .: soro
Volume .: 2.0 mL
Método .: Western blot
Resultado .: 15 dias
Temperatura .: Sob refrigeração
Coleta .: Jejum não necessário. Coletar soro.
Código SUS .: / Código CBHPM .: 4.03.07.88-3
Interpretação .:
Uso: Confirmação da positividade e discriminação entre as infecções
por HTLV 1 e 2.
http://www.htlv.com.br/patogenese.htm
Vírus linfotrópico das células T
Ativação imune contra a presença de
antígenos do HTLV-I, conduzindo a um
processo inflamatório de desmielinização,
principalmente no medula espinhal torácica.
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FISH
Hibridização in situ com 
fluorescência
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PRINCÍPIO:
Os cromossomos são isolados da célula (em lâmina de
microscopia) e tratados com solução química para desnaturar
a dupla fita do DNA. A seguir adiciona-se sondas específicas
para ligarem ao DNA. Finalmente, incuba com material
fluorescente capaz de identificar o DNA ligado à sonda.
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As principais indicações no diagnóstico pré-natal são:
· Presença de anomalias fetais à ultra-sonografia;
· Alterações nos exames séricos maternos de rastreamento (Papp-A e ß-HCG
livre);
· História familiar de aneuploidias;
· Idade materna igual ou superior a 35 anos.
DIAGNÓSTICO RÁPIDO DE CROMOSSOMOPATIAS POR FISH NO PRÉ-
NATAL
A coleta do material é guiada por ultra-som, e o exame deve ser
feito entre a décima e décima-quarta semanas de gestação, para
o vilo corial, e entre a décima quarta e vigésima semanas para o
líquido amniótico.
Pelo fato de serem investigadas apenas alterações numéricas
dos cromossomos alvo (13, 18, 21, X, Y), anomalias estruturais
não são reconhecidas. Assim, a FISH deve ser complementada
pelo cariótipo fetal convencional.
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FISH
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Captura Híbrida
HPV
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A Captura Híbrida é o exame mais moderno para se fazer o
diagnóstico do HPV. É um teste de biologia molecular qualitativo e
quantitativo, que amplifica e detecta o sinal dos híbridos formados
pela reação enzima-substrato. A leitura do resultado é feita por
quimioluminescência.
O exame consegue diagnosticar a presença do vírus mesmo antes do
aparecimento de qualquer sintoma. O exame possibilita informar com
certeza se o/a paciente é portador/a da infecção ou não.
É um exame útil no diagnóstico e acompanhamento da infecção pelo
Papilomavírus Humano (HPV). Identifica 18 tipos do HPV, divididos em
sondas de baixo e alto risco para câncer do colo do útero. Permite a
detecção de 1 pg/mL de DNA-HPV, equivalente a 0,1 cópia de vírus por
célula.
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A Captura Híbrida não identifica os tipos virais do HPV, e sim os
grupos virais. O teste possui dois pools de sondas, uma para os
vírus de baixo risco (não oncogênicos ou seja, que não causam o
câncer) que pesquisa os tipos virais 6, 11, 42, 43 e 44; e outra para
os vírus de alto risco (oncogênicos ou que podem causar o
câncer) que pesquisa os tipos virais 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,
52, 56, 58, 59 e 68.
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Como é feito o processamento laboratorial?
Após a coleta do material, o processamento laboratorial é semi-
automatizado. Reagindo com sonda gênica especifica, o material
para análise forma híbridos de RNA/DNA que são capturados por
anticorpos que revestem as paredes da microplaca.
A seguir, os híbridos imobilizados, reagem com anticorpos
específicos conjugados a fosfatase alcalina, formando um
substrato estável que é posteriormente detectado por
quimioluminescência ultra-sensível.
Os valores lidos pelo quimioluminômetro são transmitidos a um
computador, dotado de software específico, que analisa os
números recebidos e faz os cálculos de validação do ensaio e a
quantificação dos controles positivos, negativos e amostras. O
software executa o relatório final do teste e sua impressão, não
havendo margem de erro nos cálculos.
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Desnaturação – Hibridização – Captura Híbrida – Conjugação -
Detecção
O Sistema de Captura Híbrida é um teste capaz de detectar diversos
agentes etiológicos de doenças infecciosas, como o papilomavírus
humano – HPV.
Este sistema é um ensaio com amplificação do sinal dos anticorpos
contra os híbridos capturados em microplaca, que utiliza a detecção
quimiluminescente.
A presença de certos tipos de HPV no trato genital feminino são o
principal factor de risco para o cancro cervical.
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HEPATITES
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Extração de 
ácidos nucléicos
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Extração de ácidos nucléicos
Necessário pois toda a análise ou manipulação de DNA ou RNA
depende da extração do organismo a ser estudado. Exemplos: tecidos,
líquidos biológicos(sangue, escarro…)Etapas da extração: lise celular, desproteinização e 
concentração do DNA ou RNA.
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Quais são os métodos????
Fenol-clorofórmio
Quelex
Kit comercias e etc
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Como proceder após a extração 
do material genético?
Se a amostra for DNA pode ser armazenada
no -20° ou no -80°C
Se a amostra for RNA antes de armazenar
tem que fazer a RT-PCR
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Utilizada para analisar macromoléculas com carga (proteínas e 
ácidos nucléicos) em relação a um campo elétrico.
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ELETROFORESE
Metodologia amplamente empregada, que se baseia na migração de moléculas com carga em
relação a um campo elétrico. No caso dos ácidos nucléicos, que se comportam como poliânions
(carga negativa), a migração ocorre em direção ao anodo (pólo positivo).
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O que significa RT-PCR?
Etapa prévia a PCR, que é a síntese de uma fita de DNA 
tendo como molde uma molécula de RNA.
O produto obtido através dessa técnica chama-se DNA 
complementar
(cDNA).
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PCR
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• Técnica de biologia molecular empregada para obter-se amplificação
exponencial de pequenas quantidades de DNA in vitro, empregando
elementos do processo natural de replicação do DNA.
PCR = Polymerase Chain Reaction
ou
Reação em cadeia da Polimerase
ou
Reação de polimerização em cadeia
ou
Polimerização em cadeia do DNA
PCR
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Eletroforese em gel de agarose 1,5% dos 
produtos de PCR para se determinar o genótipo 
G de Rotavírus A.
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PCR Tempo Real
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TESTE DE PATERNIDADE / DNA FINGERPRINTPCR
Código .: PATDUO
Material .: sangue total com EDTA
Sinônimo .: Investigação de Vínculo Genético de Filiação
Volume .: 10.0 mL
Método .: PCR
Rotina .: Diária
Resultado .: 15 dias uteis
Temperatura .: Temperatura ambiente
Coleta .:
Coletar sangue total com EDTA de todas as partes participantes do teste.
Caso a mãe tenha menos que 18 anos encaminhar com o material uma
declaração do responsável por ela. Quando o filho não for registrado em
nome do suposto pai, é necessário uma declaração do responsável legal.
Quando o filho não tiver registro deve ser encaminhado a declaração de
nascido vivo.
Código SUS .: /Código CBHPM .: 0.00.00.00-0
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Interpretação:
O Laboratório Alvaro emprega em suas análises o DNA genômico extraído de
leucócitos presentes no sangue dos examinandos (Suposto Pai, Mãe e Filho
(a)). Para cada indivíduo determina-se os seus dois alelos de cada um dos
treze locos em estudo. Na identificação de cada loco de microssatélite utiliza-
se a tecnologia da PCR (Polymerase Chain Reaction, Reação em Cadeia pela
Polimerase) que amplifica os locos e promove a marcação destes utilizando-se
oligonucleotídeos marcados com grupos fluorescentes de quatro cores
diferentes. Os alelos amplificados e marcados são analisados em
sequenciador automático ABI-PRISM Genetic Analizer (sistema validado pelo
TWGDAM) e seus tamanhos em pares de bases (bp) são determinados por
meio de comparação com padrões previamente obtidos de DNA de
comprimento conhecido. Posteriormente todos os dados são calculados
estatisticamente com base em tabelas de frequências alélicas determinadas
experimentalmente numa amostra representativa da população.
Nos casos de inclusão de paternidade alcança-se uma certeza maior do que 
99,99% e nos casos de exclusão de paternidade a certeza é de 100%
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TESTE DE PATERNIDADE / DNA FINGERPRINT
T
ro
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a
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 b
e
b
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s
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a
 
m
a
te
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a
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e
Regiões são especificamente selecionadas por possuírem grande diversidade de 
tamanho dentro de uma população (marcadores genéticos). 
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Sequenciamento
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Sequenciamento
Sequenciamento do DNA é um
processo que determina a ordem dos
nucleotídeos em uma amostra
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Método de Sanger Pelo método de Sanger, uma fita simples 
de DNA que será sequenciada, é hibridizada com um iniciador de 
desoxinucleotídeos marcado na ponta 5 (cinco linha). 
Quatro misturas de reação são preparadas onde os iniciadores 
utilizados serão polimerisados por uma DNA polimerase.
NGS (Next Generation Sequence) – Illumina, Ion torrent, 
metagenomica, genoma completo etc.
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Sequenciamento
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HEPATITE B - Quantitativo + Genotipagem
Código .:HBQG
Material .: soro
Volume .: 2,0 mL
Método .: PCR e sequenciamento
Resultado .: 30 dias
Temperatura .: Congelar à - 4oC
Coleta .:
1 - Sangue deve ser coletado em tubos estéreis sem aditivos ou contendo
EDTA; 2 - Soro ou plasma (EDTA) devem ser separados entre 2 a 6 horas
após a coleta ; 3 - O material deve ser congelado logo após a centrifugação
e enviado congelado ao laboratório; 4 - Os materiais que chegarem
descongelados serão considerados como LIMITADOS para a
quantificação e/ou detecção viral e a interpretação do resultado será
restrito.
Código SUS .: /Código CBHPM .:4.03.14.08-1
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Interpretação: 
O vírus da Hepatite B é um dos principais agentes etiológicos das hepatites agudas
e crônicas e está também relacionado com o desenvolvimento de cirrose e
carcinoma hepático. Embora existam diversos marcadores sorológicos
extremamente úteis, em muitas situações é importante a detecção do DNA viral e a
quantificação da carga viral. Alguns mutantes VHB podem apresentar
modificações importantes no AgHBs e no AgHBe, fazendo com que não sejam mais
detectados por métodos imunológicos. Nestes casos, apenas a detecção do DNA
pode identificar a presença da partícula viral circulante. Este método tem como
objetivo detectar a presença de mutações específicas nos domínios B e C da DNA
polimerase viral. A presença dessas mutações M1550V, M550I e L 526M leva o
paciente a ficar resistente a essas drogas. Este teste também é conhecido como
resistência genotípica do VHB aos inibidores da DNA polimerase viral,
sequenciamento da DNA polimerase do VHB ou pesquisa de mutação YMDD.
Referência .:Indetectável 
Positivo : Presença de HBV-DNA e resistência 
Limite mínimo teórico de detecção 50 cópias/mL
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Microarray
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Microarray- Chip de DNA- Microarranjos de DNA
Southern blotting em lâmina
Chips de genes
Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas
Hibridização com mRNA ou cDNA fluorescentes
Leitura por scanners
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V
a
nt
a
ge
ns
D
e
sv
a
nt
a
ge
ns
Microarray
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Atividade
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1 - Cite as diferenças entre o DNA e o RNA.
2 – Explique como ocorre a replicação do DNA? Cite 3 diferenças encontradas
nesse processo entre procarioto e eucarioto.
3 - Quais das seguintes afirmações estão corretas? Justifique sua resposta
a) A forquilha de replicação é assimétrica porque contém duas moléculas de
DNA polimerase estruturalmente distintas.
b) Os fragmentos de Okazaki são removidos por uma RNA nuclease.
c) A taxa de erros da replicação de DNA é reduzida pelo mecanismo de verificação
da DNA polimerase.
d) Na ausência do reparo (DNA polimerase e enzimas), os genes são instáveis.
e) O câncer resulta de mutações não corrigidas nas células somáticas.
4 - Se uma cadeia de DNA apresenta a sequência de bases: ATTGCTGCGCATT, a
outra cadeia apresenta na região correspondente qual sequência complementar?
PÓS-GRADUAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS
Profa Dra Camila Souza Lemos e Profa Ms. Larissa Gomes
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1)Onde ocorre a transcrição do DNA? E a tradução do RNA?
2)Porque o splicing do mRNA é importante?
3)O que é um códon?
4)Podemos dizer que essas afirmações estão corretas? Se não
justifique as alternativas incorretas.
I) Os três tipos de RNA, rRNA, tRNA, mRNA participam do
processo de síntese protéica
II) rRNA que é um dos componentes dos ribossomos
III) Os mRNA contém a mensagem que será traduzida em
proteína
IV) Os tRNA carregam os aminoácidos específicos para cada
códon