Aula Métodos

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05/05/2023
Prof. Uelinton Pinto 
Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental
uelintonpinto@usp.br
FBA 5909 – Microbiologia de Alimentos
Métodos de detecção/enumeração de micro-
organismos em alimentos
PARA SEU 
USO 
EXCLUSIVO 
– FAVOR 
NÃO 
REPASSAR
Gentileza de não repassar este material para outras 
pessoas e não publicar online em nenhum tipo de site 
ou repositório.
Grato
Uelinton Pinto
05/05/2023
Tópicos
Métodos tradicionais de enumeração e detecção
• Métodos bioquímicos miniaturizados
• Meios de cultura modificados 
• Métodos imunológicos
• Métodos moleculares
• Biosensores
Métodos alternativos de enumeração e detecção
Metodologia de detecção 
• Métodos alternativos – métodos de triagem (depende!)
 Negativo – resultado definitivo
 Positivo deve ser confirmado pela metodologia tradicional
Tradicional ou 
convencional  Oficial
Alternativa (métodos rápidos)
- Metodologia validada (AOAC, AFNOR, 
NordVal, MicroVal, FSIS, FDA BAM ou 
Método ISO). 
05/05/2023
Metodologia 
de detecção 
Métodos de 
enumeração
Métodos de 
detecção
Contagem em placas
Análises Microbiológicas
Preparo da amostra
Amostra
+
Diluente
Homogenato
25g : 225mL
05/05/2023
Diluent
e 
Diluição seriada
Contagem em placas
Plaqueamento
05/05/2023
Contagem das colônias após incubação
10
-2
10
-3
10
-4
UFC= Num. colonias X (1/dil)
Alíquota 
Entre 25 e 250
Plaqueamento
05/05/2023
VANTAGENS E DESVANTAGENS
¡Plaqueamento em superfície
¡Plaqueamento em profundidade
Wheel of names
Discussão aberta
Métodos de plaqueamento
Plaqueamento em superfície
Plaqueamento em profundidade
VANTAGENS E DESVANTAGENS
¡Plaqueamento em superfície
¡Plaqueamento em profundidade
Wheel of names
Discussão aberta
Vantagens e desvantagens
Plaqueamento em superfície
Mais fácil observer a morfologia da colonia
Sem necessidade de controlar a temperature do agar
Umidade do agar precisa estar no ponto certo
Uso de volume reduzido da alíquota (0.1 mL)
Para maioria dos produtos, o limite de detecção já é 100 UFC/ g(ml)
Plaqueamento em profundidade
Uso de volume maior da alíquota (1 mL)
Limite de detecção de 10 UFC/ g(mL)
Necessidade de controlar a temperature do agar
A temperatura do agar pode inativar células injuriadas
Difícil observer a morfologia da colônia
Uma colônia pode mascara/ sobrepor a outra
05/05/2023
Contagem padrão
Ágar padrão para 
contagem
7oC/10d
Psicrotróficos
37oC/24-48h
Mesófilos
55oC/24h
Termófilos/
Termotróficos
Aeróbios Anaeróbios
aerobiose anaerobiose
Contagem padrão
05/05/2023
CALCULE
¡ Qual a população de mesófilos aeróbios em um 
leite cru com as seguintes contagens:
3 minutos
https://www.menti.com/2ywhvfvg8i
Placas da diluição
1/10.000  315 e 345 
1/100.000  70 e 80
1/1.000.000  10 e 16
Alíquota 0.1 ml
UFC/mL= Num. colonias X (Fator de diluição)
Alíquota 
MÉTODOS DE 
ENUMERAÇÃO
¡NMP Coliformes
05/05/2023
COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES
05/05/2023
Tubo contendo 
caldo lactosado 
resultado 
negativo
Tubo contendo 
caldo lactosado 
resultado positivo
TESTE PRESUNTIVO PARA A PRESENÇA DE COLIFORMES
05/05/2023
Análises Microbiológicas
Número Mais Provável
Coliformes Caldo 
LST 35.5
o
C/48 h
Presuntivo Confirmativo
Coliformes Totais Caldo 
BVB
35.5
o
C/48 h
• Confirmativo de Coliforme Termotolerante
Número Mais Provável
Coliformes Caldo EC
45 
o
C/48 h
05/05/2023
alça
Teste para separar Escherichia coli de outros coliformes
Escherichia coli Enterobacter aerogenes
Klebsiella pneumoniae
IMViC – Indol, Vermelho de Metila, Voges-Proskauer, Citrato
http://www.microrao.com/micronotes/imvic.pdf
05/05/2023
DiluiçãoMeio
10-310-210-1
2+/ 32+/ 33+/ 3LST
1+/ 22+/ 22+/ 3VB
0+/ 11+/ 22+/ 2EC
LST 3 2 2
VB 2 2 1
EC 2 1 0
Teste presuntivo
T abela 2: NM P por grama e intervalo de confiança (95% ), para sér ies de 3 tubos 
com 0,1, 0,01 e 0,001 g/mL de inóculo. 
Pos. tubes 
M PN/g 
Conf. lim. Pos. tubes 
M PN/g 
Conf. lim. 
0.10 0.01 0.001 L ow H igh 0.10 0.01 0.001 L ow H igh 
0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42 
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94 
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94 
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180 
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420 
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420 
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430 
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000 
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000 
2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000 
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100 
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 -- 
 
ht
tp
:/
/w
w
w
.c
fs
an
.f
da
.g
ov
/~
e
b
am
/b
a
m
-a
2.
h
tm
l#
ta
bl
es
05/05/2023
NMP
/g
PosDiluição
10-510-410-310-210-1
X320X00233A
XX32002333B
X010X00100C
X322X11233D
XX33333333E
MAS NEM SEMPRE TUDO DÁ CERTO...
930
9300
30
2100
>110.000
Fonte: Compendium, APHA 2001
Metodologia tradicional de detecção de patógenos
Cultivo 
em caldo e
em ágar
Provas 
bioquímicas
Provas 
sorológicas
Vantagens
Simplicidade
Custo
Limitações
Longos (lentos)
Trabalhosos
Baixa reprodutibilidade
Necessidade de mão-de-obra 
especializada
05/05/2023
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodcont.2014.07.011 - Lee et al. 2015
Metodologia Tradicional de detecção de Salmonella 
Metodologia alternativos de detecção 
- Meios de cultura modificados 
- Métodos bioquímicos miniaturizados
Métodos rápidos
- Métodos Imunológicos
- Métodos moleculares - Ácidos nucléicos
- Biosensores
05/05/2023
Normalmente envolvem enriquecimento
Metodologia alternativa (rápida) de detecção 
Fonte: Mario Killner. Tese USP
Metodologia alternativa de detecção 
 Métodos ALTERNATIVOS
Meios de cultura modificados 
(cromogênicos) 
- CHROMagar (CHROMagar)
- Oxoid Salmonella rapid test
- Rambach agar (Technogram)
- RAPID Salmonella (Bio-Rad)
- S.P.R.I.N.T Salmonella
- Petrifilms e equivalentes
05/05/2023
Metodologia alternativa de detecção 
 Petrifilms
STX
Meio cromogênico, Baird-Parker 
modificado
Colônias vermelho-violetas – teste 
finalizado
Halos rosados da DNase
Metodologia alternativa de detecção 
Métodos bioquímicos miniaturizados
Convenientes
Menos trabalhosos
Ocupam menos espaço
Sensibilidade e especificidade > 95%
Menor possibilidade de erro do analista
Volumes reduzidos
Várias provas bioquímicas ao mesmo tempo
Descartáveis e de leitura facilitada
05/05/2023
Metodologia alternativa de detecção 
Métodos bioquímicos miniaturizados
K.-M. Lee et al. / Food Control 47 (2015) 264e276
Metodologia alternativa de detecção 
Métodos bioquímicos miniaturizados
05/05/2023
10 minutos
Métodos imunológicos
(Ag-Ac)
Reação Antígeno-Anticorpo
Elevada especificidade
Sitio de ligação do antígeno ao 
anticorpo é complementar
“chave na fechadura”
Antígenos
Anticorpos
Metodologia rápida de detecção 
05/05/2023
Metodologia rápida de detecção
Métodos 
imunológicos
Anticorpos mono e policlonais
Antígenos somáticos ou flagelares
Requerem enriquecimento das 
amostras
Pode haver reação não específica 
com antígenos semelhantes
Alto custo para automação
Métodos imunológicos
• Imunofluorescencia
• Aglutinação de látex
• Imunopreciptação (imunocromatografia)
• Imunoimobilização ou imunodifusão
• Separação imunomagnética
• Ensaio imunoenzimático
Formatos dos testes imunológicos
Metodologia rápida de detecção 
05/05/2023
Métodos imunológicos
• Imunofluorescencia
• Aglutinação de látex
Anticorpos são acoplados a microesferas de Látex
• Imunopreciptação
Exemplos: 
 SinglepathR Salmonella (EMD)
 Salmonella Latex test (Oxoid)
 Tecra Salmonella (Tecra)
 VIP Salmonella (BioControl)
 Wellcotex
 ANI Salmonella (ANI Biotech)
 DuPont Lateral Flow System
 Microscreen (Microgen)
 RapidTest (Unipath)
 Salmonella Verify Slidex 
(Biomerieux)Metodologia rápida de detecção 
Lateral Flow System
Metodologia rápida de detecção 
05/05/2023
Metodologia rápida de detecção 
Métodos imunológicos
• Imunofluorescencia
• Aglutinação de látex
• Imunoprecipitação
• Imunoimobilização
- Anticoporpos anti-flagelares são usados em ensaio 
de imobilização
• Ex.: Salmonella 1-2 Test System (BioControl)
Metodologia rápida de detecção 
05/05/2023
Métodos imunológicos
• Imunofluorescencia
• Aglutinação de látex
• Detecção por imunopreciptação
• Imunoimobilização
• Separação imunomagnética (IMS)
- Anticorpos recobrem microesferas magnéticas
Metodologia rápida de detecção 
Métodos imunológicos
• Imunofluorescencia
• Aglutinação de látex
• Detecção por imunopreciptação
• Imunoimobilização
• Separação imunomagnética (IMS)
• Dynabeads anti Salmonella (Dynal)
• MIM analyser (BioVeris)
• Pathatrix (Matrix MicroScience)
• Salmonella Screen (Vicam)
Metodologia rápida de detecção 
05/05/2023
Métodos imunológicos
• Imunofluorescencia
• Aglutinação de látex
• Detecção por imunopreciptação
• Imunoimobilização
• Separação imunomagnética (IMS)
• Ensaio imunoenzimático
- ELISA ou ELFA
- Enzyme-linked immmunosorbent assay
- Enzyme-linked fluorescent assay
Metodologia rápida de detecção 
ELISA X ELFA
O ensaio imunoenzimático (ELISA) pode ser quantificado usando a enzima fosfatase 
alcalina e um substrato colorimétrico, o p-nitrofenilfosfato (PNP), por exemplo. 
Um substrato fluorogênico, o 4-metil-umbeliferil-fosfato (4MUP), pode ser utilizado 
com a mesma enzima, e o ensaio passa a ser denominado ensaio de fluorescência 
imunoenzimática (ELFA).
05/05/2023
ELISA
• Diferentes formatos
– Em comum
• Antígeno alvo reconhecido pelo anticorpo 
• Detecção da reação através de um sistema “repórter” 
– Enzima-Substrato
anticorpo capturaY
Antígeno Antígeno 
alvo
anticorpo de detecção 
marcado com enzima
Ysubstrato
Metodologia rápida de detecção 
ELISA - exemplos
• BACSpec Salmonella ELISA kit (Eurofins)
• BacTrace (KPL)
• Salmonella ELISA Test (Bioline)
• CHEKIT (Bommeli Diag.)
• Colortrix (Matrix Microscience)
• FlockCheck (IDEXX)
• Tecra Salmonella VIA (Tecra)
• TRANSIA Plate Salmonella (Biocontrol)
• VIDAS (BioMerieux) 
Metodologia rápida de detecção 
05/05/2023
ELISA - exemplos
Salmonella ELISA Test (Bioline)
MINI VIDAS
Metodologia rápida de detecção 
ANTÍGENO
05/05/2023
Métodos moleculares – ácidos nucléicos
• Amplificação por PCR
Metodologia rápida de detecção 
05/05/2023
• Amplificação por PCR
• Amplificação por PCR
• O que é necessário?
– DNA (template)
– Iniciadores (primers)
– 1 par por gene 
– DNTP´s (A,T,C,G)
– Íons Mg
– Tampão com pH controlado
– DNA polimerase
• Taq (Thermus aquaticus)
– Termociclador
05/05/2023
 Reação da polimerização em cadeia
• Detecção de Salmonella 
ttr – tetrationato redutase
inv – invasão de células epiteliais
• Detecção de Listeria monocytogenes
hlyA – listeriolisina
iap - proteína associada a invasão (p60)
• Detecção de E. coli O157:H7
eae – intimina
• Detecção de Shigella
ipaH – antígeno H codificado pelo plasmídeo de invasão
Metodologia rápida de detecção 
• Vantagens
– Pequena quantidade de amostra
– Rapidez
• Desvantagens
– Interferência de componentes dos alimentos na 
amplificação
– Risco de contaminação cruzada
– Necessidade de pessoal especializado
• Tratamentos pré-PCR
– Aumento de concentração do alvo
– Redução/ exclusão de inibidores
Métodos baseados em ácidos nucleicos
Metodologia rápida de detecção 
05/05/2023
PCR convencional
PCR 1ª geração
Evolução da PCR
Multiplex PCR
05/05/2023
PCR Tempo Real (rtPCR)
• Acompanhamento da 
reação em tempo real
– Emprego de corantes 
fluorescentes
• Quantitativo
– Mas não para micro de 
alimentos
– > especificidade
– Uso de corante 
fluorescente intercalante 
(SYBRR Green)
– Possibilidade de 
automação (sem ter que 
aplicar em géis e 
trabalhar com brometo 
de etídeo)
Anos 90
PCR Tempo Real (rtPCR)
2ª geração
• Corante fluorescente
– SYBR® Green
Fonte: www.bio-rad.com
Baixa especificidade
Intercala-se a qq Dna fita dupla
05/05/2023
PCR Tempo Real (rtPCR)
3ª geração
Sondas específicas
– Diferentes tipos de sondas
– Empregam tecnologia FRET
• Fluorescent Resonance Energy Transfer
- Transferência de Energia de Ressonância Fluorescente
Movie time
https://youtu.be/4XVn
qB1mFe0
05/05/2023
PCR Tempo Real (rtPCR)
• ABI Prism 7500 (Applied Biosystems)
• Assurance GDS Salmonella (BioControl)
• BACGene Salmonella spp. (Eurofins)
• BAX Salmonella PCR (Dupont Qualicon)
• Foodproof Salmonella detection kit (Merck KGaA)
• Gene-Trak (Neogen)
• iQ-Check PCR (BioRad)
• LightCycler (Roche Diagnostics)
• Luminex (Luminex Corporation)
• MicroSEQ Salmonella spp. (Applied Biosystems)
• Probelia (Sanofi)
PCR Tempo Real (rtPCR)
ABI Prism 7500
LightCycler
ThermoFisher
05/05/2023
PCR Tempo Real (rtPCR)
BAX Salmonella
Amplificação isotérmica
• Método de amplificação de DNA sequencia específica
– Reações em temperatura constante (não são consideradas PCR)
– Diferentes tipos
• Transcription mediated amplification (TMA)
• Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) - RNA
• Signal mediated amplification of RNA technology (SMART)
• Strand displacement amplification (SDA)
• Rolling circle amplification (RCA)
• Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) - DNA
NucliSENS easyQ®
biomerrieux
ASNR
Neogen
Loopamp LA-500
Eiken Chemical Co
Metodologia rápida de detecção 
05/05/2023
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)
https://www.youtube.com/watch?v=L5zi2P4lggw
BIOSENSORES
Lozano et al. 2019. 
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-813280-7.00040-2
Metodologia rápida de detecção 
05/05/2023
Teste ATP-bioluminescência
Aonde vamos chegar?
Metodologia rápida de detecção 
05/05/2023
Estudando ecologia microbiana na era da genômica
Estudando ecologia microbiana na era da genômica
https://nanoporetech.com/products
https://www.wired.com/2012/03/oxford-nanopore-sequencing-usb/