17b - O estradiol reduz diretamente a microviscosidade

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Artigo
17b-O estradiol reduz diretamen
te a microviscosidade 
da membrana mitocondrial e melhora a função 
bioenergética no músculo esquelético
Resumo gráfico
Destaques
d E2 restaura o equilíbrio redox e a sensibilidade à insulina no músculo 
esquelético após ovariectomia
d E2 localiza-se nas mitocôndrias independentemente do ERae reduz 
a microviscosidade da membrana
d E2 promove a função bioenergética através da atividade do complexo I, 
transferência de elétrons e capacidade de resposta OXPHOS
d O efeito de ajuste fino do E2 nas mitocôndrias influencia a 
homeostase energética
Torres et al., 2018, Metabolismo Celular27,167–179 9 
de janeiro de 2018ª2017 Elsevier Inc. https://doi.org/
10.1016/j.cmet.2017.10.003
Autores
Maria J. Torres, Kim A. Kew, Terence E. 
Ryan, ..., Tonya N. Zeczycki, Saame Raza 
Shaikh, P. Darrell Neufer
Correspondência
neuferp@ecu.edu
em resumo
A perda de estrogênio na menopausa aumenta 
o risco de desenvolver doenças metabólicas. 
Torres et al. mostre que 17b-o estradiol (E2) 
localiza-se nas membranas mitocondriais 
consistentes com o status E2 de todo o corpo. 
A presença de E2 diminui a microviscosidade, o 
que melhora a função bioenergética, 
oferecendo assim um mecanismo biofísico pelo 
qual o E2 influencia a homeostase energética.
Metabolismo Celular
Artigo
17b-O estradiol reduz diretamente a microviscosidade da 
membrana mitocondrial e melhora a função 
bioenergética no músculo esquelético
Maria J. Torres,1,2Kim A. Kew,3Terence E. Ryan,1,4Edward Ross Pennington,1,5Chien-Te Lin,1,4Katherine A. Buddo,3
Amy M. Correção,1Cheryl A. Smith,1,4Laura A. Gilliam,1,4Sira Karvinen,6Amanhecer A. Lowe,6Espen E. Spangenburg,1,4
Tonya N. Zeczycki,1,5Saame Raza Shaikh,1,5e P. Darrell Neufer1,2,4,7,*
1Instituto de Diabetes e Obesidade da Carolina do Leste, East Carolina University, 115 Heart Drive, ECHI – Mail Stop 743, Greenville, NC 27834, 
EUA
2Departamento de Cinesiologia, Faculdade de Saúde e Desempenho Humano, East Carolina University, Greenville, NC 27834, EUA
3Departamento de Química, Faculdade de Artes e Ciências, East Carolina University, Greenville, NC 27834, EUA
4Departamento de Fisiologia, Brody School of Medicine, East Carolina University, Greenville, NC 27834, EUA
5Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Brody School of Medicine, East Carolina University, Greenville, NC 27834, EUA
6Divisões de Ciência da Reabilitação e Fisioterapia, Departamento de Medicina de Reabilitação, Faculdade de Medicina, Universidade de Minnesota, 
Minneapolis, MN 55455, EUA
7Contato principal
* Correspondência:neuferp@ecu.edu https://
doi.org/10.1016/j.cmet.2017.10.003
RESUMO
A menopausa resulta num declínio progressivo em 17b-
níveis de estradiol (E2), aumento da adiposidade, 
diminuição da sensibilidade à insulina e maior risco de 
diabetes tipo 2. As terapias com estrogênio podem ajudar a 
reverter esses efeitos, mas o(s) mecanismo(s) pelo qual o E2 
modula a suscetibilidade a doenças metabólicas não é bem 
compreendido. Em camundongos C57BL/6N jovens, a 
ovariectomia de curto prazo diminuiu – enquanto a terapia 
com E2 restaurou – a função respiratória mitocondrial, o 
estado redox celular (GSH/GSSG) e a sensibilidade à insulina 
no músculo esquelético. E2 foi detectado por cromatografia 
líquida-espectrometria de massa em membranas 
mitocondriais e variou de acordo com o status de E2 no 
corpo inteiro, independentemente do ERa.A perda de E2 
aumentou a microviscosidade da membrana mitocondrial e 
H2Ó2potencial emissor, enquanto a administração E2na Vivo
eem vitroconteúdo E2 da membrana restaurado, 
microviscosidade, atividades do complexo I e I + III, H2Ó2
potencial de emissão e capacidade de resposta submáxima 
do OXPHOS. Estas descobertas demonstram que o E2 
modula diretamente as propriedades biofísicas da 
membrana e a função bioenergética nas mitocôndrias, 
oferecendo um mecanismo direto pelo qual o status do E2 
influencia amplamente a homeostase energética.
INTRODUÇÃO
17b-O estradiol (E2) é um regulador chave da homeostase energética e 
da glicose, com efeitos diretos no músculo, fígado, pâncreas, tecido 
adiposo, células imunológicas e cérebro.Mauvais-Jarvis et al., 2013). 
Assim, a redução substancial na circulação de E2 que acompanha a 
menopausa tem efeitos que vão além da saúde reprodutiva,
Meta
caracterizada por adiposidade central e declínio da sensibilidade à 
insulina (IS), predispondo as mulheres ao desenvolvimento de 
diabetes tipo 2, síndrome metabólica e doenças cardiovasculares
(Janssen et al., 2008). Além disso, as mulheres que entram na menopausa
antes dos 40 (Marca et al., 2013), submeter-se a histerectomia/ooforectomia 
bilateral (Appiah et al., 2014), ou apresentar polimorfismos no gene do 
receptor de estrogênio (ER) que prejudicam a função E2 (Lo et al., 2006) 
mostram risco ainda mais elevado para a síndrome metabólica. A ligação 
entre a deficiência de E2 e a disfunção metabólica é recapitulada em modelos 
de roedores onde a ovariectomia (OVX) (Jackson et al., 2013), eliminar a 
aromatase (Jones e outros, 2000), ou ablação genética de REaglobalmente (
Bryzgalova et al., 2006; Ribas et al., 2010) ou especificamente no músculo 
esquelético (Ribas et al., 2016) também levam ao aumento da gordura 
corporal e ao comprometimento do SI. No entanto, a administração de E2 
restaura a ação da insulina em roedores OVX alimentados com ração e com 
alto teor de gordura (Bryzgalova et al., 2008; Riant et al., 2009) e terapias 
hormonais, incluindo estrogênios e/ou progestágenos, reduzem o diabetes 
recente em mulheres saudáveis, bem como a resistência à insulina em 
mulheres diabéticas (Margolis et al., 2004; Salpeter et al., 2006). Notavelmente, 
os mecanismos moleculares por trás das ações do E2 no metabolismo 
permanecem pouco compreendidos e inoportunamente subexplorados.
E2 medeia ações genômicas e não genômicas através de ERs (ER
a,pronto-socorrob,GPER) que ativam a transcrição do gene nuclear, 
sinalização celular (Gupte et al., 2015), biogênese mitocondrial (
Mattingly et al., 2008) e processamento de transcritos de RNA que 
codificam componentes do sistema de transporte de elétrons (ETS) (
Sanchez et al., 2015). Além dos efeitos mediados por ER (Chen et al., 
2005), E2 também tem sido implicado na regulação direta de vários 
aspectos da função mitocondrial, incluindo a produção de ATP (
Moreno et al., 2013), potencial de membrana (Wang et al., 2001) e 
produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) (Yao et al., 2014), 
embora o(s) mecanismo(s) preciso(s) de ação permaneça(m) mal 
definido(s). ROS elevados derivados de mitocôndrias foram 
estabelecidos como pelo menos um mecanismo que contribui para 
o desenvolvimento da resistência à insulina (Anderson et al., 2009; 
Hoehn et al., 2009; Houstis et al., 2006), e E2 é conhecido
bolismo Celular27, 167–179, 9 de janeiro de 2018ª2017 Elsevier Inc.167
exercer efeitos antioxidantes em muitos tecidos não reprodutivos, 
prevenindo a geração de ERO ou regulando positivamente os sistemas 
de tamponamento redox.Arias-Loza et al., 2013; Bellanti et al., 2013). A 
perda progressiva de E2 e o consequente declínio nas funções 
mitocondriais e/ou redox poderiam, portanto, levar a uma redefinição da 
homeostase da glicose e à perda relativa de IS periférico.
O músculo esquelético (SM) é particularmente importante para o 
equilíbrio metabólico de todo o corpo devido à sua alta atividade 
metabólica, ao seu tamanho em relação à massa corporal total e ao seu 
papel principal na eliminação de glicose estimulada pela insulina. 
Usando uma combinação dena Vivoe em vitroabordagens experimentais 
fisiológicas, moleculares e biofísicas, os objetivos do presente estudo 
foram (1) determinar se a depleção E2 ovariana de curto prazo e a 
terapia com E2 alteram agudamente as funções mitocondriais e redox 
em SM concomitantemente com IS, e (2) investigar o mecanismo(s) 
subjacente(s) pelos quais E2 regula a função bioenergética mitocondrial.RESULTADOS
A depleção ovariana de E2 induz um estado pró-diabetogênico 
antes de induzir a obesidade
Para investigar os efeitos primários da depleção de E2 ovariana em SM, além 
da obesidade e do envelhecimento, camundongos C57BL/6N fêmeas jovens 
sexualmente maduros (10 semanas de idade) foram estudados em uma dieta 
padrão 2 semanas após OVX (OVX-2w) e comparados com fêmeas 
normalmente ciclando no estágio de proestro (NC-Pro) (Figura S1). A perda de 
E2 ovariano foi confirmada por uma redução no peso uterino (Figura S2A). 
Apesar de nenhuma mudança na composição corporal (Figura S2B), 
camundongos OVX-2w apresentaram hiperglicemia de jejum (Figura S2C), 
uma tendência (p = 0,052) para níveis mais elevados de insulina em jejum (não 
mostrado) e, consequentemente, maiores escores do índice de resistência à 
insulina (HOMA-IR) (Figura S2E). Glicose corporal total (Figura S2C) e insulina (
Figura S2D) a tolerância (por massa magra) não foi diferente. No entanto, e.
xvivoA captação de glicose SM estimulada por insulina nos músculos 
extensores longos dos dedos (EDL) foi reduzida em OVX-2w (Figura S2F), 
indicando o desenvolvimento precoce de resistência à insulina. Semelhante 
aos relatórios anteriores (Jackson et al., 2013; Rogers et al., 2009), a ingestão 
alimentar não foi alterada e os níveis de atividade no ciclo escuro foram 
reduzidos pós-OVX (Figuras S2G–S2L).
A depleção ovariana de E2 diminui a função respiratória 
mitocondrial da SM
Para determinar se as funções respiratórias e redox mitocondriais 
são agudamente afetadas na SM pela retirada ovariana de E2, feixes 
de fibras permeabilizadas (PmFbs) da porção vermelha do 
gastrocnêmio foram preparados para respirometria de alta 
resolução. A atividade da citrato sintase, um índice do conteúdo 
mitocondrial, permaneceu inalterada em camundongos OVX-2w (
figura 1A). No entanto, a taxa de respiração ligada ao complexo I 
(glutamato/malato, sem ADP) do estado 4 (J.Ó2) e estado 3 (+ADP) 
respiração ligada a CI e ligada a CI + II (+succinato) foram reduzidos 
em -25% em OVX-2w (figura 1B). C IV máximoJ.Ó2foi -20% menor em 
PmFbs de camundongos OVX-2w sob condições acopladas (+ADP) e 
desacopladas (+FCCP). Curiosamente, ligado a C IIJ.Ó2(+rotenona) 
não foi alterado. Suportado por ácidos graxosJ.Ó2foi reduzido em
- 45% em camundongos OVX-2w sob condições de estado 3 (+ADP) 
acoplado e desacoplado (+FCCP) (figura 1C).
168Metabolismo Celular27, 167–179, 9 de janeiro de 2018
Dado que o complexo piruvato desidrogenase (PDH) também é 
alvo de ação E2 (Brinton, 2008), os parâmetros cinéticos do suporte 
de piruvatoJ.Ó2foram examinados. Na presença de malato e ADP 
máximo (figura 1D), o Vmáx.diminuiu em -24% em camundongos 
OVX-2w sem alterações no K aparenteeupara piruvato. A capacidade 
das mitocôndrias de atender à demanda metabólica foi avaliada 
titulando o ADP na presença de saturação de piruvato/malato 
(requer fluxo através de PDH e CI) (figura 1E) ou glutamato/malato 
(requer fluxo apenas através de CI) (figura 1F). Em ambas as 
condições, o Vmáx.foi diminuído em camundongos OVX-2w em -24% 
sem alteração no Keu. Coletivamente, esses achados sugerem que a 
perda de E2 ovariana induz um rápido declínio na capacidade 
respiratória mitocondrial, provavelmente mediado principalmente 
por alterações na função do IC.
A depleção ovariana de E2 induz uma mudança oxidativa no 
ambiente redox celular SM
O par redox glutationa (GSH/GSSG) serve como um indicador do 
ambiente redox celular geral.Schafer e Buettner, 2001). A 
depleção de E2 ovariano resultou em uma redução de -40% na 
relação GSH/GSSG (Figuras 1G e 1H) e um aumento> 2 vezes em 
H2Ó2emissão pelo complexo PDH, que é altamente sensível ao 
status redox da glutationa mitocondrial (Fisher-Wellman et al., 
2013) (figura 1Deixei). Esta diferença desapareceu quando a 
glutationa foi esgotada pelo pré-tratamento com 1-cloro-2,4-
dinitrobenzeno (CDNB) (figura 1I, à direita), sugerindo que a 
redução da relação GSH/GSSG foi pelo menos parcialmente 
responsável pelo elevado H2Ó2emissão pelo complexo PDH no 
OVX.
A terapia E2 previne o ganho de gordura e restaura a 
homeostase da glicose
Um subconjunto de camundongos OVX-2w foi randomizado para 2 semanas 
de terapia com E2 (OVX-4w[E2]) ou placebo (OVX-4w[ctl]) (Figura 2A). O 
restabelecimento do E2 circulante foi confirmado pela hipertrofia do útero (
Figura 2B). Camundongos OVX-4w[ctl] tiveram um aumento de -7% na gordura 
corporal com depósitos aumentados de gordura perivisceral (Figuras S3A e 
S3B) e hiperglicemia de jejum persistente (+12% versus NC-Pro). No entanto, a 
terapia E2 evitou o ganho de gordura e restaurou os níveis de glicose no 
sangue em jejum para os valores pré-OVX (Figuras 2C e 2D). Camundongos 
OVX-4w[ctl] também apresentaram menor tolerância à glicose e à insulina em 
comparação com os camundongos tratados com E2 (p < 0,05,Figuras 2E e 2F). 
Os escores HOMA-IR permaneceram 70% mais altos em OVX-4w[ctl], mas 
foram restaurados em camundongos OVX-4w[E2] (Figura 2G). Além disso,ex-
vivoA captação de glicose estimulada por insulina foi reduzida em 35% nos 
músculos EDL de camundongos OVX-4w[ctl] em comparação com os controles, 
mas também foi recuperada pela terapia E2 (Figura 2H). A estimulação da 
insulina no sóleo mostrou tendências semelhantes (Figura 2EU). A ingestão 
alimentar, os níveis de atividade e o gasto energético permaneceram 
inalterados com ou sem E2 (Figuras S3C-S3H).
A terapia E2 resgata a função respiratória mitocondrial 
sustentada por carboidratos, mas não por gordura
Na OVX de 4 semanas, o estado 4 ligado ao CI e a respiração do estado 3 
diminuíram em -38% (Figura 3A; compare com -25% em OVX-2w em
figura 1B). Tratamento E2 restauradoJ.Ó2valores em todas as condições 
de substrato à base de carboidratos (Figura 3A). A respiração ligada a C II 
não foi diferente em camundongos OVX-4w (p = 0,06).
Figura 1. OVX de 2 semanas diminui a função mitocondrial e induz uma mudança oxidativa no ambiente redox celular SM
(A) Atividade da citrato sintase no gastrocnêmio vermelho (RG).
(B)J.Ó2medido em PmFbs de RG.
(C) Suportado por ácidos graxosJ.Ó2. G/M, glutamato/malato; Succ, succinato; Podridão, rotenona; AmA, antimicina A; Asc, ascorbato; TMPD,N,N,N0,N0
dicloridrato de -tetrametilp-fenilenodiamina; PC, palmitoil-carnitina; P-CoA, almitoil-CoA; L-Carn, L-carnitina.
(D – F) Cinética respiratória mitocondrial. Titulações de piruvato na presença de malato e ADP (D), e titulações de ADP na presença de G/M (E) ou piruvato/malato (F). 
Parâmetros cinéticos KMe Vmax foram determinados a partir do ajuste às funções de Michaelis-Menten. Mudanças em Vmáx.foram significativos (*p < 0,05). (G e H) 
Concentração total de GSH e GSSG (G) e relações GSH/GSSG resultantes (H) no GP.
(EU)J.H2Ó2medido em PmFbs pré-incubados com ou sem 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) para depleção de GSH e depois adicionado piruvato. Os 
valores são médias ± SEM; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001, n = 8–15 ratos/grupo.
Suportado por lipídiosJ.Ó2caiu >70% em camundongos OVX-4w[ctl], mas 
surpreendentemente não foi resgatado pela terapia E2 sob condições 
acopladas (+ADP) ou desacopladas (+FCCP) (Figura 3B).
Terapia E2 restaura a homeostase redox celular em SM Uma 
mudança oxidativa no ambiente redox celular também foi 
observada na OVX de 4 semanas, com uma queda na relação GSH/
GSSG.Figuras 3C e 3D) e um derivado de PDH 3 vezes maiorJ.H2Ó2
emissão (painel esquerdoFigura 3E). Ambos os parâmetros foram 
resgatados pela terapia E2. Curiosamente, incluindo um inibidor da 
glutationa redutase (GR), 1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosoureia (BCNU),
aumentouJ.H2Ó2em NC-Pro e OVX-4w[E2], mas não em camundongos 
OVX-4w[ctl], enquanto o pré-tratamento de feixes de fibras musculares 
permeabilizadas (PmFB) com CDNB para esgotar GSH aumentouJ.H2Ó2
igualmente entre grupos (Figura 3E, certo). Isto levanta a possibilidade 
de que o OVX afete negativamente o circuito de buffer redox GSH no SM. 
De acordo, a análise RT-PCR revelou um declínio> 90% (p <0,05) no nívelde mRNA para GR após OVX que foi resgatado pela terapia E2 (Figura S3
EU). MitocondrialJ.H2Ó2emissão (Figura 3F, esquerda) eJ.H2Ó2produção 
apoiada por succinato (+auranofina para inibir a tiorredoxina redutase,
Figura 3F, à direita) aumentou em OVX de 4 semanas, mas foi restaurado 
em E2. Mitocondrial
Metabolismo Celular27, 167–179, 9 de janeiro de 2018169
Figura 2. A terapia E2 reverte o estado pró-diabetogênico induzido por OVX
(A) Desenho do estudo.
(B) Massa uterina no sacrifício.
(C) Composição corporal.
(D) Glicemia em jejum.!p < 0,05,!!p < 0,01 versus pré-OVX para cada grupo, e#p < 0,05 versus OVX-4w[ctl].
(E) Teste de tolerância à glicose. Inserção: área sob a curva (AUC).
(F) Teste de tolerância à insulina. Inserção: inclinação da linha de regressão de mínimos quadrados calculada a partir dos primeiros 20 min.
(G) Pontuações HOMA-IR calculadas como emFigura S2E.
(H e eu)Ex vivobasal e estimulada por insulina3Captação de H-2-desoxiglicose em todos os músculos EDL (H) e sóleo (I).
Os valores são médias ± SEM, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 versus NC-Pro e#p < 0,05,##p < 0,01 versus OVX-4w[ctl], n = 6 camundongos/grupo.
vazamento de radicais livres (mFRL%;J.H2Ó2produzido por oxigênio 
molecular consumidoJ.Ó232 por minuto) seguiram assim a mesma 
tendência (Figura 3G).
A atividade CI e a transferência de elétrons no pool Q são 
sensíveis ao status E2
Os efeitos de curto prazo mediados por E2 na função mitocondrial não 
estavam ligados a alterações no conteúdo mitocondrial (Figuras 4A e 4B). 
Assim, para explorar ainda mais o(s) mecanismo(s) potencial(ais)
170Metabolismo Celular27, 167–179, 9 de janeiro de 2018
subjacente à ação E2, as atividades específicas dos complexos 
respiratórios I - IV, I + III e II + III foram determinadas 
espectrofotometricamente em mitocôndrias SM isoladas (Figuras 4C eS4
). OVX reduziu a atividade específica relativa do CI, bem como a 
transferência de elétrons entre I/II e III em -35%–50%, enquanto a 
terapia com E2 reverteu completamente essas alterações. A atividade 
específica relativa de C III foi menor apenas em OVX-2w. Estes resultados 
sugerem que os efeitos protetores do E2 são direcionados 
principalmente ao CI e à transferência de elétrons no pool Q.
Figura 3. Terapia E2 restaura a função mitocondrial e o equilíbrio redox celular em SM
(A)J.Ó2medido em PmFbs de RG. C I-suportadoJ.Ó2medido pela adição sequencial de piruvato/malato (Pyr/Mal) e ADP (painel esquerdo); ou glutamato/malato (G/
M) e ADP (painel intermediário) e suporte para C IIJ.Ó2medido na presença de rotenona (Rot), succinato (Succ) e ADP (painel direito). (B) Suportado por ácidos 
graxosJ.Ó2no RG PmFbs, como emfigura 1C.
(C) Níveis totais de GSH e GSSG em todo o gastrocnêmio.
(D) Razões 2GSH/GSSG resultantes.
(E) Esquerda:J.H2Ó2medido após a adição de Pyr, seguido de 1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosoureia (BCNU).!!p < 0,01 versus Pyr. À direita: PmFBs foram pré-incubados 
com 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) e depois adicionado piruvato.
(F)J.H2Ó2medido após a adição de succinato, auranofina.
(G) Vazamento de radical livre mitocondrial (J.H2Ó2/J.Ó2*2) sob respiração sustentada por succinato.
Os valores são médias ± SEM, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 versus NC-Pro, e#p < 0,05,##p < 0,01 versus OVX-4w[ctl], n = 6 camundongos/grupo.
E2 diminui a microviscosidade em membranas 
mitocondriais biomiméticas
A atividade proteica nas bicamadas lipídicas é fortemente regulada pelos 
fosfolipídios da membrana.Andersen e Koeppe, 2007), que nas 
mitocôndrias pode influenciar a função respiratória. Para determinar se 
o E2 altera diretamente a microviscosidade e a função da membrana 
mitocondrial, o efeito do E2 no empacotamento lipídico foi testado pela 
primeira vez usando vesículas lipídicas unilamelares pequenas e grandes 
biomiméticas (SUVs, LUVs) para permitir um controle rígido sobre os 
parâmetros biofísicos da membrana. SUVs foram feitos com dipalmitoil-
fosfatidilcolina (DPPC) (Figura S5), e LUVs mitocondriais biomiméticos 
foram preparados com uma mistura lipídica de fosfatidilcolina, 
-etanolamina e -serina (PC:PE:PS) em proporções relativas de % em mol 
semelhantes às encontradas em mitocondriais.
membranas (Horvath e Daum, 2013) (Figura 5). Tanto os SUVs quanto os 
LUVs foram incubados com merocianina (MC-540), uma sonda 
fluorescente sensível ao empacotamento lipídico cujo pico de 
fluorescência do espectro aumenta com a diminuição da viscosidade.
Stillwell et al., 1993; Zeczycki et al., 2014). Como esperado pelo seu efeito 
de condensação dos fosfolipídios circundantes (Ohvo-Rekila et al., 2002), 
a inclusão de colesterol diminuiu a intensidade de fluorescência do pico 
MC-540 em LUVs (Figuras 5A e 5B). No entanto, o pico de fluorescência 
do MC-540 aumentou progressivamente com o aumento das proporções 
de % molar de E2 em ambos os SUVs e LUVs biomiméticos, sugerindo 
um menor grau de empacotamento lipídico (isto é, microviscosidade) na 
bicamada. A incorporação de E2 nas vesículas foi confirmada por 
cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) (Figura S6A).
Metabolismo Celular27, 167–179, 9 de janeiro de 2018171
Figura 4. A terapia E2 restaura a perda de atividades de CI, CI/II + III induzida por OVX
(A e B) Análise Western blot de complexos OXPHOS (A) e atividade da citrato sintase em mitocôndrias isoladas (B).
(C) Atividade específica relativa de complexos respiratórios normalizada para atividade da citrato sintase (1 CSU = 1eumol/min/mg de proteína). VerFigura S4. Os 
valores são médias ± SEM, *p < 0,05, **p < 0,01 versus NC-Pro e#p < 0,05,##p < 0,01 versus OVX-4w[ctl], n = 4–5 camundongos/grupo. NS, não significativo.
Para examinar melhor como a presença de E2 versus colesterol tem 
como alvo a organização biofísica da membrana, área de pressão (p-A) 
as isotermas foram coletadas após compressão de uma monocamada 
DPPC, o que permite medições precisas do empacotamento lipídico no 
Ångstrom (1 Å = 1310-7mm) nível (Pennington et al., 2016).p-As isotermas 
de DPPC e colesterol isoladamente foram consistentes com relatórios 
anteriores (Gong et al., 2002; Pennington et al., 2016), mas isso não foi 
possível para E2 (Figura S5C), indicando que diferentemente do 
colesterol, o E2 não forma uma monocamada. A incorporação de 5% 
molar de E2 na monocamada de DPPC causou um deslocamento para a 
direita nap-Uma isoterma quando comparada com o colesterol presente 
na mesma % molar (Figura 5C), indicando que E2 aumentou a área 
molecular média (MmA) da monocamada em pressões superficiais 
fisiologicamente relevantes (Figura 5D). Isto sugere que E2 faz com que a 
molécula média de DPPC ocupe mais área dentro da monocamada 
(espaço lateral), reduzindo o nível de empacotamento e diminuindo 
assim tanto a ordem como a quantidade de interacções lípido-lípido. 
Análise secundária dop-Uma isotermas fornece os módulos de 
elasticidade superficial (Cs-1), um indicador da resposta elástica à 
compressão (compressibilidade). Como mostrado emFigura 5E, a 
presença de E2 deslocou o Cs-1curva para a direita. Os Cs-1em pressões 
de superfície relevantes foi determinada por extrapolação dos valores de 
MmA
172Metabolismo Celular27, 167–179, 9 de janeiro de 2018
deFigura 5C a Cs-1valores emFigura 5E (linhas pontilhadas conectando 
gráficos). As monocamadas DPPC-E2 tendem a ter Cs mais baixos-1
valores em diferentes pressões de superfície (Figura 5F), implicando que 
uma monocamada contendo E2 é mais elástica e pode ser mais 
comprimida. Estes resultados são consistentes com a microviscosidade 
reduzida detectada através dos espectros de fluorescência MC-540.
E2 localiza-se nas membranas mitocondriais e 
diminui a microviscosidade
Na Vivoa exposição de ratos OVX ao E2 titulado resulta na 
translocação do hormônio do plasmalema para as mitocôndrias 
(75%) nos tecidos do fígado, glândula adrenal e baço (Fossos e 
Ramirez, 1998). Para determinar se o E2 se localiza nas membranas 
mitocondriais, o E2 foi extraído de membranas mitocondriais 
isoladas através de uma extração em fasesólida e analisado por LC-
MS (verMétodos ESTRELA). Consistente com os dados funcionais 
mitocondriais, o conteúdo E2 da membrana mitocondrial SM 
diminuiu progressivamente em 2 (-60%, p < 0,05) e 4 semanas pós-
OVX (-90%, p < 0,001) (Figuras 6A e 6B). Na verdade, o E2 não foi 
detectado em 6 das 15 amostras de camundongos OVX-4w[ctl]. A 
perda de E2 das membranas mitocondriais foi associada a uma 
diminuição no pico de fluorescência do MC-540. Terapia E2
Figura 5. E2 diminui a microviscosidade em 
membranas mitocondriais biomiméticas
(A) Amostra de espectros de emissão de fluorescência 
MC-540 de LUVs feitos com PC:PE:PS e aumento de [E2] 
ou colesterol (controle negativo).
(B) Valores de pico MC-540 F de (A). Os valores são 
médias ± SEM, de três preparações independentes 
de LUVs. *p < 0,05; **p < 0,01 versus [E2] 0%. (C) 
Área de pressão representativa (p-A) isotermas de 
monocamadas de DPPC contendo 5% molar de E2 
ou colesterol.
(D) Área molecular média média (MmA) em 
pressões superficiais relevantes extrapoladas de 
três independentesp-A isotermas.
(E) Os módulos de elasticidade superficial (Cs-1) em 
função de MmA, correspondente ao respectivop-A 
isotermas mostradas em (C).
(F) Cs-1calculado a partir de três independentesp-A isotermas 
(linhas pontilhadas). Os valores são médias ± SEM.
restaurou os níveis de E2 nas membranas e reverteu a perda de 
microviscosidade induzida por OVX (Figuras 6A-6D).
pronto-socorroaNão é necessário para incorporação de E2 
em membranas mitocondriais
REs são supostamente expressos nas mitocôndrias (Klinge, 2017), e 
descobertas recentes de ER específico de SMaratos nocauteados 
sugerem ERaparticipa da manutenção da função mitocondrial (Ribas et 
al., 2016). Para determinar se a localização de E2 nas membranas 
mitocondriais depende do ERa,Os níveis de E2 foram medidos em 
membranas mitocondriais SM de ER normalmente ciclizadoa-floxed 
(skmERaNC) e ER específico de SManocaute (skmERaKO) camundongos 
submetidos à terapia OVX ± E2. O conteúdo mitocondrial E2 não foi 
diferente entre o skmERaNC e skmERaRatos KO (Figura 6E). Em skmERa
Em camundongos KO, o OVX diminuiu, enquanto a terapia com E2 
restaurou o conteúdo mitocondrial de E2 (Figura 6E) e atividade 
específica do IC (Figura 6F). Estas descobertas demonstram que o 
conteúdo E2 da membrana mitocondrial em SM varia com o status E2 de 
todo o corpo, independentemente do ERa e pode afetar diretamente a 
função do IC.
Metabo
AgudoEm vitroA exposição E2 das 
mitocôndrias de ratos OVX restaura o 
conteúdo da membrana E2, a 
microviscosidade e vários aspectos da 
função mitocondrial
Para determinar se a exposição aguda ao E2
em vitroé suficiente para reverter as 
alterações na função mitocondrial e na 
microviscosidade da membrana induzida 
pela perda de E2 ovariana, mitocôndrias 
isoladas frescas de camundongos NC-Pro e 
OVX-4w foram incubadas com 3 nM de E2 
(uma concentração de E2 -103maior que a 
concentração de E2 medida nas mitocôndrias 
por LC-MS), repelida e ressuspensa apenas 
em meio (Figura 7A). A exposição ao E2 
aumentou o conteúdo da membrana E2 nas 
mitocôndrias de camundongos OVX-4w para
- 0,45 ng E2/mg de proteína mitocondrial, uma
valor comparável com NC-Pro (Figura 7B) e camundongos OVX-4w 
tratadosna Vivocom E2 (Figura 6B). A incorporação de E2 nas 
membranas aumentou apenas ligeiramente nas mitocôndrias de NC-Pro 
incubadas com E2 (-0,5 ng E2/mg de proteína mitocondrial). A incubação 
com níveis mais elevados de E2 não aumentou ainda mais o conteúdo de 
E2 nas membranas mitocondriais (Figuras S6C e S6D), sugerindo que sua 
incorporação pode ser limitada.
Consistente com a administração E2na Vivo, reintrodução de E2 nas 
mitocôndrias OVX-4wem vitromicroviscosidade da membrana restaurada 
(Figura 7C), atividades específicas CI e CI + III (Figura 7D), bem como 
suportados por succinatoJ.H2Ó2emissão (Figura 7E). Curiosamente, e em 
contraste com a terapia E2na Vivo, agudo em vitroa reintrodução de E2 
nas mitocôndrias OVX-4w não restaurou o máximoJ.Ó2(Figura 7F), 
possivelmente refletindo a ausência de respostas reguladoras genéticas 
mediadas por E2-ER. Estas descobertas, no entanto, apoiam o conceito 
de que a presença de E2 nas membranas mitocondriais reduz a 
microviscosidade da membrana e melhora a atividade de complexos 
específicos dentro do ETS.
Para explorar ainda mais os efeitos potenciais das alterações 
mediadas por E2 na microviscosidade na fosforilação oxidativa
lismo Celular27, 167–179, 9 de janeiro de 2018173
Figura 6. E2 localiza-se nas membranas 
mitocondriais e diminui a microviscosidade 
independentemente do REa
(A) Cromatogramas iônicos extraídos representativos 
para E2.
(B) Conteúdo de E2 em extratos de membrana mitocondrial 
medidos por LC-MS.
(C) Espectros de emissão de fluorescência MC-540 em 
mitocôndrias SM intactas.
(D) Valores de pico MC-540 F de C.
Os dados são médias ± SEM, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p 
< 0,001 versus NC-Pro, e#p < 0,05,##p < 0,01 versus 
OVX-4w[ctl], n = 6–8 camundongos/grupo.
(E e F) Conteúdo de E2 (E) e respectiva atividade 
específica relativa do IC (F). Os valores são médias ± 
SEM, *p < 0,05 versus NC-skmERaNO, e#p < 0,05 versus 
OVX-skmERaKO, n = 3–4 ratos/grupo.
(OXPHOS), taxas de estado estacionário deJ.Ó2e síntese de ATP (J.ATP) 
foram medidos simultaneamente a uma taxa submáxima de demanda 
respiratória ''fixada'' (-40% do máximo) (Lark et al., 2016). Camundongos 
OVX apresentaram taxas de estado estacionário -20% mais baixasJ.Ó2
eJ.ATP em relação ao NC-Pro, enquanto a restauração de E2em vitro aumentou
J.Ó2eJ.Taxas de ATP quase correspondentes aos valores de controle (Figuras 7
G e 7H). Assim, enquanto a relação ATP/O (ou seja, a eficiência do OXPHOS) 
permaneceu inalterada nas mitocôndrias OVX-4w com ou sem E2 (Figura 7I), a 
capacidade do sistema OXPHOS de responder de forma tão eficaz a uma 
determinada taxa de demanda metabólica foi diretamente afetada pela 
ausência/presença de E2. No geral, estas descobertas demonstram que o E2 
se localiza nas membranas mitocondriais e otimiza a capacidade de resposta 
do OXPHOS.
DISCUSSÃO
Aqui, investigamos o impacto da depleção ovariana aguda de E2 e do 
tratamento com E2 na bioenergética mitocondrial e na biofísica da 
membrana. Relatamos duas descobertas principais. Primeiro, a perda 
aguda de E2 ovariana induz um estado pró-diabetogênico, com 
diminuição da função mitocondrial, maiorJ.H2Ó2potencial emissor e uma 
mudança oxidativa no ambiente redox celular, todas condições 
anteriormente ligadas à etiologia da resistência à insulina em SM
174Metabolismo Celular27, 167–179, 9 de janeiro de 2018
(Anderson et al., 2009; Hoehn et al., 2009; 
Houstis et al., 2006). Com exceção da 
capacidade oxidativa dos ácidos graxos do SM, 
a terapia E2 resgatou todos esses parâmetros 
sem afetar o conteúdo mitocondrial. O primeiro 
possivelmente reflete uma dependência da 
regulação de ação mais prolongada mediada 
por E2 do receptor ativado por proliferador de 
peroxissoma-dexpressão e genes do 
metabolismo lipídico a jusante (Campbell et al., 
2003; D'Eon et al., 2005; Fu et al., 2009). 
Segundo, E2 localiza-se nas membranas 
mitocondriais em um REa-de maneira 
independente, onde influencia a 
microviscosidade da membrana e a função 
bioenergética.
A regulação da homeostase redox celular é cada 
vez mais reconhecida como um fator crítico
fator para a manutenção do SI (Fisher-Wellman e Neufer, 2012; Rindler et 
al., 2013). Uma mudança oxidativa no ambiente redox reflete uma 
mudança no equilíbrio entre a produção de oxidante e a eliminação 
pelos circuitos redox. OVX provocou um declínio acentuado na expressão 
de mRNA de GR e um aumento/desregulação na produção de oxidantes 
pelo ETS. Nas mitocôndrias de mamíferos, os dois maiores locais que 
contribuem para o vazamento de elétrons no ETS são o local de redução 
da ubiquinona no CI e o local externo de ligação da quinona no C III.
Marca, 2010). A atividade do CI é altamente sensível à perturbação da 
homeostase redox do tiol, pois sua glutationilaçãopela GSSG resulta na 
inibição e aumento da produção de superóxido.Taylor et al., 2003). 
Conseqüentemente, a capacidade do E2 de promover a expressão de GR, 
aumentar as atividades de CI e CI/II + III e reduzir a atividade 
mitocondrialJ.H2Ó2-o potencial emissor sugere um papel na promoção 
da homeostase redox celular e, portanto, IS no SM.
Hormônios esteróides como testosterona, progesterona e estradiol 
são derivados do colesterol, um dos principais constituintes das 
biomembranas. Em uma bicamada lipídica, o colesterol aumenta a 
ordem de orientação das caudas de hidrocarbonetos fosfolipídicos, o 
que aumenta o grau de empacotamento fosfolipídico, levando a uma 
membrana mais condensada.Ohvo-Rekila et al., 2002). A substituição da 
cauda hidrofóbica do colesterol por grupos polares (isto é,
Figura 7.Em vitroA exposição E2 das mitocôndrias OVX restaura a microviscosidade da membrana,J.H2Ó2Potencial emissor e fluxo de estado estacionário 
OXPHOS
(A) Desenho experimental.
(B) Conteúdo de E2 nas membranas mitocondriais. Os valores são médias ± SEM, n = 7–14 ratos/grupo.
(C) Valores de pico F dos espectros de emissão MC-540 em mitocôndrias SM intactas frescas pré-incubadas ± 3 nM E2. Os valores são médias ± SEM de três medidas replicadas, n = 8 ratos/
grupo.
(D) Atividades específicas dos complexos, medidas como emFigura 4. n = 7 ratos/grupo.
(E e F)J.H2Ó2(E) e máximoJ.Ó2capacidade (F) medida em mitocôndrias isoladas como emfigura 1B.
(G-I) (G)J.Ó2(G),J.ATP (H) e relações ATP/O resultantes (J.ATP/J.Ó2) (I), na presença de G/M/Pyr/Succ e ADP.
Os valores são médias ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01 versus NC-Pro e!p < 0,05,!!p < 0,01 versus OVX-4w. n = 7 ratos/grupo. ns, não significativo.
grupos hidroxila, -OH) explica a diferença na energia livre (DG) da 
interação com as membranas lipídicas e, portanto, do comportamento 
diferente desses hormônios com as membranas (Oren et al., 2004). A 
importância dos grupos -OH na relação estrutura/atividade dos 
hormônios esteróides foi demonstrada pela primeira vez com o 
medicamento antiestrogênio tamoxifeno (TAM), cujo principal 
metabólito, 4-hidroxil-tamoxifeno (mas não TAM), se divide em 
biomembranas devido a o efeito de enfraquecimento do grupo -OH no 
empacotamento lipídico (Custódio et al., 1991). De maneira semelhante, 
a difusão passiva e a translocação de E2 através das biomembranas são 
termodinamicamente favorecidas (Oren et al., 2004) e também 
demonstrou diminuir a microviscosidade em lipossomas multilamelares 
DPPC (Boyar e Severcan, 1996) e vários modelos de células (Dicko
et al., 1999; Kumar et al., 2011; Tsuda et al., 2003; Whiting et al., 2000). A 
estrutura dos hormônios esteróides pode ser usada para prever seu 
comportamento dentro de uma membrana lipídica.Wenz, 2012). Na 
molécula E2, a presença de grupos -OH em ambas as extremidades do 
sistema de anéis e a ausência da ligação dupla entre C5 e C6 inibem as 
interações de van der Waals, enfraquecendo o empacotamento lipídico.
Wenz, 2012). Consequentemente, estudos de ressonância magnética 
nuclear no estado sólido sugerem que, embora o E2 esteja inserido de 
forma estável na bicamada lipídica, ele é altamente dinâmico e pode 
sofrer rápidas reorientações/rotações.Scheidt et al., 2010).
As propriedades fluidas das membranas biológicas são decisivas para 
as funções celulares (Andersen e Koeppe, 2007), particularmente nas 
membranas mitocondriais onde os fosfolipídios alterados
Metabolismo Celular27, 167–179, 9 de janeiro de 2018175
composição e empacotamento podem afetar a dinâmica da membrana 
e, em última análise, a transferência de elétrons (Mileykovskaya e 
Dowhan, 2014; Shaikh et al., 2014; Shi et al., 2013; Wenz et al., 2009). Foi 
demonstrado que o enriquecimento de colesterol nas mitocôndrias 
aumenta a microviscosidade da membrana (Colell et al., 2003) e 
prejudicam a produção de ATP (Yu et al., 2005). Curiosamente, a terapia 
hormonal contendo estrogênio diminui a viscosidade da membrana dos 
eritrócitos em mulheres na pós-menopausa (Tsuda et al., 2003). A 
identificação de E2 em extratos de membrana mitocondrial via LC-MS 
apoia o conceito de que E2 pode compreender um componente chave 
das membranas mitocondriais, a função ETS de ''ajuste fino''. A 
capacidade do E2 de alterar a microviscosidade da membrana 
mitocondrial parece ser independente do ERa,como (1) E2 foi detectado 
em membranas mitocondriais de skmERaKO com níveis diminuindo 
apenas após OVX, (2) E2 diminuiu a microviscosidade em modelos de 
membrana que não possuem ERa (isto é, DPPC-SUVs, monocamadas de 
DPPC e LUVs mitocondriais biomiméticos), e (3) a translocação direta de 
E2 ocorreu espontaneamenteem vitro em mitocôndrias isoladas. De 
acordo com estes resultados, a captação direta de E2 nas mitocôndrias 
foi relatada em células HepG2 (Fossos e Ramirez, 2000), que não 
expressam ERa (Harnish et al., 1998).
Alternativamente, alterações mediadas por E2 na microviscosidade da 
membrana mitocondrial também poderiam ser uma função da biologia 
redox. Os fosfolipídios mitocondriais são enriquecidos em ácidos graxos 
poliinsaturados que diminuem o empacotamento lipídico, possivelmente 
promovendo a eficiência do transporte de elétrons, aumentando o 
movimento lateral das proteínas dentro da bicamada.Namorados e 
Namorados, 2004). No entanto, os fosfolipídios poliinsaturados são 
particularmente vulneráveis à peroxidação lipídica.Catalão, 2012), o que 
pode, em última análise, aumentar a viscosidade da membrana (Choe et 
al., 1995; Solans et al., 2000). O próprio E2 pode ser metabolizado para 
formar quinonas (Bolton e Thatcher, 2008) e demonstrou atuar como um 
antioxidante neuroprotetor independentemente da ativação do RE (Behl 
et al., 1997; Prokai et al., 2003). Assim, a localização do hormônio na 
membrana interna mitocondrial poderia potencialmente ter um papel 
direto na limitação da peroxidação lipídica, preservando assim as 
propriedades biofísicas da membrana e a função global do ETS.Irwin et 
al., 2008).
Coletivamente, os dados demonstram que os níveis de E2 nas 
mitocôndrias modulam diretamente a microviscosidade da membrana 
interna, contribuindo para a função bioenergética mitocondrial. O 
presente estudo concentrou-se no SM, mas é provável que o E2 seja um 
componente das membranas mitocondriais em muitos (se não todos) 
tecidos, influenciando a atividade bioenergética localmente e a 
homeostase energética coletivamente. O impacto do E2 nas membranas 
é uma função da sua estrutura e potencialmente também não é 
exclusivo do E2. Na verdade, foi relatado que vários hormônios 
esteróides além do E2 (ou seja, testosterona, desidroepiandrosterona, 
estrona) melhoram a atividade bioenergética nas células neuronais, 
aumentando a função mitocondrial e redox (Grimm et al., 2014). Esta 
nova ação do E2 fornece informações adicionais sobre os mecanismos 
pelos quais a menopausa natural/cirúrgica se estabelece e a terapia com 
E2 reverte um estado pró-diabetogênico. Os presentes resultados 
revelam um potencial novo alvo terapêutico para o desenvolvimento de 
novas intervenções farmacológicas para prevenir a disfunção metabólica 
na menopausa, bem como estados de doença caracterizados pela 
produção excessiva de ERO mitocondriais em mulheres e homens.
176Metabolismo Celular27, 167–179, 9 de janeiro de 2018
ESTRELA+MÉTODOS
Métodos detalhados são fornecidos na versão online deste 
documento e incluem o seguinte:
dTABELA DE RECURSOS PRINCIPAIS
dCONTATO PARA COMPARTILHAMENTO DE REAGENTES E RECURSOS
dMODELO EXPERIMENTAL E DETALHES DO ASSUNTO
dDETALHES DO MÉTODO
BUso de animais
BTestes de tolerância à glicose e à insulina (GTTs, ITTs) e
Medições de insulina plasmática
BEx VivoCaptação de glicose muscular estimulada por insulina
BPreparação do Pacote de Fibras Musculares Permeabilizadas (PmFB)
ração
BRespiração mitocondrial (JO2) e JH2Ó2Média-
certezas
BEstado Redox da Glutationa
BIsolamento mitocondrial e atividade específica relativa de
Complexos mitocondriais OXPHOS
BConteúdo mitocondrial
BMediçõesSimultâneas em Tempo Real de Mitocon-
drial JO2e JATP
BSíntese de membranas mitocondriais biomiméticas
BEstudos de Monocamada
BAvaliação da Microviscosidade da Membrana por Fluores-
Espectros de Cence de Merocianina (MC540)
BExtração em fase sólida de estradiol da mitocôndria
Membranas
BQuantificação de E2 via LC/MSMS
BConfirmação do aduto E2-Cl
BPCR quantitativo
dQUANTIFICAÇÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA
INFORMAÇÃO COMPLEMENTAR
As informações suplementares incluem sete figuras e podem ser encontradas neste 
artigo online emhttps://doi.org/10.1016/j.cmet.2017.10.003.
CONTRIBUIÇÕES DO AUTOR
Conceituação e Metodologia, MJT e PDN; Investigação, MJT, TER, AMF, CAS, C.-
TL e KAB Vesículas lipídicas e estudos de monocamada foram realizados por 
extrações de estrogênio SRS e ERP e estudos de LC-MS foram realizados por 
KAK e MJT; estudos com skmERaCamundongos KO foram realizados por SK, 
MJT e DAL; Validação e Análise Formal, MJT; Redação – Rascunho Original, MJT; 
Revisado, LAG, EES, TNZ e SRS; Redação – Revisão e Edição, PDN
AGRADECIMENTOS
Gostaríamos de agradecer ao especialista em aplicações SCIEX, Robert Proos 
(Framingham, MA), por sua ajuda na validação adicional de dados e análises 
de MS/MS. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas dos Serviços de Saúde 
Pública dos EUA R01 HL123647, R01 AT008375 (SRS), ADA BS-1-15-170 (EES), 
R01 AG031743 (DAL) e R01 DK096907 e R01 DK110656 (PDN).
Recebido: 8 de janeiro de 2017 
Revisado: 7 de agosto de 2017 
Aceito: 6 de outubro de 2017 
Publicado: 2 de novembro de 2017
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Metabolismo Celular27, 167–179, 9 de janeiro de 2018179
ESTRELA+MÉTODOS
TABELA DE RECURSOS PRINCIPAIS
REAGENTE ou RECURSO
Anticorpos
FONTE IDENTIFICADOR
Kit Complexo Monoclonal Anti-Tr/Ms Total OxPhos Invitrogen RRID: AB_2533835
IRDye 680RD IgG anti-rato de burro Biociências Li-COR RID: AB_10953628
Amostras Biológicas
Músculo esquelético de camundongos fêmeas C57Bl/6N Universidade da Carolina do Leste e 
Universidade de Minnesota
N / D
Produtos Químicos, Peptídeos e Proteínas Recombinantes
Cristal Violeta Sigma-Aldrich CAS#548-62-9
N / D2HPO4 Sigma-Aldrich CAS#7558-79-4
NaH2PO4 Sigma-Aldrich CAS#10049-21-5
NaHCO3 Sigma-Aldrich CAS#144-55-8
NaOH TCI América CAS#1310-73-2
KH2PO4 JT Baker P#3252-01
Base Trizma Sigma-Aldrich CAS#77-86-1
K-MES Sigma-Aldrich CAS#39946-25-3
KCl Sigma-Aldrich CAS#7447-40-7
NaCl Sigma-Aldrich CAS#7647-14-5
CaCl2 Sigma-Aldrich CAS#10043-52-4
HEPES Sigma-Aldrich CAS#7365-45-9
MgCl2-6H2Ó Sigma-Aldrich CAS#7791-18-6
MgSO4-7H2Ó Sigma-Aldrich CAS#10034-99-8
EDTA Sigma-Aldrich CAS#6381-92-6
EGTA Sigma-Aldrich CAS#67-42-5
D-sacarose Pescador Cat#EC200-334-9
BSA Química Cruz CAS#9048-46-8
Dextrose 50% Injetáveis Pfizer NDC#00409-6648
Injeção de insulina humana, USP Eli Lilly NDC#0002-8215
14CD-manitol Perkin Elmer P#NEC314050UC
3H-2-Desoxi-glicose Perkin Elmer P#NET549A250UC
2-Desoxi-D-glicose Sigma-Aldrich CAS#154-17-6
D-manitol Sigma-Aldrich CAS#69-65-8
Creatina monohidratada Sigma-Aldrich CAS#6020-87-7
Imidazol Sigma-Aldrich CAS#288-32-4
Taurina Sigma-Aldrich CAS#107-35-7
Fosfocreatina Sigma-Aldrich CAS#19333-65-4
saponina Sigma-Aldrich CAS#8047-15-2
Ácido D-Glutâmico Sigma-Aldrich CAS#6893-26-1
Ácido DL-Málico Sigma-Aldrich CAS#676-46-0
Ácido succínico Sigma-Aldrich CAS#110-15-6
Piruvato de Sódio Sigma-Aldrich CAS#113-24-6
Cloreto de palmitoil-L-carnitina Sigma-Aldrich CAS#18877-64-0Palmitoil coenzima A Sigma-Aldrich CAS#188174-64-3
Cloridrato de L-carnitina Sigma-Aldrich CAS#6645-46-1
Citocromo C Sigma-Aldrich CAS#9007-43-6
NADH IPR Nº CAS 606-68-8
(Continua na próxima página)
e1Metabolismo Celular27, 167–179.e1–e7, 9 de janeiro de 2018
Contínuo
REAGENTE ou RECURSO FONTE IDENTIFICADOR
n-Dodecilb-D-maltosídeo Sigma-Aldrich Nº CAS 69227-93-6
Rotenona Sigma-Aldrich CAS#83-79-4
Ácido malônico Sigma-Aldrich CAS#141-82-2
Antimicina A Sigma-Aldrich CAS#1397-94-0
KCN Sigma-Aldrich CAS#151-50-8
Sal sódico de 2,6-dicloroindofenol Sigma-Aldrich Nº CAS 620-45-1
2,3,5,6-Tetrametil-p-fenilenodiamina (TMPD) Sigma-Aldrich CAS#100-22-1
Cianeto de carbonila p-(trifluoro-
metoxi)fenilhidazona (FCCP)
Sigma-Aldrich CAS#370-86-5
Decilubiquinona (DCU) Enzo Gato#CM115-0010
L-ascorbato Sigma-Aldrich CAS#134-03-2
ADP Sigma-Aldrich CAS#72696-48-1
ATP Sigma-Aldrich CAS#34369-07-8
Blebbistatina Sigma-Aldrich CAS#856925-71-8
Amplex UltraRed Termo Fisher Cat#A36006
CuZn Superóxido Dismutase Sigma-Aldrich Nº CAS 9054-89-1
Auranofina Sigma-Aldrich CAS#251-801-9
1,3-Bis(2-cloroetil)-1-nitrosoureia (BCNU) Sigma-Aldrich CAS#154-93-8
1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) Sigma-Aldrich CAS#97-00-7
P1,P5-di(adenosina-50)pentafosfato (Ap5A) Sigma-Aldrich CAS#4097-04-5
Glicose-fosfato desidrogenase Sigma-Aldrich CAS#9001-40-5
Hexocinase (HK) Sigma-Aldrich CAS#9001-51-8
b-Nicotinamida adenina dinucleótido
fosfato (NADP+)
Sigma-Aldrich CAS#53-59-8
D-glicose Sigma-Aldrich CAS#50-99-7
Merocianina 540 Termo Fisher Gato#M24571
Colesterol, lã de ovino >98% Avanti Lipídios Polares Gato#700000P
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) Avanti Lipídios Polares Gato#850355P
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina Avanti Lipídios Polares Gato#850725P
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina Avanti Lipídios Polares Cat# 840035P
Clorofórmio (grau HPLC) Fisher Científico Gato#C607SK
Água, grau Optima LC-MS Fisher Científico Gato#W6
Acetonitrila, grau Optima LC-MS Fisher Científico Cat#A-955
Metanol, grau Optima LC-MS Fisher Científico Cat#A-456
Isopropanol, grau Optima LC-MS Fisher Científico Cat#A-461
Trifluorometanossulfonato de 1-metil-2-vinilpiridínio Sigma-Aldrich CAS#339530-78-8
n-etilnaleimida (NEM) Sigma-Aldrich CAS#128-53-0
o-ftalaldeído (OPA) Sigma-Aldrich CAS#643-79-8
Acivicina Sigma-Aldrich Nº CAS 42228-92-2
Ácido acético glacial EMDmillipore Cat#AX0074-6
Ácido tricloroacético (TCA) Crescente Química 36910.01
Ácido Perclórico (70%) Sigma-Aldrich CAS#7601-90-3
Ácido bórico Sigma-Aldrich CAS#10043-35-3
L-serina Sigma-Aldrich CAS#56-45-1
L-glutationa oxidada Sigma-Aldrich CAS#27025-41-8
L-glutationa reduzida Sigma-Aldrich CAS#70-18-8
Solúvel em água 17b-estradiol Sigma-Aldrich Gato#E4389
17b-estradiol Sigma-Aldrich Gato#E8875
17b-estradiol-D5 (100eug/mL) Padrão Interno Cerilante Gato#E061
(Continua na próxima página)
Metabolismo Celular27, 167–179.e1–e7, 9 de janeiro de 2018e2
Contínuo
REAGENTE ou RECURSO
Ensaios Comerciais Críticos
FONTE IDENTIFICADOR
Kit de ensaio de proteína Pierce BCA Termo Fisher Gato#23225
Kit ELISA de insulina para camundongos ultrassensíveis Cristal Química Inc. Gato#90080
Kit de glutationa reduzida e oxidada Pesquisa Oxis Gato#21040
Kit de atividade citrato sintase Sigma-Aldrich Gato#CS0720
Kit de síntese de cDNA IScriptTM BioRad Gato#1725037
Modelos Experimentais: Organismos/Estirpes
Camundongos C57Bl/6N fêmeas com 8 semanas de idade O Laboratório Jackson Estoque#005304
Camundongos machos HSA-Cre79 O Laboratório Jackson Estoque#006149
Pronto-socorro femininoa-flratos boi (Hewitt et al., 2010)
Oligonucleotídeos
tioredoxina 2 de camundongo (ref NM_013711)
primer direto: 50-GCTTCTGGCAAGGAAGACAC-30
primer reverso: 50-CCAGCCTTCTCCAGATTCAA-30
Invitrogen N / D
glutationa redutase de camundongo (ref NM_010344) 
primer direto: 50-TGTGGAGAGTCACAAGCTG -30
primer reverso: 50-TTGAAAGCCGTAATCCACG -30
Invitrogen N / D
superóxido dismutase 2 de camundongo (ref NM_013671) 
primer direto: 50-ACTGAAGTTCAATGGTGGGG-30
primer reverso: 50- GCTTGATAGCCTCCAGCAAC-30
Invitrogen N / D
proteína ribossômica de camundongo L32 (ref NM_172086) 
primer direto: 50-TTCCTGGTCCACAATGTCAA-30
primer reverso: 50-GGCTTTTCGGTTCTTAGAGGA-30
Invitrogen N / D
Floxed ERa:
Primer direto: 50-TCACATGGAGTGAATGCTCTG-30
Primer reverso: 50-AGTGAACACCAGGCCAGTTT-30
Invitrogen N / D
Outro
Bomba microosmótica Alzet Modelo nº 1002
Pellete de liberação de estradiol por 60 dias Pousada Res da América Gato#SE-121
Estratos SPE - X 33eum Tubos poliméricos de fase 
reversa de 10 mg/1mL
Fenômeno Cat#8B-S100-AAK
CONTATO PARA COMPARTILHAMENTO DE REAGENTES E RECURSOS
Mais informações e solicitações de recursos e reagentes devem ser direcionadas e serão atendidas pelo Contato Principal, P. Darrell Neufer 
(neuferp@ecu.edu).
MODELO EXPERIMENTAL E DETALHES DO ASSUNTO
Todos os estudos em animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais da East Carolina University ou da 
Universidade de Minnesota, de acordo com os regulamentos internacionais. Camundongos fêmeas C57BL/6NJ foram alojados em uma instalação 
com temperatura controlada (22°C) com um ciclo claro/escuro de 12 horas e livre acesso a alimentos (dieta padrão) e água. A composição corporal foi 
determinada utilizando Echo MRI, e a caracterização metabólica foi realizada em gaiolas metabólicas (Phenomaster/labmaster, TSE Systems, 
Chesterfield, MO) após um período de aclimatação de 48 horas. Os camundongos foram ovariectomizados às 10 semanas de idade e sacrificados 2 
semanas depois (OVX-2w), ou implantados com uma bomba microosmótica subcutânea para receber 2 semanas de terapia E2 (OVX-4w[E2]) ou 
solução salina controle (OVX- 4w[ctl]). As intervenções de curto prazo foram selecionadas com base em observações anteriores que apoiam o início 
precoce da administração de E2 para resgate de parâmetros metabólicos (López-Grueso et al., 2014). Um grupo controle incluiu fêmeas 
normalmente cicladas no estágio Proestro do ciclo estral no momento do sacrifício (NC-Pro), para garantir altos níveis plasmáticos fisiológicos de E2 (
Figura S1). Bombas mini-ossomóticas foram removidas no sacrifício para medir o volume restante de solução no compartimento. Os critérios de 
exclusão incluíram qualquer bomba que não conseguiu fornecer >85% da dose de estrogénio pretendida (apenas uma bomba falhou/rato excluído). 
No sacrifício, os ratos foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal de cetamina antes da coleta de tecido. Porções dos músculos 
gastrocnêmios vermelhos (RG) foram dissecadas para preparações de feixes de fibras permeabilizadas (PmFBs). Os músculos sóleo e EDL foram 
dissecados paraex-vivo medição da captação de 2-desoxiglicose estimulada por insulina.
e3Metabolismo Celular27, 167–179.e1–e7, 9 de janeiro de 2018
Ratos sem ERaespecificamente no músculo esquelético (skmERaKO) foram gerados pela criação de ERa-flratos oxados (Hewitt et al., 2010) com camundongos 
cre de actina esquelética humana (HSAcre). O genótipo foi determinado por PCR usando primers para ER floxedae HSAcre. Às 12-16 semanas de idade, os 
camundongos foram submetidos a cirurgias OVX ou simuladas, e um subgrupo de camundongos OVX recebeu tratamento E2 (OVX + E2) após OVX por meio da 
implantação de pellets de liberação prolongada de 60 dias contendo 0,18 mg de 17b-estradiol. Às 6-7 semanas após a cirurgia, os ratos foram anestesiados por 
injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg/kg de massa corporal) e os músculos quadríceps e isquiotibiais foram coletados para isolamento das 
mitocôndrias. Normalmente andando de bicicleta, ER da mesma idadea-flirmãos de ninhada oxed foram usados como controles.
DETALHES DO MÉTODO
Uso de animais
O ciclo estral foi monitorado diariamente através de lavagem vaginal com água destilada e citologia (Frasier et al., 2013) (VerFigura S1). As fêmeas normalmente 
ciclizadas no Proestro foram designadas para sacrifício e coleta de tecidos no mesmo dia e representaram o grupo controle. O modelo de camundongoovariectomia (OVX) tem sido usado extensivamente para estudar o impacto da perda de E2, e o desenvolvimento de intolerância à glicose e RI em camundongos 
OVX de longo prazo (8+ semanas) está bem estabelecido.Bailey e Ahmed-Sorour, 1980; Riant et al., 2009). No entanto, a OVX a longo prazo também leva ao 
aumento da adiposidade, inflamação e diminuição do gasto energético.Rogers et al., 2009). Os ratos foram randomizados para OVX. A massa uterina no 
sacrifício foi relatada como um biomarcador dos níveis circulantes de estrogênio.Madeira et al., 2007). Camundongos OVX foram randomizados para receber 
terapia E2 ou uma solução controle. Como as bombas não são compatíveis com solventes orgânicos, solúveis em água 17b-o estradiol foi dissolvido em solução 
salina estéril. A solução E2 foi preparada fresca no dia da implantação da bomba e filtrada através de um filtro de 0,2euMembrana mMillipore. Cada bomba 
continha 100euL de uma solução de 0,743 mME2 (calculada com base em uma pureza sólida de 46,7 mg/g), preparada a uma taxa de liberação de 0,25euL/h, 
fornecendo assim -1,2eug E2 por dia, uma quantidade anteriormente demonstrada para restaurar os níveis fisiológicos circulantes e proteger contra a 
intolerância à glicose e a resistência muscular à insulina em camundongos (Camporez et al., 2013; Ingberg et al., 2012; Riant et al., 2009).
Testes de tolerância à glicose e à insulina (GTTs, ITTs) e medições de insulina plasmática
Experimentos e análises foram realizados com base nas recomendações de McGuiness et al. (McGuinness et al., 2009). Os camundongos permaneceram em 
jejum por 5 horas e receberam uma injeção intraperitoneal de glicose (2,5 g/Kg de massa livre de gordura) de uma solução salina de dextrose a 50%. A glicose 
no sangue foi medida a partir da veia da cauda usando um glicosímetro animal AlphaTrak 2 (laboratórios Abbott) aos 0, 15, 30, 60 e 90 minutos após a injeção. A 
tolerância à glicose foi avaliada calculando a área sob a curva (AUC) após normalizar os níveis de glicose no sangue em jejum. Para testes de tolerância à insulina 
(ITTs), os camundongos jejuaram por 5 horas e administraram uma injeção intraperitoneal de insulina (0,5 U/Kg de massa magra). Os níveis de glicose foram 
determinados nos momentos 0, 10, 20, 30 e 40 min. A sensibilidade à insulina foi calculada a partir da inclinação 0-30 min. Amostras de sangue coletadas após 
jejum de 5 horas (usando tubos capilares hepinarizados) foram utilizadas para medir a insulina.
Ex VivoCaptação de glicose muscular estimulada por insulina
Ex vivobasal e estimulada por insulina3A captação de H-2-desoxi-glicose foi medida conforme relatado anteriormente (Fisher-Wellman et al., 2016). Os 
músculos foram cuidadosamente dissecados e pré-incubados em tampão Krebs-Henseleit suplementado com piruvato 1 mM e oxigenados a 95% de 
O2, 5% CO2, a 37°C por 20 min. Em seguida, os músculos foram incubados com insulina (50 mU/mL) por 30 min e finalmente transferidos para poços 
de incubação contendo 1 mM de 2-DOG e 0,2euCi/mL3H-2-DOG para quantificar o transporte de glicose e 2 mM de manitol e 0,1euCi/mL14CD-manitol 
para determinar o espaço extracelular com ou sem insulina (50 mU/mL) por 15 min enquanto continuamente gaseificado com 95% de O2, 5% CO2. Os 
músculos foram liofilizados em N líquido2, pesado, solubilizado em 0,5 mL de NaOH 0,5 N e estabilizado em fluido de cintilação. Contagem 
simultânea de14C e3Os canais H2 foram realizados em um contador de cintilação líquida Perkin Elmer Tri-Carb 2800TR.
Preparação do pacote de fibras musculares permeabilizadas (PmFB)
PmFBs foram preparados conforme descrito anteriormente (Anderson et al., 2009). Resumidamente, porções do músculo gastrocnêmio 
vermelho (RG) foram dissecadas e imediatamente colocadas em tampão X gelado (K-MES 50 mM, KCl 35 mM, K 7,23 mM2EGTA, CaK 2,77 
mM2EGTA, imidazol 20 mM, taurina 20 mM, ATP 5,7 mM, fosfocreatina 14,3 mM e MgCl2 6,56 mM2-6H2O, pH = 7,1) para separação ao 
microscópio. Feixes de fibras separados foram incubados em um agitador em tampão X contendo 30eug/mL de saponina por 30 min a 4 C 
e finalmente transferido para tampão Z (105 mM K-MES, 30 mM KCl, 1 mM EGTA, 10 mM K2HPO4, MgCl2 5 mM2-6H2O, 0,5 mg/mL BSA, 
pH=7,1) a 4 C por 15 min, ou até a experimentação. Na conclusão do experimento, as fibras foram enxaguadas em dH2O e liofilizado para 
determinação do peso seco.
Respiração mitocondrial (JO2) e JH2Ó2Medidas
J.Ó2foi medida por respirometria de alta resolução (O2K, OROBOROS Innsbruck, Áustria), em tampão Z suplementado com 20 mM de 
creatina monohidratada e 25euM blebbistatina. Concentrações de substratos adicionados: glutamato 10 mM, malato 2 mM, ADP 4 mM, 
succinato 10 mM, 10euM rotenona, 10euM antimicina A, ascorbato 2 mM, TMPD 0,5 mM (N,N,N0,N0-Dicloridrato de tetrametil-p-
fenilenodiamina), 0,5euMFCCP. Para suporte de ácidos graxosJ.Ó2: 20euM palmitoil-carnitina (PC), 20euM palmitoil-CoA (P-CoA), 5 mM de L-
carnitina (L-Carn), 1 mM de ADP, 0,5euMFCCP. L-carnitina foi adicionada para facilitar a exportação de acetil-CoA (produto deb-oxidação) da 
matriz mitocondrial através da enzima carnitina-acetiltransferase (Muoio et al., 2012).J.H2Ó2foi medido usando o sistema de fluorescência 
Amplex UltraRed/Horseradish Peroxidase em espectrofluorômetros FluoroMax/Fluorolog (HORIBA Jobin Yvon). Todos
Metabolismo Celular27, 167–179.e1–e7, 9 de janeiro de 2018e4
J.H2Ó2experimentos foram realizados em tampão Z suplementado com 10euM Amplex UltraRed (Invitrogen), 20 U/mL CuZn SOD e 25euM 
Blebistatina. Concentrações de substrato utilizadas: piruvato 1 mM ou succinato 10 mM, 1euM 1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosoureia (BCNU), 1
euM auranofina, 1euM 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB). Alternativamente, para experimentos utilizando mitocôndrias isoladas,J.Ó2
eJ.H2Ó2as medições foram realizadas usando as mesmas condições de buffer e 20eug de proteína mitocondrial total. Paraem vitroExperimentos de 
exposição a E2, mitocôndrias isoladas foram ressuspensas em meio de isolamento de sacarose +/- E2 em uma concentração final de 3 nM (2 ng E2/
mg de proteína mitocondrial) e incubadas por 10 min a 37 C. Após uma última etapa de centrifugação (10 min, a 10.000 G, a 4 C), o pellet final foi 
ressuspenso em 200euL meio de sacarose.
Estado Redox da Glutationa
As concentrações de glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) foram medidas por um ensaio padrão ou HPLC adaptado de (Giustarini et 
al., 2013; Kand'ar et al., 2007). Para o ensaio padrão, os músculos GR congelados foram homogeneizados em 500euTampão L TE (Tris-base 
10 mM, EDTA 1 mM, pH = 7) previamente borbulhado com N2(g) e com coquetéis inibidores de protease e fosfatase adicionados. 
Imediatamente a seguir, 200euL alíquota foi adicionada a um tubo contendo o agente alquilante, trifluorometanossulfonato de 1-metil-2-
vinilpiridínio (M2VP, concentração final 0,5 mM). Tanto a amostra original quanto a amostra tratada com M2VP foram centrifugadas (10.000 
rpm, 4 C) e os sobrenadantes foram utilizados para medir GSH e GSSG utilizando os reagentes e conjunto de calibração fornecidos pelo kit. 
Para determinação de GSH/GSSG por HPLC, o GSH foi medido como seu conjugado com n-etilmaleimida (NEM), que se liga a grupos tiol no 
GSH, bem como inibe potencialmente a glutationa redutase para prevenir alterações nos níveis de GSSG através de reduções e auto-
oxidação de GSH para GSSG. NEM foi adicionado ao tampão de homogeneização e todo o gastrocnêmio foi homogeneizado imediatamente 
após a coleta. O conjugado GS-NEM foi medido por detecção de UV, em que dois diastereómeros são visíveis como picos de tamanhos 
iguais no cromatograma. O GSSG foi medido numa amostra paralela do homogeneizado muscular utilizando detecção fluorescente da 
ligação do GSSG ao o-ftalaldeído (OPA) a pH = 12.
Isolamento mitocondrial e atividade específica relativa de complexos mitocondriais OXPHOS
Puadriceps, isquiotibiais, plantar, sóleo e músculos gastrocnêmios inteiros foram colhidos e imediatamente homogeneizados em meio de 
isolamento mitocondrial (sacarose0,3 M, HEPES 10 mM, EGTA 1 mM) contendo 1 mg/mL de BSA, em gelo (adaptado de (Frezza et al., 2007
)). Atividades específicas de complexos ETS individuais e I/II+III foram medidas espectrofotometricamente (Barrientos, 2002). Os 
homogenatos musculares foram submetidos a uma primeira etapa de centrifugação (800 G/ 10 min/ 4 C). O sobrenadante foi novamente 
centrifugado (1.200 G/10 min/4 C) e o sedimento foi ressuspenso em meio de isolamento mitocondrial (sem BSA) para uma última etapa de 
centrifugação (1.200 G/10 min/4 C). O pellet final foi ressuspenso em 150euO meio de isolamento mitocondrial L e a quantificação de 
proteínas foram avaliados utilizando o kit de ensaio BCA Protein. Um western representativo mostrando marcadores moleculares de 
mitocôndrias (citocromo oxidase 2, Cox2), peroxissomo (Pex16), retículo sarcoplasmático (SERCA1), membrana plasmática (Na/K-ATPase) e 
citoesqueleto (a-tubulina) em várias frações coletadas durante o isolamento de mitocôndrias é mostrado emFigura S7. As mitocôndrias 
isoladas foram diluídas em meio hipotônico (25 mM K2HPO4, 5,3 mM de MgCl22, pH=7,2) dando uma concentração final de 0,8 mg/mL, e 
posteriormente submetido a 3-4 ciclos de congelamento-descongelamento. A atividade do complexo I foi determinada em Tris 5 mM, 0,5 
mg/mL BSA, 24euM KCN, 0,4euM antimicina A, pH = 8, após a oxidação de NADH (0,8 mM) a 340 nm (340= 6220 milhões-1cm-1) por 3 min 
usando decil-ubiquinona oxidada (50euM DCUboi) como o aceitador de elétrons. Rotenona (4euM) foi adicionado para medir a atividade da 
oxidoredutase NADH-DCU sensível à rotenona. A atividade do complexo II foi medida em meio SQR (10 mM KH2PO4, EDTA 2 mM, 1 mg/mL 
BSA) na presença de succinato 10 mM, após a redução de diclorofenolindofenol (80euM DCPIP) a 600 nm(340= 19100 milhões-1cm-1) por 3 
min, usando DCUboicomo aceitador de elétrons. A reação foi inibida pela adição do substrato competitivo malonato (10 mM). A atividade do 
complexo III foi medida em meio SQR suplementado com 200euM ATP e 240euM KCN, usando DCUvermelho(80 mM) como doador de elétrons 
e Cyt Cboicomo aceitante (40euM). A reação foi acompanhada medindo a redução de Cyt C a 550 nm (340= 18.500 milhões-1cm-1) por 3 min e 
finalmente inibido pela adição de 0,4euM antimicina A. A atividade do complexo I+III foi determinada no mesmo meio que o complexo I 
(sem antimicina A), na presença de 40euM Cyt Cboie NADH 0,8 mM, após a redução de Cyt C a 550 nm. A atividade do complexo II+III foi 
determinada em meio SQR suplementado com 0,2 mM ATP, 4euM rotenona e succinato 10 mM, após a redução de Cyt C (40euM) por 5 min 
a 550 nm e interrompido com a adição do inibidor competitivo malonato (10 mM).
Conteúdo mitocondrial
A atividade da citrato sintase foi medida por kit em homogeneizados RG ou mitocôndrias isoladas. A expressão dos complexos OXPHOS foi medida em 
mitocôndrias isoladas reduzindo a análise de western blot usando o coquetel complexo OXPHOS total Anti-Rt/Ms. Carga proteica igual (25eug/poço) e a 
transferência consistente do gel foi verificada pela coloração Ponceau-S. Os borrões foram visualizados usando um gerador de imagens Licor IR e quantificados 
com Image Studio Lite (V. 5.0, Licor Bioscience).
Medições simultâneas em tempo real de JO mitocondrial2e JATP
A produção de ATP foi medida fluorometricamente através da estequiometria 1:1 com produção de NADPH a partir da hidrólise de ATP 
catalisada por hexoquinase, dependente de glicose, após a redução de NADP catalisada por glicose-fosfato desidrogenase.+(Lark et al., 
2016). 1 U/mL de hexoquinase, 2,5 mM de glicose, 2,5 mM de glicose-fosfato desidrogenase (G6PDH) e 2,5 mM de NADP+foi adicionado a 5
eug/mL de mitocôndrias isoladas em tampão Z, a 37 C. Para inibir a adenilato quinase, uma fonte alternativa potencial de síntese de ATP, 
Ap5A 0,2 mM (P1,P5-di(adenosina-50)pentafosfato) foi incluído nos experimentos. A respiração foi suportada por malato 0,5 mM, piruvato 5 
mM, glutamato 5 mM e succinato 5 mM. O NADPH foi medido por autofluorescência (euex= 340,
3
3
3
e5Metabolismo Celular27, 167–179.e1–e7, 9 de janeiro de 2018
eueles= 460) simultaneamente com O2consumo usando um sistema personalizado integrando fluorescência (FluoroMax-3; Horiba Jobin Yvon, Edison, 
NJ) com respirometria de alta resolução (Oroboros Oxygraph-2k, Innsbruck, Áustria) através de um cabo de fibra óptica (Fiberguide Industries). Taxas 
de síntese de ATP (J.ATP) foram quantificados usando uma curva padrão de titulação de ATP gerada na presença do sistema acoplado à enzima e dos 
substratos. Taxas de fluxo OXPHOS em estado estacionário (J.Ó2eJ.ATP) foram determinados após uma única adição de 20euM ADP.
Síntese de membranas mitocondriais biomiméticas
Vesículas unilamelares grandes (LUVs) foram preparadas como descrito anteriormente (Shaikh et al., 2009), usando fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina 
(PE) e fosfatidilserina (PS) em proporções relativas de aproximadamente (50:40:6 (PC/PE/PS)), semelhante à proporção encontrada na membrana mitocondrial 
interna do coração (Osman et al., 2011). Resumidamente, as misturas de PC/PE/PS foram co-dissolvidas em clorofórmio e secas sob uma corrente suave de N2
gás. Posteriormente, 0,1 mg/mL 17b-estradiol em etanol foi adicionado em quantidades crescentes aos lipídios secos e secos novamente sob N2. O clorofórmio e 
o etanol residuais foram removidos no escuro com bombeamento a vácuo durante 2 horas. Os lipídios foram hidratados em 2 mL de tampão fosfato de sódio 10 
mM pH = 7,4, perfazendo concentrações de E2 de 3,23euM, 6,45euM e 31,5euM para as misturas de 0,5, 1 e 5% molar de E2, e submetidas a três ciclos de 
congelamento-descongelamento seguidos de extrusão com 1eum membrana (Avanti Polar Lipids) para gerar LUVs. Todas as misturas lipídicas continham 750eu
g de lipídio total e, portanto, as concentrações de E2 foram fixadas em 2,35 mg de E2/g de lipídio total (0,5% molar de E2), 4,69 mg de E2/g de lipídio total (1% 
molar de E2) e 22,8 mg de E2/g de lipídio total. LUVs contendo 12% em mol de colesterol (60 mg cho/g de lipídio total) serviram como controle negativo. Estudos 
foram conduzidos para avaliar o impacto do aumento da massa E2 em LUVs na fluorescência do MC-540.
Estudos de Monocamada
Área de pressão (p-A) as isotermas foram coletadas de acordo com (Pennington et al., 2016; Shaikh et al., 2001). O clorofórmio foi utilizado como 
solvente para os estudos de monocamada. Água desionizada altamente purificada foi utilizada ao longo dos estudos de monocamada e foi purificada 
através do Sistema de Purificação de Água Mili-Q (Millipore, Milford, MA). Os estudos de monocamada foram realizados utilizando uma calha 
Langmuir-Blodgett personalizada (KSV Instruments, Helsinki, Finlândia) e uma placa de papel Wilhelmy. Monocamadas lipídicas compostas por DPPC 
e colesterol/E2 foram espalhadas em uma subfase estéril (filtrada com NaH 10 mM2PO4tampão, pH=7,4) usando clorofórmio a 23°C. O solvente 
orgânico foi deixado evaporar antes da compressão (3,0 mm/min), e todas as isotermas foram coletadas em triplicatas. Para cadap-Uma isoterma, o 
(Mma)/molécula foi determinada por extrapolação das pressões superficiais alvo (15 e 30 mN/m). Cadap-Uma isoterma foi usada para determinar a 
compressibilidade da monocamada calculando os módulos de elasticidade superficial (Cs-1): Cs-1= (-A)(dp/dA)p,onde A é o Mma/molécula da mistura 
lipídica a uma pressão superficialpág.
Avaliação da Microviscosidade da Membrana por Espectros de Fluorescência de Merocianina (MC540)
Como descrito anteriormente em (Zeczycki et al., 2014). Mitocôndrias frescas isoladas (200eug), foram equilibrados com MC540 100 nM em meio de 
isolamento de sacarose por 5 min a 37°C. Espectros de fluorescência (euex= 495,eueles= 540-660 nm) foram coletados em um espectrofluorômetro 
FluoroMax (HORIBA Jobin Yvon). Os valores de pico foram relatados para análise.
Extração em fase sólida de estradiol de membranas mitocondriais
O protocolo foi modificado a partir das recomendações do Phenomenex- (Huq et al.,2008; Wei et al., 2016). Para levar em conta a eficiência da etapa 
de extração, mitocôndrias de músculo esquelético isoladas (500eug de proteína mitocondrial) foram liofilizados e enriquecidos com 20euL de padrão 
interno E2 deuterado (ISTD, 1eug/euL), diluído em 1 mL de água e submetido à extração em fase sólida com Phenomenex Strata--X 33eum Fase 
reversa polimérica, colunas de 10 mg/1 mL. Para experimentos de controle, amostras selecionadas também foram enriquecidas com 20euL de 1 mg/
mL E2 para confirmação, e os padrões E2 selecionados foram enriquecidos com 20euL de NaCl 1 M para medir e verificar o aduto de cloreto 
observado (descrito abaixo). Um coletor de extração em fase sólida (SPE) com pressão positiva de posição Biotage-48 foi conectado a um tanque de 
nitrogênio de alta pureza e foi projetado para cartuchos de SPE de 1 mL. O coletor foi ajustado para uma pressão baixa de aproximadamente 10 psi 
para condicionamento e extrações de amostras. Os cartuchos SPE foram condicionados com 400euL metanol e 400eueu água. Após o carregamento 
da amostra, os cartuchos foram lavados com água 2x 800euL e seco com fluxo de nitrogênio de 30 psi. O E2 foi eluído e coletado em tubos de cultura 
de vidro de 15 mL usando 2x 200euL metanol e 200euL acetonitrila. Os 600euL da amostra foi evaporada até a secura sob nitrogênio e reconstituída 
em 50euL acetonitrila. As amostras foram colocadas em um agitador por -5 min e centrifugadas a 800 RPM por 2 min. O volume foi transferido 
usando pipetas de vidro para um frasco de amostrador automático de 1,5 mL com capacidade de 200euL inserido no frasco e analisado usando 
cromatografia líquida-espectrometria de massa (10euL foi injetado).
Quantificação de E2 via LC/MSMS
A análise foi conduzida num espectrómetro de massa de tempo de voo quadrupolo Waters Acquity UPLC/Waters Micromass, ou num 
espectrómetro de massa triplo quadrupolo ExionLC/AB Sciex 3200 (LC/MSMS). As amostras e os padrões nos frascos do amostrador 
automático foram colocados em um suporte refrigerado (4 C). A LC foi realizada a 40°C usando um Kinetex C18 2.6eum coluna (2,1 x 50 
mm) com cartuchos SecurityGuard-ULTRA para UHPLC C18, sub-2eum e colunas core-shell com diâmetro interno de 2,1mm (Phenomenex). 
A fase móvel consistia em 95/5 de água/acetonitrila (A) e 60:20:20 de acetonitrila/isopropanol/metanol (B) entregue como um gradiente 
como segue: 0-2 min 5% B, 2-6 min 60% B, 6-11 min 90% B, 11-13 min 95% B, 13-15 min 5% B e 18 min 5% B. A vazão foi ajustada em 0,3 
mL/min e 10euL de amostra foi injetado. Para quantificação dos dados, a integração das áreas de pico (E2 e ISTD) foi realizada utilizando 
MassLynx 4.1 (Waters), e a partir da razão do E2 para o padrão interno deuterado, bem como um padrão interno
Metabolismo Celular27, 167–179.e1–e7, 9 de janeiro de 2018e6
curva, a concentração de E2 em ng E2 por mg de proteína mitocondrial foi calculada. O sinal de fundo no meio de isolamento de sacarose 
(branco) foi subtraído de todas as amostras.
O espectrômetro de massa LC/MSMS ExionLC/AB Sciex 3200 triplo quadrupolo foi operado em modo de ionização negativa usando múltiplas varreduras de 
monitoramento de reação (MRM). A temperatura da fonte foi mantida a 500°C e um tempo de permanência de 50 ms foi utilizado para cada varredura. As 
seguintes varreduras de MRM foram monitoradas:
Colisão
Energia
Potenciais de desagrupamento/entrada/
entrada de colisão/saída de colisãoMassa Q1 (Da) Massa do 3º trimestre (Da)
276,2 147,1 - 56 - 85/-10/-24/-2
276,2 187,0 - 58 - 85/-10/-22/0
271,2 145,1 - 56 - 85/-7/-22/-2
271,2 169,1 - 62 - 85/-7/-30/-6
271,2 183,1 - 59 - 85/-7/-30/-1
307.2 183,1 - 34 - 5/-3,5/-18/0
No Waters Acquity UPLC/Waters Micromass QTOF MS, a espectrometria de massa de ionização por eletropulverização foi coletada usando o modo 
de ionização negativa. Parâmetros do instrumento: tensão capilar 3000 V, cone de amostra 30 V, cone de extração 1 V, temperatura de dessolvatação 
200 C, temperatura da fonte 120 C e taxa de fluxo de dessolvatação definida para 500 L/h. Nesta plataforma, a molécula E2 foi medida como aduto de 
cloreto nos extratos mitocondriais devido aos altos níveis de sal presentes, sendo assim identificada como am/z de 307,4 Da (= E2 (271 Da) + Cl (35,4 
Da)). O aduto de cloreto foi confirmado como 500 vezes mais abundante do que o íon molecular desprotonado nas amostras mitocondriais, 
explicando por que o m/z 271 Da de E2 foi facilmente detectado nas amostras LUV, mas o m/z 307 Da foi mais forte nas amostras mitocondriais. 
amostras em meios de isolamento. Experimentos de controle que envolveram a adição de cloreto de sódio antes da extração (Figura S6B), bem como 
validação em plataforma LC-MS mais sensível (realizada pela SCIEX-), confirmou a identificação do m/z 271 Da nos extratos mitocondriais (veja abaixo 
''Confirmação do aduto E2-Cl''). Os espectros de massa foram coletados na faixa de massa de 20-1500 Da e MSMS para 271 e 307 Da também foi 
coletado. O CID foi ajustado em 20 e 35 para 271 e 307 Da, respectivamente.
Confirmação do aduto E2-Cl
Para confirmar a identificação do aduto cloreto E2, uma segunda LC-MS foi utilizada para amostras selecionadas, incluindo duas de cada 
grupo. O LC-MS foi um Shimadzu LC/Sciex 6500 mais QTRAP. As mesmas condições de cromatografia listadas acima foram aplicadas a um 
Phenomenex Kinetex XB-C18, 2.1330 mm, 2,6eum, 100Å. Três transições MRM para o [MH]-e uma transição para o [M+Cl]-
foi monitorado para estradiol e são mostrados abaixo:
Íon molecular (Da) Fragmento Energia de colisão
271 143 - 53
271 145 - 53
271 183 - 70
307 183 - 53
PCR quantitativo
70-80 mg de gastrocnêmio branco foram homogeneizados em reagente TRIzol para extrair RNA total, e 1euO gRNA foi transcrito reversamente 
usando o kit de síntese de cDNA IScriptTM. A PCR quantitativa foi realizada em um sistema de PCR em tempo real ViiaTM 7 (Life Technologies, Grand 
Island, NY) utilizando o reagente SYBR-Green. Os ensaios foram realizados em triplicado e os valores finais foram normalizados para os níveis de 
mRNA ribossômico L32. Primers pré-validados foram adquiridos da Invitrogen:
QUANTIFICAÇÃO E ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados são apresentados como médias ± SEM. Os dados apresentaram distribuições normais que permitiram análises paramétricas. As 
comparações entre 2 grupos foram realizadas por testes t de Student independentes (* vs. NC-Pro) ou pareados (! vs OVX-4w), quando aplicável. As 
comparações entre 3 ou 4 grupos foram realizadas com ANOVA unidirecional, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Sidak (* vs. NC-Pro e # 
vs. OVX-4w[ctl]). O Graph Pad Prism 7 foi utilizado para análise estatística e apresentação dos dados. Os parâmetros estatísticos podem ser 
encontrados nas legendas das figuras.
e7Metabolismo Celular27, 167–179.e1–e7, 9 de janeiro de 2018