resumos Biologia Molecular

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Manipulação da expressão genética em eucariotas
Porquê manipular a expressão genética?
Queremos estudar as funções dos genes e muitas vezes é necessário retirar um gene para perceber a sua função
Quando retiramos ou acrescentamos um gene e vemos o que é que a célula ganha ou perde, percebe-se em que é que está envolvido o gene que acrescentamos ou retirámos.· A regulação genética é o processo de controlar quais os genes no DNA de uma célula são expressos (usados ​​para produzir um produto funcional, como uma proteína).
Estudo de genes: 
· efeito de sobre-expressão ( Aumentar a expressão do gene);
· knock-in (Introduzir algo que não pertencia ao organismo);
· knock-out (Deixa de ser expresso, retirado completamente);
· knockdown de um gene (Baixar a expressão de um gene). 
Como manipular a expressão genética?
· Manipulação de expressão em células: 
 Bactérias e levedura - Transformação (inserção de material genético dentro da célula)
Células animais - Transfecção ou transdução 
• Criação de plantas e animais transgénicos (mais complexos- necessário criar de raiz um embrião com todas as modificações necessárias)
· É mais difícil criar um animal transgénico do que uma bactéria transgénica 
Para garantir que as modificações genéticas desejadas estejam presentes em todas as células do organismo, incluindo as células germinativas (óvulos e espermatozoides), para que as características transgênicas sejam herdadas pelas gerações futuras.
· Para que as características transgênicas sejam herdáveis, a modificação genética deve estar presente nas células germinativas
· Modificar o embrião no estágio inicial permite que as células que darão origem aos óvulos ou espermatozoides também carreguem a modificação
· Para que um animal transgênico expresse uma característica desejada de maneira consistente e uniforme; 
· A modificação genética deve estar presente em todas as células do organismo.
· só é possível se a modificação for introduzida no embrião em estágio inicial, quando ele ainda é uma única célula ou um pequeno grupo de células. Assim, à medida que o embrião se divide e se desenvolve, todas as células resultantes conterão a modificação
Produção de proteínas e medicamentos
transgênicos são usados na biotecnologia para produzir proteínas e medicamentos de interesse humano. Para garantir uma produção eficiente e de alta qualidade, é crucial que todos os tecidos do animal possam expressar a proteína ou o medicamento, o que só é possível com uma modificação genética presente desde o início do desenvolvimento
Criação de OGM podem ser usados para novos modelos de estudo de fármacos ou de doenças ou produção de compostos nas leveduras ou bactérias ou outros organismos OGM.
Introdução de DNA ou RNA numa célula
Exemplo: sobre-expressão do gene X (detetado aqui por imunofluorescência) 
· Introduzir o gene x numas células
· Imunofluorescência- deteção de várias proteínas com recurso a anticorpos
Técnicas usadas para introduzir DNA ou RNA ou outras moléculas na célula:
· Microinjeção
· Eletrocorporação (correntes elétricas que fazem estabilizar a membrana permitindo o DNA entrar)
· Lipofecção: pequenas estruturas lipidicas que no interior têm o RNA ou DNA
· Transferência viral (transdução)
Qual é o mais eficiente?
Transfecção quando não recorremos a virus
Transdução quando recorremos a virus
	
	Transdução
	Transfecção
	Método
	Utiliza vetores virais
Os vírus são modificados para conter o gene de interesse e, uma vez que infectam a célula alvo, eles entregam o material genético diretamente no genoma da célula ou como um elemento episoma
	Utiliza métodos não virais (químicos, físicos ou biológicos)
Envolve o uso de métodos físicos (eletroporação, microinjeção), químicos (lipossomas, polímeros), ou biológicos não virais para introduzir material genético nas células.
	Eficiência
	Geralmente alta eficiência de transferência gênica e integração
	A eficiência pode variar dependendo do método e do tipo de célula, muitas vezes sendo menos eficiente em comparação com a transdução.
	Aplicabilidade 
	Preferida para terapia gênica e modificação genética estável.
É amplamente utilizada em terapia gênica, pesquisa de função gênica, e produção de proteínas recombinantes. Também é útil na criação de modelos animais transgênicos e na reprogramação celular.
	Comumente utilizada em pesquisa básica e para expressões gênicas temporárias.
 estudar a função de genes, produção de proteínas, desenvolvimento de modelos celulares, e em algumas aplicações terapêuticas.
	Definição
	Transdução é o processo de transferência de material genético para uma célula utilizando um vetor viral.
	Transfecção é o processo de introdução de material genético (DNA ou RNA) em células eucarióticas utilizando métodos não virais.
· Lipossoma que tem duas camadas bifosfolipídicas;
· Se essa estrutura for endocitada por uma célula alvo, Endossomos: Se a vesícula lipídica for endocitada por meio de endocitose provavelmente será direcionada para os endossomos. Dentro dos endossomos, o pH ácido pode desestabilizar a estrutura da vesícula lipídica, levando à liberação do ácido nucleico no citoplasma da célula.
· Reservatório onde podemos colocar ácidos nucleicos, DNA ou RNA;
· Essa técnica aproveita as propriedades dos lipídios para formar vesículas lipídicas que podem encapsular os ácidos nucleicos e transportá-los para o interior das células.
· queremos que um virus infete a célula
· Vetor viral produzido em laboratório que contém no seu genoma o gene que queremos introduzir
· Pode se colocar o plasmídeo na bactéria ou o siRNA, 
· O SiRNA, é produzido em laboratório e é o produto de degradação de RNA de cadeia dupla que é gerado na transcrição e removido nos intrões
· Quando introduzido em uma célula, o siRNA pode interferir no processo de expressão gênica, silenciando genes específicos. Isso ocorre através de um mecanismo altamente específico. O siRNA liga se a um complexo de proteínas chamado RISC (RNA-induced silencing complex), que então direciona o siRNA para o RNA mensageiro (mRNA) correspondente ao gene que se deseja silenciar. O RISC então cliva o mRNA, impedindo que seja traduzido em proteína, essencialmente desligando a expressão do gene alvo.
· A enzima que processa moléculas de siRNA (small interfering RNA) para as suas formas maduras é chamada de Dicer. Dicer é uma ribonuclease do tipo III, uma classe de enzimas envolvidas no processamento de RNA.
Terapia genética: CAR-T (exemplo) 
Este sistema serve para eliminar cancros líquidos (linfomas, leucemias…). Ao individuo que tem o tumor, é feita uma extração de células T. Em laboratório, colocamos os linfócitos T do paciente a expressar um recetor, ou seja, estamos a fazer um Knoch in (adicionar um gene que não estava lá), e este recetor liga-se especificamente às células tumorais
· Para fazer um rato knock out- é necessário começar pelo ovo para garantir que todas as células são modificadas
Etapas:
1. 
2. Injeção do DNA clonado em um óvulo fertilizado 2. ovos de ratinhos fertilizados são mantidos sob sucção na ponta de uma pipeta e o transgene é microinjetado nos pró-núcleos com uma agulha fina 3. O transgene integra o DNA cromossomal dos pró-nucleos e é passado para os ovos das células filhas 4. Os ovos são na trompa das fêmeas para futura gestação.
 Os ratinhos KO são usados para determinar a função de genes específicos. Ao comparar ratinhos com um gene inativado com ratinhos normais, os cientistas podem identificar quais características ou processos biológicos são afetados pela ausência desse gene ou se são frequentemente usados para modelar doenças humanas. Inativando genes conhecidos por estar associados a certas doenças, os pesquisadores podem criar modelos de animais que replicam características-chave dessas doenças. Isso permite o estudo dos mecanismos subjacentes à doença e o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.
 
	Características
	Ratinhos transgénicos
	Ratinhos knockout
	Células que recebem o DNA
	Zigoto
	Células embrionáriasSignificado 
	Microinjeção no zigoto e implantação na mãe adotiva 
	Transferência das células embrionárias para o blastocisto e implantação na mãe adotiva
	resultado
	Ganho de um gene
	Perda de um gene
Análise de expressão génica 
Podemos fazer a análise da expressão de um gene, de forma muito genérica, de duas maneiras diferentes: ou analisamos o mRNA que é produzido ou então a proteína que é produzida. 
 
Microarrays de cDNA 
RNA é difícil de sequenciar, então durante muito tempo, o que havia à disposição para ver o nível de expressão global (um conjunto de mRNA) havia um chip. Dentro do chip existe uma lâmina de vidro na qual foi impressa com gotas de DNA complementar a cada um dos mRNA conhecidos da célula. 
Era necessário um chip diferente para cada modelo diferente (leveduras, bactéria ...). 
· Isola-se o mRNA de duas amostras diferentes 
· Converte-se o mRNA a cDNA com a transcriptase reversa 
· Introduz-se nucleótidos com fluorescência 
· Mistura-se 
· Coloca-se em cima do chip 
A cor revelada pelo DNA demonstra onde é que o mesmo é expresso. 
· Bom para estudos de base – grandes screens (grande número de mRNAs ao mesmo tempo). 
Necessário usar réplicas (caro) 
· Permite comparação entre diferentes tratamentos, diferentes condições, diferenciação celular, etc. 
· Começa a ser usado em previsão de resposta a tratamento (medicina personalizada) 
· Cada resultado novo requer muitas vezes validação por qPCR, Western blot, etc. 
· CRISPR/Cas9 é uma tecnologia revolucionária de edição de genes que permite aos cientistas fazer alterações precisas no DNA de um organismo
· O Cas9 é uma enzima que age como um par de tesouras moleculares, capaz de cortar o DNA em locais específicos ditados pelo RNA guia (gRNA)
 
Terapia genética: CAR-T (exemplo) 
Este sistema serve para eliminar cancros líquidos (linfomas, leucemias…). Ao individuo que tem o tumor, é feita uma extração de células T. Em laboratório, colocamos os linfócitos T do paciente a expressar um recetor, ou seja, estamos a fazer um Knoch in (adicionar um gene que não estava lá), e este recetor liga-se especificamente às células tumorais. 
As células T, são linfócitos T citotóxicos e quando elas fazem esta ligação, vão induzir a morte celular da célula tumoral. 
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