02 aula western blot pptx (3)

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<p>Michelle Melgarejo da Rosa</p><p>michelle.rosa@ufpe.br</p><p>2024</p><p>Western Blot</p><p>Técnica usa 3</p><p>conceitos: 1) Separar</p><p>proteínas por tamanho;</p><p>2) Transferência de</p><p>proteínas para</p><p>membranas; 3)</p><p>Marcação de proteínas</p><p>seletivas com</p><p>anticorpos</p><p>- Confirmação de doenças</p><p>(HIV, hepatite B,</p><p>Leyme….);</p><p>- Pesquisas científicas</p><p>- Análise forense</p><p>- Verificar silenciamento</p><p>de proteínas;</p><p>- Expressão pós</p><p>clonagem...</p><p>APLICAÇÕES</p><p>Western blot</p><p>https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/</p><p>Preparação de</p><p>amostras</p><p>Primeira parte</p><p>Preparação das amostras</p><p>• Homogeneização mecânica</p><p>• Homogeneização ultrassônica</p><p>(Sonicador)</p><p>• Lise de proteínas - detergentes</p><p>- Triton X-100</p><p>- Tween 80</p><p>- Nonidet P-40 (NP-40)</p><p>Amostras de tecido ou células</p><p>https://www.slideshare.net/kantidio/estrategias-purificacao-analises-protenas</p><p>https://www.slideshare.net/kantidio/estrategias-purificacao-analises-protenas</p><p>Quantificação de Proteínas</p><p>● Método de Bradford/Lowry</p><p>● Ensaio colorimétrico baseado em uma mudança de absorbância do</p><p>corante Coomassie Brilliant Blue G-250 - liga-se às proteínas ou</p><p>reação com cobre.</p><p>● Absorbância em 595/660 nm.</p><p>● *blank/controle</p><p>● https://www.youtube.com/watch?v=7o65va089S4</p><p>● https://www.youtube.com/watch?v=VewHJNiqom4</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=7o65va089S4</p><p>Eletroforese</p><p>Segunda parte</p><p>Eletroforese</p><p>- Proteínas quantificadas são expostas/desnaturadas e negativamente</p><p>carregado por inserção de detergentes na amostras - loading buffer</p><p>- Loading Buffer: SDS - Sódio dodecil sulfato, beta mercaptoethanol,</p><p>bromophenol blue, glicerol</p><p>- Proteínas + loading buffer são colocadas em banho maria a 95 graus para</p><p>quebra de conformações e linearização das moléculas</p><p>- A mesma concentração de proteínas por amostra é pipetada em gel de</p><p>poliacrilamida</p><p>- https://www.youtube.com/watch?v=OkH8u84t84M</p><p>Eletroforese - gel de poliacrilamida</p><p>-</p><p>Dentro del tanque se coloca de</p><p>100 -200 mL de buffer</p><p>Tris-Gly-SDS.</p><p>Composição gel: bis/acrilamida 1:29; Tris/EDTA 10 X;</p><p>TEMED 1%; APS 10%</p><p>**Voltagem seletiva para corrida</p><p>Eletroforese-</p><p>- O processo envolve migração de proteínas do eletrodo negativo para</p><p>o positivo</p><p>- Separação por peso molecular</p><p>- Proteínas maiores ficam mais retidas</p><p>- Necessário marcador de peso molecular</p><p>Eletroforese - erros no processo</p><p>Blotting/</p><p>Transferência</p><p>para membrana</p><p>de nitrocelulose</p><p>Terceira parte</p><p>Blotting</p><p>https://www.bio-rad.com/pt-br/applications-technologies/western-blotting-transfer-techniques?ID=PQEEOP70KWE7</p><p>- Transferência de proteínas do gel para membrana</p><p>de nitrocelulose (não reativa), onde o anticorpo é</p><p>capaz de se ligar</p><p>- Membrana não distingue proteínas</p><p>Blotting</p><p>https://www.bio-rad.com/pt-br/applications-technologies/western-blotting-transfer-techniques?ID=PQEEOP70KWE7</p><p>Bloqueio de</p><p>proteínas</p><p>inespecíficas</p><p>continuação do blotting</p><p>Bloqueio de proteínas inespecíficas</p><p>- Uma grande quantidade de proteínas indesejáveis ligam-se fortemente à</p><p>nitrocelulose em diferentes condições experimentais</p><p>- A solução mais utilizada para bloqueio dessas ligações é leite desnatado e BSA</p><p>- Isso reduz o ruído no produto final do WB, tornando os resultados mais claros e</p><p>eliminando falso-positivos</p><p>- Lavagens sucessivas para eliminar background - buffer com substância de bloqueio</p><p>também</p><p>Anticorpo</p><p>primário</p><p>Quarta parte</p><p>Anticorpo Primário</p><p>- Se liga especificamente na proteína de interesse</p><p>- Em tampão com substância de bloqueio</p><p>- Lavagens sucessivas após 3- 12 horas de incubação</p><p>Anticorpo</p><p>Secundário</p><p>Quinta parte</p><p>Anticorpo Secundário</p><p>Anticorpo Secundário</p><p>Anticorpos</p><p>• Anticorpos (monoclonais ou policlonais) são utilizados para</p><p>detectar uma proteína (antígeno ou epítopo) específica</p><p>• Posteriormente, esta reação antígeno/ anticorpo primário será</p><p>exposta a um anticorpo secundário direcionado à porções</p><p>espécie-específicas do anticorpo primário</p><p>• Normalmente, o anticorpo secundário está ligado à uma enzima</p><p>reveladora - HRP que gera uma mudança de coloração ou um</p><p>sinal fotométrico, quando inserido um substrato específico</p><p>Detecção</p><p>Sexta parte</p><p>Detecção</p><p>https://kasvi.com.br/western-blotting-analise-proteinas/</p><p>ChemiDoc</p><p>https://kasvi.com.br/western-blotting-analise-proteinas/</p><p>Análise de bandas</p><p>● A imagem é analisada por densitometria, a qual avalia a</p><p>quantidade de proteína colorida e quantifica os resultados em</p><p>termos de intensidade óptica</p><p>https://www.jove.com/t/52099?language=Portuguese</p><p>Densitometria mede a densidade de proteínas na amostra (o quão intensa é a banda)</p><p>https://www.jove.com/t/52099?language=Portuguese</p><p>Exemplos</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=46NnUeewmbM</p><p>Pontos Relevantes:</p><p>1. De onde vem as proteínas?</p><p>2. Como se obtém as proteínas a serem analisadas?</p><p>3. Qualquer concentração de proteína é necessária para a técnica?</p><p>4. Finalidade da técnica?</p><p>5. Como ocorre a análise inicial que a proteína de interesse é a que</p><p>está expressada?</p><p>6. Porque as proteínas são transportadas ou plotadas em uma</p><p>membrana de nitrocelulose?</p><p>7. Qual o objetivo do anticorpo primário?</p><p>8. Qual o objetivo do anticorpo secundário?</p><p>9. Como as proteínas de interesse são visualizadas?</p><p>10. Em que tipo de experimento você usaria western blot?</p><p>Ref</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=OkH8u84t84M</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=qT_AqI-MKJc</p><p>https://www.bio-rad.com/pt-br/applications-technologies/western-blotting-transfer-techniques?ID=PQEEOP7</p><p>0KWE7</p><p>https://www.analiticaweb.com.br/p.php?tit=anticorpos-secundarios-e-sistemas-de-deteccao&Bid=p614b4eab</p><p>8c98e</p><p>https://kasvi.com.br/western-blotting-analise-proteinas/</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=Y-sl523tDEE</p><p>https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-</p><p>biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-western-blotting.html#:~:text=pH%207%2C5-,Antic</p><p>orpos%20prim%C3%A1rios%20e%20secund%C3%A1rios,dom%C3%ADnio%20SH2%20ou%20tirosina%2</p><p>0fosforilada).</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=OkH8u84t84M</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=qT_AqI-MKJc</p><p>https://www.analiticaweb.com.br/p.php?tit=anticorpos-secundarios-e-sistemas-de-deteccao&Bid=p614b4eab8c98e</p><p>https://www.analiticaweb.com.br/p.php?tit=anticorpos-secundarios-e-sistemas-de-deteccao&Bid=p614b4eab8c98e</p><p>https://kasvi.com.br/western-blotting-analise-proteinas/</p><p>https://www.youtube.com/watch?v=Y-sl523tDEE</p><p>https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-western-blotting.html#:~:text=pH%207%2C5-,Anticorpos%20prim%C3%A1rios%20e%20secund%C3%A1rios,dom%C3%ADnio%20SH2%20ou%20tirosina%20fosforilada</p><p>https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-western-blotting.html#:~:text=pH%207%2C5-,Anticorpos%20prim%C3%A1rios%20e%20secund%C3%A1rios,dom%C3%ADnio%20SH2%20ou%20tirosina%20fosforilada</p><p>https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-western-blotting.html#:~:text=pH%207%2C5-,Anticorpos%20prim%C3%A1rios%20e%20secund%C3%A1rios,dom%C3%ADnio%20SH2%20ou%20tirosina%20fosforilada</p><p>https://www.thermofisher.com/br/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/overview-western-blotting.html#:~:text=pH%207%2C5-,Anticorpos%20prim%C3%A1rios%20e%20secund%C3%A1rios,dom%C3%ADnio%20SH2%20ou%20tirosina%20fosforilada</p><p>Obrigada!</p>