Biologia Molecular Material AVA

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<p>ISBN 978-65-5821-027-6</p><p>9 7 8 6 5 5 8 2 1 0 2 7 6</p><p>Código Logístico</p><p>59877</p><p>MARIA CAROLINA VIEIRA DA ROCHAMARIA CAROLINA VIEIRA DA ROCHA</p><p>BIOLOGIA MOLECULAR</p><p>Biologia Molecular</p><p>Maria Carolina Vieira da Rocha</p><p>IESDE BRASIL</p><p>2021</p><p>© 2021 – IESDE BRASIL S/A.</p><p>É proibida a reprodução, mesmo parcial, por qualquer processo, sem autorização por escrito da autora e do</p><p>detentor dos direitos autorais.</p><p>Projeto de capa: IESDE BRASIL S/A. Imagem da capa:Anusorn Nakdee/Shutterstock</p><p>Todos os direitos reservados.</p><p>IESDE BRASIL S/A.</p><p>Al. Dr. Carlos de Carvalho, 1.482. CEP: 80730-200</p><p>Batel – Curitiba – PR</p><p>0800 708 88 88 – www.iesde.com.br</p><p>CIP-BRASIL. CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO</p><p>SINDICATO NACIONAL DOS EDITORES DE LIVROS, RJ</p><p>R574b</p><p>Rocha, Maria Carolina Vieira da</p><p>Biologia molecular / Maria Carolina Vieira da Rocha. - 1. ed. - Curitiba</p><p>[PR] : Iesde, 2021.</p><p>100 p. : il.</p><p>Inclui bibliografia</p><p>ISBN 978-65-5821-027-6</p><p>1. Biologia molecular. 2. Genética molecular. 3. DNA. I. Título.</p><p>21-70827 CDD: 572.8</p><p>CDU: 576</p><p>Maria Carolina Vieira</p><p>da Rocha</p><p>Doutora e mestre em Engenharia de Recursos Hídricos</p><p>e Ambiental pela Universidade Federal do Paraná</p><p>(UFPR). Especialista em Perícia Criminal pela Faculdade</p><p>de Ciências Gerenciais da Bahia. Graduada em</p><p>Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia pela UFPR</p><p>e em Ciências Biológicas pela Universidade Positivo</p><p>(UP). Coordenadora e professora no ensino superior,</p><p>dos cursos de Engenharia de Produção e Engenharia</p><p>Ambiental. Atua em pesquisas com ênfase em</p><p>microbiologia e parasitologia ambiental e em biologia</p><p>molecular aplicada ao saneamento.</p><p>SUMÁRIO</p><p>Agora é possível acessar os vídeos do livro por</p><p>meio de QR codes (códigos de barras) presentes</p><p>no início de cada seção de capítulo.</p><p>Acesse os vídeos automaticamente, direcionando</p><p>a câmera fotográ�ca de seu smartphone ou tablet</p><p>para o QR code.</p><p>Em alguns dispositivos é necessário ter instalado</p><p>um leitor de QR code, que pode ser adquirido</p><p>gratuitamente em lojas de aplicativos.</p><p>Vídeos</p><p>em QR code!</p><p>SUMÁRIO</p><p>Agora é possível acessar os vídeos do livro por</p><p>meio de QR codes (códigos de barras) presentes</p><p>no início de cada seção de capítulo.</p><p>Acesse os vídeos automaticamente, direcionando</p><p>a câmera fotográ�ca de seu smartphone ou tablet</p><p>para o QR code.</p><p>Em alguns dispositivos é necessário ter instalado</p><p>um leitor de QR code, que pode ser adquirido</p><p>gratuitamente em lojas de aplicativos.</p><p>Vídeos</p><p>em QR code!</p><p>1 Introdução à Biologia Molecular 9</p><p>1.1 Histórico da Biologia Molecular 9</p><p>1.2 Genética molecular versus genética clássica 16</p><p>1.3 Conhecendo a Biologia Molecular 19</p><p>2 Genética molecular 23</p><p>2.1 A molécula de DNA 23</p><p>2.2 Estrutura e função do RNA 35</p><p>2.3 Cromossomos: empacotando o DNA 37</p><p>3 Compreendendo os genes e os genomas 40</p><p>3.1 Dogma central 40</p><p>3.2 Genes e mecanismos de regulação 54</p><p>3.3 Análise de genomas 57</p><p>4 Tecnologias de DNA: solucionando mistérios 62</p><p>4.1 A Revolução da PCR 62</p><p>4.2 O que é um marcador molecular? 71</p><p>4.3 Testes de Identificação Humana 76</p><p>4.4 A PCR e a evolução forense 78</p><p>5 Ciência 4.0: a nova revolução industrial 81</p><p>5.1 A nova indústria: a revolução 4.0 81</p><p>5.2 Tecnologias moleculares 86</p><p>5.3 A inovação com base na pesquisa científica: a técnica CRISPR/</p><p>Cas9 93</p><p>6 Gabarito 98</p><p>Os mistérios por trás de nossa hereditariedade sempre</p><p>fascinaram a humanidade. Afinal, como é possível que</p><p>determinadas características sejam transmitidas por gerações?</p><p>Como algumas espécies e proles podem ser mais adaptadas a</p><p>um ambiente do que outras? Qual é o mecanismo que faz com</p><p>que uma doença acometa um filho e não outro?</p><p>No início do século XX, esses aparentes mistérios foram</p><p>aos poucos sendo desvendados: inicialmente com os estudos</p><p>mendelianos, que fundaram a genética clássica, e posteriormente,</p><p>com a ciência das moléculas da hereditariedade – a Biologia</p><p>Molecular.</p><p>A descoberta do DNA e sua imensa capacidade de armazenar</p><p>informações rompeu barreiras e começamos a questionar até</p><p>para onde conseguiríamos ir em busca de nossa identidade. De</p><p>fato, temos avançado rapidamente, conceitos que antes pareciam</p><p>sair de um filme de ficção científica – como a edição de genes e a</p><p>clonagem molecular – hoje são realidade e têm auxiliado na cura</p><p>de inúmeras doenças e no aumento de nosso bem-estar.</p><p>Assim, esta obra tem como objetivo apresentar o histórico,</p><p>os princípios e as práticas que regem a Biologia Molecular. No</p><p>Capítulo 1, conheceremos a história dessa ciência e a verdadeira</p><p>corrida científica realizada para elucidar os mecanismos da</p><p>hereditariedade. Na sequência, no Capítulo 2, discutiremos a</p><p>molécula do DNA e os atributos que a tornam responsável pela</p><p>transmissão das características nos organismos. O Capítulo 3,</p><p>por sua vez, aborda os processos moleculares e a síntese das</p><p>principais responsáveis pela cor de nossos olhos ou pelo formato</p><p>do nosso nariz: as proteínas. O Capítulo 4 trata das aplicações</p><p>práticas que o desenvolvimento da técnica da Reação em Cadeia</p><p>da Polimerase (PCR) trouxe à Biologia Molecular, notadamente na</p><p>identificação humana e nas ciências forenses. Por fim, o Capítulo</p><p>5 apresenta a nova Indústria 4.0 do ponto de vista biomolecular:</p><p>como as novas técnicas utilizadas no estudo dos genes têm</p><p>APRESENTAÇÃO</p><p>Vídeo</p><p>revolucionado tudo o que sabíamos sobre a Medicina e o desenvolvimento de</p><p>processos e produtos.</p><p>Podemos afirmar, de fato, que a Biologia Molecular é a ciência da vida; seus</p><p>processos regem as características de cada indivíduo no planeta. As pesquisas</p><p>e os estudos nessa área, portanto, são fundamentais para entendermos como</p><p>funciona o ser humano e como podemos melhorar a qualidade de vida desta</p><p>e das futuras gerações.</p><p>Introdução à Biologia Molecular 9</p><p>1</p><p>Introdução à Biologia Molecular</p><p>Quando você ouve o termo Biologia Molecular, o que vem à</p><p>sua mente? Cientistas desvendando o DNA humano? Clonagem?</p><p>Transgênicos? Sim, tudo isso faz parte do universo dessa ciência,</p><p>mas ela é muito mais do que isso e está bem mais perto do que</p><p>imaginamos.</p><p>Desde uma simples cebola até o complexo ser humano, todos</p><p>os seres vivos são dotados de um maquinário que conduz perfei-</p><p>tamente o funcionamento dos organismos. Nessa orquestra, o</p><p>maestro é uma molécula que nos torna únicos (e com característi-</p><p>cas diversas de uma cebola): o DNA.</p><p>Neste capítulo, veremos um pouco sobre o histórico dessa mo-</p><p>lécula, entendendo como ela foi descoberta e como esse conhe-</p><p>cimento transformou tudo o que sabíamos sobre os seres vivos.</p><p>Também atentaremos para as diferenças entre a genética clássica</p><p>e a genética molecular, bem como para os princípios que regem</p><p>cada uma. Por fim, estudaremos os conceitos necessários para</p><p>compreender os processos biomoleculares e como eles são res-</p><p>ponsáveis pela vida como conhecemos hoje.</p><p>1.1 Histórico da Biologia Molecular</p><p>Vídeo A biologia é uma ciência tão interessante quanto extensa. De fato,</p><p>para cada ramo dela, temos uma outra ciência completa, com dogmas,</p><p>axiomas, mecanismos e processos. É muito comum que um desses ra-</p><p>mos maiores se divida e dê origem a outros mais específicos, à medida</p><p>que o conhecimento e a tecnologia progridem.</p><p>Foi dessa forma que a Biologia Molecular nasceu. Sendo inicialmen-</p><p>te um misto de bioquímica, genética e biofísica, a Biologia Molecular co-</p><p>meçou a ter seu próprio espaço na década de 1930, quando cientistas</p><p>descobriram uma relação direta entre os genes. Estes eram objeto de</p><p>10 Biologia Molecular</p><p>estudo da genética, com as proteínas e as enzimas,</p><p>que são abordadas extensivamente na bioquímica.</p><p>A primeira metade do século XX foi marcada</p><p>por grandes descobertas no estudo da química fi-</p><p>siológica, rebatizada posteriormente como bioquí-</p><p>mica. Foi nesse período que as macromoléculas</p><p>foram descritas e definidas como uma união de</p><p>unidades menores por meio de ligações fracas,</p><p>como ligações iônicas ou pontes de hidrogênio. Es-</p><p>tudos de Linus Carl Pauling – até hoje um dos quí-</p><p>micos de maior renome na história da ciência</p><p>– demonstraram</p><p>capítulo, vamos conhecer como o DNA está dividido em</p><p>genes, que podem ou não estar ativados em determinadas células</p><p>e diferentes indivíduos. Vamos também conhecer o conceito de</p><p>genoma e como um conjunto de genes idênticos – o genoma hu-</p><p>mano, por exemplo – é capaz de originar seres tão distintos e com</p><p>características singulares.</p><p>Iniciamos o capítulo entendendo como o DNA é transcrito em</p><p>RNA mensageiro e traduzido em produtos funcionais para a célula</p><p>– as proteínas.</p><p>3.1 Dogma central</p><p>Vídeo O fluxo de informação genética, objeto de estudo da genética mo-</p><p>lecular, percorre um caminho bem definido. Nossas características ge-</p><p>néticas encontram-se codificadas na molécula de DNA. A partir de um</p><p>trecho codificante desse DNA denominado de gene, o RNA mensageiro</p><p>é produzido com o auxílio de enzimas específicas. Após sua síntese,</p><p>esse RNA mensageiro é traduzido em proteínas, principal produto fun-</p><p>cional dos genes.</p><p>Compreendendo os genes e os genomas 41</p><p>Essa sequência, partindo do DNA e resultando em proteínas, ou po-</p><p>lipeptídeos, define o que conhecemos como o dogma central da biologia</p><p>molecular (Figura 1).</p><p>Figura 1</p><p>Dogma central da biologia molecular</p><p>Fa</p><p>nc</p><p>y T</p><p>ap</p><p>is</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Replicação /DNA → DNA/</p><p>DNA</p><p>Transcrição /DNA → RNA/</p><p>RNA</p><p>Tradução /RNA → Proteína/</p><p>Proteína</p><p>Definido por Francis Crick, em 1958, segundo Lewin (2009), o nome</p><p>dogma central se deve ao fato de que essa cadeia de processos é con-</p><p>senso em todos os organismos, desde os mais simples procariotos até</p><p>o complexo ser humano. Além disso, ela deve ocorrer apenas no senti-</p><p>do descrito, não sendo possível o caminho inverso.</p><p>Os processos constituintes do dogma central recebem nomes espe-</p><p>cíficos. Assim, ao mecanismo de codificação do DNA em um RNA men-</p><p>sageiro (mRNA), é dado o nome de transcrição; por sua vez, o processo</p><p>de decodificar esse mRNA em proteínas é chamado de tradução, os</p><p>quais veremos nos tópicos a seguir.</p><p>3.1.1 Transcrição</p><p>A transcrição é o processo de síntese de uma molécula de RNA –</p><p>definida como RNA mensageiro – a partir de um molde de DNA.</p><p>Apesar de o dogma central ser universal, a transcrição vai ocorrer</p><p>com algumas diferenças significativas entre procariotos e eucariotos.</p><p>42 Biologia Molecular</p><p>Como esse mecanismo é mais simplificado em procariotos, iremos des-</p><p>crever o processo considerando uma célula bacteriana. Na subseção</p><p>3.1.1.1 serão descritas as principais diferenças observadas na transcri-</p><p>ção de células eucariontes.</p><p>O processo de transcrição vai ocorrer em sequências específicas das</p><p>moléculas de DNA: os genes. Apesar de ter a proteína como principal</p><p>produto funcional, os genes também podem transcrever outras molé-</p><p>culas de RNA diferentes do RNA mensageiro: o RNA de transferência,</p><p>o RNA ribossomal e alguns RNAs menores, como microRNA (miRNA)</p><p>e o RNA de interferência (iRNA). Os dois primeiros são fundamentais</p><p>para o processo de tradução, auxiliando a enzima RNA polimerase na</p><p>síntese de proteínas. Os dois últimos, apesar de não codificantes, são</p><p>importantes no processo de regulação da síntese proteica, podendo</p><p>silenciar genes ou degradar mRNAs transcritos (RIELLA, 2019). As estru-</p><p>turas de algumas das moléculas de RNA encontram-se representadas</p><p>nas Figuras 2a e 2b.</p><p>Figura 2a</p><p>Representação esquemática da estrutura do tRNA</p><p>tRNA</p><p>Aminoácido</p><p>Haste</p><p>aceptora</p><p>3’</p><p>5’</p><p>Braço D</p><p>Braço T</p><p>Braço</p><p>variável</p><p>Braço</p><p>anticódon</p><p>Códon</p><p>mRNA</p><p>De</p><p>si</p><p>gn</p><p>ua</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Figura 2b</p><p>Representação esquemática do ribossomo</p><p>(formado por rRNA) e do mRNA</p><p>Ribossomo</p><p>Subunidade</p><p>maior</p><p>Subunidade menor</p><p>mRNA</p><p>De</p><p>si</p><p>gn</p><p>ua</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Compreendendo os genes e os genomas 43</p><p>O processo de transcrição vai ocorrer nas etapas: iniciação, elon-</p><p>gação e terminação. A iniciação envolve a sinalização – por cofatores</p><p>e fatores de transcrição específicos – da região de início da transcrição</p><p>(região promotora). Esse sinal é reconhecido pela enzima RNA polime-</p><p>rase (RNApol), uma enzima dependente de DNA que vai catalisar a po-</p><p>limerização da fita de RNA mensageiro (Figura 3).</p><p>Figura 3</p><p>Representação estrutural de uma molécula de RNA polimerase (amarelo), ligada ao DNA (roxo)</p><p>e sintetizando mRNA (vermelho).</p><p>Ju</p><p>an</p><p>G</p><p>ae</p><p>rtn</p><p>er</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>O principal cofator de sinalização em bactérias é o σs70. Trata-se de</p><p>uma proteína que, após ligar-se à região promotora do gene, vai sina-</p><p>lizar para a RNApol a localização do ponto de início da transcrição. A</p><p>RNApol possui um sítio de ligação específico a esse fator de transcri-</p><p>ção e, após migrar para o local indicado, irá promover o acoplamen-</p><p>44 Biologia Molecular</p><p>to ao fator, originando uma estrutura conhecida como RNA polimerase</p><p>holoenzima.</p><p>Apenas uma das fitas de DNA servirá como molde à síntese do RNA mensa-</p><p>geiro. Essa fita, que será lida no sentido 3’-5’, recebe o nome de fita molde</p><p>ou fita antissenso. Isso significa que ela é não codificante, pois servirá apenas</p><p>como modelo para gerar um RNA mensageiro que será similar à outra fita</p><p>complementar – definida como senso ou codificante (vide figura). Embora</p><p>seja uma cópia da fita senso, o RNA mensageiro vai apresentar características</p><p>distintas. Entre as principais diferenças estruturais estão a presença da base</p><p>pirimídica uracila 1 no lugar de timina e a estrutura em fita simples do RNA.</p><p>So</p><p>le</p><p>il</p><p>No</p><p>rd</p><p>ic</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>.</p><p>Assim como a timina, a uracila</p><p>se liga à adenina como base</p><p>complementar.</p><p>1</p><p>O mecanismo de ação da RNA polimerase é bastante similar àquele</p><p>da DNA polimerase, apesar de apresentarem estruturas e origens evo-</p><p>lutivas distintas. Após sua ligação ao fator de transcrição, a RNA poli-</p><p>merase catalisará a síntese do mRNA no sentido 5’- 3’, utilizando como</p><p>molde a fita antissenso (3’- 5’).</p><p>A RNA polimerase apresenta dois sítios de ligação a NTPs (nucleo-</p><p>tídeos trifosfato – ATP, GTP, UTP e CTP). O primeiro deles liga-se pre-</p><p>ferencialmente à adenina (ATP) ou à guanina (GTP) durante a fase de</p><p>iniciação. O outro, denominado de sítio de alongamento, liga-se ao pró-</p><p>ximo NTP da sequência de leitura. Aos primeiros 6 a 10 nucleotídeos</p><p>unidos na fita é dado o nome de primer ou iniciador.</p><p>Compreendendo os genes e os genomas 45</p><p>Com a formação do primer, o fator de transcrição σs70 desprende-se</p><p>da RNApol, deixando um espaço livre por onde o RNA transcrito será</p><p>liberado, conforme a polimerização avança. Durante essa etapa, um</p><p>trecho híbrido de DNA e RNA, denominado de bolha de transcrição, é</p><p>formado, com aproximadamente oito pares de bases (pb) nitrogena-</p><p>das. Com o alongamento da cadeia, essa bolha desloca-se da esquer-</p><p>da para a direita, deixando trechos pouco enovelados à montante 2</p><p>, enquanto o DNA à jusante 3 da bolha estará superenovelado. Para</p><p>manter a estrutura e estabilidade da molécula de DNA, a RNApol atua</p><p>abrindo e fechando a dupla-hélice, conforme se desloca pela fita mol-</p><p>de, auxiliada pelas enzimas topoisomerases.</p><p>O processo de transcrição demanda a presença de dois íons metá-</p><p>licos, em geral Mg2+, que se ligarão a sítios específicos da RNA polime-</p><p>rase. A principal função desses íons é auxiliar no ataque nucleofílico 4</p><p>Ataque nucleofílico, ou subs-</p><p>tituição nucleofílica, é uma</p><p>reação na qual um elemento</p><p>rico em elétrons substitui um</p><p>átomo ou molécula menos</p><p>eletrofílico.</p><p>4</p><p>responsável por incorporar novos NTPs na fita de RNA que está sendo</p><p>sintetizada. Assim, um dos íons ativará a hidroxila presente no carbono</p><p>C3 de um dos nucleotídeos; com isso, o oxigênio desse grupo torna-se</p><p>um nucleófilo e vai atacar o grupamento trifosfato de um outro nucleo-</p><p>tídeo. Uma molécula difosfato é liberada no meio (grupo abandona-</p><p>dor), sendo direcionada e estabilizada pelo outro íon metálico.</p><p>Esse ataque nucleofílico promove a ligação fosfodiéster entre o car-</p><p>bono C3 de um nucleotídeo e o C5 de outro, e a fita de RNA é sintetizada</p><p>no sentido 5’-3’. A energia necessária a esse processo é fornecida pela</p><p>hidrólise do grupamento fosfato dos nucleotídeos. A Figura 4 apresen-</p><p>ta uma representação esquemática</p><p>da etapa de elongação do RNA.</p><p>O sinal para a terminação da transcrição ocorre quando a RNA po-</p><p>limerase encontra uma região rica em adenina e timina. Isso porque</p><p>essas bases ligam-se com apenas duas ligações de hidrogênio, o que</p><p>torna as interações entre o RNA transcrito e a fita molde do DNA fracas</p><p>o suficiente para que o RNA seja liberado no meio e a RNA polimerase</p><p>se desligue do gene. É comum a ocorrência de grampos no mRNA nes-</p><p>sa etapa, uma vez livre do pareamento com o DNA molde, sequências</p><p>autocomplementares podem se ligar, formando essas estruturas se-</p><p>cundárias de conformação.</p><p>Antes da bolha de transcrição.</p><p>2</p><p>Após a bolha de transcrição.</p><p>3</p><p>46 Biologia Molecular</p><p>Figura 4</p><p>Elongação do RNA mensageiro, a partir de uma fita molde de DNA</p><p>Al</p><p>do</p><p>na</p><p>G</p><p>ris</p><p>ke</p><p>vic</p><p>ie</p><p>ne</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>.</p><p>Nucleotídeos livres</p><p>RNA polimerase</p><p>Fita de DNA</p><p>inativa</p><p>mRNA</p><p>mRNA transcrito</p><p>Modelo de fita de</p><p>DNA</p><p>A taxa de processamento da RNA polimerase é bastante alta, com</p><p>até 50 nucleotídeos adicionados à fita de RNA por segundo. Essa alta</p><p>processividade tem um preço, e a taxa de erros na transcrição é bem</p><p>maior do que aquela da replicação, principalmente pela ausência de</p><p>atividade de correção exonucleásica 3’-5’ na RNA polimerase. Já os da-</p><p>Compreendendo os genes e os genomas 47</p><p>nos resultantes dos erros de transcrição são menos prejudiciais do que</p><p>aqueles de replicação, além de se restringirem a possíveis alterações</p><p>conformacionais ou inativação do produto funcional produzido. Assim,</p><p>não haverá necessariamente consequências danosas ao organismo por</p><p>essa falha; RNAs mensageiros são bastante instáveis e serão degrada-</p><p>dos rapidamente pela célula caso não sejam funcionais. Também, por</p><p>ser um erro pontual, mesmo proteínas geradas com diferenças estru-</p><p>turais não impactarão negativamente o organismo, considerando que</p><p>serão numericamente inferiores àquelas com a correta conformação.</p><p>3.1.1.1 Transcrição em eucariotos</p><p>A transcrição de RNA em eucariotos é mais complexa do que aquela</p><p>que ocorre em procariotos, apesar de apresentarem diversos pontos</p><p>em comum em seus mecanismos. Algumas das diferenças na síntese</p><p>do RNA desses organismos são:</p><p>• Local de transcrição: a síntese de RNA de procariotos ocorre</p><p>no citoplasma, pois esses organismos não possuem um núcleo</p><p>individualizado. Em eucariotos, entretanto, que apresentam cito-</p><p>plasma compartimentalizado por membranas internas, a trans-</p><p>crição ocorrerá no interior do núcleo. Isso implica uma dinâmica</p><p>diferente na síntese proteica. Em procariotos, a transcrição e a</p><p>tradução proteica podem ocorrer concomitantemente; conforme</p><p>o mRNA é liberado da RNA polimerase, já ocorre o acoplamento</p><p>com ribossomos e a síntese de proteínas. Em eucariotos isso não</p><p>é possível, pois todo o maquinário necessário à tradução encon-</p><p>tra-se no citoplasma. Dessa forma, o mRNA mensageiro deverá</p><p>ser transportado do núcleo ao citoplasma para que a produção</p><p>de proteínas ocorra.</p><p>• Processamento de mRNA: o mRNA produzido em procariotos</p><p>não demanda nenhuma alteração posterior e encontra-se pronto</p><p>para a etapa de tradução. Em eucariotos, por sua vez, é neces-</p><p>sário um processamento pós-síntese. O transcrito primário de</p><p>mRNA de eucariotos deve ser protegido para que mantenha sua</p><p>integridade durante a transferência entre núcleo e citoplasma.</p><p>Isso implica o seu revestimento por proteínas de proteção e a</p><p>formação de uma cobertura na extremidade 5’ do mRNA, deno-</p><p>minada de cap 5 . Na extremidade 3’, é adicionada uma sequência</p><p>de resíduos de adenina, chamada de cauda poli-A, que, além de</p><p>O termo cap significa, em tra-</p><p>dução livre, capuz ou coberta</p><p>5</p><p>48 Biologia Molecular</p><p>auxiliar na proteção do mRNA, sinaliza, para a célula, a necessi-</p><p>dade de transportar essa molécula para o citoplasma. Por fim,</p><p>alguns trechos do mRNA sintetizado que não estão envolvidos na</p><p>expressão proteica são removidos por um processo denomina-</p><p>do de splicing. Esses trechos não codificadores são denominados</p><p>de íntrons e se encontram intercalados com sequências codifica-</p><p>doras – os éxons. Com a remoção dos íntrons, as sequências de</p><p>éxons podem se unir e codificar corretamente os aminoácidos da</p><p>proteína associada.</p><p>• Tempo de permanência: pelo fato de a transcrição e de a tra-</p><p>dução ocorrerem simultaneamente, o mRNA de procariotos não</p><p>necessita de um tempo de vida longo, além de geralmente per-</p><p>manecer íntegro por apenas segundos na célula. Já no caso do</p><p>mRNA eucariótico, que demanda processamento pós-síntese e</p><p>transporte intracelular, o tempo de permanência é de horas, an-</p><p>tes de ser degradado pela célula.</p><p>• RNA polimerase: apesar de atividades similares, as RNA polime-</p><p>rases de procariotos e eucariotos são distintas, e em eucariotos</p><p>apresentam diferentes funções. Em procariotos, a RNApol é uma</p><p>só, responsável pela transcrição das diferentes moléculas de RNA</p><p>mensageiro, de transferência e ribossomal. Por outro lado, em</p><p>eucariotos, diferentes tipos de RNApol irão atuar na síntese des-</p><p>sas moléculas. Assim, RNApol I irá transcrever as moléculas de</p><p>rRNA (subunidade maior); RNApol II será responsável pela síntese</p><p>do transcrito primário de mRNA, sRNA 6 e microRNA; e RNApol III</p><p>irá transcrever as moléculas de rRNA (subunidade menor) e tRNA.</p><p>• Fatores de transcrição: os eucariotos não possuem o cofator</p><p>σs70, mas apresentam outros fatores de transcrição, que podem</p><p>ser tanto ativadores quanto repressores. Alguns deles e suas</p><p>principais atividades: o TBP reconhece a sequência de um pro-</p><p>motor eucariótico (TATA box); o TFIIB recruta a RNA polimerase</p><p>para o sítio de transcrição; o TFIIF impede a ligação da RNA po-</p><p>limerase a sequências inespecíficas de DNA; e o TFIIH promove</p><p>o relaxamento do DNA no promotor, auxiliando a formação da</p><p>bolha de replicação.</p><p>Small RNA, ou pequeno RNA, é</p><p>responsável pelo silenciamento</p><p>de alguns genes.</p><p>6</p><p>Compreendendo os genes e os genomas 49</p><p>3.1.2 Tradução</p><p>Na sequência da transcrição, e no caso dos procariotos, simultanea-</p><p>mente a ela, o mRNA gerado irá codificar uma proteína. Isso significa</p><p>que, agora, ele agirá como fita molde e será lido e traduzido em se-</p><p>quências de aminoácidos específicas.</p><p>O processo de tradução é energeticamente custoso para a célula,</p><p>pois produz a segunda molécula que mais contribui em massa nos or-</p><p>ganismos, atrás apenas da água. Dessa forma, o processo vai ocorrer</p><p>utilizando um maquinário celular complexo e com o auxílio de outras</p><p>moléculas, além do mRNA.</p><p>Apesar de haver variações em relação ao tipo, tamanho e quantida-</p><p>de de moléculas, o mecanismo de tradução em procariotos e eucario-</p><p>tos é bastante similar. Ambos ocorrerão no citoplasma celular, com a</p><p>participação do retículo endoplasmático rugoso, no caso dos eucario-</p><p>tos. As principais moléculas envolvidas no processo serão o mRNA</p><p>pronto para codificação (após processamento na célula eucariótica), o</p><p>ribossomo, o tRNA e fatores enzimáticos de tradução.</p><p>O ribossomo é uma molécula formada por RNA ribossomal e proteí-</p><p>nas. Divide-se em duas subunidades – maior e menor – que apresen-</p><p>tam tamanhos distintos entre as espécies. Justamente, a capacidade de</p><p>sedimentação dessas subunidades quando submetidas à centrifuga-</p><p>ção é uma característica que permite classificar e identificar essas mo-</p><p>léculas. Utilizando a unidade Svedberg (S), que se refere à sua</p><p>taxa de sedimentação, os ribossomos procariotos apresen-</p><p>tam a subunidade maior 50S e a menor 30S. No caso de</p><p>eucariotos, há a subunidade 60S (dividida nos RNA ribos-</p><p>somais 28S, 5.8S e 5S) e 40S (com RNA ribossomal 18S). A</p><p>Figura 5 apresenta uma representação esquemática de</p><p>um ribossomo procarioto.</p><p>Figura 5</p><p>Subunidade menor (30S,</p><p>em azul) do ribossomo da</p><p>bactéria Thermus thermo-</p><p>philus, com três moléculas</p><p>de tRNA acopladas (alto</p><p>da imagem) e proteínas</p><p>ribossomais.</p><p>Vo</p><p>lo</p><p>dy</p><p>m</p><p>yr</p><p>D</p><p>vo</p><p>rn</p><p>yk</p><p>/</p><p>Sh</p><p>ut</p><p>te</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>50 Biologia Molecular</p><p>A função das moléculas envolvidas na tradução é, a partir das se-</p><p>quências dos nucleotídeos, produzir uma determinada sequência de</p><p>aminoácidos.</p><p>Isso é possível graças ao código genético, que permi-</p><p>te que as células reconheçam, para cada três bases nitrogenadas, um</p><p>aminoácido correspondente. A Figura 6 apresenta a estrutura e o nome</p><p>de 22 aminoácidos produzidos durante a etapa de tradução.</p><p>Figura 6</p><p>Nome e estrutura dos aminoácidos conhecidos</p><p>Glicina Alanina Valina</p><p>Leucina Isoleucina</p><p>Fenilalanina Tirosina</p><p>Triptofano</p><p>Lisina Arginina</p><p>Histidina Ácido aspárgico</p><p>Ácido glutâmico Asparagina Glutamina Cisteína Metionina</p><p>Serina Treonina</p><p>Prolina</p><p>Hidroxiprolina Hidroxilisina</p><p>ch</p><p>ro</p><p>m</p><p>at</p><p>os</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>hidrogênio carbono nitrogênio oxigênio enxofre</p><p>Compreendendo os genes e os genomas 51</p><p>No código genético, cada sequência de três nucleotídeos codifica</p><p>para um aminoácido. Essa sequência tripla é chamada de códon. Algu-</p><p>mas características importantes do código genético são:</p><p>• Universalidade: o código genético é o mesmo para todas as es-</p><p>pécies, sejam elas procariotas ou eucariotas.</p><p>• Redundância: dada a quantidade de bases nitrogenadas, seu ar-</p><p>ranjo três a três resultaria em 64 combinações. Entretanto, há</p><p>apenas 22 aminoácidos conhecidos, o que significa que o código</p><p>genético é redundante, isto é, mais de um códon pode codificar</p><p>para o mesmo aminoácido.</p><p>• Não ambiguidade: apesar de os aminoácidos poderem ser de-</p><p>finidos por mais de um códon, o contrário não é verdadeiro. De-</p><p>terminado códon vai estar relacionado a apenas um aminoácido.</p><p>Na Figura 7 são apresentados os códons e seus respectivos ami-</p><p>noácidos. Note que há códons que vão sinalizar o término da tradu-</p><p>ção (UAA, UAG e UGA) e aminoácidos definidos por mais de um códon,</p><p>como a Leucina (CUU, CUC, CUA, CUG, UUA e UAG).</p><p>Figura 7</p><p>Códons de nucleotídeos e seus respectivos aminoácidos</p><p>Segunda letra</p><p>Pr</p><p>im</p><p>ei</p><p>ra</p><p>le</p><p>tr</p><p>a Terceira letra</p><p>U C A G</p><p>U</p><p>UUU</p><p>UUC</p><p>UUA</p><p>UUG</p><p>Phe</p><p>Leu</p><p>UCU</p><p>UCC</p><p>UCA</p><p>UCG</p><p>Ser</p><p>UAU</p><p>UAC</p><p>UAA</p><p>UAG</p><p>Tyr</p><p>Stop</p><p>Stop</p><p>UGU</p><p>UGC</p><p>UGA</p><p>UGG</p><p>Cys</p><p>Trp</p><p>Stop</p><p>U</p><p>C</p><p>A</p><p>G</p><p>C</p><p>CUU</p><p>CUC</p><p>CUA</p><p>CUG</p><p>Leu</p><p>CCU</p><p>CCC</p><p>CCA</p><p>CCG</p><p>Pro</p><p>CAU</p><p>CAC</p><p>CAA</p><p>CAG</p><p>His</p><p>Gin</p><p>CGU</p><p>CGC</p><p>CGA</p><p>CGG</p><p>Arg</p><p>U</p><p>C</p><p>A</p><p>G</p><p>A</p><p>AUU</p><p>AUC</p><p>AUA</p><p>AUG</p><p>lle</p><p>Met</p><p>ACU</p><p>ACC</p><p>ACA</p><p>ACG</p><p>Thr</p><p>AAU</p><p>AAC</p><p>AAA</p><p>AAG</p><p>Asn</p><p>Lys</p><p>AGU</p><p>AGC</p><p>AGA</p><p>AGG</p><p>Ser</p><p>Arg</p><p>U</p><p>C</p><p>A</p><p>G</p><p>G</p><p>GUU</p><p>GUC</p><p>GUA</p><p>GUG</p><p>Val</p><p>GCU</p><p>GCC</p><p>GCA</p><p>GCG</p><p>Ala</p><p>GAU</p><p>GAC</p><p>GAA</p><p>GAG</p><p>Asp</p><p>Glu</p><p>GGU</p><p>GGC</p><p>GGA</p><p>GGG</p><p>Gly</p><p>U</p><p>C</p><p>A</p><p>G</p><p>52 Biologia Molecular</p><p>Assim como a transcrição, a tradução pode ser dividida em três eta-</p><p>pas: iniciação, elongação e terminação. Como realizado com a trans-</p><p>crição na seção 3.1.1, iremos apresentar a tradução em uma célula</p><p>procariótica, comentando as diferenças desse mecanismo observadas</p><p>em eucariotos.</p><p>A tradução tem início quando um tRNA reconhece um códon no</p><p>mRNA. A ligação inicial do tRNA envia um sinal para o ribossomo, que</p><p>migra para esse complexo mRNA-tRNA, unindo suas subunidades. Um</p><p>segundo tRNA é recrutado, contendo o aminoácido referente ao próxi-</p><p>mo códon da sequência de mRNA.</p><p>O tRNA apresenta uma conformação única, que lhe permite reconhecer o códon rela-</p><p>cionado ao aminoácido que ele carrega. Isso porque cada tRNA contém um conjunto</p><p>de três nucleotídeos chamado de anticódon, que reconhecerá e realizará o pareamento</p><p>com o mRNA. Em sua outra extremidade, o tRNA carrega o aminoácido correspondente</p><p>ao códon de ligação.</p><p>Em</p><p>re</p><p>T</p><p>er</p><p>im</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>O ribossomo apresenta três sítios de ligação com o RNA de trans-</p><p>ferência: A, P e E. Após a ligação com os primeiros tRNA, o sítio A rece-</p><p>berá um novo tRNA, que irá parear com seu respectivo códon no RNA</p><p>mensageiro. Na sequência, esse tRNA de entrada migra para o sítio P,</p><p>promovendo uma ligação peptídica com o aminoácido da cadeia poli-</p><p>peptídica sendo sintetizada (que teve início com os dois tRNA da fase</p><p>Compreendendo os genes e os genomas 53</p><p>de iniciação), enquanto um próximo tRNA ocupará o sítio A. O tRNA do</p><p>sítio P migra, então, para o sítio E, e é liberado do complexo de tradu-</p><p>ção, estando livre para transportar outros aminoácidos.</p><p>Simultaneamente à saída desse tRNA, os demais tRNA ligados tam-</p><p>bém realizam uma migração: do sítio P para o sítio E, do sítio A para o</p><p>sítio P, e uma nova entrada de tRNA no sítio A. Essa sequência termina-</p><p>rá quando o mRNA apresentar um códon de término. Quando esse có-</p><p>don é reconhecido, a cadeia polipeptídica é liberada e as subunidades</p><p>do ribossomo são dissociadas, abandonando o mRNA. Esse, por sua</p><p>vez, é degradado posteriormente pela célula e seus nucleotídeos são</p><p>reaproveitados para os processos de replicação e transcrição. A Figura</p><p>8 apresenta um resumo esquemático das etapas da tradução.</p><p>Figura 8</p><p>Tradução de mRNA em uma cadeia polipeptídica</p><p>De</p><p>si</p><p>gn</p><p>ua</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Sítio</p><p>Proteína sendo sintetizada</p><p>Subunidade maior</p><p>Aminoácido</p><p>tRNA</p><p>mRNA</p><p>Subunidade menor</p><p>O processo de tradução garante a produção de proteínas neces-</p><p>sárias à manutenção e atividades celulares, e muitas patologias estão</p><p>relacionadas à falha em algum ponto nesse processo (SCHEPER et al.,</p><p>2007). Entretanto, nem todos os RNA transcritos a partir do DNA molde</p><p>se destinam à produção proteica, e muitos têm funções diversas, mas</p><p>tão importantes quanto as proteínas. É o caso, por exemplo, do RNA ri-</p><p>bossomal, responsável pela estrutura dos ribossomos e os microRNAs,</p><p>essenciais em mecanismos de regulação gênica.</p><p>O livro Código de Deus</p><p>traz uma abordagem</p><p>interessante ao relacio-</p><p>nar o código genético</p><p>dos seres vivos a uma</p><p>possível mensagem</p><p>divina codificada. Os</p><p>anos de estudos do</p><p>pesquisador sobre o</p><p>tema tornam essa obra</p><p>uma oportunidade de</p><p>reflexão sobre a relação</p><p>entre Deus, o homem e</p><p>a genética.</p><p>BRADEN, G. São Paulo: Cultrix,</p><p>2011.</p><p>Livro</p><p>AP</p><p>E</p><p>54 Biologia Molecular</p><p>3.2 Genes e mecanismos de regulação</p><p>Vídeo Genes são as sequências transcritas de DNA que codificam para</p><p>um produto funcional – seja ele uma proteína ou uma molécula de</p><p>RNA. Em uma célula, apenas alguns genes serão transcritos, de acordo</p><p>com a sua necessidade. No começo do capítulo, questionamos como</p><p>células contendo o mesmo material genético podem ser tão diferen-</p><p>tes. Uma célula será diferente da outra não pelo seu DNA, mas sim</p><p>pelos genes que estão sendo transcritos. Nesse caso, é fundamental</p><p>que os processos de transcrição e/ou síntese proteica sejam bem re-</p><p>gulados, permitindo a expressão apenas de proteínas demandadas</p><p>para determinada célula.</p><p>3.2.1 Regulação gênica</p><p>O processo de manter alguns genes ativos, enquanto outros são</p><p>“desligados”, é chamado de regulação gênica. Ele é extremamente ne-</p><p>cessário para a especialização celular – tornando diferentes as células</p><p>do fígado, do cérebro e da pele, por exemplo –, mas também é impor-</p><p>tante quando fatores ambientais exigem mais ou menos de determi-</p><p>nada proteína. Como exemplo, organismos unicelulares precisam se</p><p>adaptar rapidamente a mudanças de temperatura, demandando pro-</p><p>teínas que auxiliem nas atividades sob essas condições atípicas.</p><p>A regulação gênica é extremamente importante; falhas nesse meca-</p><p>nismo podem ser imensamente danosas às células, gerando patologias</p><p>como o câncer. O processo regulatório poderá ocorrer em diferentes</p><p>etapas da produção da proteína em eucariotos. Em procariotos, entre-</p><p>tanto, a regulação será basicamente a nível transcricional. Isso porque</p><p>o mRNA desses organismos não demanda processamento posterior à</p><p>sua síntese, além de ser traduzido antes mesmo de ser liberado pela</p><p>RNA polimerase.</p><p>Um dos primeiros sistemas de regulação estudados foi o operon lac,</p><p>em Escherichia coli. Um operon é um conjunto de genes com funções</p><p>relacionadas, que se encontra posicionado sequencialmente no DNA,</p><p>compartilhando o mesmo promotor e o mesmo regulador. No caso do</p><p>operon lac, os genes são responsáveis pelo processamento e metabo-</p><p>lização da lactose como fonte de nutrição da E. coli. Quando não há</p><p>lactose no meio, esses genes são silenciados pela ação de uma proteí-</p><p>Compreendendo os genes e os genomas 55</p><p>na bloqueadora, que vai se ligar em uma região posicionada entre o</p><p>promotor e os genes. Quando a lactose está presente, um</p><p>subproduto</p><p>da sua metabolização liga-se com a proteína bloqueadora (agente indu-</p><p>tor), impossibilitando o bloqueio da transcrição do operon, que ocorre</p><p>normalmente (Figura 9).</p><p>Figura 9</p><p>Regulação gênica do operon lac em Escherichia coli</p><p>M</p><p>el</p><p>et</p><p>io</p><p>s</p><p>Ve</p><p>rra</p><p>s/</p><p>Sh</p><p>ut</p><p>te</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>RNA</p><p>polimerase Operon lac: DESLIGADO</p><p>Ausência de indutor</p><p>Transcrição está bloqueada</p><p>Repressor ativo</p><p>Presença do indutor</p><p>Operon lac: LIGADO</p><p>RNA</p><p>polimerase Transcrição ocorre</p><p>Repressor</p><p>ativo</p><p>Indutor Repressor</p><p>inativo</p><p>lacZ: gene para β-galactosidase</p><p>lacY: gene para permease</p><p>lacA: gene para transacetilase</p><p>Em eucariotos, cujos processos de transcrição e tradução são mais</p><p>complexos e encontram-se fisicamente separados no interior da célula,</p><p>existem diversos níveis de regulação gênica. Nesses casos, a regula-</p><p>ção pode ocorrer em diferentes níveis. A nível epigenético, acontece</p><p>mediante interferências na conformação do DNA por nucleossomas,</p><p>tornando-o mais espiralado ou relaxado, o que interfere na ligação dos</p><p>fatores de transcrição e, consequentemente, na sinalização para a RNA</p><p>polimerase. Na Figura 10 é apresentada uma representação esquemá-</p><p>tica da regulação epigenética.</p><p>56 Biologia Molecular</p><p>Figura10</p><p>Regulação epigenética mediada por nucleossomas</p><p>M</p><p>ar</p><p>i-L</p><p>ea</p><p>f/</p><p>Sh</p><p>ut</p><p>te</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>DNA inacessível: o gene está inativo</p><p>Cromatina</p><p>Cauda de</p><p>histona</p><p>Histona</p><p>Gene</p><p>Nucleossoma</p><p>DNA acessível: o gene está ativo</p><p>Sequência de DNA</p><p>A nível transcricional, a regulação vai ocorrer de maneira similar</p><p>àquela em procariotos: bloqueadores ligando-se entre o promotor e o</p><p>gene a ser transcrito. O bloqueio interfere espacialmente na ligação da</p><p>RNA polimerase no sítio de transcrição. Um outro nível é o pós-trans-</p><p>cricional, em que a interferência no processamento do mRNA e na sua</p><p>exportação para o núcleo é o que caracteriza esse tipo de regulação.</p><p>Esses mecanismos impedem a tradução do mRNA em proteínas funcio-</p><p>nais. Com a regulação ocorrendo a nível traducional, a interferência</p><p>ocorre na produção de proteínas, na elongação da cadeia polipeptídi-</p><p>ca, por exemplo, ou no impedimento da iniciação, como a degradação</p><p>do mRNA no citoplasma. Por fim, a nível pós-traducional, a regulação</p><p>será realizada diretamente na proteína sintetizada, pela remoção de</p><p>aminoácidos ou modificação mediante adição de grupos químicos.</p><p>Em seu livro O gene: his-</p><p>tória íntima, o vencedor</p><p>do Pulitzer de 2011,</p><p>Siddharta Mukherjee,</p><p>narra como a genética</p><p>influencia nossa vida,</p><p>nosso destino e nossas</p><p>escolhas. O autor tam-</p><p>bém avalia o tema de</p><p>maneira bem próxima,</p><p>discutindo o histórico</p><p>de doenças mentais em</p><p>sua família.</p><p>MUKHERJEE, S. São Paulo:</p><p>Companhia das Letras, 2016.</p><p>Livro</p><p>Compreendendo os genes e os genomas 57</p><p>3.3 Análise de genomas</p><p>Vídeo O conjunto completo de DNA de uma célula é conhecido como ge-</p><p>noma. Em procariotos, ele se resume a uma única molécula circular</p><p>de DNA; em eucariotos, está organizado em estruturas compactas, os</p><p>cromossomos, que variam em número e tamanho, conforme a espécie.</p><p>A genômica é o estudo dos genomas completos das espécies, in-</p><p>cluindo os genes, as suas sequências de nucleotídeos e as suas inte-</p><p>rações intraespecíficas e interespecíficas. Para realizar esse estudo</p><p>genômico, são necessárias ferramentas de análise, dentre as quais se</p><p>destaca o mapeamento genético.</p><p>3.3.1 Mapeamento genético</p><p>Mapear um genoma significa indicar a localização de cada um de</p><p>seus genes. Antes do advento do sequenciamento, pesquisadores iden-</p><p>tificavam a posição de um gene e a sua distância em relação a outros</p><p>genes fazendo uso de marcadores genéticos. Esses marcadores, que</p><p>podem ser um gene, um fragmento de gene ou uma região não codifi-</p><p>cadora, funcionam como pontos de referência e, por muitas vezes, são</p><p>herdados com genes de interesse – em geral relacionados a alguma</p><p>característica – e ainda não identificados. Atualmente, o método de ma-</p><p>peamento genético evoluiu e vem utilizando técnicas mais avançadas,</p><p>como a clonagem e o sequenciamento de genes.</p><p>O sequenciamento genético, segundo Griffiths (1999), foi uma re-</p><p>volução na biologia molecular e permitiu a determinação da ordem dos</p><p>nucleotídeos em genomas completos. Assim, ficou mais rápido e exato</p><p>determinar a posição e função de um gene, assim como sua interação</p><p>com as demais sequências genômicas. Apesar de ser conhecida como</p><p>a técnica que desvendou o genoma humano, o sequenciamento tam-</p><p>bém pode ser utilizado para determinar regiões menores e mais espe-</p><p>cíficas, como genes, operons ou mesmo RNA e proteínas. O método</p><p>original de sequenciamento foi desenvolvido por Frederick Sanger e co-</p><p>laboradores, em 1977, e baseia-se na terminação de cadeias utilizando</p><p>nucleotídeos modificados – os dideoxinucleotídeos (ddNTP). Esses nu-</p><p>cleotídeos não apresentam hidroxila no C3 e não conseguem dar con-</p><p>tinuidade à síntese do DNA, por não realizarem ligações fosfodiéster.</p><p>58 Biologia Molecular</p><p>Durante o sequenciamento, a etapa de replicação é reproduzida uti-</p><p>lizando-se todos os reagentes necessários: o DNA molde (que se deseja</p><p>sequenciar), o primer (iniciador), a DNA polimerase e os nucleotídeos</p><p>normais (dNTPs), além dos nucleotídeos modificados (ddNTPs) marca-</p><p>dos com fluorescência ou radioatividade. Amostras de DNA molde são</p><p>adicionadas em quatro reações diferentes, cada uma contendo, além</p><p>dos reagentes normais necessários à replicação, um tipo de ddNTP.</p><p>Após a reação, os fragmentos de DNA obtidos são desnaturados, se-</p><p>parados por tamanho em gel de eletroforese e revelados por autor-</p><p>radiografia ou luz ultravioleta. Analisando o gel, é possível encontrar a</p><p>sequência de nucleotídeos do DNA molde, de acordo com o ponto de</p><p>parada da replicação pela inserção do ddNTP.</p><p>A Figura 11 apresenta um gel de eletroforese contendo os fragmen-</p><p>tos de DNA e o mapa de sequência de nucleotídeos fornecido por equi-</p><p>pamentos automatizados.</p><p>Figura 11</p><p>Representação esquemática de gel de eletroforese (esquerda) e mapa automatizado (direita)</p><p>contendo os fragmentos de DNA obtidos pela técnica de sequenciamento de Sanger.</p><p>A</p><p>T</p><p>G</p><p>C</p><p>T</p><p>T</p><p>C</p><p>G</p><p>G</p><p>C</p><p>A</p><p>A</p><p>G</p><p>A</p><p>C</p><p>T</p><p>C</p><p>A</p><p>A</p><p>A</p><p>A</p><p>A</p><p>A</p><p>T</p><p>A</p><p>G  C  A  T</p><p>Compreendendo os genes e os genomas 59</p><p>Apesar de revolucionária, a técnica de Sanger apresenta a desvan-</p><p>tagem de ser muito trabalhosa e extremamente cara, mesmo utilizan-</p><p>do sequenciadores automatizados. Atualmente, técnicas mais rápidas</p><p>e com o custo reduzido têm sido utilizadas para sequenciamento de</p><p>genomas, determinação de perfil de transcriptoma e determinação de</p><p>interações entre DNA e proteínas. Essas técnicas realizam, simultanea-</p><p>mente, milhares de reações de sequenciamento das frações do DNA</p><p>alvo, o que permite sequenciar um genoma inteiro em apenas um dia.</p><p>Exemplos dessas tecnologias são o sequenciamento em tempo real de</p><p>molécula única (Pacific Biosciences) e o sequenciamento de ion torrent</p><p>(Thermo Fisher Scientific).</p><p>3.3.2 Entendendo as ômicas</p><p>Além da genômica, outras análises biomoleculares podem ser rea-</p><p>lizadas, promovendo o amplo entendimento sobre o maquinário ce-</p><p>lular de hereditariedade. Atualmente, destacam-se algumas análises,</p><p>sendo uma a transcriptômica, que visa determinar quais transcrições</p><p>(mRNA, rRNA, tRNA etc.) estão ativas em uma célula, órgão ou tecido</p><p>de determinada espécie, sendo uma técnica que apresenta muitas va-</p><p>riações entre os indivíduos, considerando que fatores externos podem</p><p>influenciar a taxa de transcrição de determinados genes.</p><p>Essa análise é bastante utilizada para comparar a expressão gênica</p><p>entre diferentes células e organismos, sendo particularmente útil na</p><p>identificação de células cancerosas e seus mecanismos de propagação</p><p>e diferenciação celular. Atualmente, as duas principais técnicas para</p><p>determinação de transcritos celulares são DNA microarrays e sequen-</p><p>ciamento de RNA. A primeira envolve técnicas de microarranjo, isto é,</p><p>construção de “chips” de DNA, em que determinadas sequências de</p><p>oligonucleotídeos são posicionadas e fixadas em uma placa de vidro,</p><p>servindo como sondas para reconhecer os mRNA alvos</p><p>da amostra. Na</p><p>segunda, o processo é realizado utilizando técnicas avançadas (next ge-</p><p>neration), com equipamentos que demandam uma pequena quantida-</p><p>de de RNA e nenhum conhecimento prévio do genoma.</p><p>Outra análise, como o nome proteômica, visa estudar o conteúdo</p><p>proteico dentro de uma célula ou de sistemas associados. Esse perfil</p><p>proteico é bastante utilizado em investigações médicas, desvendando</p><p>o mecanismo de patologias e seus respectivos agentes. Também pode</p><p>A técnica CRISPR</p><p>(repetições palindrô-</p><p>micas curtas agrupa-</p><p>das e regularmente</p><p>interespaçadas) veio</p><p>revolucionar a genética</p><p>molecular ao propor-</p><p>cionar a possibilidade</p><p>de “edição” dos genes,</p><p>removendo característi-</p><p>cas indesejadas, como a</p><p>propensão a deter-</p><p>minado câncer. Essa</p><p>temática é abordada no</p><p>documentário Human</p><p>Nature, que apresenta</p><p>as possibilidades do</p><p>uso da técnica versus</p><p>as consequências na</p><p>determinação artificial</p><p>do genoma.</p><p>Direção: Adam Bolt. EUA: Sandbox</p><p>Films; News and Guts Films; The</p><p>Wonder Collaborative, 2019.</p><p>Filme</p><p>60 Biologia Molecular</p><p>ser aplicada na prospecção de novos medicamentos, no estudo das in-</p><p>terações entre organismos e na identificação de antígenos envolvidos</p><p>na resposta imune. Os métodos de proteômica, segundo o site Techno-</p><p>logy Networks (2021), podem ser baseados em ligação com anticorpos,</p><p>como a técnica ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay ou ensaio de</p><p>imunoabsorção enzimática) em métodos de desnaturação e separação</p><p>em géis; ou em métodos cromatográficos.</p><p>Por último, a análise biomolecular metabolômica visa à determina-</p><p>ção do perfil de metabólitos em determinado momento, ou ao longo</p><p>do tempo. O metaboloma é o conjunto de todos os metabólitos em</p><p>um organismo, sendo representado pelos produtos finais celulares. A</p><p>análise do metaboloma permite um diagnóstico momentâneo do es-</p><p>tado fisiológico de um organismo, possibilitando acompanhar o efei-</p><p>to de contaminações ambientais no equilíbrio celular, por exemplo.</p><p>As principais técnicas utilizadas para determinar os metabólitos e sua</p><p>quantidade na amostra-alvo são a espectrometria de massa e a espec-</p><p>troscopia por ressonância magnética nuclear.</p><p>As análises genômica, transcriptômica, proteômica e etabolômica</p><p>fornecem dados importantes para a compreensão da biologia celular</p><p>dos indivíduos.</p><p>CONSIDERAÇÕES</p><p>FINAIS</p><p>Neste capítulo, conhecemos o dogma central da biologia molecular</p><p>e os processos pelos quais o DNA direciona a produção de uma proteí-</p><p>na específica. Essas etapas, universais em todos os seres vivos, são res-</p><p>ponsáveis pela manutenção e propagação da vida no planeta. Também</p><p>abordamos os genes e os mecanismos da regulação gênica – essenciais</p><p>para o controle dos processos celulares – e os genomas e as suas ferra-</p><p>mentas de análise, com destaque ao sequenciamento genético. A cada</p><p>ano, mecanismos biomoleculares vêm sendo desvendados, trazendo</p><p>à luz novos conhecimentos e renovando a forma como entendemos</p><p>nossa hereditariedade.</p><p>Compreendendo os genes e os genomas 61</p><p>ATIVIDADES</p><p>1. Por que, apesar de haver 64 possibilidades de combinações com</p><p>as quatro bases nitrogenadas da molécula de RNA, são conhecidos</p><p>apenas 22 aminoácidos?</p><p>2. Como as nucleossomas auxiliam a regulação epigenética?</p><p>3. Como a transcriptômica pode auxiliar a compreensão de patologias</p><p>como o câncer?</p><p>REFERÊNCIAS</p><p>GRIFFITHS, A. J. F. et al. Modern genetic analysis. Nova Iorque: W. H. Freeman, 1999.</p><p>LEWIN, B. Genes IX. Porto Alegre: Artmed, 2009.</p><p>RIELLA, C. V. Pequenos RNAs não codificantes: do lixo ao tesouro. Brazilian Journal of</p><p>Nephrology, v. 41, n. 2, p. 168-169, 2019.</p><p>SCHEPER, G. C.; VAN DER KNAAP, M. S.; PROUD, C. G. Translation matters: protein synthesis</p><p>defects in inherited disease. Nature Reviews Genetics, v. 8, n. 9, p. 711-723, 2007.</p><p>TECHNOLOGY NETWORKS. Proteomics: principle, techniques, and application. Disponível</p><p>em: https://www.technologynetworks.com/proteomics/articles/proteomics-principles-</p><p>techniques-and-applications-343804. Acesso em: 14 fev. 2021.</p><p>Vídeo</p><p>62 Biologia Molecular</p><p>4</p><p>Tecnologias de DNA:</p><p>solucionando mistérios</p><p>Após a descoberta do DNA, dos genes e dos mecanismos de</p><p>hereditariedade presentes em todos os seres vivos, não demorou</p><p>muito para que esse conhecimento fosse utilizado para identificar</p><p>e caracterizar indivíduos na população. Para isso, foram desen-</p><p>volvidas tecnologias de DNA, isto é, técnicas capazes de utilizar o</p><p>material genético para identificação e comparação de característi-</p><p>cas em diversos níveis – seja entre diferentes gêneros, espécies ou</p><p>indivíduos.</p><p>Entre essas técnicas, destaca-se a Reação em Cadeia da</p><p>Polimerase (PCR, da sua sigla em inglês Polymerase Chain Reaction),</p><p>que teve um papel de destaque na identificação humana. Com o</p><p>tempo, a PCR tornou-se essencial para a resposta de diversas inda-</p><p>gações, principalmente no campo jurídico. Neste capítulo descre-</p><p>veremos as principais técnicas de DNA utilizadas para identificação</p><p>humana, com destaque para a PCR e sua grande influência na par-</p><p>ticularização de cada ser vivo.</p><p>4.1 A Revolução da PCR</p><p>Vídeo O surgimento da técnica da PCR – que permite produzir muitas cópias</p><p>de uma sequência específica de DNA – deu-se pela junção de esforços e</p><p>descobertas de diversos cientistas, culminando com o seu desenvolvi-</p><p>mento e implementação mundial em meados da década de 1980.</p><p>Uma das primeiras contribuições ocorreu em 1976, com a desco-</p><p>berta de uma enzima DNA polimerase capaz de manter-se estável e</p><p>funcional mesmo sob elevadas temperaturas. Trata-se da Taq DNA</p><p>Polimerase, polimerase isolada da bactéria Thermus Aquaticus, que ha-</p><p>bita fontes termais que podem chegar a temperaturas acima de 100ºC.</p><p>Tecnologias de DNA: solucionando mistérios 63</p><p>A primeira dessas enzimas, em particurlar, foi obtida por Chien, Edgar</p><p>e Trela (1976) por meio da T. aquaticus, presente no Parque Nacional do</p><p>Yellowstone (Yellowstone National Park, Figura 1), em Montana, Estados</p><p>Unidos. Isoladamente essa descoberta não teria grande impactos se</p><p>não fosse pelas pesquisas desenvolvidas paralelamente, principalmen-</p><p>te em relação às tentativas de reproduzir a replicação do DNA in vitro.</p><p>Figura 1</p><p>Parque Nacional de Yellowstone</p><p>Lo</p><p>rc</p><p>el</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Antes da descoberta da Taq polimerase, pesquisadores já reuniam esforços para pro-</p><p>duzir fragmentos de DNA amplificados em laboratório. Em 1971, Kjell Kleppe e Har</p><p>Gobind Khorana publicaram um método que se baseava na sequência “desnatura-</p><p>ção – anelamento – extensão”, adotada posteriormente na PCR. Os pesquisadores</p><p>descrevem nesse método – denominado replicação de reparo – que seria possível</p><p>amplificar sequências específicas de um DNA alvo utilizando-se dois primers e a</p><p>DNA polimerase (fragmento Klenow da DNApol 1 de E.coli 1 ). Apesar da simila-</p><p>ridade com a técnica da PCR que seria desenvolvida (ver seção 4.1.1), o método</p><p>descrito apresentava algumas fragilidades. Entre elas estava a instabilidade da DNA</p><p>polimerase utilizada, que não suportava as elevadas temperaturas de desnaturação</p><p>e precisava ser reposta ao final de cada ciclo, e a dificuldade de síntese de primers</p><p>específicos, técnica ainda incipiente na época.</p><p>Fragmento da DNA polimerase I</p><p>de Escherichia coli que mantém</p><p>apenas as atividades de polime-</p><p>rase e de 3’-5’ exonuclease.</p><p>1</p><p>64 Biologia Molecular</p><p>Outro esforço importante na concepção da PCR foi a produção</p><p>comercial de sequências curtas de oligonucleotídeos, os primers.</p><p>Cientistas vinham aperfeiçoando metodologias de síntese de oligonu-</p><p>cleotídeos em laboratório desde a década de 1950; entretanto, foi ape-</p><p>nas em 1982 que esse processo se tornou comercial e acessível.</p><p>Em março de 1982, na Universidade Técnica de Darmstad, Alema-</p><p>nha, foi ofertado um curso sobre a síntese química de oligonucleotí-</p><p>deos. Na época, além de pesquisadores, participaram representantes</p><p>de grandes empresas de automação e foi nesse evento que o primeiro</p><p>sintetizador semiautomático de oligonucleotídeos foi apresentado pela</p><p>empresa Biosearch, da Califórnia. Depois disso, os equipamentos</p><p>fo-</p><p>ram sendo aperfeiçoados, tornando-se cada vez mais automatizados, o</p><p>que possibilitou a obtenção de primers específicos com bastante rapi-</p><p>dez e custos cada vez menores.</p><p>Diante desse cenário, tornou-se questão de tempo até que as no-</p><p>vas descobertas e tecnologias fossem implementadas na replicação</p><p>in vitro do DNA, e os primeiros passos foram dados por Kary Mullis e</p><p>seus colaboradores da empresa de biotecnologia Cetus Corporation®</p><p>(BARTLETT; STIRLING, 2003).</p><p>Em 1983, Kary Mullis começou a investigar a possibilidade de ampli-</p><p>ficar uma sequência específica de um DNA já bem estudado – o gene da</p><p>beta globina – utilizando um par de primers para flanquear a região de-</p><p>sejada e uma DNA polimerase para amplificação. Ao promover vários</p><p>ciclos de replicação, o pesquisador obteve uma enorme quantidade de</p><p>cópias daquela sequência específica, que poderiam ser isoladas e puri-</p><p>ficadas da reação utilizando-se um gel de agarose.</p><p>Essa descoberta revolucionou a Biologia Molecular ao tornar factível</p><p>o método de replicação in vitro, inicialmente apresentado por Kleppe e</p><p>Khorana em 1971. Entretanto, o método somente se tornaria ampla-</p><p>mente utilizado após a substituição da DNApol I de E. coli pela Taq DNA</p><p>polimerase, enzima termoestável isolada em 1976 (ISHINO; ISHINO,</p><p>2014).</p><p>Por não apresentar estabilidade frente às mudanças de temperatura,</p><p>a DNApol I não poderia ser submetida a temperaturas muito elevadas,</p><p>sob o risco de desnaturar e não realizar a polimerização do fragmento</p><p>de DNA. Essa restrição era bastante problemática para a técnica, pois</p><p>diminuía consideravelmente a fidelidade de replicação da enzima, além</p><p>Do</p><p>na</p><p>M</p><p>ap</p><p>st</p><p>on</p><p>Kary Banks Mullis nasceu em</p><p>Newport Beach, Califórnia, em</p><p>1944. Foi o responsável pela</p><p>concepção da técnica da PCR.</p><p>Cientista imprevisível e com</p><p>ideias pouco ortodoxas, passou</p><p>a trabalhar com a companhia</p><p>de biotecnologia Cetus Corpora-</p><p>tion® em 1979, empresa onde,</p><p>apesar de desentendimentos</p><p>frequentes com colegas e</p><p>do comportamento errático,</p><p>evidenciou a possibilidade</p><p>de amplificar sequências</p><p>específicas de DNA, o que seria</p><p>uma revolução na Biologia</p><p>Molecular. Por essa técnica,</p><p>recebeu, em 1993, o Nobel de</p><p>Química. Outras invenções de</p><p>Mullis incluem um plástico</p><p>sensível à luz ultravioleta, cuja</p><p>cor se altera na presença da</p><p>radiação, e uma técnica imu-</p><p>noquímica capaz de tratar com</p><p>alta eficiência pacientes com</p><p>infecções resistentes a antibióti-</p><p>cos. Faleceu de pneumonia aos</p><p>74 anos, em 2019.</p><p>Biografia</p><p>Tecnologias de DNA: solucionando mistérios 65</p><p>de permitir o reanelamento da fita molde de DNA. Assim, ao introduzir</p><p>a Taq DNA polimerase na reação, os pesquisadores puderam trabalhar</p><p>com ciclos de temperaturas mais elevadas, aumentando a fidedignidade</p><p>das cópias e tornando o processo mais rápido e eficiente.</p><p>Após uma equipe de cientistas experimentais da Cetus Corporation®</p><p>publicar o primeiro trabalho utilizando a PCR (SAIKI et al., 1985), novas</p><p>tecnologias foram desenvolvidas em todo o mundo para promover me-</p><p>lhorias na técnica. Aconteceu, ainda, a automação do processo, utili-</p><p>zando-se sistemas capazes de alternar entre diferentes temperaturas</p><p>em segundos – os termocicladores –, o que foi um diferencial na sua</p><p>disseminação, sendo a técnica hoje reconhecida como um marco na</p><p>ciência mundial.</p><p>4.1.1 Técnica da PCR</p><p>O conceito por trás da PCR é bastante simples. Trata-se de uma se-</p><p>quência de reações, repetida várias vezes, que ao final produz muitas</p><p>cópias de um pedaço específico de um DNA.</p><p>Considerando-se que o DNA é uma molécula extensa, formada por</p><p>milhares de genes e um número infindável de nucleotídeos, a possibili-</p><p>dade de fazer cópias apenas de uma sequência específica é bastante pro-</p><p>missora. Com uma sequência isolada, e em grande quantidade, torna-se</p><p>possível identificar a presença de determinado DNA na amostra, locali-</p><p>zar mutações, produzir bibliotecas genômicas ou realizar clonagens, por</p><p>exemplo. As possibilidades são infinitas, e diversas áreas e estudos podem</p><p>se beneficiar da técnica, sendo a identificação humana aquela que notada-</p><p>mente mais avançou com o advento da PCR.</p><p>E como funciona essa amplificação da PCR em cadeia? Inicialmente,</p><p>vamos listar os “ingredientes” de nossa reação, ou seja, tudo aquilo que</p><p>é necessário adicionar para que a amplificação ocorra. São eles:</p><p>• DNA molde: é a molécula alvo, que contém a sequência que de-</p><p>sejamos amplificar. Como exemplo, caso desejássemos realizar</p><p>cópias de um gene de uma cebola, seria necessário extrair e pu-</p><p>rificar o seu DNA para usá-lo como molde na PCR. Da mesma</p><p>forma, caso o interesse fosse em um gene ou sequência de DNA</p><p>humano, seria necessário realizar a extração do DNA presente</p><p>nas células do indivíduo a ser estudado.</p><p>66 Biologia Molecular</p><p>• Primers: são sequências curtas de oligonucleotídeos – cerca de</p><p>20 pares de base – que se ligarão nas extremidades da região a</p><p>ser copiada. Trata-se dos iniciadores da reação acoplados às fitas</p><p>do DNA molde por complementaridade de bases. Assim, eles de-</p><p>vem ser produzidos especificamente para a região que se deseja</p><p>copiar. Para realizar a amplificação de uma sequência, são neces-</p><p>sários dois primers, cada um se ligando a uma das fitas do DNA</p><p>molde já desnaturado (separado).</p><p>• Oligonucleotídeos (dNTPs): são os “bloquinhos de construção”,</p><p>que serão conectados uns aos outros por ligações fosfodiéster,</p><p>construindo as novas cópias da sequência de DNA alvo. As liga-</p><p>ções e o alongamento das cópias serão catalisados pela enzima</p><p>Taq DNA polimerase. É necessário adicionar, no tubo de reação,</p><p>concentrações iguais dos nucleotídeos adenina, timina, citosina e</p><p>guanina, que ficarão disponíveis no meio para a síntese das có-</p><p>pias da sequência do DNA.</p><p>• Taq DNA polimerase: é a enzima que vai promover as ligações</p><p>nucleotídicas e a extensão das novas fitas de DNA. Por ser ter-</p><p>moestável, sua adição no tubo é feita uma única vez, em concen-</p><p>tração suficiente para atuar em 30 ou mais ciclos de amplificação.</p><p>A temperatura ótima de ação da enzima é em torno de 70ºC,</p><p>o que auxilia na redução de ligações inespecíficas durante a</p><p>polimerização.</p><p>• MgCl2 (cloreto de magnésio): é um importante cofator 2 da</p><p>Taq DNA polimerase, além de auxiliar na formação das ligações</p><p>fosfodiéster. Deve ser adicionado em uma quantidade ótima, que</p><p>depende da concentração dos dNTPs e da enzima polimerase</p><p>adicionada. Quando presente em pouca quantidade, resulta em</p><p>baixa fidelidade e eficiência de replicação pela DNA polimerase;</p><p>em excesso, entretanto, pode promover o anelamento inespe-</p><p>cífico de primers em regiões que não aquela de interesse. Para</p><p>avaliar qual é a concentração ótima desse reagente, é necessário</p><p>realizar testes de otimização dos parâmetros da PCR.</p><p>• Solução tampão: é o meio ideal para que a reação enzimática</p><p>ocorra. Contém, em geral, uma solução tampão Tris-HCl que</p><p>mantém o pH da solução entre 7 e 9 (ideal para sistemas bioló-</p><p>gicos); KCl (cloreto de potássio), que auxilia na estabilização do</p><p>DNA durante a elongação; e (NH4)2SO4 (sulfato de amônio), que</p><p>Um cofator enzimático refere-se</p><p>a uma molécula não proteica</p><p>que modula a atividade catalítica</p><p>de enzimas, modificando sua</p><p>conformação e/ou aumentando</p><p>a afinidade de ligações químicas</p><p>2</p><p>Tecnologias de DNA: solucionando mistérios 67</p><p>previne as ligações inespecíficas dos primers e regiões que não</p><p>aquela alvo no DNA molde.</p><p>Com o passo a passo da PCR, podemos compreender como é possí-</p><p>vel replicar apenas um fragmento da molécula de DNA.</p><p>4.1.1.1 Ciclos da PCR</p><p>Adicionadas as concentrações ideais de cada um dos reagentes des-</p><p>critos anteriormente, é possível iniciar a PCR. A amplificação do DNA</p><p>alvo vai ocorrer em três etapas:</p><p>• Desnaturação: nessa etapa, a dupla fita do DNA molde deve ser</p><p>separada para possibilitar a ligação dos primers e a replicação da</p><p>sequência de interesse. Para isso, a amostra (contendo todos os</p><p>reagentes da PCR) será aquecida até 95°C por aproximadamente</p><p>1 minuto. A temperatura elevada promove a desnaturação do</p><p>DNA, cujas fitas se separam pelo rompimento de suas ligações de</p><p>hidrogênio. A termoestabilidade da Taq DNA polimerase é uma</p><p>vantagem nessa etapa, e a enzima não é inativada ou desnatura-</p><p>da como o DNA molde.</p><p>• Anelamento: após a separação da dupla fita, os primers vão se</p><p>anelar às suas sequências complementares nas fitas simples do</p><p>DNA. Para que o anelamento ocorra, a temperatura é reduzida,</p><p>mantendo-se entre 55ºC e 65ºC por 30 segundos (dependendo</p><p>das características do primer).</p><p>• Extensão: essa etapa envolve o alongamento dos primers pela</p><p>adição dos nucleotídeos pela Taq DNApol. A temperatura ótima</p><p>para a atividade enzimática é 72ºC, que deverá ser mantida por</p><p>aproximadamente 1 minuto.</p><p>Um ciclo de amplificação corresponde à realização dessas três eta-</p><p>pas em sequência. Ao final de um ciclo, é esperado que, a partir de uma</p><p>molécula de DNA molde, sejam geradas outras duas. No próximo ciclo,</p><p>as etapas se repetem, com cada molécula gerando outras duas, e assim</p><p>sucessivamente nos ciclos posteriores. Em geral, são utilizados de 25 a</p><p>40 ciclos em um ensaio de PCR, o que garante a produção de quantida-</p><p>de suficiente de cópias da sequência de interesse. A Figura 2 apresenta</p><p>um esquema da PCR.</p><p>68 Biologia Molecular</p><p>Figura 2</p><p>Representação esquemática dos reagentes e etapas da PCR</p><p>DA</p><p>nt</p><p>es</p><p>D</p><p>es</p><p>ig</p><p>n/</p><p>Sh</p><p>ut</p><p>te</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Amplificação de uma</p><p>sequência específica de DNA</p><p>DNA molde</p><p>primers de DNA dNTPs DNA polimerase Solução tampão</p><p>Reação</p><p>Termociclador</p><p>Desnaturação</p><p>Anelamento</p><p>Extensão</p><p>Produtos Ciclo 1</p><p>Ciclo 2</p><p>Ciclo 4</p><p>Ciclo 3</p><p>25 – 40 ciclos</p><p>Considerando-se a rapidez com que cada etapa acontece, seria bas-</p><p>tante laborioso realizar o processo manualmente. Felizmente, com o</p><p>advento dos termocicladores, esse processo pôde ser automatizado,</p><p>reduzindo notadamente o trabalho em cada ensaio de PCR.</p><p>Um termociclador (Figura 3) é um equipamento capaz de alternar</p><p>rapidamente entre temperaturas quentes e frias graças ao uso de um</p><p>dispositivo Peltier 3 (bateria termoelétrica).</p><p>Dispositivo que atua como uma</p><p>bomba de calor, transferindo-o</p><p>de um lado para outro com</p><p>consumo de energia elétrica</p><p>3</p><p>Tecnologias de DNA: solucionando mistérios 69</p><p>O equipamento apresenta um bloco de aquecimento em que são</p><p>dispostos os tubos contendo os reagentes da PCR. Em geral, sua tampa</p><p>também apresenta um sistema de aquecimento/resfriamento, o que</p><p>evita a condensação nas amostras. Os ciclos são pré-programados, e o</p><p>equipamento segue a sequência definida, aquecendo ou resfriando</p><p>quando necessário e pelo tempo especificado.</p><p>4.1.1.2 Eletroforese</p><p>Após o ensaio de PCR, é necessário verificar se a sequência</p><p>desejada foi realmente amplificada. Para isso, é comumente</p><p>utilizada a eletroforese em gel de agarose.</p><p>A eletroforese é uma técnica que promove a migração e</p><p>a separação de moléculas não neutras. Levando em consi-</p><p>deração que a molécula de DNA apresenta grupamentos fos-</p><p>fatos – e, portanto, cargas negativas em sua superfície –, ao</p><p>colocá-la em um campo elétrico ela migrará do polo negativo (cátodo)</p><p>ao polo positivo (ânodo). Caso essa migração ocorra em um meio po-</p><p>roso, a distância percorrida vai depender do tamanho da molécula.</p><p>Grandes moléculas ficarão retidas no início do meio, enquanto as me-</p><p>nores percorrerão distâncias maiores.</p><p>Este é justamente o princípio da eletroforese: promover a separação</p><p>das moléculas de DNA da amostra quando colocadas em um gel de aga-</p><p>rose e submetidas à corrente elétrica. A reação vai ocorrer em uma cuba</p><p>de eletroforese (Figura 4), contendo um tampão adequado para a con-</p><p>dução elétrica. Para definir aproximadamente o tamanho das moléculas</p><p>de DNA separadas no gel, é utilizado um marcador (DNA ladder),</p><p>que apresenta uma mistura de fragmentos de DNA de dife-</p><p>rentes tamanhos. Dessa forma, por comparação, é possível</p><p>ter uma noção do tamanho dos fragmentos no gel após a</p><p>corrida – assim como identificar se a sequência de inte-</p><p>resse amplificada se encontra entre eles.</p><p>Após a corrida, o gel recebe um corante que se liga</p><p>ao DNA e emite fluorescência quando submetido à</p><p>luz ultravioleta. Assim, é possível visualizar as bandas</p><p>de DNA e suas respectivas posições no gel de agarose.</p><p>Para registro, o gel poderá ser fotografado em câmera</p><p>Figura 3</p><p>Equipamento termociclador</p><p>para ensaio de PCR</p><p>na</p><p>ta</p><p>tra</p><p>ve</p><p>l/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Figura 4</p><p>Cuba de eletroforese contendo</p><p>o gel, o tampão eletrolítico</p><p>(solução) e as amostras sendo</p><p>aplicadas nos poços (cavida-</p><p>des) de corrida</p><p>dhvstockphoto/Shutterstock</p><p>70 Biologia Molecular</p><p>UV. A figura a seguir mostra um esquema da técnica de eletroforese</p><p>em gel de agarose.</p><p>Figura 5</p><p>Representação esquemática da eletroforese em gel de agarose</p><p>So</p><p>le</p><p>il</p><p>No</p><p>rd</p><p>ic</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>gel de agarose</p><p>tampão ânodo</p><p>amostras</p><p>nos poços</p><p>fonte de energia</p><p>amostras após</p><p>corrida no gel</p><p>gel sob luz UV foto do gel</p><p>poços cátodo</p><p>Além do uso da eletroforese em gel de agarose, é possível usá-la</p><p>em gel de poliacrilamida (PAGE, do seu termo em inglês Polyacrylamide</p><p>gel electrophoresis). Essa técnica é indicada quando se deseja separar</p><p>fragmentos menores de ácidos nucleicos – como o RNA – devido ao</p><p>tamanho mais reduzido dos poros no gel de poliacrilamida quando</p><p>comparados com aqueles de agarose.</p><p>Escrito por um dos coor-</p><p>denadores do Projeto</p><p>Genoma Humano, o livro</p><p>A linguagem da vida – o</p><p>DNA e a revolução na sua</p><p>saúde discute como os</p><p>avanços no diagnóstico</p><p>e no tratamento de</p><p>doenças estão ligados à</p><p>revolução proporcionada</p><p>pelos conhecimentos da</p><p>Biologia Molecular.</p><p>COLLINS, F. S. Belo Horizonte:</p><p>Gente, 2010.</p><p>Livro</p><p>Tecnologias de DNA: solucionando mistérios 71</p><p>4.2 O que é um marcador molecular?</p><p>Vídeo Conhecendo como a técnica da PCR funciona, é possível utilizá-la</p><p>em inúmeras aplicações. Entre elas, destacam-se a análise de popu-</p><p>lações, o mapeamento gênico, a genotipagem e o estudo da distância</p><p>genética entre espécies ou indivíduos da mesma espécie. Entretanto,</p><p>para que seja possível levantar essas informações, é importante que</p><p>exista alguma forma de comparar e rastrear a variabilidade genética</p><p>entre os grupos.</p><p>Em Biologia Molecular, definimos como marcador molecular uma</p><p>sequência de DNA – herdável e não influenciada pelo ambiente – que</p><p>está localizada em uma ou em várias regiões do genoma e que apre-</p><p>senta pequenas diferenças de nucleotídeos entre organismos distintos.</p><p>Essas diferenças permitem identificar grupos taxonômicos, localizar</p><p>genes ou particularizar um indivíduo diferenciando-o de outros de uma</p><p>mesma espécie. Portanto, a presença de marcadores permite que de-</p><p>terminada região do genoma seja estudada e utilizada para análise e</p><p>comparação de perfis genéticos distintos.</p><p>Vários sistemas de marcadores vêm sendo desenvolvidos nas úl-</p><p>timas décadas com o objetivo de identificar esses polimorfismos</p><p>genômicos. O primeiro marcador a ser utilizado para pesquisas de ma-</p><p>peamento gênico foi o RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism,</p><p>ou polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição), de-</p><p>senvolvido no início da década de 1970. Com o advento da PCR e de</p><p>técnicas de sequenciamento, diversos outros marcadores molecula-</p><p>res foram desenvolvidos, apresentando vantagens e desvantagens de</p><p>acordo com seu propósito de uso. A seguir, discutiremos brevemente</p><p>como funcionam alguns marcadores moleculares desenvolvidos até o</p><p>momento e suas aplicações. É importante salientar que existem deze-</p><p>nas de marcadores, e a escolha do mais adequado deve ser realizada</p><p>com base no interesse e na disponibilidade de recursos dos estudos ou</p><p>das investigações conduzidas.</p><p>72 Biologia Molecular</p><p>4.2.1 RFLP – polimorfismo de comprimento de</p><p>fragmento de restrição</p><p>Como o nome da técnica já evidencia, RFLP é um marcador que</p><p>vai atuar avaliando as diferenças entre fragmentos de DNA gerados</p><p>pela clivagem de diferentes amostras com a(s) mesma(s) enzima(s) de</p><p>restrição.</p><p>Enzimas de restrição são endonucleases, o que significa que elas reconhecem se-</p><p>quências específicas de nucleotídeos – chamadas</p><p>de sítios de restrição – e realizam</p><p>a clivagem (corte) do DNA naquele ponto específico. São comumente encontradas</p><p>em procariontes, particularmente bactérias, muito provavelmente como um meca-</p><p>nismo de defesa contra DNAs exógenos prejudiciais. Uma enzima de restrição bas-</p><p>tante estudada é a EcoRI, isolada a partir da Escherichia coli. Essa enzima reconhece o</p><p>sítio que contém a sequência GAATTC e cliva a dupla fita de maneira bem específica,</p><p>resultando em duas extremidades de DNA fita simples. Abaixo, em verde, está indi-</p><p>cado o corte que a EcoRI vai realizar na sequência de DNA encontrada (dupla fita).</p><p>Br</p><p>ya</p><p>n</p><p>De</p><p>rk</p><p>se</p><p>n</p><p>Para utilizar esse marcador, inicialmente é necessário isolar o DNA</p><p>das amostras biológicas de interesse. Na sequência, essas moléculas de</p><p>DNA serão clivadas por enzimas de restrição, que podem ser de um úni-</p><p>co tipo (i.g. EcoRI) ou uma combinação de diferentes enzimas (i.g. EcoRI,</p><p>BamH1, Pst1 etc.). Existem centenas de tipos de enzimas de restrição, e</p><p>todas encontram-se listadas em um banco de dados de acesso aberto,</p><p>chamado Rebase – The Restriction Enzyme Database (rebase.neb.com).</p><p>As enzimas clivam sequências específicas e curtas de nucleotídeos;</p><p>entretanto, se houver uma mutação – isto é, uma deleção, inserção ou</p><p>substituição de nucleotídeo no sítio de restrição –, elas não realizarão a</p><p>clivagem. Esse é o princípio da técnica do RFLP. Como nossas sequên-</p><p>cias de DNA (não codificadoras) podem ser bastante distintas umas das</p><p>outras, o padrão de clivagem de uma enzima de restrição vai ser dife-</p><p>rente para cada indivíduo.</p><p>Tecnologias de DNA: solucionando mistérios 73</p><p>Para verificar o padrão de clivagem de cada amostra, é realizada</p><p>uma eletroforese em gel de agarose, separando os fragmentos confor-</p><p>me seu tamanho. As diferenças no perfil obtido podem ser utilizadas</p><p>para estudos de hereditariedade, identificação criminal ou diagnóstico</p><p>e tratamento de doenças. Assim, é possível, por exemplo, determinar</p><p>se um indivíduo é homozigoto (dominante ou recessivo) ou hetero-</p><p>zigoto para determinada característica em estudo. A capacidade de</p><p>diferenciar homozigotos de heterozigotos classifica o RFLP como um</p><p>marcador codominante.</p><p>Por se tratar de uma técnica desenvolvida antes do advento da PCR,</p><p>o marcador RFLP utilizava todo o genoma para a clivagem, o que gerava</p><p>uma quantidade enorme de fragmentos. Caso o interesse do estudo</p><p>fosse em uma região específica – determinando se o indivíduo possui</p><p>um alelo recessivo para determinado gene, por exemplo –, seria ne-</p><p>cessário realizar uma hibridização conhecida como Southern Blotting 4 .</p><p>A Figura 6 representa a técnica RFLP, comparando o perfil de cliva-</p><p>gem dos cromossomos homólogos de duas amostras (A e B). A amostra</p><p>A apresenta os mesmos sítios de restrição em ambos os cromossomos,</p><p>sendo definida como homozigota para aquela característica, enquanto</p><p>a amostra B apresenta sítios de restrição distintos e é definida como</p><p>heterozigota.</p><p>Re</p><p>ta</p><p>m</p><p>a/</p><p>W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>Figura 6</p><p>RFLP entre duas amostras</p><p>A técnica de hibridização</p><p>Southern Blotting refere-se à</p><p>capacidade de uma molécula</p><p>de DNA fita simples, curta e</p><p>marcada (denominada sonda)</p><p>reconhecer, em uma amostra –</p><p>em geral DNA transferido do gel</p><p>de agarose para uma membrana</p><p>de nylon ou nitrocelulose –, a</p><p>sua sequência complementar,</p><p>que se encontra também como</p><p>fita simples. Caso a sonda</p><p>encontre um trecho de DNA</p><p>complementar na amostra,</p><p>ela se ligará a ele e poderá</p><p>ser visualizada sob luz UV ou</p><p>em raio-X, dependendo se a</p><p>marcação tiver sido realizada</p><p>com fluoróforo ou elemento</p><p>radioativo, respectivamente.</p><p>4</p><p>74 Biologia Molecular</p><p>As principais vantagens do marcador RFLP são a sua codominância</p><p>e a possibilidade de construir mapas de ligação bem detalhados. Suas</p><p>desvantagens estão, principalmente, na necessidade de grandes quan-</p><p>tidades de DNA íntegro, no elevado custo da técnica (principalmente re-</p><p>lacionado às sondas) e na impossibilidade de automação, o que torna o</p><p>trabalho exaustivo e demorado.</p><p>4.2.2 RAPD – DNA polimórfico amplificado</p><p>aleatoriamente</p><p>Com o estabelecimento da PCR como abordagem biomolecular</p><p>corriqueira, foram desenvolvidos novos marcadores moleculares com</p><p>base nessa técnica. Entre eles, destaca-se o RAPD (Randomly amplified</p><p>polymorphic DNA, ou DNA polimórfico amplificado aleatoriamente), de-</p><p>senvolvido no início da década de 1990.</p><p>Nessa técnica são utilizados primers curtos (cerca de 10 pares de</p><p>base) que vão se anelar em sequências aleatórias no genoma ensaiado</p><p>durante a realização de um ensaio de PCR com condições específicas</p><p>(i.g. baixa temperatura e alta concentração de MgCl2). Após o ensaio, é</p><p>realizada uma eletroforese em gel de agarose para separar os ampli-</p><p>cons 5 obtidos. Assim, será possível visualizar padrões de amplificação</p><p>distintos, dependendo do grupo ou indivíduo estudado. Considerando-</p><p>-se todo o genoma, haverá diversos pontos de mutação que interferi-</p><p>rão no anelamento dos primers, o que garante a produção de um DNA</p><p>fingerprinting (ou digital de DNA) única para cada grupo estudado.</p><p>Como vantagens, esse marcador apresenta o fato de ser barato e</p><p>não necessitar de nenhum conhecimento prévio do genoma de inte-</p><p>resse. As principais desvantagens são o fato de ser dominante (não</p><p>diferenciando entre alelos homozigotos e heterozigotos) e de difícil re-</p><p>produtibilidade, podendo variar de acordo com a DNA polimerase ou</p><p>equipamento utilizados.</p><p>4.2.3 SSR – repetição de sequências simples</p><p>O marcador SSR (Single Sequence Repeats, ou repetição de sequên-</p><p>cias simples), também conhecido como microssatélites ou STR (Short</p><p>tandem repeat, ou repetição curta em tandem), é uma técnica do tipo</p><p>VNTR (Variable number of tandem repeats, ou número variável de repeti-</p><p>ções em tandem 6 ) e vai utilizar a PCR como técnica base.</p><p>Amplicon refere-se ao produto</p><p>amplificado da PCR.</p><p>5</p><p>Tandem é uma repetição</p><p>periódica de uma sequência</p><p>6</p><p>Tecnologias de DNA: solucionando mistérios 75</p><p>Nesse marcador são identificadas sequências de DNA microssatélite</p><p>no genoma, isto é, repetições de 1 a 6 pares de base. Essas repetições</p><p>são altamente polimórficas, o que significa que variam grandemente</p><p>entre espécies e indivíduos. Como exemplo, imagine a presença da</p><p>sequência AATT (4 pares de base) no genoma humano. Alguns indi-</p><p>víduos podem apresentá-la em 3 repetições em tandem no geno-</p><p>ma (AATTAATTAATT), enquanto outros podem possuir 4 repetições</p><p>( AATTAATTAATTAATT). Entretanto, apesar de variarem em quantidade,</p><p>os trechos em tandem são flanqueados sempre por uma sequência</p><p>única, o que torna esse marcador uma excelente opção para identifica-</p><p>ção e diferenciação genética.</p><p>Conhecendo a sequência anterior às repetições em tandem, é pos-</p><p>sível produzir primers que reconheçam e amplifiquem essas regiões.</p><p>Após a PCR, é realizada uma eletroforese, em geral em gel de polia-</p><p>crilamida (maior resolução) para separar e visualizar o DNA amplifica-</p><p>do. Também é possível utilizar técnicas quantitativas, como o PCR em</p><p>tempo real 7 e a espectrometria de massas. O marcador SSR apresenta</p><p>como vantagens o fato de ser um marcador codominante, com alta re-</p><p>produtibilidade e capacidade de levantar muitas informações genéticas</p><p>sobre a amostra. Sua principal desvantagem é a necessidade de conhe-</p><p>cer o genoma e produzir primers específicos para a espécie estudada.</p><p>4.2.4 SNP – polimorfismo de nucleotídeo simples</p><p>No marcador SNP (Single Nucleotide Polymorphisms, ou polimorfis-</p><p>mo de nucleotídeos simples) são consideradas diferenças pontuais de</p><p>nucleotídeos, causadas por deleções, substituições ou inserções no ge-</p><p>noma. É um dos marcadores que mais evoluiu nos últimos anos, indo</p><p>de uma técnica cara e laboriosa para uma das mais rápidas, eficientes</p><p>e automatizadas (MARWAL; SAHU; GAUR, 2014).</p><p>A base de análise desse marcador é o sequenciamento em larga</p><p>escala, identificando essas alterações em regiões codificadoras e não</p><p>codificadoras. Suas aplicações vão desde a genotipagem até a seleção</p><p>de linhagens mais produtivas na agricultura,</p><p>pecuária e bioindústria.</p><p>PCR em tempo real, também</p><p>conhecida como PCR quantita-</p><p>tiva ou qPCR, é a evolução da</p><p>técnica da PCR, que faz uso de</p><p>equipamentos que permitem</p><p>monitorar a quantidade de</p><p>material amplificado ao final de</p><p>cada ciclo. Para isso, a técnica</p><p>faz uso, além dos primers, de</p><p>uma sonda fluorescente que se</p><p>liga na região entre os primers e</p><p>emite sinal após a amplificação,</p><p>quando é quebrada e removida</p><p>da sua ligação. Esse sinal é cap-</p><p>tado pelo equipamento e pode</p><p>ser visualizado diretamente,</p><p>sem necessidade de realizar</p><p>eletroforese dos amplicons. A</p><p>qPCR é amplamente utilizada</p><p>no diagnóstico de doenças,</p><p>particularmente viroses, por ser</p><p>uma técnica bastante específica,</p><p>sensível e de resposta rápida.</p><p>7</p><p>No documentário Sonhos</p><p>de DNA um grupo de</p><p>jovens cientistas chineses</p><p>ambiciona sequenciar</p><p>o DNA de todos os</p><p>indivíduos no planeta.</p><p>O objetivo é utilizar a in-</p><p>formação para a seleção</p><p>daqueles mais aptos, o</p><p>que levanta a discussão</p><p>sobre a ética na criação</p><p>de seres humanos “sob</p><p>medida”.</p><p>Direção: Bregt Je Van Der Haak.</p><p>China; Holanda: VPRO, 2012.</p><p>Filme</p><p>76 Biologia Molecular</p><p>4.3 Testes de Identificação Humana</p><p>Vídeo Sem dúvida, uma das principais aplicações dos marcadores mole-</p><p>culares é na identificação humana. Com o avanço das técnicas de DNA</p><p>fingerprinting, foi questão de tempo para que elas fossem aplicadas no</p><p>reconhecimento de indivíduos, principalmente em testes de paternida-</p><p>de, desastres em massa e identificação criminal.</p><p>Os marcadores moleculares considerados padrão-ouro na identifica-</p><p>ção humana atualmente são o STR (sinônimo de SSR ou microssatélites)</p><p>e o SNP. Isso porque eles apresentam as características de um marcador</p><p>molecular ideal para identificação, ou seja, elevado grau de polimorfis-</p><p>mo, alta reprodutibilidade e simplicidade e rapidez na realização.</p><p>Para que os testes garantam elevada acurácia e uma identificação</p><p>segura, é necessário utilizar diversos marcadores STR distintos, isto é,</p><p>avaliar não apenas um, mas o perfil de várias sequências em tandem.</p><p>Em geral, são adotados 15 microssatélites de tetranucleotídeos 8 para</p><p>conferir um grau elevado de precisão na análise. Considerando-se que,</p><p>dependendo do indivíduo, esses microssatélites podem ser encontra-</p><p>dos em 6 a 27 repetições, a combinação dos 15 microssatélites com 21</p><p>possibilidades de repetição resulta em 1019 perfis de DNA diferentes.</p><p>Isso quer dizer que 1 em cada 1019 indivíduos vai apresentar aquela</p><p>combinação de marcadores, o que extrapola – e muito – toda a popu-</p><p>lação do planeta (DEVINDER; PANKAJ; SMRUTI, 2014). De modo simpli-</p><p>ficado, podemos afirmar que o perfil de DNA com esses parâmetros é</p><p>único e pode determinar com grande precisão o indivíduo a partir do</p><p>qual foi originada a amostra.</p><p>Nos casos de paternidade, a abordagem ocorre de maneira similar;</p><p>entretanto, levando em conta que os marcadores moleculares são her-</p><p>dados do pai e da mãe, deve-se avaliar o perfil de ambos para confir-</p><p>mar ou refutar a paternidade. A Figura 7 apresenta um relatório fictício</p><p>contendo a comparação de um perfil molecular de um filho e do seu</p><p>suposto pai. Nesse caso, é importante que um dos alelos da criança seja</p><p>herdado do pai presumido (ela recebe um do pai e outro da mãe) para</p><p>que não se refute a paternidade. O relatório não apresenta o perfil mo-</p><p>lecular da mãe para os loci avaliados, mas é fundamental que ele tam-</p><p>bém seja verificado, garantindo uma análise mais robusta e assertiva.</p><p>Quatro nucleotídeos repetidos</p><p>em série.</p><p>8</p><p>Tecnologias de DNA: solucionando mistérios 77</p><p>Figura 7</p><p>Relatório fictício de análise de paternidade utilizando-se o marcador molecular STR</p><p>Relatório de teste de DNA</p><p>Caso 26887 CRIANÇA</p><p>268879-2 68879-30</p><p>Lócus PI Tamanho dos alelos Tamanho dos alelos</p><p>Possível PAI</p><p>Teste n.</p><p>D3S1358</p><p>vWA</p><p>D16S539</p><p>CSF1PO</p><p>TPOX</p><p>DSS1179</p><p>D21311</p><p>D18S51</p><p>D2S441</p><p>D19S433</p><p>TH01</p><p>FGA</p><p>D22S1045</p><p>D5S818</p><p>D13S317</p><p>D7S820</p><p>SE33</p><p>D10S1248</p><p>D1S11656</p><p>D2S1338</p><p>Amelogenin</p><p>1,24</p><p>4,77</p><p>2,83</p><p>1,65</p><p>0,47</p><p>2,43</p><p>17,01</p><p>3,39</p><p>1,47</p><p>2,05</p><p>0,82</p><p>1,39</p><p>3,42</p><p>0,67</p><p>1,72</p><p>1,21</p><p>25,09</p><p>0,78</p><p>3,40</p><p>3,33</p><p>16</p><p>16</p><p>13</p><p>11</p><p>8</p><p>14</p><p>32</p><p>15</p><p>11</p><p>14</p><p>7</p><p>20,2</p><p>15</p><p>9</p><p>11</p><p>9</p><p>19</p><p>12</p><p>11</p><p>17</p><p>X</p><p>17</p><p>12</p><p>33,2</p><p>15</p><p>93</p><p>22</p><p>17</p><p>11</p><p>11</p><p>11</p><p>21,2</p><p>13</p><p>16</p><p>24</p><p>Y</p><p>15</p><p>16</p><p>12</p><p>11</p><p>8</p><p>10</p><p>28</p><p>15</p><p>10</p><p>14</p><p>9</p><p>22</p><p>15</p><p>10</p><p>11</p><p>7</p><p>14</p><p>13</p><p>16</p><p>17</p><p>X</p><p>17</p><p>13</p><p>12</p><p>11</p><p>14</p><p>32</p><p>20</p><p>11</p><p>15</p><p>93</p><p>23</p><p>17</p><p>11</p><p>12</p><p>11</p><p>21,2</p><p>16</p><p>24</p><p>Y</p><p>Interpretação</p><p>Índice de Paternidade Combinada: 6.612.598</p><p>Probabilidade de paternidade: 99,99998%</p><p>O suposto pai não pode ser excluído como pai biológico da criança testada. Com base nos</p><p>resultados dos testes obtidos a partir das análises dos loci de DNA listados, a probabilidade de</p><p>paternidade é 99,99998%. Essa probabilidade de paternidade é calculada pela comparação com</p><p>um indivíduo não testado, não relacionado e randômico, pertencente à população caucasiana</p><p>(assunção de probabilidade prévia igual a 0,5)</p><p>Fonte: Journey Genetic Testing, 2021, tradução nossa.</p><p>Analisando a Figura 7, podemos observar alguns pontos importan-</p><p>tes associados ao teste de paternidade: ele considera 20 loci, ou seja,</p><p>20 microssatélites analisados (mais a amelogenina 9 , que é indicadora</p><p>do sexo do indivíduo), os quais estão descritos de maneira codificada</p><p>na coluna do lado esquerdo do relatório. Assim, por exemplo, D3S1358</p><p>é um microssatélite localizado no cromossomo 3, que apresenta a se-</p><p>quência AGAT repetindo-se de 8 a 20 vezes, com tamanho variando de</p><p>99 a 145 pares de base (NIST, 2021).</p><p>Outro ponto a respeito do teste de paternidade é que PI significa Pa-</p><p>ternity Index, ou índice de paternidade. Ele indica quantas vezes é mais</p><p>provável que aquele indivíduo testado seja o pai verdadeiro quando</p><p>comparado com outro aleatório dentro da mesma população. Para o</p><p>A amelogenina é uma das</p><p>proteínas responsáveis pela</p><p>formação do esmalte dos</p><p>dentes em seres humanos. Ela</p><p>é frequentemente utilizada na</p><p>identificação humana como</p><p>marcador molecular, pois</p><p>apresenta pequenas variações de</p><p>aminoácidos em sua estrutura</p><p>que são dependentes do sexo.</p><p>Assim, os cromossomos sexuais</p><p>(X e Y) apresentarão sequências</p><p>distintas de nucleotídeos no</p><p>lócus desse gene. Ao detectar e</p><p>amplificar essas sequências em</p><p>um ensaio de PCR, é possível</p><p>identificar o sexo do indivíduo.</p><p>9</p><p>78 Biologia Molecular</p><p>cálculo, consideram-se os alelos obtidos para pai e filho, dentro daque-</p><p>le marcador molecular.</p><p>A segunda coluna da figura refere-se aos alelos da criança, e o nú-</p><p>mero é a quantidade de repetições em tandem que aquele marcador</p><p>é encontrado no lócus. Assim, considerando-se ainda a sequência do</p><p>marcador D3S1358, a criança apresenta 16 repetições AGAT em um</p><p>cromossomo e 17 no outro, enquanto seu pai apresenta 15 e 17 repe-</p><p>tições em cada cromossomo. Isso significa que o pai só pode ter trans-</p><p>mitido o alelo 17 para o filho, e obrigatoriamente a mãe deve possuir</p><p>o alelo 16. Avaliar o DNA da mãe, quando possível, é fundamental para</p><p>confirmar a paternidade.</p><p>Além disso, o produto entre todos os PI resulta no CPI (Combined</p><p>Paternity Index, ou índice de paternidade combinado). O valor encontra-</p><p>do é utilizado para calcular a probabilidade de o indivíduo testado ser o</p><p>pai da criança. No relatório apresentado, essa chance é de 99,99998%.</p><p>Mesmo assim, deve-se concluir que o pai presumido não pode ser des-</p><p>cartado como pai biológico da criança (e não afirmar diretamente que</p><p>ele é o pai), pois o teste trabalha com probabilidades.</p><p>4.4 A PCR e a evolução forense</p><p>Vídeo Ainda no campo da identificação humana, uma das áreas que mais</p><p>se beneficiou com o desenvolvimento da PCR foi, sem dúvida, a perí-</p><p>cia criminal. Com a técnica, tornou-se possível detectar com precisão</p><p>se o material biológico presente na cena do crime pertence a deter-</p><p>minado suspeito, contrapondo-se à subjetividade de testemunhas</p><p>e à fragilidade de provas circunstanciais. Tornou-se, também, uma</p><p>ferramenta essencial na identificação de cadáveres, em casos nos quais</p><p>há incertezas a respeito da identidade.</p><p>Assim, nas últimas décadas, uma nova ciência foi estruturada: a ge-</p><p>nética forense. E, sendo derivada da Biologia Molecular, ela também</p><p>deve se manter atualizada, procurando implementar as técnicas mais</p><p>recentes, efetivas e confiáveis durante a investigação criminal. Isso é</p><p>ainda mais importante quando nos referimos a amostras biológicas</p><p>bastante degradadas, como são aquelas obtidas em locais de crime.</p><p>Dessa forma, métodos capazes de isolar e utilizar DNA mesmo em con-</p><p>dições adversas são extremamente necessários.</p><p>Tecnologias de DNA: solucionando mistérios 79</p><p>Da mesma forma que o teste de paternidade, os testes de identifi-</p><p>cação criminal utilizam o marcador molecular STR pela sua robustez,</p><p>rapidez e reprodutibilidade. Além disso, esse marcador não evidencia</p><p>informações a respeito de doenças, características físicas ou comporta-</p><p>mento, que poderiam ser fornecidas caso fossem analisadas sequências</p><p>codificantes (DECANINE, 2016). Desse modo, é garantido o anonimato</p><p>civil dos suspeitos, e as provas fornecidas baseiam-se tão somente na</p><p>similaridade de sequências amplificadas. A Figura 8 apresenta um exem-</p><p>plo de análise de DNA forense para identificação de suspeito.</p><p>Figura 8</p><p>Perfil molecular de amostra obtida em local de crime (à esquerda) e comparação com três</p><p>perfis moleculares de suspeitos</p><p>Fonte: Adaptada de NIST, 2021.</p><p>Local de crime Suspeito 1 Suspeito 2 Suspeito 3</p><p>Para que uma amostra seja compatível com o DNA de um suspeito,</p><p>é necessário que ambos apresentem os mesmos alelos. Na Figura 8, ao</p><p>comparar o tamanho e a posição das bandas obtidas, é possível afir-</p><p>mar que o suspeito 2 apresenta os mesmos alelos da amostra, o que</p><p>resulta em elevada probabilidade de ele ser o indivíduo que originou o</p><p>material biológico coletado no local do crime.</p><p>Nos casos em que as amostras estão bastante degradadas ou não há</p><p>DNA nuclear disponível, tem sido adotada a análise do DNA mitocondrial</p><p>(DNAmt). Esse DNA também apresenta regiões polimórficas e está pre-</p><p>sente em várias cópias por célula, podendo ser utilizado para descartar</p><p>suspeitos. A confirmação, entretanto, é mais difícil, levando em conside-</p><p>A série American Crime</p><p>Story: o povo contra</p><p>O.J.Simpson é uma drama-</p><p>tização de um caso real</p><p>que provocou comoção</p><p>nos Estados Unidos:</p><p>o assassinato de duas</p><p>pessoas e o julgamento</p><p>do suspeito, a estrela do</p><p>futebol americano, O. J.</p><p>Simpson. Problemas na</p><p>coleta de evidências e na</p><p>realização das análises</p><p>moleculares tiveram gran-</p><p>de impacto no desfecho</p><p>desse julgamento.</p><p>Direção: Ryan Murphy e Anthony</p><p>Hemingway. EUA: FX, 2016.</p><p>Filme</p><p>80 Biologia Molecular</p><p>ração que ele é herdado apenas da mãe. De maneira simplificada, todos</p><p>os indivíduos de uma linhagem materna terão o mesmo DNA mitocon-</p><p>drial e, caso o DNA da amostra seja compatível com o do suspeito, não</p><p>será possível eliminar seus irmãos, que possuem o mesmo DNAmt.</p><p>CONSIDERAÇÕES</p><p>FINAIS</p><p>Neste capítulo abordamos o desenvolvimento da PCR e a sua revolu-</p><p>ção na Biologia Molecular. Atualmente, essa técnica é imprescindível em</p><p>inúmeras análises moleculares. Também discutimos os marcadores mole-</p><p>culares, o que são e como podem ser utilizados para identificar indivíduos,</p><p>mapear genes ou realizar diagnósticos de doenças. Por fim, abordamos o</p><p>uso do marcador molecular baseado na PCR – o STR – e seu amplo uso na</p><p>identificação de paternidade e na genética forense.</p><p>ATIVIDADES</p><p>1. Quais são as etapas necessárias para a amplificação de uma sequência</p><p>de DNA pela técnica da PCR? Comente.</p><p>2. Com que finalidade os procariotos, principalmente bactérias, produzem</p><p>enzimas de restrição? Comente.</p><p>3. Qual é o marcador molecular utilizado na identificação parental e por</p><p>quê?</p><p>REFERÊNCIAS</p><p>BARTLETT, J. M. S.; STIRLING, D. PCR Protocols. Totowa, NJ: Humana Press, 2003.</p><p>CHIEN, A.; EDGAR, D. B.; TRELA, J. M. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme</p><p>thermophile Thermus aquaticus. Journal of Bacteriology, v. 127, n. 3, p. 1550-1557, 1976.</p><p>DECANINE, D. O papel de marcadores moleculares na genética forense. Revista Brasileira</p><p>de Criminalística, v. 5, n. 2, p. 18-27, 2016.</p><p>DEVINDER S. N.; PANKAJ, S.; SMRUTI, P. D. Biochemical characterization of Molecular</p><p>Markers for Human Genetic Identification in Paternity testing by DNA profiling. Asian</p><p>Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, v. 4, n. 37, p. 52-56, 2014.</p><p>ISHINO, S.; ISHINO, Y. DNA polymerases as useful reagents for biotechnology: the history</p><p>of developmental research in the field. Frontiers in microbiology, v. 5, p. 465, 2014.</p><p>MARWAL, A.; SAHU, A. K.; GAUR, R. K. Molecular Markers: tool for genetic analysis. In:</p><p>Animal Biotechnology. Academic Press, 2014. p. 289-305.</p><p>NIST. STR BASE. 2021. Disponível em: https://strbase.nist.gov/str_D3S1358.htm. Acesso em:</p><p>7 abr. 2021.</p><p>SAIKI, R. K. et al. Enzymatic amplification of betaglobin genomic sequences and restriction</p><p>site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, v. 230, n. 4732, p. 1350-1354, 1985.</p><p>Vídeo</p><p>Ciência 4.0: a nova revolução industrial 81</p><p>5</p><p>Ciência 4.0: a nova</p><p>revolução industrial</p><p>Após as revoluções sociais e industriais ocorridas nos últimos</p><p>séculos – e com o advento do século XXI –, a humanidade tem</p><p>vivenciado grandes (e rápidas) mudanças associadas à evolução</p><p>científica e tecnológica mundial. Essa transformação em nosso en-</p><p>tendimento e no uso da tecnologia e do conhecimento científico é</p><p>o que caracteriza a Indústria 4.0, também conhecida como a nova</p><p>revolução industrial.</p><p>Neste capítulo discutiremos a evolução do conhecimento na</p><p>Biologia Molecular e como as tecnologias moleculares têm contri-</p><p>buído para a construção dessa nova forma de produção.</p><p>5.1 A nova indústria: a revolução 4.0</p><p>Vídeo O conceito 4.0 está relacionado à evolução das tecnologias, com</p><p>destaque àquelas com aplicação industrial. Portanto, é comum ouvir-</p><p>mos o termo Indústria 4.0 referindo-se aos processos produtivos que</p><p>fazem uso de tecnologia de ponta, digitalização e inteligência artificial</p><p>em alguma de suas etapas.</p><p>O termo 4.0 refere-se à ideia de que estamos vivenciando a Quarta</p><p>Revolução Industrial no planeta. A Primeira Revolução Industrial teve</p><p>início em meados do século XVIII, com a substituição da manufatura</p><p>pelos maquinários e o uso da mão de obra assalariada. O uso dos com-</p><p>bustíveis fósseis nesse período, notadamente o carvão, serviu para im-</p><p>pulsionar as produções e suas formas de transporte.</p><p>A Segunda Revolução Industrial, por sua vez, envolveu a automatiza-</p><p>ção dos processos e a melhora na capacidade produtiva das indústrias.</p><p>82 Biologia Molecular</p><p>O surgimento de novas indústrias – como as de petróleo e as farmoquí-</p><p>micas – também marcou o período. Na sequência, a Terceira Revolução</p><p>Industrial se baseou no uso mais disseminado de tecnologias moder-</p><p>nas e de sistemas de informação, além do advento e do fortalecimento</p><p>da internet. Nesse momento o avanço no uso dos recursos renováveis</p><p>na geração de energia também foi um dos marcos no desenvolvimento</p><p>dessa forma produtiva.</p><p>É difícil datarmos com exatidão o surgimento da Quarta Revolução</p><p>Industrial, considerando-se que ainda estamos no processo de cons-</p><p>trução dessa nova relação. Entretanto, alguns estudiosos indicam que</p><p>o conceito foi primeiramente discutido pela Bosh, empresa de tecno-</p><p>logia industrial, em 2011, na Hannover Messe, uma das maiores fei-</p><p>ras de exposição do mundo. No mesmo ano, Schwab (2011) publicou</p><p>o livro A Quarta Revolução Industrial, abordando a então recente fusão</p><p>entre os mundos físico, digital e biológico, além dos benefícios e pe-</p><p>rigos que essa nova relação poderia acarretar. Esses são marcos que</p><p>possibilitam atribuir o início da Quarta Revolução Industrial à segunda</p><p>década do século XXI.</p><p>De modo geral, essa nova revolução tem como foco o uso de tec-</p><p>nologias de ponta, como a inteligência artificial e a Internet das Coisas</p><p>(IoT) 1 , para tornar os processos produtivos mais rápidos, baratos e efi-</p><p>cientes. A figura a seguir faz uma síntese das quatro revoluções indus-</p><p>triais mundiais vivenciadas até o momento.</p><p>Figura 1</p><p>As quatro revoluções industriais e suas principais</p><p>a importância de ligações fracas</p><p>nas interações entre macromoléculas e como esse</p><p>processo ocorre de maneira específica. Seus estu-</p><p>dos, juntamente com os de Karl Landsteiner, trou-</p><p>xeram à luz a enorme especificidade existente em</p><p>nosso organismo. Afinal, como seria possível nos-</p><p>so corpo combater com tanta eficiência algum or-</p><p>ganismo invasor (e não nossas próprias células) se</p><p>ele não pudesse reconhecer especificamente es-</p><p>truturas do agente indesejado?</p><p>Assim, Pauling e Landsteiner evidenciaram que</p><p>as interações responsáveis por constituir as macro-</p><p>moléculas ocorrem pelas ligações fracas, não pelas</p><p>ligações covalentes. Eles concluíram, ainda, que a</p><p>macromolécula, ao perder tais ligações, é desna-</p><p>turada, isto é, perde sua conformação e atividade</p><p>específica. Pauling constatou também que, para</p><p>que as ligações fracas fossem efetivas em manter</p><p>as estruturas unidas, seria necessário que houves-</p><p>se uma complementaridade de formas, ou seja, um</p><p>encaixe físico entre elas. Essa teoria, muito parecida</p><p>com a ideia de chave e fechadura, adotada no início</p><p>dos estudos de enzimologia 1 (Figura 1), completou</p><p>o entendimento sobre a especificidade de interação</p><p>entre as macromoléculas; essas descobertas até</p><p>hoje são responsáveis pela forma como entende-</p><p>mos tais estruturas.</p><p>Nascido no estado do</p><p>Oregon, Estados Unidos,</p><p>em 28 de fevereiro de</p><p>1901, Linus Carl Pauling</p><p>iniciou seus estudos em</p><p>Engenharia Química em</p><p>1917, tendo concluído a</p><p>faculdade em 1922. Em</p><p>1925, concluiu seu PhD</p><p>(Philosophy Doctor) em</p><p>química. Desde o início de sua carreira acadêmica, Pauling se</p><p>dedicou ao estudo das estruturas moleculares e de suas ligações</p><p>químicas, tendo publicado 350 artigos científicos sobre o tema.</p><p>Além do Nobel de Química, recebido em 1954, ele também foi</p><p>agraciado com o Nobel da Paz em 1962, por seus esforços em</p><p>combater a corrida nuclear entre Oriente e Ocidente. Ele faleceu</p><p>em Big Sur, Califórnia, em 1994, aos 93 anos.</p><p>Biografia</p><p>US</p><p>-G</p><p>ov</p><p>., L</p><p>ibr</p><p>ary</p><p>of</p><p>Co</p><p>ng</p><p>res</p><p>s/</p><p>W</p><p>iki</p><p>m</p><p>ed</p><p>ia</p><p>Co</p><p>m</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>Karl Landsteiner nasceu em</p><p>Viena, Império Austríaco</p><p>(atual Áustria) em 1868.</p><p>Formou-se em Medicina</p><p>em 1891, com grande</p><p>interesse na área de imu-</p><p>nologia. Após formado,</p><p>estudou química orgânica</p><p>com diversos cientistas</p><p>europeus, incluindo o</p><p>alemão Emil Fisher, contribuindo para o aprofundamento de</p><p>seus estudos imunológicos. Em 1901, publicou suas descobertas</p><p>sobre o sistema ABO, o que permitiu a realização de transfusões</p><p>sanguíneas de modo mais seguro. Por essa descoberta, ele foi</p><p>agraciado com o prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em</p><p>1930. Outras contribuições do cientista incluem a descoberta</p><p>do agente causador da poliomielite, um poliovírus, e da sífilis, a</p><p>bactéria Treponema pallidum. Landsteiner faleceu em 1943, aos</p><p>75 anos, na cidade de Nova York.</p><p>Biografia</p><p>Al</p><p>be</p><p>rt</p><p>Hi</p><p>ls</p><p>ch</p><p>er</p><p>/W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>Enzimologia é a ciência que estuda os principais catalisadores</p><p>biológicos encontrados em todos os organismos vivos: as enzi-</p><p>mas. Trata-se de uma vertente da bioquímica que aborda, além</p><p>da estrutura e da atividade enzimática, as diversas aplicações</p><p>dessas moléculas em atividades econômicas, como nas indús-</p><p>trias farmacêutica e alimentícia e na produção de biossensores.</p><p>O mecanismo de ação das enzimas envolve a redução da energia</p><p>de ativação das reações químicas, que passam a ocorrer muito</p><p>mais rapidamente e com alta estabilidade e eficácia.</p><p>1</p><p>Figura 1</p><p>Modelo chave-fechadura</p><p>Al</p><p>do</p><p>na</p><p>G</p><p>ris</p><p>ke</p><p>vic</p><p>ie</p><p>ne</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Chave (substrato)</p><p>Chave incorreta (substrato)</p><p>Fechadura (enzima)</p><p>Fechadura (enzima)</p><p>Encaixe correto, a reação ocorre</p><p>Sem reação</p><p>O modelo é utilizado para compreender a complementaridade en-</p><p>tre enzimas e substrato, que só será transformado pela enzima (fecha-</p><p>dura) caso haja um encaixe perfeito entre eles.</p><p>Paralelamente ao desenvolvimento da bioquímica, a genética tam-</p><p>bém vinha se destacando, no início do século XX, com a redescoberta</p><p>do trabalho de Gregor Mendel e o estudo dos fatores de transmissão</p><p>gênica, definidos em 1909, por Wilhelm Johannsen, como genes.</p><p>Mendel e as ervilhas do monastério</p><p>Qualquer um que se interesse ou inicie estudos em genética inevita-</p><p>velmente vai se deparar com Mendel e seus experimentos com ervilhas</p><p>(Pisum sativum). Gregor Johann Mendel (Figura 2) era um monge agos-</p><p>tiniano com interesses em botânica e astronomia. No monastério em</p><p>que vivia, localizado na atual República Tcheca, havia um jardim botâni-</p><p>co, no qual iniciou seus estudos. Com o objetivo de descobrir como as</p><p>características físicas poderiam ser transmitidas entre gerações de</p><p>uma espécie, ele optou por estudar ervilhas, por apresentarem cresci-</p><p>mento rápido e a possibilidade de cultivo durante todo o ano. Elas tam-</p><p>bém têm a capacidade de se autopolinizar, por apresentarem</p><p>estruturas reprodutivas masculinas e femininas em um único indiví-</p><p>duo. Dessa forma, é possível obter indivíduos com características pu-</p><p>ras após uma série de autofecundações.</p><p>Em seus experimentos, Mendel avaliou sete características transmi-</p><p>tidas entre gerações, como a cor e o formato das flores e sementes, a</p><p>posição das flores e a altura das plantas. Ele utilizou a polini-</p><p>zação controlada, produzindo plantas híbridas por meio</p><p>do cruzamento entre plantas com características puras. A</p><p>Figura 2</p><p>Gregor Mendel (1822-1884)</p><p>William</p><p>Watesom</p><p>/W</p><p>ikim</p><p>edia Com</p><p>m</p><p>ons</p><p>1111Introdução à Biologia MolecularIntrodução à Biologia Molecular</p><p>12 Biologia Molecular</p><p>primeira geração desse cruzamento, denominada F1, apresentou ape-</p><p>nas plantas idênticas a um dos pais, demonstrando que, para aquela</p><p>característica específica, havia dominância de um traço em relação ao</p><p>outro. Como exemplo, ao cruzar plantas puras de flores roxas com</p><p>outras puras de flores brancas, a geração F1 foi de flores roxas, e não</p><p>rosas, como se esperaria, caso ocorresse uma mistura entre elas.</p><p>Ao realizar um novo cruzamento – dessa vez entre duas gerações</p><p>F1 – o resultado foi ainda mais surpreendente. Mendel obteve uma re-</p><p>lação 3:1 de plantas com traço dominante e recessivo, respectivamen-</p><p>te (Figura 3). Dessa forma, foi possível concluir que a geração F1 era</p><p>formada por indivíduos híbridos, que carregavam ambos os traços, e</p><p>que a característica recessiva só se expressaria na ausência da domi-</p><p>nante. Ele também avaliou se a herança desses traços estava ligada à</p><p>transmissão de outras características. Como resultado, concluiu que</p><p>a hereditariedade para as características avaliadas era independente</p><p>e que era possível surgirem plantas com algumas características do-</p><p>minantes e outras recessivas.</p><p>Figura 3</p><p>Cruzamentos realizados por Mendel para avaliar a hereditariedade da característica cor das flores em ervilhas (Pisum sativum)</p><p>Em</p><p>re</p><p>T</p><p>er</p><p>im</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Autopolinização</p><p>Autopolinização</p><p>Polinização</p><p>cruzada</p><p>Autopolinização</p><p>Geração parental Geração F1</p><p>todas roxas</p><p>Geração F2</p><p>705 roxas, 224 brancas</p><p>Após estudar mais de 30 mil cruzamentos em um período de</p><p>aproximadamente oito anos, Mendel publicou seus achados sobre a</p><p>hereditariedade, em 1865, no artigo intitulado Versuche über Plflan-</p><p>zenhybriden (Experimentos em hibridização de plantas, em tradução</p><p>livre do alemão). Apesar da vanguarda de suas descobertas, o traba-</p><p>lho dele foi ignorado na época, sendo redescoberto apenas no início</p><p>do século XX, por Hugo de Vries, Erich von Tschermak e Carl Correns.</p><p>Introdução à Biologia Molecular 13</p><p>Merecidamente, ele é hoje reconhecido como pai da genética, tendo</p><p>contribuído enormemente com suas pesquisas para a descoberta</p><p>do gene e dos mecanismos da hereditariedade.</p><p>Além do estudo das ervilhas, conduzido por Mendel, outros or-</p><p>ganismos auxiliaram no entendimento da transmissão dos genes.</p><p>Foi o caso da drosófila (gênero Drosophila), conhecida popularmente</p><p>como mosca-da-fruta. A escolha da drosófila como organismo-mo-</p><p>delo se deve, principalmente, à sua elevada taxa de reprodução, o</p><p>que torna mais rápido o estudo e o acompanhamento das caracte-</p><p>características</p><p>el</p><p>en</p><p>ab</p><p>sl</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Revolução Industrial</p><p>A transformação das</p><p>indústrias e inovação</p><p>Indústria 1.0</p><p>Indústria 2.0</p><p>Indústria 3.0</p><p>Indústria 4.0</p><p>Mecanização,</p><p>máquinas</p><p>a vapor e</p><p>tecelagem de tear</p><p>Produção em</p><p>massa, linha de</p><p>montagem e</p><p>eletricidade</p><p>Automação,</p><p>computadores e</p><p>eletrônicos</p><p>Sistemas</p><p>ciberfísicos,</p><p>Internet das</p><p>Coisas, redes</p><p>Internet das Coisas (Internet of</p><p>Things - IoT) é a conexão digital</p><p>de objetos de uso cotidiano pelo</p><p>uso da internet, o que possibilita</p><p>seu controle remoto, a execução</p><p>de serviços e o processamento</p><p>de dados.</p><p>1</p><p>Ciência 4.0: a nova revolução industrial 83</p><p>Dentro do método produtivo da Indústria 4.0, técnicas biológicas</p><p>inovadoras também foram desenvolvidas e vêm contribuindo para</p><p>ampliar o entendimento e a aplicação da biotecnologia em qualquer</p><p>indústria que possa se beneficiar de processos biológicos, como far-</p><p>macêutica, alimentícia e aquelas de diagnóstico, insumos e equipa-</p><p>mentos médicos.</p><p>5.1.1 Biotecnologia e a indústria 4.0</p><p>O conceito de biotecnologia refere-se ao uso das ciências natu-</p><p>rais para produzir tecnologias e insumos industriais. Com o avanço</p><p>das técnicas moleculares, o uso da biotecnologia como ferramenta</p><p>na produção tem se tornado cada vez mais comum, auxiliando no</p><p>aumento da eficiência e na redução de custos dos processos.</p><p>O objetivo principal da biotecnologia é, portanto, transformar a</p><p>ciência em objetos, tecnologia ou serviços. Sua evolução está intrin-</p><p>secamente ligada ao conceito da Indústria 4.0 e à Internet das Coisas</p><p>e só tem sido possível pela união entre universidades e institutos de</p><p>pesquisa com o setor produtivo dos países.</p><p>O novo e crescente espectro de aplicação da biotecnologia é par-</p><p>te fundamental da nova ciência, ou Ciência 4.0, na qual aspectos</p><p>tecnológicos e biológicos comunicam-se em prol da evolução dos</p><p>processos. Para isso, no entanto, é fundamental que o input inte-</p><p>lectual – formado pelos conhecimentos científicos básico e aplicado</p><p>– seja adequado, o que só é possível pela capacitação contínua dos</p><p>profissionais envolvidos (MASSABNI; SILVA, 2019).</p><p>Apesar de as técnicas biotecnológicas terem ganhado mais des-</p><p>taque nos últimos anos, muitos processos que fazem uso dessa</p><p>tecnologia têm sido levados a efeito há algum tempo. É o caso dos</p><p>processos fermentativos para a produção de bebidas e alimentos; a</p><p>produção de medicamentos – notadamente os antibióticos, como a</p><p>penicilina; e os processos transformativos conduzidos com o uso de</p><p>enzimas em diversos setores industriais, principalmente o alimentí-</p><p>cio e o farmacêutico.</p><p>A evolução dessas técnicas foi capaz de promover revoluções</p><p>dentro da própria biotecnologia, e alguns marcos foram importantes</p><p>para a construção da Ciência 4.0. Entre eles está a “revolução gené-</p><p>tica”, com a descoberta dos mecanismos de hereditariedade e da</p><p>84 Biologia Molecular</p><p>estrutura do DNA na primeira metade do século XX, e a “revolução</p><p>molecular”, conduzida desde o final do século XX até o momento,</p><p>cuja principal referência foi o desenvolvimento da técnica da PCR</p><p>(SAIKI et al., 1985).</p><p>Atualmente – e considerando-se a aplicação industrial –, a biotec-</p><p>nologia vem promovendo mudanças profundas em diversas áreas.</p><p>É o caso, por exemplo, dos processos agrícolas, que têm sido bene-</p><p>ficiados com o melhoramento genético de cultivares, e os estudos</p><p>com células-tronco, que apresentam um vasto campo de aplicação</p><p>na Medicina.</p><p>Células-tronco são as células base do nosso organismo. São as primeiras células</p><p>formadas durante o desenvolvimento embrionário e apresentam capacidade plu-</p><p>ripotente, isto é, podem se especializar em diversos tipos de células, como neurô-</p><p>nios, células musculares ou do miocárdio. Devido a essa capacidade de formar</p><p>qualquer tecido, essas células têm sido bastante utilizadas em terapias regenera-</p><p>tivas, em que órgãos e tecidos afetados por doenças são reconstituídos com a aju-</p><p>da delas. Além da origem embrionária, alguns tecidos apresentam células-tronco</p><p>no indivíduo adulto. Pesquisas vêm sido conduzidas para utilizar células-tronco</p><p>adultas, reduzindo a necessidade do uso de embriões em sua produção.</p><p>De</p><p>si</p><p>gn</p><p>ua</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Especializações de células-tronco</p><p>Célula-tronco</p><p>Neurônio</p><p>Células</p><p>cardíacas</p><p>Hepatócitos</p><p>Enterócitos</p><p>Osteócito</p><p>Ciência 4.0: a nova revolução industrial 85</p><p>Entretanto, um dos principais problemas na disseminação do</p><p>uso da biotecnologia e de novas técnicas desenvolvidas em labora-</p><p>tórios de pesquisa é a baixa reprodutibilidade de experimentos. Isso</p><p>significa que grande parte das técnicas biológicas desenvolvidas e</p><p>descritas em livros e artigos científicos não são passíveis de serem</p><p>realizadas por outros pesquisadores (BAKER, 2016).</p><p>A melhor forma de contornar o problema da baixa reproduti-</p><p>bilidade, ao mesmo tempo que se otimizam os processos biotec-</p><p>nológicos, é pelo uso da automação, da robotização e de sistemas</p><p>interligados, como a IoT, em laboratórios e centros de pesquisa</p><p>(Figura 2). Assim, é possível reduzir erros durante os experimentos,</p><p>obtendo-se resultados robustos e confiáveis e permitindo a utiliza-</p><p>ção industrial de novas técnicas, sistemas e produtos biológicos.</p><p>Figura 2</p><p>Sistema automatizado de manipulação de frascos em um laboratório de pesquisas médicas</p><p>Be</p><p>lis</p><p>h/</p><p>Sh</p><p>ut</p><p>te</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>As tecnologias digitais e ciberfísicas 2 são, portanto, essenciais para</p><p>a construção da Ciência 4.0, em que os conhecimentos sobre sistemas</p><p>biológicos poderão ser convertidos em produtos que garantam melhor</p><p>qualidade de vida para a população mundial.</p><p>No filme Tempos Mo-</p><p>dernos o inesquecível</p><p>Charles Chaplin é o</p><p>personagem Vagabundo,</p><p>em uma crítica às novas</p><p>formas de produção</p><p>que estavam vigentes na</p><p>época. Trata-se de uma</p><p>narrativa interessante</p><p>sobre os aspectos da</p><p>Segunda Revolução In-</p><p>dustrial e suas principais</p><p>características, como as</p><p>linhas de montagem e a</p><p>automação.</p><p>Direção: Charles Chaplin. EUA:</p><p>Charles Chaplin Film Corporation,</p><p>1936.</p><p>Filme</p><p>Sistemas ciberfísicos envolvem</p><p>a associação de máquinas/equi-</p><p>pamentos com sistemas digitais</p><p>e sensores. A tecnologia digital é</p><p>capaz de controlar e gerar dados</p><p>sobre o funcionamento dos</p><p>sistemas físicos associados.</p><p>2</p><p>86 Biologia Molecular</p><p>5.2 Tecnologias moleculares</p><p>Vídeo A revolução 4.0 tem uma forte base biológica que, em conjunto</p><p>com a tecnologia de redes e a automação, constitui a Ciência 4.0.</p><p>No entanto, o fenômeno não é recente, e diversas pesquisas têm</p><p>sido conduzidas nas últimas décadas para promover esse avanço. A</p><p>seguir serão apresentadas algumas das principais contribuições da</p><p>Biologia Molecular para a construção dessa nova ciência.</p><p>5.2.1 Clonagem</p><p>A partir da segunda metade do século XX, após a elucidação da</p><p>estrutura do DNA, do código genético e dos mecanismos de transcri-</p><p>ção e tradução proteica, a ciência ainda nascente da Biologia Mole-</p><p>cular procurava formas de desvendar os mecanismos de expressão</p><p>e regulação gênica e sua influência nas características e patologias</p><p>humanas. Entretanto, as técnicas disponíveis não permitiam que in-</p><p>vestigações mais detalhadas fossem conduzidas, o que gerava uma</p><p>sensação de frustração nos geneticistas e biologistas moleculares da</p><p>época (BROWN, 2020).</p><p>Esse quadro mudaria drasticamente quando, no início da déca-</p><p>da de 1970, pesquisadores conseguiram copiar sequências gênicas</p><p>inteiras, inserindo-as em plasmídeos bacterianos com o auxílio de</p><p>enzimas nucleases (JACKSON; SYMONS; BERG, 1972; COHEN et al.,</p><p>1973). Esse processo ficou conhecido como clonagem molecular, ou</p><p>clonagem gênica, e possibilitaria o estudo aprofundado dos genes,</p><p>bem como o sequenciamento de genomas completos. O genoma hu-</p><p>mano, por exemplo, foi inteiramente sequenciado pelo Projeto Ge-</p><p>noma, um trabalho conjunto entre pesquisadores de diversos países</p><p>e que foi concluído com sucesso em 2003.</p><p>Apesar de a clonagem de genes ser relativamente recente, a clo-</p><p>nagem de organismos não é tão nova. De fato, de acordo com o Na-</p><p>tional Human Genome Research Institute</p><p>(NHGRI, 2021) – renomado</p><p>instituto internacional de pesquisas genômicas –, o termo clonagem</p><p>pode se referir a três abordagens distintas: à clonagem reprodutiva</p><p>(organismos inteiros), à clonagem terapêutica e à clonagem gênica.</p><p>A clonagem de organismos inteiros é a forma mais antiga de</p><p>duplicação biológica e foi documentada pela primeira vez em 1902,</p><p>Ciência 4.0: a nova revolução industrial 87</p><p>quando o cientista alemão Hans Adolf Driesch obteve salamandras</p><p>geneticamente idênticas por meio da divisão de um embrião viável.</p><p>Em 1958, o biólogo britânico John Gurdon conseguiu clonar sapos a</p><p>partir das células epiteliais de um indivíduo adulto da espécie. Em</p><p>1996, foi realizada a clonagem mais notória de um organismo: a ove-</p><p>lha Dolly.</p><p>A ovelha Dolly ficou conhecida mundialmente como o primeiro mamífero a ser</p><p>clonado com êxito. O processo de clonagem foi conduzido em 1996 no Instituto</p><p>Roslin, na Universidade de Edimburgo, Escócia, pela equipe dos pesquisadores</p><p>Keith Campbell e Ian Wilmut. A técnica utilizada foi a transferência nuclear de cé-</p><p>lula somática, na qual o núcleo de uma célula somática de um indivíduo adulto é</p><p>removido e, posteriormente, inserido em um ovócito com núcleo também ausen-</p><p>te. A célula híbrida formada é estimulada para iniciar seu crescimento e duplicação,</p><p>e o blastocisto formado é inserido no útero de uma fêmea da mesma espécie. No</p><p>caso de Dolly, a célula doadora veio do tecido mamário da ovelha clonada. Em</p><p>2003, com seis anos e meio de vida, Dolly faleceu devido a um câncer pulmo-</p><p>nar (adenocarcinoma pulmonar ovino). Segundo os pesquisadores, o fato de ela</p><p>ser um clone não teve influência em sua morte, sendo a doença que a acometeu</p><p>comum em ovelhas parcialmente mantidas em ambientes fechados, como era o</p><p>seu caso. Atualmente, Dolly encontra-se taxidermizada e em exposição no Museu</p><p>Nacional da Escócia, em Edimburgo.</p><p>M</p><p>ik</p><p>e</p><p>Pe</p><p>nn</p><p>in</p><p>gt</p><p>on</p><p>/W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>ovócito: célula gamética</p><p>feminina que dá origem ao</p><p>óvulo, também definida como</p><p>um óvulo imaturo.</p><p>Glossário</p><p>Apesar de Dolly ser o clone animal mais conhecido, ela não foi</p><p>a única. De fato, a clonagem reprodutiva tem avançado considera-</p><p>velmente e diversos outros animais, como porcos, vacas, cabras e</p><p>primatas, têm sido clonados com sucesso. Há, porém, um consenso</p><p>88 Biologia Molecular</p><p>entre pesquisadores de que a importância da clonagem de Dolly,</p><p>mais do que a produção do clone em si, reside no fato de ela ter sido</p><p>realizada a partir de uma célula somática adulta, o que ampliou os</p><p>horizontes das pesquisas com células-tronco.</p><p>A segunda forma de clonagem conhecida é aquela utilizada em</p><p>processos regenerativos: a clonagem terapêutica. Essa abordagem</p><p>apresenta similaridade com a clonagem reprodutiva, entretanto ela</p><p>objetiva utilizar células-tronco para produção de células de tecidos</p><p>específicos, o que auxilia no entendimento de patologias e no trata-</p><p>mento de doenças degenerativas, como Alzheimer, distrofias mus-</p><p>culares e doenças cardíacas.</p><p>Por fim e de maior interesse à Biologia Molecular, a clonagem</p><p>gênica consiste na técnica de produzir cópias de genes ou de DNA.</p><p>Como apresentado anteriormente, o desenvolvimento dessa forma</p><p>de clonagem só foi possível a partir da década de 1970, com a desco-</p><p>berta das endonucleases ou enzimas de restrição – as “tesouras mo-</p><p>leculares” responsáveis por clivar o DNA em sequências específicas.</p><p>Resumidamente, a clonagem molecular apresenta as seguintes</p><p>etapas (BROWN, 2020):</p><p>• Com o uso das enzimas de restrição, o fragmento de DNA con-</p><p>tendo o gene a ser clonado é clivado (do genoma de origem)</p><p>e inserido em uma molécula de DNA circular (i.g. plasmídeo)</p><p>chamada de vetor.</p><p>• O vetor é inserido em uma célula hospedeira, em geral</p><p>bacteriana.</p><p>• No interior da célula hospedeira, o vetor é replicado, aumen-</p><p>tando sua quantidade de cópias. Com isso, o gene de interesse</p><p>também é replicado.</p><p>• Após a divisão da célula hospedeira, os vetores contendo o clo-</p><p>ne também são transmitidos às células-filhas, onde se multipli-</p><p>carão igualmente.</p><p>• Após várias gerações, há a formação de uma colônia de células</p><p>idênticas à hospedeira, com cada célula contendo uma ou vá-</p><p>rias cópias do gene clonado.</p><p>A Figura 3 ilustra as etapas de clonagem molecular descritas.</p><p>Ciência 4.0: a nova revolução industrial 89</p><p>Figura 3</p><p>Etapas da clonagem molecular, utilizando-se plasmídeo como vetor e uma célula bacteriana</p><p>como hospedeira</p><p>W</p><p>hy</p><p>D</p><p>es</p><p>ig</p><p>n/</p><p>Sh</p><p>ut</p><p>te</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>DNA</p><p>Bactéria</p><p>O DNA que contém</p><p>o gene de interesse</p><p>é isolado com</p><p>um plasmídeo</p><p>bacteriano</p><p>Gene e plasmídeo</p><p>são clivados com</p><p>enzimas de restrição</p><p>DNA recombinante</p><p>é obtido pela união</p><p>entre gene clivado e</p><p>plasmídeo, pela ação</p><p>de enzimas ligases</p><p>DNA plasmidial</p><p>recombinante é</p><p>transferido para uma</p><p>célula bacteriana</p><p>Bactéria multiplica-se,</p><p>produzindo a proteína</p><p>de interesse</p><p>Célula contendo o</p><p>gene de interessePlasmídeo</p><p>A clonagem molecular apresenta inúmeras aplicações, podendo ser</p><p>utilizada para superexpressar uma proteína, modificar geneticamen-</p><p>te organismos ou sequenciar genomas. Diversos vetores de clonagem</p><p>podem ser utilizados, de acordo com a aplicação a que a técnica se</p><p>destina – para grandes fragmentos de DNA, por exemplo, o plasmídeo</p><p>poderá ser substituído por cromossomos artificiais bacterianos (BACs)</p><p>ou cromossomos artificiais de leveduras (YACs).</p><p>O advento da clonagem molecular foi crucial para a produção de</p><p>transgênicos, beneficiando enormemente o setor agrícola e a produção</p><p>de medicamentos.</p><p>90 Biologia Molecular</p><p>5.2.2 Bioinformática</p><p>A bioinformática é um ótimo exemplo de como as tecnologias digi-</p><p>tais e o conhecimento biológico podem ser conectados em benefício</p><p>de uma ciência mais completa. Esse campo científico visa desenvolver</p><p>softwares que auxiliem na organização e na interpretação de dados bio-</p><p>lógicos, como extensas sequências de genes e proteínas.</p><p>O uso das ferramentas de bioinformática permite a identificação de</p><p>possíveis genes (candidatos) em determinado genoma, assim como de</p><p>mutações pontuais (Single Nucleotide Polymorphism – SNPs). Também</p><p>pode predizer a conformação de uma proteína, fornecer dados para a</p><p>produção de medicamentos, identificar interações proteína-proteína,</p><p>reconhecer padrões, elaborar modelos de evolução, comparar geno-</p><p>mas, entre muitas outras aplicações.</p><p>Para que seja possível verificar e comparar a amostra de interesse com</p><p>outros genomas ou proteomas já descritos, é fundamental que exista um</p><p>banco de dados para análises moleculares robusto e de fácil acesso e</p><p>execução. De fato, diversos bancos de dados foram criados desde as pri-</p><p>meiras investigações moleculares, e hoje eles formam bibliotecas exten-</p><p>sas, com uma quantidade gigantesca de informações e possibilidades de</p><p>análises. Os principais são:</p><p>• Bancos de dados de DNA: contêm sequências de nucleotídeos</p><p>de todos os organismos. Os principais – GenBank (produzido e</p><p>mantido pelo National Center for Biotechnology Information , nos</p><p>Estados Unidos), DNA Data Bank of Japan (Japão) e EMBL (Euro-</p><p>pean Bioinformatics Institute, localizado no Reino Unido) – for-</p><p>necem dados unificados para o banco de dados internacional</p><p>de nucleotídeos, o International Nucleotide Sequence Database</p><p>(INSD). Todos os bancos aceitam depósitos de sequências e tro-</p><p>cam informações entre si, o que permite a constante atualização</p><p>de seus repositórios.</p><p>• Bancos de dados de genomas: contêm sequências de genomas</p><p>completos, com acesso público e ferramentas de análise e com-</p><p>paração. Podem ser referentes a um único organismo – como o</p><p>banco FlyBase, sobre o organismo modelo Drosophila melanogas-</p><p>ter, e o Saccharomyces Genome Database, que apresenta o ge-</p><p>noma da levedura Saccharomyces –, ou apresentar genomas de</p><p>Ciência 4.0: a nova revolução industrial 91</p><p>organismos variados, como é o caso do Ensembly (genomas de</p><p>eucariotos) e do Ensembly Genomes (genomas de procariotos).</p><p>• Bancos de dados de microarranjos: referem-se a repositórios</p><p>contendo dados sobre expressão</p><p>gênica em microarranjos. Um</p><p>microarranjo de DNA é uma superfície sólida com diversos frag-</p><p>mentos de DNA ligados, utilizado para medir os níveis de ex-</p><p>pressão gênica de vários genes simultaneamente. Um banco de</p><p>microarranjos permite a inserção de informações sobre experi-</p><p>mentos de expressão gênica e fornece análise sobre os dados,</p><p>incluindo comparações com microarranjos já depositados. São</p><p>exemplos o ArrayTrack e o Gene Expression Omnibus (NCBI).</p><p>• Bancos de dados de fenótipos: fornecem informações sobre os</p><p>fenótipos associados a determinados genes. Exemplos: Rat Ge-</p><p>nome Database (espécie Rattus norvegicus) e PomBase (levedura</p><p>Schizosaccaromyces pombe).</p><p>• Bancos de dados de RNA: organizam informações sobre a se-</p><p>quência e a estrutura de RNAs. Exemplos: Rfam, um banco de</p><p>dados para as famílias de RNA, e miRBase, que contém dados</p><p>sobre os microRNAs.</p><p>Além desses, existem dezenas de outros bancos de dados ou fer-</p><p>ramentas tecnológicas que auxiliam no delineamento experimental</p><p>de pesquisas em Biologia Molecular, além de fornecerem ferramentas</p><p>para o tratamento dos dados brutos obtidos. A bioinformática foi – e</p><p>continua sendo – peça fundamental para a evolução do conhecimen-</p><p>to científico que temos vivenciado nessa recente revolução científica e</p><p>tecnológica mundial.</p><p>5.2.3 Epigenética</p><p>Por muito tempo acreditou-se que o ambiente em que vivemos não</p><p>teria como modificar nossa genética. Realmente, o meio não é capaz</p><p>de alterar nossa sequência de DNA, salvo na presença de algum agente</p><p>mutagênico. Entretanto, ele exerce uma enorme influência na forma</p><p>como nossos genes trabalham, e esse é justamente o estudo da área</p><p>da Biologia Molecular denominada epigenética.</p><p>A epigenética avalia como o nosso comportamento e o meio ao nos-</p><p>so redor são capazes de “ligar e desligar” genes, induzindo ou repri-</p><p>mindo sua expressão. Assim, fatores como poluição, envelhecimento,</p><p>92 Biologia Molecular</p><p>obesidade, sedentarismo e uso de substâncias tóxicas podem modifi-</p><p>car os padrões de expressão de determinados genes, o que resulta em</p><p>mudanças consideráveis na bioquímica dos organismos. A vantagem é</p><p>que, diferentemente de uma mutação, os efeitos epigenéticos podem</p><p>ser revertidos na ausência dos seus fatores desencadeantes.</p><p>Existem várias formas por meio das quais um gene pode ser contro-</p><p>lado. As principais envolvem o impedimento de ligação da RNA polime-</p><p>rase devido à presença de um agente bloqueador, ou pela degradação</p><p>do RNA codificante produzido. Resumindo, esses mecanismos podem</p><p>atuar pelas formas que se seguem.</p><p>• Metilação/desmetilação do DNA: nesse processo, enzimas es-</p><p>pecíficas adicionarão um grupamento metila na sequência de</p><p>DNA a ser regulada. Devido a essa inserção, a RNA polimerase</p><p>não consegue se ligar àquela região para realizar a transcrição do</p><p>RNA codificante. Nessa configuração o gene se encontra silencia-</p><p>do ou reprimido. O processo inverso – a desmetilação, também</p><p>por ação enzimática – vai “religar” o gene ao remover o agente</p><p>bloqueador da sequência.</p><p>• Modificação por histonas: histonas são proteínas encontradas</p><p>no núcleo das células eucarióticas, compondo o nucleossomo. Ao</p><p>promoverem a compactação do DNA, que irá se enovelar ao seu</p><p>redor, elas impedem a ligação da RNA polimerase e a consequen-</p><p>te transcrição de genes localizados no trecho compactado. Ao</p><p>relaxarem o enovelamento, tornam as sequências de DNA nova-</p><p>mente acessíveis para a transcrição. Várias doenças como câncer,</p><p>diabetes e as autoimunes podem gerar fatores epigenéticos, in-</p><p>terferindo no enovelamento ou relaxamento dos nucleossomos.</p><p>• RNAs de regulação: algumas moléculas de RNA não codifican-</p><p>tes, como os microRNAs, auxiliam no controle da expressão</p><p>gênica ao degradar o RNA mensageiro transcrito, impedindo a</p><p>tradução proteica.</p><p>A Figura 4 apresenta um resumo esquemático dos principais me-</p><p>canismos de ação da epigenética. É importante salientar que muitas</p><p>doenças podem ser causadas ou agravadas pelas diferenças na regu-</p><p>lação gênica conduzida pelos mecanismos epigenéticos. É o caso, por</p><p>exemplo, da metilação do gene BRCA1. A diminuição na sua expressão</p><p>ocasionada pela adição do grupamento metila aumenta o risco de</p><p>desenvolvimento de câncer de mama e de ovário.</p><p>Em uma trama que mistu-</p><p>ra história com ficção, Os</p><p>Meninos do Brasil narra a</p><p>tentativa do infame médi-</p><p>co Josef Mengele de gerar</p><p>clones de Adolf Hitler</p><p>para construir o Quarto</p><p>Reich. Além da discussão</p><p>sobre clonagem, o</p><p>filme também aborda a</p><p>importância dos fatores</p><p>ambientais no desenvolvi-</p><p>mento das características</p><p>dos indivíduos.</p><p>Direção: Franklin J. Schaffner. Reino</p><p>Unido; EUA: ITC Entertainment</p><p>Producer Circle, 1978.</p><p>Filme</p><p>Ciência 4.0: a nova revolução industrial 93</p><p>Figura 4</p><p>Principais mecanismos de regulação da epigenética</p><p>Mecanismos epigenéticos são afetados por</p><p>estes fatores e processos:</p><p>• Desenvolvimento (no útero, na infância)</p><p>• Compostos químicos ambientais</p><p>• Medicamentos/drogas</p><p>• Envelhecimento</p><p>• Dieta</p><p>Metilação de DNA</p><p>Grupamento metila (fator epigenético</p><p>encontrado em alimentos) pode marcar o DNA</p><p>e ativar ou reprimir genes</p><p>Modificação de histonas</p><p>A ligação de fatores epigenéticos nas caudas</p><p>de histonas altera o enovelamento do DNA ao</p><p>redor dessas proteínas e a disponibilidade dos</p><p>genes para transcrição</p><p>Histonas são proteínas em</p><p>torno das quais o DNA se</p><p>enrola para compactação e</p><p>regulação gênica</p><p>Cromossomo</p><p>DNA</p><p>Grupamento metila</p><p>Cromatina</p><p>Fator</p><p>epigenético</p><p>Fatores desencadeantes:</p><p>• Câncer</p><p>• Doenças autoimunes</p><p>• Doenças mentais</p><p>• Diabetes</p><p>Gene</p><p>Histonas</p><p>Cauda de</p><p>histona</p><p>Cauda de</p><p>histona</p><p>DNA inacessível, gene inativo</p><p>DNA inacessível, gene inativo</p><p>Na</p><p>tio</p><p>na</p><p>l I</p><p>ns</p><p>tit</p><p>ut</p><p>es</p><p>o</p><p>f H</p><p>ea</p><p>lth</p><p>/W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>O desenvolvimento de estudos epigenéticos tem possibilitado uma</p><p>grande revolução na Medicina por meio da realização de diagnósticos</p><p>precoces – principalmente de câncer em seus estágios iniciais – e de</p><p>terapias gênicas com foco no combate de fatores desencadeadores de</p><p>diversas patologias.</p><p>5.3 A inovação com base na pesquisa</p><p>científica: a técnica CRISPR/Cas9</p><p>Vídeo Como apresentado na seção 5.1, a união entre a pesquisa científica</p><p>de ponta, desenvolvida em universidades e institutos de pesquisas, e</p><p>os diversos setores produtivos que podem fazer uso de seus produtos</p><p>e serviços é fator essencial da Revolução 4.0. O acesso facilitado à in-</p><p>formação científica e a troca contínua de informações entre pesquisa-</p><p>dores de todo o mundo têm tornado a ciência cada vez mais completa</p><p>e aplicada.</p><p>94 Biologia Molecular</p><p>Um exemplo recente de pesquisa que resultou em uma gran-</p><p>de revolução tecnológica mundial foi o desenvolvimento da téc-</p><p>nica CRISPR/Cas9, também conhecida como a técnica de edição</p><p>de genes.</p><p>O sistema CRISPR/Cas9 é parte de um mecanismo natural de</p><p>defesa antiviral em bactérias, sendo a enzima endonuclease Cas9</p><p>específica da espécie Streptococcus pyogenes. Quando essa bactéria</p><p>é infectada por um vírus, ela integra parte do material genético</p><p>dele em seu próprio DNA, em regiões específicas do seu genoma,</p><p>as quais são denominadas CRISPR, da sua sigla em inglês Clustered</p><p>Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat, ou grupos de repeti-</p><p>ções palindrômicas curtas regularmente espaçadas.</p><p>Quando a bactéria é novamente infectada, a região CRISPR</p><p>contendo o DNA do vírus será transcrita, dando origem a uma se-</p><p>quência curta de RNA (crRNA). Também será transcrito um RNA</p><p>(transcrRNA, ou RNA transativador de CRISPR) responsável por for-</p><p>mar um complexo com o crRNA, ativando-o. Em um lócus próximo</p><p>ao CRISPR, é transcrita e expressa uma endonuclease, a Cas9. Ao se</p><p>ligar ao complexo crRNA – transcrRNA, a Cas9 passa a percorrer a</p><p>célula bacteriana; e quando o crRNA reconhece sequências de DNA</p><p>do vírus, a Cas9 promove a clivagem do DNA, inativando-o.</p><p>Esse mecanismo altamente específico de reconhecimento e</p><p>inativação de gene foi descoberto em 2012 pelas pesquisadoras</p><p>Jennifer Doudna (EUA) e Emmanuelle Charpentier (França), que</p><p>passaram a adaptar</p><p>esse sistema para reconhecimento e clivagem</p><p>de genes de quaisquer células de interesse, inativando-os ou reali-</p><p>zando a edição pela adição de uma sequência diferente na região</p><p>clivada.</p><p>A técnica desenvolvida pelas pesquisadoras utiliza um plasmí-</p><p>deo contendo as sequências de CRISPR e de Cas9 e que é inseri-</p><p>do no interior da célula a ser modificada. Utilizando o mecanismo</p><p>de expressão gênica da própria célula, o complexo CRISPR/Cas9 é</p><p>expresso no interior celular. Nessa técnica de edição, o complexo</p><p>crRNA – trascrRNA é transcrito de modo unificado, dando origem a</p><p>um RNA guia (sgRNA ou single-guide RNA). Esse sgRNA pode ser for-</p><p>mado por uma sequência alvo ou várias, dependendo do número</p><p>de crRNAs transcritos a partir da região CRISPR (Figura 5).</p><p>Ciência 4.0: a nova revolução industrial 95</p><p>Figura 5</p><p>Inserção em vetor plasmidial do complexo formado por sgRNA/Cas9</p><p>CRISPR/Cas9 e edição de genomas</p><p>Sequência alvo CRISPR</p><p>crRNA (com sequência alvo)</p><p>Múltiplos crRNAs podem ser incorporados em</p><p>um arranjo crRNA e complexados com tracRNA</p><p>para formar sgRNA</p><p>sgRNA e Cas9 podem ser combinados em um plasmídeo que sgRNA e Cas9 podem ser combinados em um plasmídeo que</p><p>será transferido para as célulasserá transferido para as células</p><p>Plasmídeo</p><p>Ka</p><p>id</p><p>or</p><p>/W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>PAM</p><p>Ao percorrer o genoma, o complexo vai reconhecer a sequência</p><p>alvo, e a enzima Cas9 realizará a clivagem. Dependendo do tipo de</p><p>Cas9 utilizada, esse corte poderá ser de fita dupla ou simples. Quando</p><p>ocorrer a quebra da fita dupla, em geral o mecanismo de reparação do</p><p>DNA conduzido pela célula será o de união de extremidade não homó-</p><p>loga (NHEJ – Non-homologous end joining). Esse mecanismo promove a</p><p>junção das extremidades mesmo sem paridade em suas sequências e</p><p>é utilizado quando se deseja remover um trecho de DNA, inativando</p><p>aquele gene.</p><p>Quando o corte é realizado em fita simples, o mecanismo de repara-</p><p>ção, por sua vez, será aquele dirigido por homologia (HDR – Homology</p><p>directed repair). Nesse caso, o maquinário molecular da célula procura-</p><p>rá sequências homólogas para completar o DNA clivado. Nesse caso, é</p><p>96 Biologia Molecular</p><p>possível adicionar uma sequência de DNA de interesse no local daquele</p><p>removido; dessa forma, o gene não será inativado, mas sim modifica-</p><p>do, permitindo a produção de uma molécula – RNA ou proteína – dife-</p><p>rente da original. A figura a seguir faz uma representação esquemática</p><p>da técnica CRISPR/Cas9 para edição gênica.</p><p>Figura 6</p><p>Etapas da técnica CRISPR/Cas9 para edição de genes</p><p>1: Transfecção</p><p>3: Ativação da Cas9</p><p>5: Clivando DNA genômico</p><p>DNA clivado</p><p>6: DNA pronto para reparo</p><p>4: Ligando-se à sequência alvo no genoma</p><p>DNA</p><p>genômico</p><p>Transfectado</p><p>Célula alvo</p><p>Plasmídeo</p><p>Plasmídeo</p><p>2: Expressão do plasmídeo</p><p>Expressão</p><p>DNA genômico pode</p><p>ser reparado por</p><p>NHJE ou HDR</p><p>Ni</p><p>el</p><p>sr</p><p>ca</p><p>/W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>Uma grande vantagem do uso dessa forma de edição é que ela pode</p><p>ser realizada em células vivas, podendo ser uma ferramenta preciosa</p><p>no tratamento de doenças genéticas, no combate a células cancerosas</p><p>ou no estudo da função de genes e proteínas. Pelo desenvolvimento</p><p>da técnica CRISPR/Cas9, Doudna e Charpentier foram laureadas com o</p><p>prêmio Nobel de Química em 2020.</p><p>A história de uma das</p><p>pesquisadoras respon-</p><p>sáveis pelo desenvolvi-</p><p>mento da técnica CRISPR/</p><p>Cas9, é contada em A</p><p>decodificadora: Jennifer</p><p>Doudna, edição e genes e o</p><p>futuro da espécie humana.</p><p>Nessa obra, Walter Isaa-</p><p>cson discute o passado e</p><p>o futuro da humanidade,</p><p>debatendo a evolução</p><p>médica e os conflitos éti-</p><p>cos associados à técnica.</p><p>ISAACSON, W. Intrínseca: Rio de</p><p>Janeiro, 2021.</p><p>Livro</p><p>Ciência 4.0: a nova revolução industrial 97</p><p>CONSIDERAÇÕES</p><p>FINAIS</p><p>A Quarta Revolução Industrial, resumida no termo Indústria 4.0, vai mui-</p><p>to além da evolução digital e tecnológica. Os avanços nos conhecimentos</p><p>da Biologia Molecular são responsáveis pelo gigantesco progresso que</p><p>temos observado na medicina, agricultura, bioengenharia e, consequen-</p><p>temente, na qualidade de vida da população mundial, o que é apenas o</p><p>começo. A maior parte dos mecanismos moleculares de uma infinidade</p><p>de espécies permanece ainda desconhecido, e novas descobertas devem,</p><p>em breve, ampliar ainda mais os horizontes científicos e tecnológicos da</p><p>humanidade.</p><p>ATIVIDADES</p><p>1. Quais são as características produtivas da Indústria 4.0? Comente.</p><p>2. Quais são as definições de vetor e célula hospedeira na clonagem</p><p>molecular? Explique.</p><p>3. Como o sistema CRISPR/Cas9 pode ser utilizado para editar genes?</p><p>Explique.</p><p>REFERÊNCIAS</p><p>BAKER, M. 1,500 scientists lift the lid on reproducibility. Nature, v. 533, n. 7.604, p. 452-454,</p><p>2016.</p><p>BROWN, T. A. Gene cloning and DNA analysis: an introduction. New Jersey: John Wiley and</p><p>Sons, 2020.</p><p>COHEN, S. N. et al. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro.</p><p>Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 70, n.11,</p><p>p. 3240–3244, 1973.</p><p>JACKSON, D. A.; SYMONS, R. H.; BERG, P. Biochemical method for inserting new genetic</p><p>information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda</p><p>phage genes and the galactose operon of Escherichia coli. Proceedings of the National</p><p>Academy of Sciences of the United States of America, v. 69, n.10, p. 2904–2909, 1972.</p><p>MASSABNI, A. C., SILVA, G. J. Biotechnology and Industry 4.0: The professionals of the</p><p>future. International Journal of Advances in Medical Biotechnology-IJAMB, v. 2, n. 2, p. 45-53,</p><p>2019.</p><p>NHGRI. Cloning fact sheet. 2021. Disponível em: https://www.genome.gov/about-genomics/</p><p>fact-sheets/Cloning-Fact-Sheet. Acesso em: 30 abr. 2021.</p><p>SAIKI, R. K. et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction</p><p>site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, v. 230, n. 4732, p.1350-1354, 1985.</p><p>SCHWAB, K. A quarta revolução industrial. São Paulo: Edipro, 2011.</p><p>Vídeo</p><p>98 Biologia Molecular</p><p>GABARITO</p><p>1 Introdução à Biologia Molecular</p><p>1. Como funciona a cristalografia de raios-X, técnica responsável</p><p>por desvendar a estrutura do DNA?</p><p>A cristalografia de raios-X se baseia na capacidade dos cristais em</p><p>desviar (difratar) as ondas de raios-X incidentes sobre eles em diversos</p><p>ângulos. Vários materiais, como a molécula de DNA, podem gerar</p><p>cristais, o que possibilita o uso dessa técnica para descrever suas</p><p>estruturas. Por meio da medição dos ângulos e das intensidades de</p><p>difração obtidos, é possível produzir uma imagem tridimensional da</p><p>densidade eletrônica do material, determinando a posição de seus</p><p>átomos e suas ligações químicas.</p><p>2. Por que a genética clássica pode ser também definida como</p><p>genética mendeliana?</p><p>A genética clássica estuda a transmissão dos genes de acordo com</p><p>as leis de segregação independente. Assim, ela visa descrever se um</p><p>gene é dominante, recessivo ou intermediário e como isso se traduzirá</p><p>em um aspecto observável do indivíduo. Os primeiros estudos</p><p>desenvolvidos com esse objetivo foram os de Gregor Mendel, na</p><p>segunda metade do século XIX, razão pela qual essa genética também</p><p>é denominada mendeliana.</p><p>3. Todas as regiões do genoma produzem proteínas?</p><p>Um genoma conterá regiões codificadoras e outras não codificadoras.</p><p>Enquanto os trechos codificadores serão traduzidos em proteínas, as</p><p>regiões não codificadoras poderão apresentar funções diversas, mas</p><p>também importantes, como a transcrição de moléculas de RNA ou a</p><p>regulação de genes.</p><p>2 Genética molecular</p><p>1. Qual é a diferença entre a fita líder e a fita tardia, sintetizadas</p><p>pela DNA polimerase durante a replicação do DNA?</p><p>A fita líder é sintetizada de maneira contínua pela DNA polimerase, pois</p><p>utiliza um molde 3’-5’ do DNA parental, gerando uma fita complementar</p><p>5’-3’. A fita tardia, entretanto, por utilizar como molde a fita 5’-3’, será</p><p>sintetizada em fragmentos, demandando diversos oligonucleotídeos</p><p>iniciadores (primers) no processo.</p><p>Gabarito 99</p><p>2. Por que o DNA, e não o RNA, é a molécula responsável pela</p><p>transmissão dos</p><p>caracteres hereditários?</p><p>Devido a diferenças estruturais, como a presença de desoxirribose – e</p><p>não ribose – em seus nucleotídeos, o DNA é mais estável do que o RNA e</p><p>capaz de resistir a elevadas temperaturas e à ação de agentes químicos.</p><p>Isso o torna um melhor candidato à molécula de hereditariedade, pois</p><p>pode ser transmitido de modo integral e consistente às células-filhas.</p><p>3. Quais são as funções das histonas no DNA eucarioto?</p><p>As histonas têm como função manter a estrutura da cromatina</p><p>enovelada, permitindo sua compactação no interior da célula, além</p><p>de atuarem como moléculas reguladoras da expressão de genes e da</p><p>síntese de proteínas.</p><p>3 Compreendendo os genes e os genomas</p><p>1. Por que, apesar de haver 64 possibilidades de combinações</p><p>com as quatro bases nitrogenadas da molécula de RNA, são</p><p>conhecidos apenas 22 aminoácidos?</p><p>Apesar das possíveis combinações, temos apenas 22 aminoácidos</p><p>porque o código genético é redundante. Isso significa que vários</p><p>códons podem codificar para o mesmo aminoácido, reduzindo as</p><p>possibilidades de combinação.</p><p>2. Como as nucleossomas auxiliam a regulação epigenética?</p><p>As nucleossomas agem relaxando ou espiralando o trecho de DNA</p><p>que contém o gene. Dessa maneira, é possível promover ou bloquear</p><p>o acesso ao promotor pela RNA polimerase.</p><p>3. Como a transcriptômica pode auxiliar a compreensão de</p><p>patologias como o câncer?</p><p>Com a transcriptômica, é possível avaliar quais genes estão sendo</p><p>expressos e em quais células, o que permite a comparação entre</p><p>células saudáveis e doentes. Para o câncer, isso significa que poderão</p><p>ser identificados genes relacionados ao mecanismo de erro promovido</p><p>pela doença.</p><p>4 Tecnologias de DNA: solucionando mistérios</p><p>1. Quais são as etapas necessárias para a amplificação de uma</p><p>sequência de DNA pela técnica da PCR? Comente.</p><p>As etapas de uma PCR são: desnaturação, em que o DNA dupla fita é</p><p>separado; anelamento, em que os primers reconhecem as sequências</p><p>100 Biologia Molecular</p><p>complementares na molécula de DNA e ligam-se a elas; e extensão, em</p><p>que a Taq DNA polimerase estende os fragmentos, utilizando os dNTPs</p><p>fornecidos na reação.</p><p>2. Com que finalidade os procariotos, principalmente bactérias,</p><p>produzem enzimas de restrição? Comente.</p><p>As bactérias produzem enzimas de restrição como forma de proteção</p><p>contra DNAs exógenos, principalmente bacteriófagos (vírus). As</p><p>enzimas atuam clivando o DNA do vírus que foi inserido dentro da</p><p>célula bacteriana para multiplicação.</p><p>3. Qual é o marcador molecular utilizado na identificação parental</p><p>e por quê?</p><p>O marcador molecular de análise parental é o STR (Short Tandem</p><p>Repeats). É utilizado por apresentar elevado polimorfismo, além</p><p>de ser um marcador com elevada reprodutibilidade e grau de</p><p>discriminação.</p><p>5 Ciência 4.0: a nova revolução industrial</p><p>1. Quais são as características produtivas da Indústria 4.0?</p><p>Comente.</p><p>A indústria 4.0 caracteriza-se pela união dos aspectos digitais,</p><p>biológicos e tecnológicos, fazendo uso de tecnologias de ponta, como</p><p>a inteligência artificial e a Internet das Coisas (IoT) para otimizar os</p><p>processos produtivos.</p><p>2. Quais são as definições de vetor e célula hospedeira na clonagem</p><p>molecular? Explique.</p><p>Um vetor é a molécula que vai transportar a sequência gênica a ser</p><p>clonada. Pode ser, por exemplo, um plasmídeo ou cromossomos</p><p>artificiais de bactérias (BACs) ou leveduras (YACs). A célula hospedeira</p><p>é aquela que será transformada, isto é, receberá o vetor, aumentando</p><p>o número de cópias do gene clonado à medida que se multiplica.</p><p>3. Como o sistema CRISPR/Cas9 pode ser utilizado para editar</p><p>genes? Explique.</p><p>O sistema CRISPR/Cas9 reconhece, na célula em que for inserido,</p><p>sequências homólogas ao crRNA presente no complexo. Ao identificar</p><p>a sequência correspondente, a endonuclease Cas9 vai clivar o DNA</p><p>encontrado, podendo inativar – ou substituir – um ou vários genes na</p><p>célula.</p><p>ISBN 978-65-5821-027-6</p><p>9 7 8 6 5 5 8 2 1 0 2 7 6</p><p>Código Logístico</p><p>59877</p><p>MARIA CAROLINA VIEIRA DA ROCHAMARIA CAROLINA VIEIRA DA ROCHA</p><p>BIOLOGIA MOLECULAR</p><p>Página em branco</p><p>Página em branco</p><p>rísticas genéticas da prole.</p><p>Em 1910, o zoólogo e geneticista americano</p><p>Thomas Hunt Morgan, utilizando a drosófila como</p><p>modelo, descobriu que alguns genes são transmi-</p><p>tidos de modo diferente, dependendo do sexo do</p><p>indivíduo. Sua descoberta confirmou a hipótese já</p><p>levantada por outros pesquisadores – notadamen-</p><p>te Theodor H. Boveri e Walter S. Sutton – de que os</p><p>genes estão localizados em regiões específicas dos</p><p>cromossomos e que, durante a meiose, são sepa-</p><p>rados nas cromátides-irmãs e transmitidos, expli-</p><p>cando as leis mendelianas da hereditariedade. A</p><p>hipótese de Boveri e Sutton ficou conhecida como</p><p>Teoria Cromossômica da Herança e sua confirmação</p><p>por Thomas Morgan evidenciou a importância dos</p><p>genes como a base da vida (MORANGE, 2000).</p><p>Apesar do reconhecimento dos genes e da con-</p><p>firmação de que eles estão presentes nos cromos-</p><p>somos, poucos geneticistas se interessaram em</p><p>saber a natureza química dessas estruturas. Her-</p><p>mann Muller foi um dos poucos que demonstrou</p><p>interesse nesse questionamento; em 1927, desco-</p><p>briu que emissões de raios-X causavam mutações</p><p>nos genes, alterando ou inativando sua função.</p><p>Thomas Hunt Morgan</p><p>nasceu em 1866 em</p><p>Lexington, Estados Unidos.</p><p>Desde cedo, mostrou grande</p><p>interesse por história natural,</p><p>tendo se formado em</p><p>zoologia pela Universidade</p><p>do Kentucky, em 1886.</p><p>Em 1890, conquistou seu</p><p>PhD em Biologia pela Universidade Johns Hopkins, estudando</p><p>morfologia e embriologia. Sua maior notoriedade científica ocorreu</p><p>pelas pesquisas com a mosca-da-fruta (Drosophila), responsáveis</p><p>por confirmar os cromossomos como unidades de transmissão da</p><p>hereditariedade. Morgan recebeu o prêmio Nobel de Fisiologia ou</p><p>Medicina por essas descobertas em 1933. Faleceu em 1945, em</p><p>Pasadena, Califórnia (EUA), aos 79 anos de idade.</p><p>Biografia</p><p>US</p><p>g</p><p>ov</p><p>/W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>Hermann Joseph Muller</p><p>nasceu em 1890 na cidade</p><p>de Nova York, Estados Uni-</p><p>dos. Frequentou a Univer-</p><p>sidade de Columbia, onde</p><p>começou a desenvolver</p><p>experimentos genéticos, in-</p><p>centivado pelos resultados</p><p>obtidos por pesquisadores</p><p>como Edmund Wilson e</p><p>Thomas Morgan. Muller demonstrou que raios-X têm o potencial</p><p>de causar mutações e mudanças no padrão hereditário. Por sua</p><p>descoberta, recebeu o prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina</p><p>em 1946. Após grandes contribuições científicas sobre os meca-</p><p>nismos da mutação, faleceu em Indianápolis, capital do estado</p><p>de Indiana (EUA) em 1967, aos 77 anos.</p><p>Biografia</p><p>Fu</p><p>nd</p><p>aç</p><p>ão</p><p>N</p><p>ob</p><p>el</p><p>/W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>14 Biologia Molecular</p><p>Nessa época, acreditava-se que eles eram constituídos majoritaria-</p><p>mente por proteínas, e que os ácidos nucleicos 2 , identificados nos</p><p>cromossomos por meio de análises químicas, serviriam apenas de re-</p><p>serva energética ou suporte físico às estruturas proteicas.</p><p>Apesar de ainda raso, o conhecimento da composição química dos</p><p>cromossomos, aliado a pesquisas de mutação e transferência gênica</p><p>em bactérias e plantas, começou a delimitar uma nova ciência, unindo</p><p>os conhecimentos genéticos às novas informações bioquímicas sobre</p><p>as macromoléculas envolvidas na hereditariedade.</p><p>Macromoléculas constituídas</p><p>de açúcares (pentoses), fosfato</p><p>e bases nitrogenadas (ver seção</p><p>1.3 para mais detalhes).</p><p>2</p><p>Em 1944, Oswald Avery, médico e bioquímico ca-</p><p>nadense, isolou uma macromolécula – um ácido de-</p><p>soxirribonucleico ou DNA –, definindo-a como</p><p>matéria-prima por meio da qual genes e cromosso-</p><p>mos são formados. Sua pesquisa também inovou ao</p><p>descobrir que as transformações (transferência de</p><p>características gênicas) que ocorrem em bactérias se</p><p>devem ao DNA, e não à transferência de proteínas,</p><p>como se acreditava na época. Mesmo conhecendo a</p><p>composição química dessa molécula, pouco se sabia</p><p>sobre sua estrutura e organização. É nesse ponto que</p><p>a história fica ainda mais interessante, contando com</p><p>a entrada de outros três pesquisadores.</p><p>Utilizando a cristalografia de raios-X, Rosalind El-</p><p>sie Franklin determinou duas formas da molécula de</p><p>DNA, denominadas tipo A e tipo B, com as unidades</p><p>de fosfato localizadas externamente à estrutura. Ela</p><p>também definiu a quantidade de água que deveria</p><p>ser encontrada na molécula para manter sua estru-</p><p>tura estável. Franklin apresentou seus achados, no</p><p>ano de 1951, no King’s College de Londres, em uma</p><p>palestra que contou com a presença de outro cien-</p><p>tista que também desenvolvia trabalhos com ácidos</p><p>nucleicos: James Watson.</p><p>James Dewey Watson é um biologista molecular</p><p>americano que trabalhou na Universidade de Cam-</p><p>bridge, Inglaterra, com seu colega pesquisador Fran-</p><p>Oswald Theodore Avery</p><p>nasceu em 1977 na Nova</p><p>Escócia, Canadá. Estudou na</p><p>Universidade de Columbia,</p><p>formando-se médico em</p><p>1904. Após um breve perío-</p><p>do de prática clínica, voltou</p><p>ao laboratório, aprofundando</p><p>suas pesquisas em bacterio-</p><p>logia. Durante seus estudos,</p><p>o pesquisador isolou uma substância chamada transformante,</p><p>capaz de tornar cepas não virulentas de uma bactéria em virulen-</p><p>tas. Em 1944, ele, juntamente com seus colegas Maclyn McCarty</p><p>e Colin MacLeod, determinaram que a substância transformante</p><p>era o DNA, demonstrando a importância dessa molécula para os</p><p>estudos de hereditariedade. Avery faleceu em 1955, aos 78 anos,</p><p>em Nashville, Estados Unidos.</p><p>Biografia</p><p>W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>Rosalind Elsie Franklin foi</p><p>uma química inglesa nascida</p><p>em 1920, em Londres, na</p><p>Inglaterra. Trabalhou extensi-</p><p>vamente com uma técnica</p><p>denominada cristalografia</p><p>de raios-X, que permite</p><p>determinar a estrutura</p><p>cristalina de uma molécula</p><p>de acordo com os ângulos</p><p>e a intensidade de refração dos raios-X incidentes sobre ela. A</p><p>pesquisadora estudou vírus e compostos minerais, como o carvão,</p><p>pelos quais foi reconhecida em vida. Infelizmente, seus achados</p><p>sobre a estrutura do DNA só foram reconhecidos muito tempo</p><p>depois de sua morte. Franklin faleceu em Londres precocemente,</p><p>vítima de um câncer no ovário aos 37 anos.</p><p>Biografia</p><p>M</p><p>RC</p><p>La</p><p>bo</p><p>rat</p><p>ory</p><p>of M</p><p>ole</p><p>cu</p><p>lar</p><p>Wio</p><p>log</p><p>y/W</p><p>ikim</p><p>ed</p><p>ia C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>Introdução à Biologia Molecular 15</p><p>cis H. C. Crick. Ambos desenvolviam pesquisas com</p><p>cristalografia de raios-X, estudando as estruturas de</p><p>ácidos nucleicos e proteínas.</p><p>Em 1951, após participar da palestra de Franklin,</p><p>uma fotografia de raios-X foi mostrada a Watson</p><p>pelo pesquisador Maurice Wilkins, colega de Franklin</p><p>no King’s College. Essa fotografia, denominada Photo</p><p>51, é uma imagem de difração de raios-X da molécu-</p><p>la do DNA. Ela foi obtida pelo aluno de Franklin, Ray-</p><p>mond Gosling. Relatos afirmam que Franklin não</p><p>estava ciente de que seu trabalho havia sido com-</p><p>partilhado por Wilkins com Watson.</p><p>O fato é que tal foto foi crucial para desvendar</p><p>a estrutura em dupla-hélice do DNA, publicada pos-</p><p>teriormente por Watson e Crick em seu artigo The</p><p>structure of DNA (A estrutura do DNA, em tradução</p><p>do inglês). Os pesquisadores não deram crédito à</p><p>contribuição de Franklin nessa descoberta. Em 1982,</p><p>Watson, Crick e Wilkins foram agraciados com o</p><p>Nobel de Fisiologia ou Medicina. Por não realizarem</p><p>premiações póstumas, Franklin não foi laureada,</p><p>mas atualmente sua contribuição é considerada es-</p><p>sencial para a descoberta da estrutura do DNA.</p><p>James Dewey Watson nasceu</p><p>em Chicago, Estados Unidos</p><p>em 1928. Ingressou na</p><p>Universidade de Chicago</p><p>com apenas 15 anos,</p><p>formando-se em 1947. Seus</p><p>estudos como geneticista</p><p>e biofísico permitiram</p><p>desvendar a estrutura</p><p>secundária do DNA – hoje</p><p>sabidamente uma dupla-hélice. Por essa descoberta, ele e seus</p><p>colegas Francis Crick e Maurice Wilkins foram agraciados com o</p><p>Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1962. Atualmente, Watson</p><p>vive em Nova York e continua realizando suas pesquisas no Cold</p><p>Spring Harbor Laboratory como chanceler emérito.</p><p>Biografia</p><p>W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>Francis Harry Compton</p><p>Crick nasceu em 1916, em</p><p>Northampton, Inglaterra.</p><p>Formou-se em biologia pela</p><p>Universidade de Cambridge</p><p>em 1947 estudando estru-</p><p>turas tridimensionais de</p><p>macromoléculas encontra-</p><p>das em seres vivos.</p><p>Junta-</p><p>mente com James Watson,</p><p>passou a estudar a estrutura do DNA. Seus estudos resultaram</p><p>no Nobel de Fisiologia ou Medicina, em 1962, ao determinar a</p><p>estrutura de dupla-hélice dessa macromolécula. Crick faleceu em</p><p>San Diego, Estados Unidos, em 2004, aos 88 anos.</p><p>Biografia</p><p>M</p><p>ar</p><p>c</p><p>Li</p><p>eb</p><p>er</p><p>m</p><p>an</p><p>/W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>Outros cientistas fizeram importantes descobertas para o entendimento do DNA.</p><p>Johann Friedrich Miescher: primeiro cientista a trabalhar com a molécula de DNA, que descobriu ter propriedades</p><p>diferentes das proteínas. Denominou-a nucleína.</p><p>Fredrick Griffith: descobriu o processo de transformação, isto é, a capacidade bacteriana de transmitir informações</p><p>genéticas de maneira horizontal 3 , promovendo a geração de novas cepas.</p><p>Barbara McClintock: citogeneticista em um tempo em que essa área era exclusiva de homens. Revolucionou os</p><p>estudos genéticos ao descobrir os mecanismos de transposição e dos “genes saltadores”, estudando variedades do</p><p>milho.</p><p>Erwin Chargaff: desvendou o pareamento entre bases nitrogenadas, o que corroborou que o DNA tem uma estru-</p><p>tura em dupla-hélice. Descobriu que a porcentagem de bases de timina é igual à de adeninas, o mesmo ocorrendo</p><p>entre guanina e citosina 4 . Dessa forma, foi possível estabelecer que a ligação deve ocorrer de maneira específica</p><p>entre essas bases.</p><p>Maurice Wilkins: trabalhou com Franklin, em 1951, produzindo raios-X de DNA, técnica essencial para desvendar a</p><p>estrutura dessa macromolécula.</p><p>Saiba mais</p><p>Nesse processo, uma bactéria re-</p><p>cebe um gene de outra bactéria,</p><p>em geral conferindo resistência</p><p>a alguma adversidade no meio.</p><p>Bactérias realizam transformação</p><p>entre sua espécie, assim como</p><p>entre espécies diferentes.</p><p>3</p><p>Guanina e citosina se ligam</p><p>com três ligações de hidrogênio,</p><p>enquanto timina e adenina se</p><p>ligam com apenas duas.</p><p>4</p><p>16 Biologia Molecular</p><p>1.2 Genética molecular versus genética clássica</p><p>Vídeo Agora que já conhecemos o contexto histórico do surgimento da</p><p>Biologia Molecular, é importante saber diferenciar os objetos de estudo</p><p>da genética clássica e da genética molecular.</p><p>A genética clássica tem como base características observáveis de</p><p>organismos e padrões de hereditariedade transmitidos de pais para</p><p>filhos. Sabe aquele seu sobrinho que tem os olhos do avô? Essa heran-</p><p>ça de características é justamente o foco principal da genética clássica,</p><p>muitas vezes denominada genética mendeliana por estar relacionada</p><p>aos padrões de transmissão independente de genes, estabelecido por</p><p>Mendel na segunda metade do século XIX.</p><p>As leis de Mendel sobre a segregação e recombinação gênica per-</p><p>mitiram o mapeamento de genes de milhares de espécies. Um mapa</p><p>genético nada mais é do que o conjunto de mapas de cromossomos</p><p>daquela espécie, mostrando a localização dos genes e outras caracte-</p><p>rísticas genéticas de interesse. A Figura 4 apresenta um exemplo de</p><p>mapa genético contendo os cromossomos e os genes da Mimulus, uma</p><p>planta pertencente à classe das magnólias.</p><p>Figura 4</p><p>Mapa genético proposto para Mimulus (linhagem M. guttatus x M. nasutus)</p><p>Cada estrutura vertical (LG) representa um cromossomo e cada traço horizontal em seu interior indica a posição de um gene,</p><p>nomeado por letras e números.</p><p>Fonte: Lyra et al., 2020.</p><p>Introdução à Biologia Molecular 17</p><p>Na Figura 4, os cromossomos da magnólia Mimulus são as estrutu-</p><p>ras verticais (LG de 1 a 5) com diferentes comprimentos. Um cromosso-</p><p>mo difere de outro em tamanho, tipos e quantidades de genes. Nesse</p><p>mapeamento, os genes foram denominados com um código de letras</p><p>e números; sua posição e ordem em cada cromossomo são indicadas</p><p>no mapa.</p><p>Apesar de desenvolvidos pela genética clássica, os mapas gené-</p><p>ticos são bastante estudados pela genética molecular, que analisa a</p><p>possibilidade de ligação entre dois ou mais genes. Assim, quanto mais</p><p>próximos esses genes se encontrarem em um cromossomo, maior é</p><p>a chance de que sejam transmitidos e herdados em conjunto. Nesse</p><p>caso, ocorre o que chamamos de ligação gênica, também conhecida por</p><p>seu termo em inglês linkage. São exemplos de características herdadas</p><p>em conjunto o tamanho da asa, o tamanho das antenas e a cor do</p><p>corpo em drosófilas (Figura 5). Por se encontrarem no mesmo cromos-</p><p>somo, essas características são transmitidas juntas, em “blocos”, e não</p><p>obedecem à lei da segregação independente, descrita por Mendel. Nes-</p><p>ses casos, para que haja separação entre esses genes, é necessário que</p><p>ocorra permutação, a troca de alelos 5 entre cromossomos durante a</p><p>divisão celular para formação dos gametas (meiose).</p><p>Figura 5</p><p>Características hereditárias de drosófilas – linhagens selvagem e mutante</p><p>CC</p><p>W</p><p>Y-</p><p>SA</p><p>4</p><p>.0</p><p>/W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>Linhagem</p><p>selvagem AA</p><p>Linhagem</p><p>mutante aa</p><p>As características das drosófilas são herdadas em bloco pela ligação gênica. Na linha superior:</p><p>características do indivíduo selvagem (dominante). Linha inferior: características do indivíduo</p><p>mutante (recessivo).</p><p>O filme DNA: História da</p><p>Vida conta a história da</p><p>descoberta da dupla-</p><p>-hélice, mostrando as</p><p>equipes do King’s College</p><p>(Rosalind Franklin e Mau-</p><p>rice Wilkins) e de Cam-</p><p>bridge (James Watson e</p><p>Francis Crick) em uma</p><p>rivalidade científica para</p><p>desvendar a estrutura</p><p>do DNA.</p><p>Direção: Mick Jackson. EUA: A + E</p><p>Networks; BBC; Horizon Films, 1987.</p><p>Filme</p><p>Versões de um gene. Na</p><p>drosófila, por exemplo, a cor do</p><p>corpo ébano é atribuída a um</p><p>alelo dominante desse gene,</p><p>enquanto a cor cinza se deve a</p><p>um alelo recessivo.</p><p>5</p><p>Para uma característica observável – ou traço –, a genética clássica</p><p>visa determinar se ela é dominante, recessiva, intermediária (quando</p><p>é parcialmente expressa) ou poligênica (quando é expressa mediante</p><p>combinação de múltiplos genes). A cor da pele, por exemplo, é uma ca-</p><p>racterística poligênica, determinada por uma série de alelos com efeito</p><p>aditivo, gerando uma grande quantidade de fenótipos 6 distintos.</p><p>Diferentemente da genética clássica, que tem como foco a caracte-</p><p>rística visível ou mensurável de um indivíduo, a genética molecular vai</p><p>mais a fundo e investiga as bases moleculares para que essa caracterís-</p><p>tica ocorra. Seu interesse é descobrir qual foi a proteína (ou proteínas)</p><p>produzida pelo material genético daquele organismo e responsável</p><p>pela expressão de determinado atributo. Enquanto a genética clássica</p><p>enxerga o gene como uma unidade de herança a ser transmitida, a</p><p>genética molecular o define como um segmento de DNA que codifica</p><p>para uma proteína e que deve atuar de alguma forma dentro do indi-</p><p>víduo. Perceba que ambos os conceitos estão corretos, o que muda é</p><p>o modo como a estrutura é abordada. O Quadro 1 lista as principais</p><p>diferenças entre essas abordagens.</p><p>Quadro 1</p><p>Diferentes abordagens da genética clássica e molecular para os atributos: característica</p><p>observável, gene e alelo</p><p>Característica</p><p>observável Gene Alelo</p><p>Genética clássica</p><p>Análise da incidên-</p><p>cia na população</p><p>Unidade de he-</p><p>reditariedade</p><p>Em geral, estuda</p><p>dois: um dominante</p><p>e outro recessivo</p><p>Genética molecular</p><p>Estudo da proteína</p><p>associada</p><p>Segmento de</p><p>DNA que codi-</p><p>fica para uma</p><p>proteína</p><p>Vários alelos na</p><p>população para uma</p><p>só característica</p><p>Fonte: Elaborado pela autora.</p><p>De acordo com a genética molecular, a diferença entre alelos ou</p><p>versões de um gene afeta a proteína correspondente, podendo, inclu-</p><p>sive, impedir a sua produção. Assim, algumas características podem</p><p>diferir apenas pela produção, ou não, de determinada proteína.</p><p>Estudar essa variação é um dos focos da genética molecular.</p><p>Como exemplo, o albinismo, respresentado na Figura 6, uma</p><p>doença congênita caracterizada pela ausência ou redução de</p><p>pigmento na pele, é causada pela falta de atividade da enzima</p><p>tirosinase, consequência da herança de alelos recessivos.</p><p>Características ou traços obser-</p><p>váveis em um organismo.</p><p>6</p><p>Área</p><p>Atributo</p><p>1818 Biologia MolecularBiologia Molecular</p><p>Figura 6</p><p>Rapaz albino</p><p>sondem</p><p>/Shutterstock</p><p>Introdução à Biologia Molecular 19</p><p>Com relação aos alelos, a genética</p><p>clássica considera, em geral, ape-</p><p>nas duas variações do gene, isto é, um alelo dominante e outro reces-</p><p>sivo. Entretanto, para alguns genes, a população pode ter dezenas de</p><p>alelos para um único gene. Essa distribuição de alelos é estudada na</p><p>genética de populações, em que a frequência de alelos e as mudanças</p><p>no genótipo 7 e fenótipo são avaliadas para se entender a suscetibili-</p><p>dade a doenças ou a resistência a condições adversas em diferentes</p><p>populações.</p><p>Já pensou como algumas pessoas conseguem ingerir álcool em maior quantidade sem efeitos visíveis, enquanto</p><p>outras, mesmo ingerindo uma quantidade pequena, sofrem mais com seus efeitos imediatos? A resposta está nos</p><p>genes. De acordo com estudos da pesquisadora americana Nicole Duranceaux e colaboradores (2008), algumas</p><p>populações apresentam maior tolerância ou suscetibilidade à ingestão alcoólica devido à presença de alelos especí-</p><p>ficos dos genes da enzima aldeído desidrogenase (ALDH2) e álcool desidrogenase (ADH1B). É o caso de populações</p><p>asiáticas, que apresentam um nível de resposta ao álcool bem elevado, sentindo os efeitos de sua ingestão bem</p><p>rapidamente, ao mesmo tempo em que sua suscetibilidade à dependência é bastante reduzida.</p><p>Curiosidade</p><p>Conjunto de genes herdados</p><p>dos pais.</p><p>7</p><p>O livro Princípios de Genética</p><p>de Populações aprofunda o</p><p>estudo do tema, discutindo</p><p>de que forma a análise de</p><p>frequências gênicas pode</p><p>ser utilizada em diversas</p><p>áreas, como no melhora-</p><p>mento de cultivos agrícolas</p><p>e na medicina preventiva.</p><p>Os autores apresentam</p><p>abordagens práticas de</p><p>modo simples e acessível,</p><p>auxiliando na compreensão</p><p>desse ramo da biologia.</p><p>HARTL, D. L., CLARK, A. G. Porto</p><p>Alegre: Artmed, 2010.</p><p>Livro</p><p>1.3 Conhecendo a Biologia Molecular</p><p>Vídeo Antes de iniciarmos um estudo mais aprofundado sobre o assun-</p><p>to, precisamos conhecer os conceitos e principais dogmas da Biolo-</p><p>gia Molecular. Sendo assim, nesta seção teremos um “quem é quem”</p><p>dentro desse campo de estudo. Listaremos e discutiremos breve-</p><p>mente alguns dos elementos que regem essa ciência.</p><p>Figura 7</p><p>Estrutura molecular de um</p><p>nucleotídeo (adenina)</p><p>Um nucleotídeo, formado por (da esquerda</p><p>para direita): um grupamento fosfato,</p><p>uma pentose (desoxirribose) e uma base</p><p>nitrogenada (adenina).</p><p>• Genoma: trata-se do conjunto de todos os genes de um</p><p>organismo. Entretanto, engana-se quem acredita que ele é</p><p>formado apenas por genes que conferem alguma caracte-</p><p>rística ao indivíduo. Na verdade, existem regiões no genoma</p><p>que são codificadoras (dão origem a proteínas) e outras não</p><p>codificadoras. Isso não significa, porém, que essas regiões</p><p>não apresentam função em nossos organismos; pelo con-</p><p>trário, muitas delas são extremamente importantes, seja</p><p>por transcreverem moléculas de RNA ou por regularem a</p><p>ação de outros genes.</p><p>• Nucleotídeos: trata-se das moléculas orgânicas formadas</p><p>por uma pentose (açúcar com cinco carbonos), uma base</p><p>nitrogenada e um grupamento fosfato (Figura 7). A pentose</p><p>de um nucleotídeo pode ser ribose ou desoxirribose, resul-</p><p>tando em RNA ou DNA, respectivamente.</p><p>20 Biologia Molecular</p><p>• Bases nitrogenadas: são moléculas que contêm um nitrogênio</p><p>em sua estrutura cíclica, apresentando, dessa forma, característi-</p><p>cas químicas básicas. Como sua função principal está associada à</p><p>construção dos nucleotídeos, também são denominadas nucleo-</p><p>bases. De acordo com o tipo de ligações que realizam, a quantida-</p><p>de de anéis aromáticos e a presença de grupamentos metila, as</p><p>nucleobases se dividem em: timina, citosina e uracila (denomina-</p><p>das pirimidinas) e adenina e guanina (purinas) (Figura 8).</p><p>• DNA: trata-se do ácido desoxirribonucleico; é formado pela união</p><p>de duas cadeias polinucleotídicas. Um polinucleotídio apresen-</p><p>ta uma grande quantidade de nucleotídeos unidos por ligações</p><p>covalentes. As cadeias polinucleotídicas do DNA se ligam uma à</p><p>outra pelas suas bases nitrogenadas formando uma dupla-hélice.</p><p>A estrutura dessa macromolécula pode ser extremamente con-</p><p>densada e compacta, dando origem aos cromossomos.</p><p>• RNA: trata-se do ácido ribonucleico, formado por uma fita simples.</p><p>Pode adotar diversas conformações e suas funções nas células são</p><p>inúmeras, atuando desde como catalizador na síntese proteica</p><p>até como molécula estrutural. Os mais conhecidos tipos de RNA</p><p>que atuam nos processos biomoleculares são o RNA mensageiro</p><p>(mRNA), o RNA de transferência (tRNA) e o RNA ribossomal (rRNA).</p><p>• Cromossomos: trata-se de estruturas nucleoproteicas que carre-</p><p>gam as informações genéticas. Um cromossomo é formado por</p><p>uma longa molécula de DNA compactada, juntamente</p><p>com algumas proteínas (Figura 8) que auxiliam</p><p>nos processos de replicação e transcrição do</p><p>DNA. Entre as proteínas encontradas nos cro-</p><p>mossomos de eucariotos estão as histonas,</p><p>proteínas de empacotamento que auxiliam na</p><p>compactação do DNA, atuando como um “car-</p><p>retel” para o enrolamento da estrutura, e as</p><p>chaperonas, proteínas que auxiliam no desen-</p><p>rolar do DNA, evitando que ocorram erros du-</p><p>rante os processos de replicação e transcrição.</p><p>• Cromatina: trata-se do cromossomo em sua</p><p>forma não condensada. Nessa forma, o DNA não</p><p>está completamente empacotado, mas já se encon-</p><p>Figura 8</p><p>Representação esquemá-</p><p>tica da estrutura de um</p><p>cromossomo eucarioto</p><p>Ve</p><p>ct</p><p>or</p><p>M</p><p>in</p><p>e/</p><p>Sh</p><p>ut</p><p>te</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck Cromossomo</p><p>Histona</p><p>DNA</p><p>Dupla-hélice</p><p>Fibra de</p><p>cromatina</p><p>Nucleossomo</p><p>Introdução à Biologia Molecular 21</p><p>tra enovelado em nucleossomos, que são porções da molécula</p><p>enroladas em torno de quatro histonas.</p><p>• Genes: como visto na seção 1.2, um gene é definido, molecular-</p><p>mente, como uma sequência de DNA que codifica para uma pro-</p><p>teína. Essa porção de DNA está localizada em regiões específicas</p><p>dos cromossomos. Durante a expressão gênica, essa sequência é</p><p>transcrita em uma molécula de RNA mensageiro, que será tradu-</p><p>zida na proteína equivalente.</p><p>• Alelos: são gerados pelas mutações de um gene. De maneira sim-</p><p>plificada, são versões do gene que vão produzir características</p><p>distintas no organismo. Existem genes com apenas dois alelos</p><p>(dominante e recessivo) e outros que possuem dezenas de alelos</p><p>diferentes. Como exemplo, o gene responsável pela produção de</p><p>moléculas MHC – marcadores celulares imunológicos – possuem</p><p>mais de 800 alelos. Outro exemplo são os padrões de manchas</p><p>em coelhos, que possuem quatro alelos diferentes, cuja combina-</p><p>ção gera quatro cores distintas de pelos: selvagem (aguti), chin-</p><p>chila, himalaia e albino (Figura 9).</p><p>Figura 9</p><p>Padrão de manchas em coelhos</p><p>Do</p><p>ri/</p><p>W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>Ca</p><p>rl</p><p>He</p><p>ue</p><p>r/</p><p>W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>Am</p><p>be</p><p>r/</p><p>W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>Wo</p><p>dl</p><p>in</p><p>a/</p><p>W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>O filme Gattaca discute</p><p>ética, eugenia e determi-</p><p>nismo genético, trazendo</p><p>uma reflexão interessan-</p><p>te sobre os limites do</p><p>melhoramento genético.</p><p>Em um futuro próximo,</p><p>a civilização baseia-se</p><p>na qualidade do mapa</p><p>genético dos indivíduos.</p><p>Assim, apenas porta-</p><p>dores de genes “ideais”</p><p>podem realizar tarefas</p><p>superiores, como cargos</p><p>de chefia e missões no</p><p>espaço.</p><p>Direção: Andrew Niccol. EUA:</p><p>Columbia Pictures Corporation, 1997.</p><p>Filme</p><p>A pelagem em coelhos é uma característica multialélica: selvagem (aguti) (A), chinchila (B),</p><p>himalaia (C) e albino (D).</p><p>A</p><p>C</p><p>B</p><p>D</p><p>22 Biologia Molecular</p><p>CONSIDERAÇÕES</p><p>FINAIS</p><p>Ao final da leitura deste capítulo, é possível ter uma noção da impor-</p><p>tância da Biologia Molecular na compreensão dos mecanismos da vida.</p><p>Responsável pelo estudo aprofundado das moléculas e processos que</p><p>garantem a hereditariedade, essa ciência nos presenteia com o conheci-</p><p>mento de como nos tornamos o que somos.</p><p>ATIVIDADES</p><p>1. Como funciona a cristalografia de raios-X, técnica responsável por</p><p>desvendar a estrutura do DNA?</p><p>2. Por que a genética clássica pode ser também definida como genética</p><p>mendeliana?</p><p>3. Todas as regiões do genoma produzem proteínas?</p><p>REFERÊNCIAS</p><p>DURANCEAUX, N., et al. Ethnic differences in level of response to alcohol between Chinese</p><p>americans and Korean americans.</p><p>Journal of studies on alcohol and drugs, v. 69, n. 2, p.</p><p>227-234, 2008.</p><p>LYRA, D.; COUTO, F.; MATIAS, F.; BANDEIRA, M. Reformulation of the genetic map in M.</p><p>guttatus x M. nasutus F2 hybrid population. Genetic map mimulus. Disponível em: https://</p><p>sites.google.com/site/geneticmapmimulus/home/novo-mapa-genetico. Acesso em: 28 jan.</p><p>2021.</p><p>MORANGE, M. A History of Molecular Biology. Cambridge: Harvard University Press, 2000.</p><p>Vídeo</p><p>Genética molecular 23</p><p>2</p><p>Genética molecular</p><p>A diferença entre as genéticas clássica e molecular reside, basi-</p><p>camente, no tipo de abordagem utilizada para se estudar a here-</p><p>ditariedade. Enquanto os estudos mendelianos (genética clássica)</p><p>se baseiam nas características observáveis do indivíduo – como o</p><p>formato do nariz, a cor dos olhos ou o tipo sanguíneo –, a aborda-</p><p>gem molecular visa discutir os mecanismos bioquímicos por trás</p><p>da transmissão dessas características.</p><p>Neste capítulo, vamos conhecer a estrutura da molécula fun-</p><p>damental da hereditariedade: o DNA. Também desvendaremos</p><p>sua dinâmica no interior de cada célula, isto é, como funciona sua</p><p>replicação e sua transcrição em uma molécula de RNA. Finalizando</p><p>o capítulo, discutiremos como a longa molécula de DNA é capaz</p><p>de se anelar no interior celular e produzir as estruturas compactas</p><p>conhecidas como cromossomos.</p><p>2.1 A molécula de DNA</p><p>Vídeo Para compreender a estrutura e o funcionamento do DNA, é neces-</p><p>sário abordar brevemente a química das moléculas orgânicas. O áci-</p><p>do desoxirribonucleico (ADN, em sua sigla em português, ou DNA, do</p><p>inglês deoxyribonucleic acid) é uma macromolécula orgânica, ou seja,</p><p>uma extensa molécula contendo carbono e formada pela ligação de</p><p>unidades menores denominadas monômeros.</p><p>Fica mais fácil compreender esse conceito fazendo uma analogia</p><p>com blocos de construir. Juntando vários bloquinhos (como os que são</p><p>apresentados mais adiante na Figura 1), podemos formar, por exemplo,</p><p>uma torre de brinquedo. Essa torre é similar a uma macromolécula,</p><p>que é constituída também pela repetição de “bloquinhos” – os monô-</p><p>meros. Por ser a união de várias dessas unidades, macromoléculas são</p><p>24 Biologia Molecular</p><p>comumente denominadas polímeros (dos termos em grego poli = mui-</p><p>tas e meros = partes).</p><p>Em uma molécula de DNA, os monômeros são os nucleotídeos.</p><p>Cada nucleotídeo é constituído por três grupos: uma molécula de fos-</p><p>fato, uma de açúcar (a pentose desoxirribose) e uma que apresenta</p><p>nitrogênio em sua composição e possui característica química básica,</p><p>motivo pelo qual é denominada base nitrogenada. As Figuras 2 e 3 apre-</p><p>sentam, respectivamente, uma representação esquemática de um nu-</p><p>cleotídeo e a sua estrutura química.</p><p>Figura 2</p><p>Representação esquemática de um nucleotídeo</p><p>Molécula</p><p>de</p><p>fosfato</p><p>Desoxirribose</p><p>(açúcar)</p><p>Base</p><p>nitrogenada</p><p>(citosina)</p><p>Nucleotídeo</p><p>(com citosina)</p><p>An</p><p>th</p><p>on</p><p>y P</p><p>au</p><p>l T</p><p>ay</p><p>lo</p><p>r/</p><p>Sh</p><p>ut</p><p>te</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>.</p><p>Figura 1</p><p>Estrutura de bloquinhos de</p><p>construção</p><p>Figura 3</p><p>Estrutura química de um nucleotídeo</p><p>Apresentando (da esquerda para a direita): grupamento</p><p>fosfato, açúcar (desoxirribose) e base nitrogenada</p><p>(adenina).</p><p>W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>gr</p><p>ay</p><p>ja</p><p>y/</p><p>Sh</p><p>ut</p><p>te</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Apesar de se repetirem ao longo da estrutura do</p><p>DNA, os nucleotídeos não são todos iguais, diferin-</p><p>do pelo tipo de base nitrogenada que possuem. Em</p><p>uma molécula de DNA, existem quatro bases: ade-</p><p>nina, timina, guanina e citosina. Duas dessas bases</p><p>– adenina e guanina – apresentam dois núcleos cí-</p><p>clicos em sua constituição e são denominadas pu-</p><p>rinas. As outras duas – timina e citosina – possuem</p><p>um único componente cíclico e formam o grupo das</p><p>pirimidinas.</p><p>As bases nitrogenadas apresentam uma função</p><p>estrutural essencial à integridade do DNA: ligam-se</p><p>entre si, mantendo unidas as duas fitas dessa macro-</p><p>molécula. Isso porque a molécula de DNA é formada</p><p>não por uma única sequência de monômeros, mas sim duas. Voltando</p><p>à nossa analogia, podemos pensar que, ao lado da primeira torre, adi-</p><p>cionamos agora uma segunda torre de bloquinhos, de mesmo com-</p><p>primento da primeira e ligada a ela por pontes que mantêm ambas</p><p>unidas. As pontes são as ligações existentes entre as bases nitrogena-</p><p>das, que ocorrerão de maneira específica.</p><p>Genética molecular 25</p><p>Assim, bases nitrogenadas do tipo timina, presentes em uma das fi-</p><p>tas do DNA, ligam-se às bases nitrogenadas do tipo adenina, presentes</p><p>em outra fita. De maneira similar, bases do tipo citosina se ligarão com</p><p>bases do tipo guanina, mantendo a estrutura de dupla fita estável. Na</p><p>Figura 4 é apresentada a fórmula estrutural plana das bases nitrogena-</p><p>das, indicando o pareamento específico entre elas.</p><p>Figura 4</p><p>Representa-</p><p>ção química</p><p>das bases</p><p>nitrogenadas</p><p>e das ligações</p><p>timina-adenina e</p><p>guanina-citosina</p><p>So</p><p>le</p><p>il</p><p>No</p><p>rd</p><p>ic</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Timina</p><p>Guanina</p><p>Adenina</p><p>Citosina</p><p>As conexões específicas entre as bases nitrogenadas das fitas opos-</p><p>tas são do tipo ligação de hidrogênio. Trata-se de uma ligação de atra-</p><p>ção eletrostática entre o átomo de hidrogênio – covalentemente ligado</p><p>a um elemento mais eletronegativo, como oxigênio, nitrogênio ou flúor</p><p>– e outro elemento também mais eletronegativo. Entre timina e ade-</p><p>nina são formadas duas ligações ou pontes de hidrogênio, enquanto</p><p>guanina e citosina realizam três dessas ligações.</p><p>Muitas moléculas, orgânicas e inorgânicas, apresentam ligações de hidrogênio. Essa</p><p>ligação é mais fraca do que as ligações covalentes ou iônicas, mas mais forte do que</p><p>as forças Van der Waals, sendo responsável pela estabilidade de compostos como água,</p><p>celulose, proteínas e o próprio DNA. Essas ligações aumentam os pontos de fusão e</p><p>evaporação, além de promoverem maior solubilidade e viscosidade nos compostos.</p><p>26 Biologia Molecular</p><p>No DNA, além de manterem as fitas unidas e estáveis, as ligações</p><p>de hidrogênio são responsáveis pelo dobramento e pela conformação</p><p>característica dessa molécula, originando uma dupla-hélice. Esse for-</p><p>mato helicoidal foi elucidado por Watson e Crick em 1953, com base</p><p>nos resultados obtidos pela equipe da pesquisadora Rosalind Franklin.</p><p>Na Figura 5, é possível observar uma representação esquemática da</p><p>molécula de DNA, evidenciando seu formato helicoidal e as ligações</p><p>específicas entre as bases nitrogenadas complementares.</p><p>Figura 5</p><p>Ilustração esquemática da molécula de DNA</p><p>So</p><p>le</p><p>il</p><p>No</p><p>rd</p><p>ic</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Pares de bases</p><p>Hélice de DNA</p><p>Cromossomo</p><p>Núcleo Célula</p><p>Timina</p><p>Guanina</p><p>Adenina</p><p>Citosina Esqueleto de</p><p>açúcar-fosfato</p><p>Perceba que os nucleotídeos são indicados com a primeira letra da</p><p>base nitrogenada que cada um contém: A para adenina; T para timina;</p><p>G para guanina; e C para citosina. Por convenção, e para facilitar a lei-</p><p>tura das sequências de DNA, esse formato deve ser adotado sempre</p><p>que indicarmos uma sequência de nucleotídeos no DNA. É importan-</p><p>te lembrar que essa macromolécula apresenta duas fitas e, ao indicar</p><p>uma cadeia de bases na primeira delas, deve-se ter em mente que a</p><p>segunda conterá as bases complementares.</p><p>2.1.1 Estrutura primária</p><p>A estrutura primária do DNA é formada pela sequência de nucleotí-</p><p>deos ligados em sua cadeia. É a estrutura mais simples dessa macromo-</p><p>Genética molecular 27</p><p>lécula; também é a forma em que ela se encontra quando desnaturada,</p><p>isto é, sem sua conformação bi e tridimensional.</p><p>Uma característica importante da estrutura primária do DNA é</p><p>a sua direcionalidade. Isso quer dizer que há um sentido especí-</p><p>fico para a leitura da sequência de bases. Esse sentido é indicado</p><p>como sendo 5’ → 3’. Mas o que isso significa? Para compreender essa</p><p>orientação, vamos retornar à estrutura química dos nucleotídeos e</p><p>às suas ligações.</p><p>O açúcar presente nos nucleotídeos é uma pentose; isso signifi-</p><p>ca que ele possui cinco carbonos ligados covalentemente e numera-</p><p>dos sequencialmente. Por regras de nomenclatura química, inicia-se</p><p>a contagem no carbono ligado à base nitrogenada, numerando os</p><p>demais em sentido anti-horário. Para diferenciar os carbonos da de-</p><p>soxirribose</p><p>daqueles do grupamento fosfato e da base nitrogenada,</p><p>é adotado um apóstrofo ao lado de cada número (Figura 6). Assim, no</p><p>nucleotídeo teremos os carbonos 1’, 2’, 3’, 4’ e 5’, sendo este último</p><p>ligado ao grupamento fosfato.</p><p>Figura 6</p><p>Indicação dos carbonos (1’ a 5’) na desoxirribose</p><p>Yi</p><p>kr</p><p>az</p><p>uu</p><p>l (</p><p>ta</p><p>lk</p><p>)/</p><p>W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>3’ 2’</p><p>1’4’</p><p>5’</p><p>(Desoxi)Ribose</p><p>Sabemos que o DNA é um polímero; dessa forma, seus nucleotí-</p><p>deos (considerando-se cada fita) devem estar covalentemente ligados</p><p>uns aos outros. A ligação que ocorre entre os nucleotídeos é do tipo</p><p>fosfodiéster, com a hidroxila presente no carbono 3’ de um nucleotí-</p><p>deo reagindo com o grupamento fosfato do nucleotídeo subsequente.</p><p>Na extremidade inicial da fita, é mantido o carbono 5’. A fita, portanto,</p><p>alonga-se nesse sentido: inicia no carbono 5’ do primeiro nucleotídeo e</p><p>finaliza no carbono 3’ do último (Figura 7), motivo pelo qual é definida a</p><p>direção de leitura da sequência do DNA como 5’ → 3’.</p><p>28 Biologia Molecular</p><p>Ligações fosfodiéster são covalentes e, portanto, bastante fortes. Elas garantem a in-</p><p>tegridade da fita de DNA e de seu esqueleto de açúcar-fosfato mesmo sob elevadas</p><p>temperaturas. Entretanto, não podemos dizer o mesmo das ligações de hidrogênio, res-</p><p>ponsáveis por manter unidas as duas fitas do DNA. Por serem mais fracas e de natureza</p><p>eletrostática, essas ligações se rompem com o aumento da temperatura, separando as</p><p>fitas complementares. Essa maior facilidade de separação, porém, apresenta seus bene-</p><p>fícios. Ao romper a ligação entre as fitas, o DNA se abre para a replicação (duplicação),</p><p>que será realizada por enzimas específicas no interior das células.</p><p>Em</p><p>re</p><p>T</p><p>er</p><p>im</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ckFigura 7</p><p>Fita simples de</p><p>DNA (sentido</p><p>5’-3’) com liga-</p><p>ções fosfodiéster</p><p>indicadas</p><p>5’-fosfato</p><p>3’-hidroxila</p><p>Ligações</p><p>fosfodiéster</p><p>A segunda fita do DNA também é polimerizada nesse sentido; entre-</p><p>tanto, ela se liga de maneira antiparalela à primeira fita, no sentido 3’-5’</p><p>(Figura 8). De maneira simplificada, podemos imaginar essa fita com-</p><p>plementar posicionada invertida ou de ponta-cabeça. Apesar desse po-</p><p>sicionamento, a duplicação da fita complementar também seguirá o</p><p>Genética molecular 29</p><p>sentido convencional, e ela será percorrida pelas enzimas da replicação</p><p>da extremidade 5’ para a 3’.</p><p>Figura 8</p><p>Dupla-hélice de</p><p>DNA com a fita</p><p>5’-3’ e sua fita</p><p>complementar</p><p>3’-5’ unidas por</p><p>ligações de</p><p>hidrogênio entre</p><p>suas bases</p><p>nitrogenadas</p><p>1</p><p>vo</p><p>lta</p><p>d</p><p>a</p><p>es</p><p>pi</p><p>ra</p><p>l –</p><p>3</p><p>,4</p><p>n</p><p>m</p><p>DNA dupla hélice</p><p>Adenina (A)</p><p>Timina (T)</p><p>Guanina (G)</p><p>Citosina (C)</p><p>3’</p><p>3’</p><p>5’</p><p>5’</p><p>Esqueleto de</p><p>açúcar-fosfato</p><p>Zv</p><p>ita</p><p>liy</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>2.1.2 Estrutura secundária</p><p>A estrutura secundária da molécula de DNA se refere à confor-</p><p>mação tridimensional das cadeias de nucleotídeos, que originam a</p><p>dupla-hélice. As principais forças responsáveis por esse arranjo são as</p><p>ligações de hidrogênio que ocorrem entre as bases nitrogenadas de</p><p>ambas as fitas.</p><p>Como as bases se ligam de maneira específica – adenina com ti-</p><p>mina e guanina com citosina –, a sequência de nucleotídeos nas fitas</p><p>não será a mesma, mas sim complementar. O Quadro 1 apresenta um</p><p>exemplo de sequência de nucleotídeos na fita 5’-3’ e a respectiva se-</p><p>quência complementar na fita 3’-5’.</p><p>Quadro 1</p><p>Exemplo de sequência de nucleotídeos nas fitas de DNA</p><p>Orientação Sequência</p><p>5’ → 3’ A T G C T A G T C C A G T C A G</p><p>3’ → 5’ T A C G A T C A G G T C A G T C</p><p>Fonte: elaborado pela autora.</p><p>30 Biologia Molecular</p><p>Apesar de serem ligações fracas, a grande quantidade de ligações de</p><p>hidrogênio na molécula de DNA garante sua estabilidade e a conforma-</p><p>ção de dupla-hélice. O número de ligações, de fato, varia com o tamanho</p><p>e com a complexidade do genoma de cada organismo. Enquanto a bac-</p><p>téria Escherichia coli, utilizada como modelo em diversos estudos genéti-</p><p>cos pela sua relativa simplicidade genômica, apresenta 4,6 milhões de</p><p>pares de bases realizando ligações de hidrogênio, nossa espécie – Homo</p><p>sapiens – possui 3,2 bilhões. Entretanto, há casos em que mesmo orga-</p><p>nismos de menor complexidade apresentam genomas extremamente</p><p>longos, como é o caso da planta Paris japonica, organismo com o maior</p><p>genoma documentado do mundo (Figura 9), com incríveis 148,8 bilhões</p><p>de pares de bases em seu DNA (HIDALGO et al., 2017).</p><p>Figura 9</p><p>Paris japonica</p><p>H.</p><p>Ta</p><p>na</p><p>ka</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Na molécula de DNA, a dupla-héli-</p><p>ce é formada, majoritariamente, pela</p><p>sua rotação à direita; é a conforma-</p><p>ção DNA-B. Outras formas já foram</p><p>descritas na literatura (NEIDLE, 1994),</p><p>mas são bem mais raras e dificilmente</p><p>se encontram no interior celular, sal-</p><p>vo quando há alguma alteração em</p><p>sequências específicas da molécula</p><p>DNA-B. Entre essas formas distintas,</p><p>estão o DNA-A, em que a dupla-hélice</p><p>rotaciona para esquerda, e o DNA-Z,</p><p>que, além de girar para a esquerda,</p><p>apresenta o seu esqueleto de açúcar-</p><p>-fosfato em ziguezague (Figura 10).</p><p>Figura 10</p><p>Conformações secundárias do DNA</p><p>DNA A DNA B DNA Z</p><p>Sulco</p><p>Sulco</p><p>maior</p><p>Sulco</p><p>maior</p><p>Sulco</p><p>menor</p><p>Sulco</p><p>menor</p><p>Genética molecular 31</p><p>A estrutura secundária do DNA-B completa uma volta da hélice a</p><p>cada 3,4 nm ou 10 pares de bases, aproximadamente. Isso significa que</p><p>cada par de bases nitrogenadas está afastado do seguinte por 0,34 nm.</p><p>Essa curta distância garante a sua compacidade, evitando a ligação de</p><p>outros íons ou moléculas indesejadas. Mesmo assim, é importante que</p><p>haja áreas livres para ligação de proteínas associadas aos mecanismos</p><p>de replicação e transcrição do DNA. Essas áreas são as depressões ou</p><p>sulcos – maior e menor – existentes na molécula (Figura 10).</p><p>2.1.3 Estrutura terciária</p><p>As fitas de DNA podem adotar outras conformações tridimensionais</p><p>pelo seu dobramento e enovelamento. Nesse caso, forma-se uma es-</p><p>trutura terciária na molécula. Quando está ativo na célula, o DNA se</p><p>encontra enrolado em proteínas que auxiliam nos processos de dupli-</p><p>cação do material genético e transmissão das características hereditá-</p><p>rias. A esse DNA é dado o nome de cromatina.</p><p>O dobramento do DNA e sua compactação por meio de enrolamentos</p><p>terciários são importantes para que ele possa ser armazenado no interior</p><p>celular. Isso porque, caso estivesse completamente esticada, uma molé-</p><p>cula de DNA teria, aproximadamente, dois metros de comprimento.</p><p>Quando a célula se encontra em divisão, a cromatina é sub-</p><p>metida à duplicação e a intenso enovelamento, que permitem a</p><p>transferência do material genético às células-filhas. Essa croma-</p><p>tina compactada e super enovelada é denominada cromossomo</p><p>(Figura 11). Apesar de ser comum na literatura a representação</p><p>do DNA na forma de cromossomo, ele permanece pouco tempo</p><p>nessa configuração, que é bastante instável. Com efeito, have-</p><p>rá simultaneamente trechos da molécula que estarão</p><p>condensados enquanto outros estarão livres,</p><p>dependendo das regiões que estão sendo</p><p>acessadas. As sequências não enove-</p><p>ladas permitem a ligação de molécu-</p><p>las atuantes na transcrição de genes</p><p>em RNA, que posteriormente pode-</p><p>rá ser traduzido em proteínas para</p><p>a célula.</p><p>Figura 11</p><p>Da sequência linear de DNA</p><p>(estrutura primária) ao eno-</p><p>velamento e constituição</p><p>do cromossomo</p><p>M. PATTHAWEE/Shutterstock</p><p>32 Biologia Molecular</p><p>2.1.4 Replicação do DNA</p><p>Um dos requisitos necessários para que uma molécula seja capaz</p><p>de transmitir características hereditárias é a sua capacidade de dupli-</p><p>cação. O DNA cumpre essa condição, produzindo diversas cópias de si</p><p>mesmo por meio do processo de replicação.</p><p>A replicação do DNA é do tipo semiconservativa, isto é, cada fita ser-</p><p>virá de molde para a polimerização de uma fita nova. A nova molécula</p><p>terá 50% da molécula-mãe, e os demais 50% serão formados pela fita</p><p>filha sintetizada, razão pela qual se adotou o termo semiconservativo</p><p>para esse processo (Figura 12).</p><p>Figura 12</p><p>Replicação semiconservativa do DNA</p><p>Fitas parentais</p><p>Primeira</p><p>geração de</p><p>fitas-filhas</p><p>Segunda</p><p>geração de</p><p>fitas-filhas</p><p>Li</p><p>za</p><p>nn</p><p>e</p><p>Ko</p><p>ch</p><p>–</p><p>lg</p><p>ko</p><p>ch</p><p>/W</p><p>ik</p><p>im</p><p>ed</p><p>ia</p><p>C</p><p>om</p><p>m</p><p>on</p><p>s</p><p>A replicação do DNA é realizada em três etapas, que são comuns a</p><p>todos os organismos: iniciação, alongamento e terminação. Para cum-</p><p>prir essas etapas e garantir que todo o DNA seja corretamente – e rapi-</p><p>damente – replicado, atuam diversas enzimas e proteínas específicas.</p><p>A etapa de iniciação visa desfazer as ligações de hidrogênio em regiões</p><p>específicas do DNA, chamadas de origem de replicação, e mantê-lo aberto</p><p>para que a principal enzima de polimerização – a DNA polimerase – sinte-</p><p>Isótopos são versões de um</p><p>elemento químico que diferem</p><p>entre si pela quantidade de</p><p>nêutrons em seu núcleo.</p><p>1</p><p>O primeiro experimento a confir-</p><p>mar a replicação semiconserva-</p><p>tiva do DNA foi conduzido pelos</p><p>pesquisadores Matt Meselson</p><p>e Franklin Stahl, em 1954. Em</p><p>seus ensaios, os pesquisadores</p><p>marcaram moléculas de DNA</p><p>com um isótopo 1 pesado do</p><p>nitrogênio, o N15. Depois, acom-</p><p>panharam a replicação de uma</p><p>dessas moléculas em um meio</p><p>de cultura contendo apenas o</p><p>isótopo mais leve, o N14. A ideia</p><p>era verificar se a molécula-filha</p><p>seria formada por ambos os ni-</p><p>trogênios (caso a replicação fosse</p><p>realmente semiconservativa)</p><p>ou se apresentaria apenas um</p><p>deles, o que corroboraria a ideia</p><p>de duplicação conservativa, sem</p><p>a presença das fitas parentais na</p><p>molécula-filha.</p><p>Para detectar a presença dos</p><p>nitrogênios, Meselson e Stahl</p><p>realizaram uma técnica de</p><p>centrifugação diferencial em</p><p>Césio, que permite separar as</p><p>substâncias com base em suas</p><p>densidades. Como resultado,</p><p>eles identificaram ambos os</p><p>nitrogênios na fita recém-sinte-</p><p>tizada, o que indicou a presença</p><p>das fitas parental e filha na nova</p><p>molécula gerada.</p><p>Saiba mais</p><p>Genética molecular 33</p><p>tize uma nova fita por meio do molde de uma das fitas originais. A enzima</p><p>responsável por essa etapa inicial de rompimento das ligações de hidro-</p><p>gênio é a helicase, que reconhecerá a sequência de nucleotídeos que ca-</p><p>racteriza a origem de replicação. Em geral, essa sequência contém maior</p><p>quantidade de pares de bases A+T, que apresentam apenas duas ligações</p><p>de hidrogênio e, portanto, são quebradas mais facilmente.</p><p>Uma vez rompidas as ligações, é formada uma forquilha de replica-</p><p>ção, e as fitas de DNA devem permanecer afastadas, evitando assim a</p><p>reconstrução das ligações e da dupla-hélice. Para isso, proteínas deno-</p><p>minadas SSB (sigla para a expressão em inglês Single Strand Binding, ou</p><p>proteínas de ligação de DNA fita simples) se ligam rapidamente a esses</p><p>trechos abertos, impedindo a sua religação.</p><p>Antes de iniciar a síntese da nova fita, é necessário que seja pro-</p><p>duzida uma sequência iniciadora de nucleotídeos, denominada primer.</p><p>Essa sequência é necessária porque a DNA polimerase só é capaz de</p><p>adicionar nucleotídeos na extremidade 3’ do DNA, e não consegue</p><p>produzir uma fita por síntese de novo, isto é, a partir do zero. Assim,</p><p>uma outra enzima, a primase, produzirá uma pequena sequência de</p><p>RNA (fita simples), complementar à origem de replicação. Esse primer</p><p>sintetizado reconhecerá a sequência exposta pela helicase e se ligará</p><p>ao DNA molde, ativando a DNA polimerase. Durante todo o processo,</p><p>a enzima DNA topoisomerase é responsável por evitar o superenrola-</p><p>mento do DNA na região subsequente à forquilha de replicação, reali-</p><p>zando quebras temporárias no DNA para aliviar a tensão e catalisando</p><p>novas ligações covalentes.</p><p>A etapa seguinte é a de alongamento e envolve a adição de nucleotí-</p><p>deos à extremidade 3’ do primer pela DNA polimerase. Existem diversos</p><p>tipos de DNA polimerases tanto em procariotos (DNA pol I, II, III, IV e V)</p><p>quanto em eucariotos (DNA pol α, β, γ e δ), entretanto suas atividades</p><p>são bastante similares em ambos os grupos. Essas polimerases apre-</p><p>sentam, ainda, uma atividade de exonuclease e podem corrigir erros na</p><p>replicação, removendo nucleotídeos em ambos os sentidos, 5’-3’ e 3’-5’.</p><p>Os nucleotídeos adicionados pela DNA polimerase à fita crescente</p><p>são encontrados livres na célula na forma de dNTPs, isto é, desoxirri-</p><p>bonucleotídeos fosfatados. Diferentemente dos nucleotídeos presen-</p><p>tes na molécula do DNA, eles apresentam três grupamentos fosfato.</p><p>Quando os nucleotídeos são ligados à sequência de DNA na reação ca-</p><p>34 Biologia Molecular</p><p>talisada pela enzima, dois desses fosfatos são quebrados e liberados,</p><p>gerando energia. Essa energia é fundamental para o processo de repli-</p><p>cação, que é altamente endergônico 2 .</p><p>Durante o alongamento, uma das fitas originais será lida no senti-</p><p>do 3’-5’, resultando em uma fita complementar sintetizada no sentido</p><p>5’-3’. Essa fita é denominada fita líder. Isso porque ela será construída</p><p>de maneira contínua pela DNA polimerase, e apenas um primer será</p><p>necessário para sua polimerização.</p><p>A fita 5’-3’, entretanto, servirá de molde para uma fita complementar</p><p>3’-5’. Como a DNA polimerase só consegue adicionar nucleotídeos na</p><p>extremidade 3’, essa fita deverá ser sintetizada em partes (pequenos</p><p>pedaços no sentido 5’-3’) e precisará de diversos iniciadores para que</p><p>sua polimerização seja levada a efeito. Essa fita recebe o nome de fita</p><p>tardia ou atrasada, e sua síntese leva à produção de diversos fragmen-</p><p>tos, conhecidos como fragmentos de Okazaki.</p><p>A etapa de terminação tem início quando todo o DNA foi replicado.</p><p>Nessa fase final, os primers de RNA são removidos por outra DNA poli-</p><p>merase, enquanto os fragmentos de Okazaki são unidos pela atividade</p><p>da enzima DNA ligase. A Figura 13 apresenta esquematicamente as eta-</p><p>pas e moléculas envolvidas no processo de replicação do DNA.</p><p>DNA parental</p><p>DNA polimerase</p><p>DNA original</p><p>Topoisomerase</p><p>Fita tardia</p><p>Fita líder</p><p>Fragmento</p><p>de Okazaki</p><p>Primer de</p><p>RNA Primase</p><p>Helicase</p><p>De</p><p>si</p><p>gn</p><p>ua</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Figura 13</p><p>Representação esquemática da replicação do DNA</p><p>É importante salientar que, em células de eucariotos, o DNA apre-</p><p>senta diversas origens de replicação, garantindo a rapidez no processo</p><p>de duplicação dessa molécula. Por sua vez, a maioria das bactérias –</p><p>como Escherichia coli – apresenta uma única origem de replicação. Em</p><p>ambos os grupos, entretanto, a região é rica nas bases nitrogenadas</p><p>timina e adenina, o que facilita o processo de separação da dupla fita</p><p>naquele ponto específico.</p><p>Processo químico não espontâ-</p><p>neo, que necessita de energia</p><p>para ocorrer.</p><p>2</p><p>Em Jurassic Park: o parque</p><p>dos dinossauros, enge-</p><p>nheiros genéticos recriam</p><p>o DNA dos dinossauros,</p><p>complementando as</p><p>sequências com DNA de</p><p>anfíbios. Na cena em que</p><p>o “Sr. DNA” explica como</p><p>foi realizado o processo,</p><p>discute-se brevemente</p><p>sobre a estrutura e a</p><p>função do DNA nos</p><p>organismos.</p><p>Direção: Steven Spielberg. Estados</p><p>Unidos: Amblin Entertainment, 1993.</p><p>Filme</p><p>Genética molecular 35</p><p>2.2 Estrutura e função do RNA</p><p>Vídeo O ácido ribonucleico (ARN, em sua sigla em português, ou RNA, do</p><p>inglês ribonucleic acid) é estruturalmente similar ao DNA. Assim como</p><p>essa molécula, seus nucleotídeos são unidos por ligações fosfodiéster e</p><p>apresentam um núcleo de açúcar-fosfato ligado a bases nitrogenadas.</p><p>Entretanto, algumas diferenças estruturais no RNA garantem a ele fun-</p><p>ções bastante distintas daquelas do DNA.</p><p>Uma das principais diferenças está no açúcar presente nos nucleo-</p><p>tídeos do RNA: trata-se da ribose, que difere da desoxirribose pela pre-</p><p>sença de uma hidroxila no carbono 2’ (Figura 14).</p><p>Figura 14</p><p>Representação</p><p>química dos</p><p>açúcares ribose</p><p>(RNA) e desoxir-</p><p>ribose (DNA)</p><p>Ribose Desoxirribose</p><p>Ba</p><p>cs</p><p>ic</p><p>a/</p><p>Sh</p><p>ut</p><p>te</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Apesar de parecer sutil, essa diferença na composição da pentose</p><p>atribui ao RNA uma maior instabilidade, tornando-o mais suscetível à de-</p><p>gradação em condições desfavoráveis do meio (e.g., temperaturas eleva-</p><p>das, lise química, quebra mecânica) quando comparado ao DNA. De fato,</p><p>por ser mais estável, o DNA é a molécula responsável pela transmissão</p><p>dos caracteres hereditários, ficando ao encargo do RNA as atividades de</p><p>curto prazo, como o transporte de moléculas e a síntese proteica.</p><p>Outros pontos de diferenças estruturais entre RNA e DNA se encon-</p><p>tram na substituição da base</p><p>timina pela uracila (ambas pirimidinas) e na</p><p>sua conformação de fita simples (Figura 15). Apesar de não possuir uma</p><p>estrutura secundária em dupla-hélice, o RNA comumente apresenta pa-</p><p>reamentos internos entre suas bases, constituindo estruturas secundá-</p><p>rias e terciárias que serão úteis para o desempenho de suas funções.</p><p>36 Biologia Molecular</p><p>Figura 15</p><p>Diferenças</p><p>estruturais entre</p><p>as moléculas de</p><p>RNA e DNA</p><p>RNA (ácido</p><p>ribonucleico)</p><p>Adenina</p><p>Guanina</p><p>Citosina</p><p>TiminaUracila</p><p>DNA (ácido</p><p>desoxirribonucleico)</p><p>Sh</p><p>ad</p><p>eD</p><p>es</p><p>ig</p><p>n/</p><p>Sh</p><p>ut</p><p>te</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Entre as funções do RNA, a síntese de proteínas é aquela que mais</p><p>se destaca, haja vista sua importância para a vida de todos os organis-</p><p>mos. Nesse processo, o RNA atuará em três formas distintas: RNA men-</p><p>sageiro (mRNA), RNA transportador (tRNA) e RNA ribossomal (rRNA).</p><p>O RNA mensageiro é sintetizado por meio de uma sequência de DNA</p><p>pela enzima RNA polimerase em um processo denominado transcri-</p><p>ção. A sequência de nucleotídeos sintetizados será complementar ao</p><p>DNA molde, de maneira similar ao que acontece na replicação do DNA;</p><p>entretanto, uracila – e não timina – será a base que se ligará de modo</p><p>complementar à adenina na sequência a ser transcrita. Esse RNA men-</p><p>sageiro será posteriormente traduzido em proteínas com o auxílio do</p><p>RNA transportador e do RNA ribossomal, que apresentam estruturas</p><p>adaptadas para o desempenho dessas funções.</p><p>No Quadro 2, é apresentado um exemplo de sequência de DNA</p><p>molde e a sequência de mRNA correspondente obtida por meio da</p><p>transcrição.</p><p>Quadro 2</p><p>Exemplo de mRNA obtido por meio de uma sequência de DNA</p><p>Molécula Sequência</p><p>DNA molde A T G C T A G T C C A G T C A G</p><p>mRNA U A C G A U C A G G U C A G U C</p><p>O livro O mundo do RNA</p><p>apresenta a molécula</p><p>como protagonista,</p><p>discutindo a estrutura e a</p><p>função de suas diversas</p><p>formas. Também aborda</p><p>os fundamentos e as dife-</p><p>renças da transcrição em</p><p>procariotos e eucariotos e</p><p>os mecanismos de conta-</p><p>minação dos RNA vírus.</p><p>FIALHO, A. M.; ARRAIANO, C. M.</p><p>Lisboa: Lidel, 2007.</p><p>Livro</p><p>Fonte: elaborado pela autora.</p><p>Genética molecular 37</p><p>2.3 Cromossomos: empacotando o DNA</p><p>Vídeo Os cromossomos podem ser entendidos como pacotes de DNA; são</p><p>a forma que os organismos encontraram de transmitir uma gigantesca</p><p>quantidade de informação em uma embalagem reduzida.</p><p>Conforme apresentado na subseção 2.1.3, a molécula de DNA se</p><p>enovela, juntamente com proteínas, e adota uma forma conhecida</p><p>como cromatina. Essa forma filamentosa e ainda pouco condensada é</p><p>aquela em que o DNA poderá ser encontrado na maior parte do tempo.</p><p>As principais moléculas que auxiliam nesse enovelamento em eucario-</p><p>tos são as histonas, proteínas hidrofílicas e de caráter básico.</p><p>Trechos de DNA enovelados com histonas são denominados nu-</p><p>cleossomos. Nessa estrutura, as fitas de DNA se enrolam ao redor de</p><p>um disco proteico, contendo quatro moléculas de histonas (Figura 16).</p><p>Além de sua evidente função estrutural, que permite a compactação do</p><p>material genético, as histonas também atuam na regulação gênica, per-</p><p>mitindo o acesso a sequências específicas de DNA à medida que é ne-</p><p>cessária a síntese de RNA.</p><p>Figura 16</p><p>Histonas e a</p><p>formação de</p><p>nucleossomos</p><p>no DNA de</p><p>organismos</p><p>eucariotos</p><p>DNA</p><p>Nucleossoma</p><p>Cromossomo</p><p>Histonas De</p><p>si</p><p>gn</p><p>ua</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Quando células somáticas 3 se dividem, é necessário que</p><p>todo o material genético seja duplicado e separado em duas</p><p>células-filhas. Para isso, é importante que os filamentos de cro-</p><p>matina dispersos no núcleo (em eucariotos) ou na região nu-</p><p>cleoide do citoplasma (em procariotos) sejam condensados e</p><p>individualizados dos demais conteúdos celulares. A essa cromatina ex-</p><p>tremamente condensada durante o processo de divisão celular é dado</p><p>o nome de cromossomo.</p><p>Células responsáveis pela</p><p>constituição de órgãos e tecidos</p><p>e que se dividem por mitose.</p><p>3</p><p>38 Biologia Molecular</p><p>Bactérias, em geral, possuem um único filamento circular de DNA e,</p><p>portanto, um único cromossomo a ser duplicado. Células eucariontes,</p><p>entretanto, ao condensar seus filamentos de cromatina, evidenciam</p><p>mais do que uma estrutura cromossômica.</p><p>A quantidade de cromossomos varia de acordo com a espécie. Hu-</p><p>manos apresentam 46 cromossomos em células somáticas e 23 em</p><p>gametas 4 , enquanto gatos apresentam 38 (19 em gametas) e cães, 78</p><p>(39 em gametas). A quantidade de cromossomos, entretanto, não está</p><p>ligada diretamente à complexidade dos organismos, e espécies mais</p><p>simples podem exibir um número elevado dessas moléculas. É o caso</p><p>da borboleta Polyommatus atlantica, que apresenta impressionantes</p><p>446 cromossomos em suas células somáticas (LUKHTANOV, 2015).</p><p>No núcleo, os cromossomos de eucariotos se encontram em pares</p><p>– os cromossomos homólogos –, um deles herdado do genoma ma-</p><p>terno e o outro, do paterno. Células que apresentam essa quantidade</p><p>par de cromossomos são diploides (2n). Gametas, que contêm metade</p><p>do material genético do indivíduo, são células haploides (n). Em seres</p><p>humanos, são 22 pares de cromossomos autossômicos e um par de</p><p>cromossomos sexuais, que podem ser X ou Y. A presença de dois cro-</p><p>mossomos X confere características femininas ao indivíduo, enquan-</p><p>to um cromossomo X e outro Y atribuem caracteres masculinos. Na</p><p>Figura 17, é apresentado o cariótipo (conjunto cromossômico diploide)</p><p>da espécie humana.</p><p>Figura 17</p><p>Cariótipo humano – masculino e feminino</p><p>Ka</p><p>te</p><p>ry</p><p>na</p><p>K</p><p>on</p><p>/S</p><p>hu</p><p>tte</p><p>rs</p><p>to</p><p>ck</p><p>Masculino Feminino</p><p>Células associadas à reprodução</p><p>sexuada; em humanos, são</p><p>denominadas óvulos (feminino)</p><p>e espermatozoides (masculino).</p><p>4</p><p>Baseado em uma história</p><p>real, o filme O óleo de</p><p>Lorenzo aborda a busca</p><p>de tratamento por uma</p><p>família cujo filho de seis</p><p>anos é diagnosticado com</p><p>adenoleucodistrofia, um</p><p>problema genético ligado</p><p>ao cromossomo X.</p><p>Direção: George Miller. Estados</p><p>Unidos: Universal Pictures, 1992.</p><p>Filme</p><p>Genética molecular 39</p><p>Durante a divisão celular, cada cromossomo (filamento de cromati-</p><p>na condensado) é duplicado, originando dois braços, denominados cro-</p><p>mátides-irmãs. Essas cromátides permanecem ligadas em uma região</p><p>conhecida como centrômero, até sua separação e destinação às célu-</p><p>las-filhas geradas na divisão celular. Assim, cada célula diploide gerada</p><p>vai receber uma cópia exata de cada um dos cromossomos existentes</p><p>na célula original.</p><p>CONSIDERAÇÕES</p><p>FINAIS</p><p>A estrutura e os mecanismos de replicação do DNA confirmam seu</p><p>papel como molécula da hereditariedade. Menos estável, o RNA é a mo-</p><p>lécula-chave no processo de síntese proteica. Os cromossomos transpor-</p><p>tam a informação genética do DNA para células-filhas e contêm genes de</p><p>origem materna e paterna, atribuindo características fenotípicas únicas a</p><p>cada indivíduo.</p><p>ATIVIDADES</p><p>1. Qual é a diferença entre a fita líder e a fita tardia, sintetizadas pela DNA</p><p>polimerase durante a replicação do DNA?</p><p>2. Por que o DNA, e não o RNA, é a molécula responsável pela transmissão</p><p>dos caracteres hereditários?</p><p>3. Quais são as funções das histonas no DNA eucarioto?</p><p>REFERÊNCIAS</p><p>HIDALGO, O. et al. Is there an upper limit to genome size? Trends in Plant Science, v. 22, n. 7,</p><p>p. 567-573, maio 2017.</p><p>LUKHTANOV, V. A. The blue butterfly Polyommatus (Plebicula) atlanticus (Lepidoptera,</p><p>Lycaenidae) holds the record of the highest number of chromosomes in the non-polyploid</p><p>eukaryotic organisms. Comparative Cytogenetics, v. 9, n. 4, p. 683-690, out. 2015.</p><p>NEIDLE, S. DNA structure and recognition. Oxford; Nova York: IRL Press at Oxford University</p><p>Press, 1994.</p><p>Vídeo</p><p>40 Biologia Molecular</p><p>3</p><p>Compreendendo os</p><p>genes e os genomas</p><p>Na molécula de DNA estão inseridas todas as informações ge-</p><p>néticas de um indivíduo. Características físicas, comportamentais e</p><p>a produção do maquinário celular originam-se a partir dessa mo-</p><p>lécula, componente de todas as células dos organismos. Mas, se</p><p>o DNA é o mesmo, o que diferencia um neurônio de uma célula</p><p>muscular? Ou as células da epiderme daquelas presentes nos rins</p><p>ou no fígado? A resposta está nos genes.</p><p>Neste</p>