pralle-et-al-2020-hyperketonemia-gwas-and-parity-dependent-snp-associations-in-holstein-dairy-cows-intensively-sampled pt

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<p>Descarregado de journals.physiology.org/journal/physiolgenomics (2804:014D:1A87:D742:C4C4:027A:2E93:E861) em 18 de junho de</p><p>2024.</p><p>Physiol Genomics 52: 347-357, 2020.</p><p>Publicado pela primeira vez em 6 de julho de 2020; doi:10.1152/physiolgenomics.00016.2020.</p><p>ARTIGO DE INVESTIGAÇÃO Estudos de associação de todo o genoma e função</p><p>GWAS da hipercetonemia e associações SNP dependentes da paridade em</p><p>vacas leiteiras da raça Holstein objeto de amostragem intensiva para a</p><p>concentração de β-hidroxibutirato no sangue</p><p>Ryan S. Pralle, Nichol E. Schultz, Heather M. White e Kent A. Weigel</p><p>Departamento de Ciência dos Lacticínios, Universidade de Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin</p><p>Enviado em 24 de fevereiro de 2020; aceite na forma final em 2 de julho de 2020</p><p>Pralle RS, Schultz NE, White HM, Weigel KA. Hipercetonemia</p><p>GWAS e associações SNP dependentes da paridade em vacas</p><p>leiteiras Holstein amostradas intensivamente para a concentração de</p><p>β-hidroxibutirato no sangue. Fisiologia Genômica 52: 347-357,</p><p>2020. Publicado pela primeira vez em 6 de julho de 2020; doi:</p><p>10.1152 / physiolgenomics.00016.2020.-Hipercetonemia (HYK) é</p><p>um distúrbio metabólico que afeta vacas leiteiras no início do pós-</p><p>parto; no entanto, tem havido sucesso limitado na identificação de</p><p>variantes genômicas que contribuem para a suscetibilidade ao HYK.</p><p>Realizámos um estudo de associação do genoma (GWAS) utilizando</p><p>fenótipos HYK baseados num protocolo de rastreio intensivo,</p><p>interrogámos as interacções genotípicas com o grupo de paridade</p><p>(GWIS) e avaliámos o enriquecimento de vias metabólicas anotadas.</p><p>As vacas Holstein foram inscritas na experiência após o parto e foram</p><p>colhidas amostras de sangue em quatro momentos, entre 5 e 18 dias</p><p>após o parto. A concentração sanguínea de β-hidroxibutirato (BHB)</p><p>foi quantificada ao lado da vaca através de um medidor de BHB</p><p>portátil. As vacas foram rotuladas como um caso HYK quando pelo</p><p>menos uma amostra de sangue tinha BHB ≥ 1,2 mmol / L, e todas as</p><p>outras vacas foram c o n s i d e r a d a s controles não HYK. Após os</p><p>procedimentos de controlo de qualidade, 1.710 vacas e 58.699</p><p>genótipos estavam disponíveis para análise posterior. O GWAS e o</p><p>GWIS foram realizados utilizando o método de modelo linear misto</p><p>forward feature select. Houve provas de uma associação entre ARS-</p><p>BFGL-NGS-91238 e a suscetibilidade ao HYK, bem como</p><p>associações dependentes da paridade ao HYK para</p><p>BovineHD0600024247 e BovineHD1400023753. Os genes</p><p>candidatos anotados para estas associações de polimorfismo nuclear</p><p>único foram previamente associados à obesidade, diabetes, resistência</p><p>à insulina e fígado gordo em seres humanos e modelos de roedores. A</p><p>análise de enriquecimento revelou a adesão focal e a orientação</p><p>axonal como vias metabólicas que contribuem para a etiologia do</p><p>HYK, enquanto a variação genética nas vias relacionadas com a</p><p>secreção e sensibilidade à insulina pode afetar a suscetibilidade ao</p><p>HYK de forma dependente da paridade. Em conclusão, o presente</p><p>trabalho propõe várias novas associações de marcadores e vias</p><p>metabólicas que contribuem para o risco genético de suscetibilidade</p><p>ao HYK.</p><p>BHB; vacas leiteiras; GWAS; hipercetonemia; cetose</p><p>INTRODUÇÃO</p><p>A hipercetonemia (HYK) é um distúrbio metabólico comum</p><p>em vacas leiteiras no início do pós-parto, com uma prevalência</p><p>que varia entre</p><p>10,3 a 53,2% em todos os estudos (18, 30, 56, 59, 83). A</p><p>progressão do HYK é impulsionada pelo balanço energético</p><p>negativo no início do pós-parto (7a, 32, 33), que promove a</p><p>lipólise adiposa e a cetogénese hepática (32, 45, 91). O β-</p><p>hidroxibutirato (BHB) sanguíneo, um produto da cetogénese, é</p><p>o metabolito de referência para o HYK, sendo as concentrações</p><p>de BHB ≥ 1,2 mmol/L consideradas casos positivos de HYK</p><p>(20, 59, 80). As consequências negativas associadas ao HYK</p><p>incluem um maior risco de comorbilidades,</p><p>Assine o DeepL Pro para traduzir documentos maiores.</p><p>Visite www.DeepL.com/pro para mais informações.</p><p>http://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00016.2020</p><p>http://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00016.2020</p><p>https://www.deepl.com/pro?cta=edit-document&pdf=1</p><p>Physiol Genomics - doi:10.1152/physiolgenomics.00016.2020 - www.physiolgenomics.org</p><p>Descarregado de journals.physiology.org/journal/physiolgenomics (2804:014D:1A87:D742:C4C4:027A:2E93:E861) em 18 de junho de</p><p>2024.</p><p>diminuição da eficiência reprodutiva, perdas produtivas e</p><p>abate antes da maturidade (26, 59, 73, 88). Estas</p><p>consequências associadas culminam numa perda económica</p><p>total de $375 e $256 por caso de HYK para vacas primíparas</p><p>e multíparas, respetivamente (60). Melhorar a rentabilidade e</p><p>a saúde das vacas leiteiras através da gestão genética levou a</p><p>várias investigações que avaliaram a hereditariedade do</p><p>HYK. A maioria das investigações baseou-se em registos</p><p>voluntários (auto-registados) de produtores, estimando a</p><p>hereditariedade entre 0,02 e 0,17 em vacas Holstein (42, 43,</p><p>68, 99). Esta grande variação na hereditariedade pode refletir</p><p>o facto de os registos voluntários não fornecerem fenótipos</p><p>consistentes e precisos para HYK devido à variabilidade nos</p><p>protocolos de diagnóstico, cumprimento dos protocolos e</p><p>procedimentos de registo. Além disso, o curto tempo de</p><p>resolução, o dia variável de incidência e a natureza subclínica</p><p>do HYK requerem a quantificação repetida de BHB no</p><p>sangue no início da lactação para diagnosticar o HYK com</p><p>precisão (56, 59, 67). A estimativa da hereditariedade de um</p><p>fenótipo binário de HYK com base em</p><p>A amostragem de BHB no sangue forneceu uma estimativa de</p><p>0,07 (90).</p><p>Os estudos de associação de todo o genoma (GWAS), os</p><p>estudos de interação de todo o genoma (GWIS) e as análises</p><p>de enriquecimento de vias metabólicas são métodos para</p><p>dissecar ainda mais a arquitetura genética das características.</p><p>Estas análises podem ajudar na descoberta de variantes</p><p>genéticas, genes e vias essenciais para a etiologia das</p><p>doenças, fornecendo candidatos para experiências</p><p>reducionistas (87). Além disso, o refinamento dos</p><p>componentes genéticos essenciais para o risco de HYK pode</p><p>ser utilizado para uma seleção genética melhorada e integrado</p><p>em esquemas de gestão de HYK orientados com base no risco</p><p>genético (90, 98). Utilizando uma população de vacas Jersey</p><p>dos EUA, Parker Gaddis et al.</p><p>(69) propuseram vários polimorfismos de nucleotídeo único</p><p>(SNP) associados ao HYK com base no tamanho do efeito</p><p>padronizado. Os genes próximos e a análise subsequente das</p><p>vias sugeriram a regulação da insulina, o metabolismo lipídico</p><p>e a resposta imunitária como vias metabólicas que contribuem</p><p>para a suscetibilidade ao HYK. Klein et al. (43) identificaram</p><p>associações de SNP candidatos com HYK numa população de</p><p>Holsteins alemães, com genes proximais relacionados com</p><p>diabetes e obesidade. No entanto, nenhum destes estudos</p><p>identificou SNP ou vias metabólicas que fossem significativas</p><p>após a correção de testes múltiplos (43, 68). Ambos os estudos</p><p>basearam-se em fenótipos de conveniência sem práticas de</p><p>diagnóstico padronizadas de HYK (43, 68). Leal Yepes et al.</p><p>(51) realizaram GWAS para um fenótipo HYK com base em</p><p>amostras repetidas de BHB num pequeno número de vacas</p><p>Holstein (n = 128) e sugeriram várias associações SNP. Os</p><p>genes candidatos propostos estavam geralmente relacionados</p><p>com a regulação do metabolismo energético e do metabolismo</p><p>das lipoproteínas.</p><p>Levantámos a hipótese de um estudo genómico da</p><p>suscetibilidade ao HYK</p><p>utilizando fenótipos baseados num processo intensivo de</p><p>rastreio de HYK</p><p>Correspondência: R. S. Pralle (e-mail: praller@uwplatt.edu). tocol resultaria na deteção de SNP significativos ao nível do</p><p>genoma</p><p>1094-8341/20 Direitos de autor © 2020 Sociedade Americana de Fisiologia 347</p><p>http://www.physiolgenomics.org/</p><p>mailto:praller@uwplatt.edu</p><p>Physiol Genomics - doi:10.1152/physiolgenomics.00016.2020 - www.physiolgenomics.org</p><p>Descarregado de journals.physiology.org/journal/physiolgenomics (2804:014D:1A87:D742:C4C4:027A:2E93:E861) em 18 de junho de</p><p>2024.</p><p>348 HIPERCETONEMIA</p><p>XF, Liu Y, Lv QZ, Liu GL, Zhang JG, Li XY.</p><p>Potencial Nexo de Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica e Diabetes</p><p>Mellitus Tipo 2: Insulin Resistance Between Hepatic and Peripheral</p><p>Tissues (Resistência à Insulina entre Tecidos Hepáticos e Periféricos).</p><p>Front Phar- macol 9: 1566, 2019. doi: 10.3389 / fphar.2018.01566.</p><p>64. Nguyen NLT, Barr CL, Ryu V, Cao Q, Xue B, Bartness TJ. 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Ann Hepatol 15: 190 -199, 2016.</p><p>doi:10.5604/16652681.</p><p>1193709.</p><p>http://www.physiolgenomics.org/</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.2016-12085</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.2015-10154</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.2017-13583</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.2017-13583</p><p>https://doi.org/10.1017/S0022029916000807</p><p>https://doi.org/bioRxiv%2010.1101/2020.01.01.892455</p><p>https://doi.org/bioRxiv%2010.1101/2020.01.01.892455</p><p>https://doi.org/10.1186/s12864-017-3754-y</p><p>https://doi.org/10.2337/dc11-1853</p><p>https://doi.org/10.2337/dc11-1853</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.2012-6035</p><p>https://doi.org/10.1007/BF00284110</p><p>https://doi.org/10.1007/BF00284110</p><p>https://doi.org/10.1053/j.gastro.2016.05.051</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.2011-4417</p><p>https://doi.org/10.1371/journal.pone.0013929</p><p>https://doi.org/10.1186/1297-9686-43-10</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.2012-5702</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.2012-6440</p><p>https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2017.06.005</p><p>https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2017.06.005</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.2006-560</p><p>https://doi.org/10.5604/16652681.1193709</p><p>https://doi.org/10.5604/16652681.1193709</p><p>365HIPERCETONEMIA GWAS E GWIS</p><p>Physiol Genomics - doi:10.1152/physiolgenomics.00016.2020 - www.physiolgenomics.org</p><p>Descarregado de journals.physiology.org/journal/physiolgenomics (2804:014D:1A87:D742:C4C4:027A:2E93:E861) em 18 de junho de</p><p>2024.</p><p>90. Weigel KA, Pralle RS, Adams H, Cho K, Do C, White HM. Previsão</p><p>do risco do genoma completo para a seleção e gestão da hipercetonemia</p><p>em bovinos leiteiros Holstein. J Anim Breed Genet 134: 275-285, 2017.</p><p>doi:10. 1111/jbg.12259.</p><p>91. White HM. The Role of TCA Cycle Anaplerosis in Ketosis and Fatty</p><p>Liver in Periparturient Dairy Cows (O papel da anaplerose do ciclo TCA</p><p>na cetose e no fígado gordo em vacas leiteiras periparturientes). Animais</p><p>(Basileia) 5: 793-802, 2015. doi:10.3390/ani5030384.</p><p>92. Widmer C, Lippert C, Weissbrod O, Fusi N, Kadie C, Davidson R,</p><p>Listgarten J, Heckerman D. Outras melhorias nos modelos lineares</p><p>mistos para estudos de associação de todo o genoma. Sci Rep 4: 6874,</p><p>2014. doi:10.1038/srep06874.</p><p>93. Wiggans GR, Sonstegard TS, VanRaden PM, Matukumalli LK,</p><p>Schnabel RD, Taylor JF, Schenkel FS, Van Tassell CP. Selection of</p><p>single-nucleotide polymorphisms and quality of genotypes used in</p><p>genomic evaluation of dairy cattle in the United States and Canada</p><p>(Seleção de polimorfismos de nucleótido único e qualidade dos genótipos</p><p>utilizados na avaliação genómica de bovinos leiteiros nos Estados Unidos</p><p>e no Canadá). J Dairy Sci 92: 3431-3436, 2009. doi:10.3168/jds.2008-</p><p>1758.</p><p>94. Wiggans GR, VanRaden PM, Bacheller LR, Tooker ME, Hutchison</p><p>JL, Cooper TA, Sonstegard TS. Seleção e gestão de ADN</p><p>marcadores para utilização na avaliação genómica. J Dairy Sci 93: 2287-</p><p>2292, 2010. doi:10.3168/jds.2009-2773.</p><p>95. Wozniak MA, Modzelewska K, Kwong L, Keely PJ. Focal adhesion</p><p>regulation of cell behavior (Regulação da adesão focal do comportamento</p><p>celular). Biochim Biophys Ata 1692: 103-119, 2004.</p><p>doi:10.1016/j.bbamcr.2004.04.007.</p><p>96. Xia F, He Z, Li K, Wang X, Dong J. Avaliação do papel da desnervação</p><p>simpática na função hepática. Hepatol Res 36: 259 -264, 2006.</p><p>doi:10.1016/j.hepres.2006.08.009.</p><p>97. Youssef MA, El-Ashker MR, Younis MS. O efeito da cetose subclínica</p><p>em índices de sensibilidade à insulina e variáveis metabólicas</p><p>seleccionadas em gado leiteiro de transição. Comp Clin Pathol 26: 329 -</p><p>334, 2017. doi:10.1007/ s00580-016-2377-z.</p><p>98. Zhang Z, Ober U, Erbe M, Zhang H, Gao N, He J, Li J, Simianer H.</p><p>Melhorar a exatidão da previsão do genoma completo para características</p><p>complexas utilizando os resultados de estudos de associação alargada do</p><p>genoma. PLoS One 9: e93017, 2014. doi:10.1371/journal.pone.0093017.</p><p>99. Zwald NR, Weigel KA, Chang YM, Welper RD, Clay JS. Genetic</p><p>selection for health traits using producer-recorded data. I. Taxas de</p><p>incidência, estimativas de hereditariedade e valores de reprodução do</p><p>reprodutor. J Dairy Sci 87: 4287- 4294, 2004. doi:10.3168/jds.S0022-</p><p>0302(04)73573-0.</p><p>http://www.physiolgenomics.org/</p><p>https://doi.org/10.1111/jbg.12259</p><p>https://doi.org/10.3390/ani5030384</p><p>https://doi.org/10.1038/srep06874</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.2008-1758</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.2008-1758</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.2009-2773</p><p>https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2004.04.007</p><p>https://doi.org/10.1016/j.hepres.2006.08.009</p><p>https://doi.org/10.1007/s00580-016-2377-z</p><p>https://doi.org/10.1371/journal.pone.0093017</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302%2804%2973573-0</p><p>https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302%2804%2973573-0</p><p>GWAS E GWIS</p><p>rm</p><p>e vias metabólicas. Os objectivos do presente trabalho foram</p><p>utilizar uma população de vacas Holstein com um fenótipo</p><p>HYK baseado em múltiplas medições de BHB no início da</p><p>lactação (90) para 1) descobrir qualquer SNP associado à</p><p>suscetibilidade ao HYK, 2) identificar associações de SNP</p><p>com HYK dependentes do grupo de paridade (primíparas vs.</p><p>multíparas), e 3) inferir vias genéticas enriquecidas dentro do</p><p>SNP associado à suscetibilidade ao HYK.</p><p>MATERIAIS E MÉTODOS</p><p>Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comité</p><p>de Cuidados e Utilização de Animais da Faculdade de Agricultura e</p><p>Ciências da Vida da Universidade de Wisconsin-Madison.</p><p>As vacas leiteiras Holstein (n = 1.903) de três explorações leiteiras</p><p>privadas do sul do Wisconsin e do Centro de Investigação de Gado</p><p>Leiteiro Emmons Blaine da Universidade de Wisconsin-Madison</p><p>foram registadas para avaliação do fenótipo HYK (72, 90). As vacas</p><p>foram afectadas a um grupo de contemporaneidade rebanho-ano-</p><p>estação (HYS) (10 níveis) com estações</p><p>GWAS. O teste de associação foi efectuado com o método Feature</p><p>For- ward Selection (FFselect) para testar os efeitos aditivos dos SNP</p><p>em todo o genoma (76). Em resumo, o método FFselect estende o</p><p>modelo linear misto melhorado para GWAS proposto por Widmer et</p><p>al.</p><p>(92), incorporando uma matriz de relação de ambiente partilhado para</p><p>além da matriz de relação genómica (GRM) que compreende uma</p><p>mistura de duas GRMs componentes (uma construída a partir de</p><p>todos os SNP e outra construída a partir de SNP seleccionados que</p><p>prevêem bem o fenótipo). Este método melhora o poder de detetar</p><p>associações modelando de forma mais precisa o efeito de loci de</p><p>grande efeito, enquanto a retenção da GRM de todos os SNP reduz os</p><p>falsos positivos devido à estrutura populacional confusa ou ao</p><p>parentesco críptico. A execução foi efectuada com a função</p><p>lrgprApply do pacote R lrgpr (36) e foi utilizado o seguinte modelo</p><p>estatístico geral:</p><p>yijk =µ+ paridadei + SNPj + uk + εijk</p><p>em que yijk é o fenótipo HYK binário para uma dada vaca com média</p><p>global µ; paridadej é a covariável de efeito fixo do número de</p><p>paridade; SNPj é o efeito aditivo de substituição do SNP; uk é um</p><p>efeito aleatório com uma média de distribuição igual a zero e uma</p><p>matriz de covariância igual a</p><p>definida como uma data de parto no intervalo de janeiro a março,</p><p>abril a junho, julho a setembro, ou outubro a dezembro. Um sangue RM</p><p>ponderada</p><p>σ2 , em que RM é uma matriz de relações constituída por um</p><p>Uma amostra de um vaso coccígeo foi obtida de cada vaca</p><p>imediatamente após o regresso ao alojamento em free-stall da</p><p>colheita de leite da manhã e 1 hora após o acesso à alimentação. A</p><p>frequência de amostragem foi de duas vezes por semana, com 3 ou 4</p><p>dias de intervalo, de modo a que estivessem disponíveis quatro</p><p>medições para cada vaca entre os 5 e os 18 dias pós-parto, inclusive.</p><p>Cada amostra de sangue foi analisada ao lado da vaca para determinar</p><p>a concentração de BHB com o medidor de glicose e cetonas no</p><p>sangue Precision Xtra (Abbott Diabetes Care, Alameda, CA; 8 grupos</p><p>HYS) ou o medidor de cetonas no sangue BHBCheck (PortaCheck,</p><p>Moorestown, NJ; 2 grupos HYS), que foram validados para utilização</p><p>em bovinos leiteiros com um desempenho de diagnóstico semelhante</p><p>(6, 40, 74). As vacas foram diagnosticadas com HYK se o BHB</p><p>sanguíneo ≥</p><p>1,2 mmol/L e comunicadas ao pessoal da exploração para tratamento</p><p>de HYK de acordo com o procedimento operacional normalizado da</p><p>respectiva exploração. Foi atribuído um fenótipo binário de HYK a</p><p>cada vaca, em que as vacas com um BHB sanguíneo máximo</p><p>observado ≥ 1,2 mmol/L foram rotuladas de HYK [1] e as restantes</p><p>vacas rotuladas como controlos sem HYK [0].</p><p>Os genótipos de SNP imputados foram fornecidos pelo Council on</p><p>Dairy Cattle Breeding (Bowie, MD) e representaram 60 671 SNP</p><p>implementados rotineiramente em avaliações genómicas nos EUA:</p><p>Illumina BovineLD BeadChip (32% das vacas com genótipo;</p><p>Illumina, San Diego, CA), Zoetis Low Density (23% das vacas com</p><p>genótipo; Zoetis, Parsippany, NJ), Zoetis Low Density Version 4</p><p>(20% das vacas com genótipo; Zoetis), Zoetis Low Density Version 2</p><p>(10% das vacas com genótipo; Zoetis), Illumina BovineSNP50</p><p>BeadChip Version 2 (5% das vacas com genótipo; Illumina) e</p><p>GeneSeek Genomic Profiler LD Version 4 (5% das vacas com</p><p>genótipo; Neogen, Lincoln, NE). As coordenadas genómicas do SNP</p><p>fornecido foram actualizadas de acordo com a versão mais recente</p><p>do conjunto do genoma Bos taurus (versão 106, ARS-UCD 1.2).</p><p>Os procedimentos de controlo da qualidade dos genótipos</p><p>foram efectuados no ambiente estatístico R (versão 3.4.5),</p><p>utilizando procedimentos do pacote GenABEL (versão 1.8) (5).</p><p>Vacas fenotipadas com genótipos indisponíveis (n = 100),</p><p>registadas como cruzadas (n = 9), gémeas (n = 4 pares, exclusão</p><p>aleatória de uma vaca em cada par), ou com uma taxa de chamada</p><p>de genótipo 0,15). Após o controlo de qualidade, restaram 1 710 vacas de</p><p>raça pura da raça Holstein com 58 699 SNP de qualidade para o</p><p>GWAS.</p><p>http://www.physiolgenomics.org/</p><p>Descarregado de journals.physiology.org/journal/physiolgenomics (2804:014D:1A87:D742:C4C4:027A:2E93:E861) em 18 de junho de</p><p>2024.</p><p>349HIPERCETONEMIA GWAS E GWIS</p><p>rm</p><p>mistura de matrizes de relações de três componentes. A Matriz de</p><p>Relação 1 (RM1) é uma matriz de relação ambiental com o elemento</p><p>RM1lm (l, m = 1, 2, . . ., n) igual a 1 para indivíduos que partilham o</p><p>mesmo HYS e 0 para indivíduos de grupos HYS diferentes. A</p><p>Matriz de Relação 2 (RM2) é uma matriz de relação genómica com</p><p>o elemento RM2lm (l, m = 1, 2, . . ., n) calculado a partir de um</p><p>subconjunto de marcadores genéticos associados a características</p><p>seleccionadas. A matriz de relação 3 (RM3) é uma matriz de relação</p><p>genómica com o elemento RM3lm (l, m = 1, 2, . . ., n) calculado a</p><p>partir de todos os marcadores genéticos. RM2 e RM3 são matrizes</p><p>de relações genómicas centradas, calculadas multiplicando a matriz</p><p>genotípica centrada pela sua transposição e dividindo pelo número</p><p>de marcadores. RM1, RM2 e RM3 são ponderadas pelas suas</p><p>contribuições para a variância desconhecida (σ2 ). O efeito aleatório</p><p>u é equivalente à soma dos efeitos genéticos HYS e aditivos. Para</p><p>efeitos de GWAS, não é necessário estimar explicitamente cada um</p><p>destes efeitos. O erro residual aleatório é denotado como εijk . Os</p><p>componentes da variância foram estimados por máxima</p><p>verosimilhança. SNP dentro de 1 MB de um SNP de teste individual</p><p>foram excluídos do RM2 para evitar contaminação proximal (ou</p><p>seja, contagem dupla). A significância do efeito de um SNP foi</p><p>testada pela estatística de Wald. A inflação genómica (λ) das</p><p>estatísticas de teste do SNP para cada GWAS foi calculada pelo</p><p>método mediano da função estlambda() no pacote R GenABEL</p><p>(versão 1.8) (5). Os valores P do GWAS foram fornecidos à função</p><p>p.adjust do R e corrigidos para multiplicidade pelo método da taxa</p><p>de falsa descoberta (10). As associações individuais de SNP foram</p><p>consideradas estatisticamente significativas quando Q ≤ 0,05 e</p><p>marginalmente significativas quando 0,05</p><p>interação entre os efeitos aditivos do</p><p>SNP e o grupo de paridade (primíparas vs. multíparas). Para</p><p>aumentar o poder de deteção, foi implementado um método GWIS</p><p>em duas etapas, conforme proposto por Kooperberg e LeBlanc (46).</p><p>Primeiro, os SNP foram filtrados com base em associações doença-</p><p>genótipo em que os SNP com valores de P do GWAS</p><p>- www.physiolgenomics.org</p><p>Descarregado de journals.physiology.org/journal/physiolgenomics (2804:014D:1A87:D742:C4C4:027A:2E93:E861) em 18 de junho de</p><p>2024.</p><p>Tabela 2. Estatísticas de associação para o estudo de associação do genoma da hipercetonemia e para o estudo de interação</p><p>do genótipo com o grupo de paridade</p><p>Polimorfismo de nucleótido único Valor P Valor Q</p><p>Modelo Covariável Nome Chr Posição GWAS GWIS GWAS GWIS</p><p>Paridade</p><p>ARS-BFGL-NGS-91238 10 3856662 1.54 × 10—6 0.09</p><p>BovinoHD1600004315 16 15375298 2.25 × 10—5 0.55</p><p>BTB-00318749 7 70336255 2.82 × 10—5 0.55</p><p>Grupo Parity</p><p>BovinoHD0600024247 6 86882515 5.29 × 10—4 5.33 × 10—4 0.03</p><p>BovinoHD1400023753 14 81538205 2.02 × 10—4 2.73 × 10—3 0.09</p><p>O estudo de associação de todo o genoma (GWAS) e o estudo de interação de genótipos (GWIS) foram executados utilizando o método de seleção de</p><p>características avançadas. As estatísticas do GWAS representam a associação do efeito aditivo do genótipo na hipercetonemia, enquanto as estatísticas do GWIS</p><p>representam a interação do grupo de paridade e do genótipo na hipercetonemia. Valor Q: Para o GWAS e o GWIS separadamente, os valores P foram fornecidos</p><p>à função p.adjust do R (versão 3.4.5) e corrigidos para multiplicidade utilizando o método da taxa de descoberta falsa (método = "FDR"). Covariável do</p><p>modelo: Designação da forma como o efeito fixo da covariável foi codificado quando a paridade é contínua e o grupo de paridade é binário (primíparas versus</p><p>multíparas). Chr, cromossoma de Bos taurus.</p><p>GWIS de HYK para o grupo de paridade. Após a</p><p>filtragem baseada na associação doença-genótipo,</p><p>encontrámos 64 SNP disponíveis para avaliação da sua</p><p>interação P × G. Foi detectada uma interação P × G</p><p>significativa para a paridade no caso do bovino</p><p>HD0600024247 (P = 5,3 × 10—4 , Q = 0,03; Quadro 2) e</p><p>foi detectada uma evidência marginal de uma interação P ×</p><p>G no caso do bovino HD1400023753 (P = 2,7 × 10—3 , Q =</p><p>0,09; Quadro 2). Genes</p><p>dentro de 500 KB destes SNP são apresentados no Quadro 3;</p><p>nomeadamente, o BovineHD1400023753 foi encontrado na</p><p>sequência de codificação da cadeia alfa 1 do colagénio tipo</p><p>XIV (COL14A1).</p><p>Evidências de enriquecimento para 20 vias KEGG foram</p><p>detectadas para genes proximais ao SNP identificado por P ×</p><p>GWIS, com 14 e seis demonstrando evidências</p><p>significativas (Q ≤ 0.05) ou marginais (0.07 ≤ Q ≤ 0.10),</p><p>respetivamente (Tabela 5). Curiosamente, 16 vias</p><p>compartilham anotações de genes com seis ou mais outras</p><p>vias com valores n variando de 0,30 a 0,69 (Fig. 3). As vias</p><p>metabólicas com maior sobreposição foram a via de</p><p>sinalização do cAMP (bta04024, P = 2,2 × 10—3 , Q =</p><p>0,02), a secreção de insulina (bta04911, P = 4,1 × 10—3 , Q</p><p>= 0,02) e a síntese e secreção de aldosterona (bta04925, P</p><p>= 7,6 × 10—3 , Q = 0,04). A digestão e absorção de</p><p>proteínas (bta04974, P = 0,01, Q = 0,05) foi a única via que</p><p>não partilhou genes com qualquer outra via detalhada no</p><p>quadro 5.</p><p>DISCUSSÃO</p><p>Neste estudo, o nosso objetivo foi descobrir as variantes</p><p>genómicas, os processos biológicos e as vias metabólicas</p><p>associadas à</p><p>com a suscetibilidade ao HYK através de GWAS, GWIS e</p><p>análise de enriquecimento. Isto foi efectuado utilizando um</p><p>fenótipo de HYK intensivo determinado pela amostragem</p><p>repetida das concentrações de BHB no sangue de vacas no</p><p>período de alto risco do início da lactação. A ocorrência de</p><p>casos de HYK é difícil de comparar entre experiências porque</p><p>a proporção de casos subclínicos é uma função da frequência</p><p>dos testes e da janela de elegibilidade de dias pós-parto para</p><p>testes (56, 59, 67). O precedente para uma avaliação de alta</p><p>qualidade da incidência de HYK são os testes repetidos de</p><p>concentração de BHB no sangue, que ocorrem em 2 (ou mais)</p><p>dias por semana durante as primeiras 2-3 semanas após o parto</p><p>(56, 59, 60, 67). As experiências com menos medições</p><p>semanais de BHB no sangue, que utilizam outros diagnósticos</p><p>de HYK para além da concentração de BHB no sangue, ou que</p><p>se baseiam na notificação voluntária de casos, podem</p><p>subnotificar significativamente a incidência de HYK em</p><p>comparação (56, 60, 67); assim, referimo-nos à proporção de</p><p>casos de HYK destas experiências como prevalência. As</p><p>estimativas de prevalência do HYK baseadas no BHB</p><p>sanguíneo variam entre 10,3 e 21,8% (18, 30, 80). A</p><p>prevalência de HYK é menor em experiências que utilizam</p><p>registos voluntários fornecidos pelos proprietários de vacas</p><p>leiteiras, variando entre 0,2 e 10,0% (42-44, 99). McArt et al.</p><p>(58) e Mahrt et al. (56) implementaram protocolos de análise</p><p>intensiva de BHB no sangue e observaram incidências de</p><p>HYK superiores às do presente estudo, 43,2% e 53,2%,</p><p>respetivamente. As suas maiores incidências de HYK podem</p><p>dever-se a uma amostragem mais frequente de BHB ou a</p><p>diferenças nas condições ambientais, em particular na gestão</p><p>da exploração. Além disso, Mahrt et al. (56) monitorizaram a</p><p>BHB durante um período mais longo, 3-42 dias</p><p>Fig. 2. Gráfico de Manhattan representando o</p><p>logaritmo deca-dico negativo de valores P de</p><p>polimorfismo de nucleotídeo único de um estudo de</p><p>associação de todo o genoma para hipercetonemia</p><p>em vacas Holstein de lactação precoce (n = 1.710)</p><p>usando a metodologia de modelo linear misto de</p><p>seleção de recursos avançados. As linhas tracejadas</p><p>horizontais indicam que os limiares de significância</p><p>http://www.physiolgenomics.org/</p><p>353HIPERCETONEMIA GWAS E GWIS</p><p>Physiol Genomics - doi:10.1152/physiolgenomics.00016.2020 - www.physiolgenomics.org</p><p>Descarregado de journals.physiology.org/journal/physiolgenomics (2804:014D:1A87:D742:C4C4:027A:2E93:E861) em 18 de junho de</p><p>2024.</p><p>são lavanda, laranja e vermelho para associações</p><p>putativas (P ≤ 5,0 × 10—5 ), marginais (0,05</p><p>0 pares de bases indica que o SNP reside no respetivo gene. A coluna Chromosome (Chr) indica o cromossoma Bos taurus. Significância identifica</p><p>o estudo genómico em que o polimorfismo de nucleótido único apresentou provas de associação com a suscetibilidade à hipercetonemia. As estatísticas de</p><p>associação são apresentadas na Tabela 2 e no texto.</p><p>pós-parto, e a sua maior incidência poderia refletir um tempo</p><p>de observação mais longo. No entanto, esperava-se que o</p><p>procedimento de monitorização do BHB sanguíneo utilizado</p><p>no presente trabalho diagnosticasse 95% dos casos de HYK</p><p>(Oetzel GR, dados não publicados). Por conseguinte, nós</p><p>Tabela 4. Vias metabólicas da Enciclopédia Kyoto de Genes</p><p>e Genomas enriquecidas para hipercetonemia com base nos</p><p>genes próximos dos polimorfismos de nucleótido único</p><p>associados</p><p>Termo KEGG FE Valor P Valor Q</p><p>Adesão focal bta04510 1.9 6.5 × 10—4 0.03</p><p>Orientação dos axónios bta04360 2.1 1.5 × 10—3 0.03</p><p>Potenciação a longo prazo bta04015 2.3 5.9 × 10—3 0.06</p><p>Via de sinalização Rap1 bta04720 1.7 7.5 × 10—3 0.06</p><p>Ativação das plaquetas bta04611 1.9 7.8 × 10—3 0.06</p><p>Depressão a longo prazo bta04151 2.3 8.3 × 10—3 0.06</p><p>Junção de lacunas bta04810 2.1 8.4 × 10—3 0.06</p><p>Regulação do citoesqueleto de actina bta04540 1.7 0.01 0.06</p><p>Via de sinalização PI3K-Akt bta04730 1.5 0.01 0.06</p><p>Contração do músculo liso vascular bta04270 1.8 0.02 0.07</p><p>Proteólise mediada por ubiquitina bta04120 1.8 0.02 0.09</p><p>Os polimorfismos associados à hipercetonemia foram determinados por</p><p>associação geral (P</p><p>noutras espécies. A</p><p>HYK bovina e o fígado gordo, uma doença comórbida (32,</p><p>33), têm características metabólicas em comum com doenças</p><p>humanas, como a obesidade, o diabetes mellitus tipo 2 (T2D)</p><p>e a doença hepática gorda não alcoólica (NAFLD). Entre as</p><p>características metabólicas em comum estão a adiposidade, a</p><p>esteatose hepática e a resistência à insulina (11, 12, 32, 63,</p><p>79); por conseguinte, são discutidos genes candidatos</p><p>previamente associados a estas doenças ou características</p><p>metabólicas.</p><p>Foram identificados vários genes candidatos geralmente</p><p>relacionados com a adipogénese e a obesidade, incluindo o</p><p>recetor 2 do neuropeptídeo FF (NPFFR2), a Ectonucleótido</p><p>Pirofosfatase/Fosfodiesterase 2 (ENPP2), a proteína de</p><p>interação mTOR contendo o domínio DEP (DEPTOR) e o</p><p>COL14A1. A expressão de ENPP2 impede a adipogénese em</p><p>ratinhos com obesidade induzida por dieta (27, 66). Os</p><p>polimorfismos anotados na NPFFR2 foram associados ao</p><p>índice de massa corporal em humanos (39). Além disso, o</p><p>NPFFR2 tem sido implicado como um alvo farmacológico</p><p>para gerir a obesidade, particularmente através da redução da</p><p>ingestão alimentar (57, 70). Existe alguma controvérsia quanto</p><p>ao papel do DEPTOR na regulação da adipogénese e da</p><p>obesidade, em que a sobreexpressão sistémica e específica do</p><p>hipotálamo do DEPTOR em ratinhos demonstrou proteção</p><p>contra a obesidade induzida pela dieta em ratinhos</p><p>transgénicos (16), mas estes resultados não foram</p><p>recapitulados quando especificamente sobreexpressos em</p><p>neurónios proopiomelanocortina de ratinho do hipotálamo</p><p>(17). Num modelo de ratinho transgénico DEPTOR induzido</p><p>por doxiciclina, a adiposidade foi promovida pela sobre-</p><p>expressão induzida de DEPTOR (50). Para além disso, o</p><p>conteúdo proteico de DEPTOR no tecido adiposo branco era</p><p>maior em humanos obesos do que em magros (50). Estudos de</p><p>microarray demonstraram uma expressão aumentada de</p><p>COL14A1 no fígado e no tecido adiposo de ratinhos com</p><p>obesidade induzida por dieta (48, 49, 53). Nas vacas leiteiras,</p><p>a pontuação da condição corporal e a perda extensiva da</p><p>condição corporal no periparto são factores de risco</p><p>estabelecidos para a incidência de HYK (11, 30, 72); por</p><p>conseguinte, estes genes candidatos sugerem que a</p><p>predisposição genética para HYK foi mediada em parte pela</p><p>obesidade das vacas.</p><p>Genes candidatos associados à DM2 e à resistência à</p><p>insulina</p><p>incluíam a proteína GC de ligação à vitamina D (GC),</p><p>Tripartite Motif Containing 36 (TRIM36) e ENPP2. Nos seres</p><p>humanos, as variantes genómicas da GC foram associadas à</p><p>concentração de insulina no plasma em jejum (35, 81) e à</p><p>tolerância oral à glicose (7); além disso, a proteína plasmática</p><p>de ligação à vitamina D foi inversamente associada a índices</p><p>de resistência à insulina em adolescentes do sexo masculino</p><p>(4). A análise da rede de co-expressão de dados de microarray</p><p>hepático sugeriu o TRIM36 como um gene semente; no</p><p>entanto, a expressão do ARNm do TRIM36 não foi alterada</p><p>em modelos hepáticos resistentes à insulina (52). A metilação</p><p>diferencial do TRIM36 no tecido adiposo também foi</p><p>associada ao estado de T2D (65). Anteriormente discutido</p><p>para um papel na adipogénese, a expressão do mRNA do</p><p>ENPP2 foi aumentada no tecido adiposo de indivíduos com</p><p>T2D (13) e associada à resistência à insulina em ratos com</p><p>obesidade induzida por dieta (66). Em geral, estes genes</p><p>candidatos demonstram a suscetibilidade genética para HYK e</p><p>os efeitos genéticos dependentes do grupo de paridade podem</p><p>ter semelhança mecanicista com T2D em humanos,</p><p>particularmente através da resistência à insulina.</p><p>A maioria dos SNP com evidência de associação a HYK ou</p><p>com um efeito P × G tinha um (ou mais) genes candidatos</p><p>previamente associados a NAFLD ou esteatose hepática. Estes</p><p>genes incluem</p><p>Proteína ribossómica mitocondrial L13 (MRPL13), membro 4</p><p>da família 4 do transportador de soluto (SLC4A4), GC,</p><p>DEPTOR e COL14A1. Expressão diferencial de MRPL13 e</p><p>COL14A1</p><p>http://www.physiolgenomics.org/</p><p>358 HIPERCETONEMIA GWAS E GWIS</p><p>Physiol Genomics - doi:10.1152/physiolgenomics.00016.2020 - www.physiolgenomics.org</p><p>Descarregado de journals.physiology.org/journal/physiolgenomics (2804:014D:1A87:D742:C4C4:027A:2E93:E861) em 18 de junho de</p><p>2024.</p><p>mRNA foi observado no tecido hepático de humanos com</p><p>esteatose (89), enquanto o SLC4A4 foi expresso de forma</p><p>diferente em roedores com esteatose (52, 82). As variantes</p><p>genómicas do GC foram associadas à NAFLD, bem como a</p><p>uma menor expressão hepática do mRNA do GC e à</p><p>concentração sérica da proteína de ligação à vitamina D em</p><p>doentes com NAFLD em comparação com os controlos (2).</p><p>A sobreexpressão sistémica e a sobreexpressão específica dos</p><p>neurónios da proopiomelanocortina do DEPTOR em modelos</p><p>de ratinhos transgénicos foram associadas a uma maior</p><p>esteatose hepática (17, 50). Em geral, estas anotações</p><p>genéticas sugerem uma semelhança mecanicista na</p><p>progressão da NAFLD em humanos e a suscetibilidade</p><p>genómica para HYK em vacas leiteiras. É interessante</p><p>especular se estas anotações de genes candidatos relacionados</p><p>com a NAFLD sugerem uma suscetibilidade genómica</p><p>partilhada entre os fenótipos HYK e fígado gordo em vacas</p><p>leiteiras.</p><p>Análise de enriquecimento de polimorfismos anotados. A</p><p>análise de enriquecimento de vias explora o efeito poligénico</p><p>do GWAS, avaliando a associação de observações curadas de</p><p>genes-fenótipos a um subconjunto de SNP anotados</p><p>associados à caraterística. Assim, obtemos uma visão</p><p>funcional dos numerosos pequenos efeitos que contribuem</p><p>para características complexas, como a suscetibilidade ao</p><p>HYK (38, 62). Além disso, a avaliação das vias metabólicas</p><p>enriquecidas nas interacções P × G do GWIS pode fornecer</p><p>informações sobre quais as vias que têm importância</p><p>diferencial para o HYK entre grupos de paridade.</p><p>O enriquecimento da via de adesão focal sugere um papel</p><p>importante para as adesões célula-matriz na etiologia do</p><p>HYK em todos os grupos de paridade. Existe uma enorme</p><p>diversidade nos componentes das adesões focais, incluindo</p><p>moléculas de suporte, GTPases, cinases, fosfatases, lipases e</p><p>proteases</p><p>(95). Além disso, a adesão focal desempenha um papel</p><p>fundamental em numerosos processos biológicos, tais como a</p><p>regulação da expressão genética, a diferenciação celular, a</p><p>proliferação celular, a motilidade celular e a sobrevivência</p><p>celular (95). A ubiquidade e diversidade da influência das</p><p>adesões focais nos tipos de células e tecidos constitui um</p><p>desafio para a sua contextualização na etiologia do HYK. No</p><p>entanto, a investigação futura sobre o HYK pode beneficiar</p><p>do estudo do papel dos genes e vias relacionados com a</p><p>adesão focal.</p><p>A orientação axonal refere-se a uma fase crucial na</p><p>formação de redes neuronais, em que o cone de crescimento</p><p>de uma neurite em desenvolvimento recebe orientação de</p><p>sinais quimiotrópicos para se estender a um alvo axonal</p><p>apropriado (24). Tal como acontece com a adesão focal, a</p><p>inervação dos tecidos é ubíqua e não foi extensivamente</p><p>estudada no contexto da etiologia do HYK das vacas leiteiras.</p><p>Vários tecidos responsáveis pela regulação da homeostase</p><p>energética têm demonstrado capacidade de resposta a sinais</p><p>neurais, incluindo o fígado (23, 96), o tecido adiposo (14, 29,</p><p>64) e o pâncreas (31, 61). Por conseguinte, o papel do</p><p>desenvolvimento neural e da regulação neural dos tecidos</p><p>relacionados com a etiologia do HYK poderá ser uma área</p><p>rica em descobertas.</p><p>As numerosas vias enriquecidas (Tabela 5) dentro das</p><p>associações P × G podem indicar diferenças biológicas na</p><p>etiologia HYK entre primíparas e multíparas, que atualmente</p><p>não são exploradas na pesquisa reducionista. Muitas das vias</p><p>enriquecidas com evidências mais fortes (Q ≤ 0.01) estão</p><p>relacionadas à função neurológica e à sinalização (ou seja,</p><p>sinapse colinérgica e sinalização endocanabinóide retrógrada),</p><p>que discutimos anteriormente como um aspeto não investigado</p><p>da etiologia do HYK. No entanto, a quantidade substancial de</p><p>concordância em genes anotados entre vias</p><p>(Fig. 3) sugere que</p><p>um aspeto mais amplo da biologia pode ser visado. Este facto</p><p>pode indicar uma base genética</p><p>http://www.physiolgenomics.org/</p><p>359HIPERCETONEMIA GWAS E GWIS</p><p>Physiol Genomics - doi:10.1152/physiolgenomics.00016.2020 - www.physiolgenomics.org</p><p>Descarregado de journals.physiology.org/journal/physiolgenomics (2804:014D:1A87:D742:C4C4:027A:2E93:E861) em 18 de junho de</p><p>2024.</p><p>para vacas pertencentes a diferentes grupos de paridade que se</p><p>adaptam de forma diferente à resistência à insulina no início</p><p>do pós-parto, necessária para suportar a lactação (9, 22). As</p><p>vias que apoiam esta opinião incluem a secreção de insulina, a</p><p>via de sinalização do estrogénio e a síntese e secreção de</p><p>aldosterona. A secreção de insulina estimulada pela glicose é</p><p>prejudicada em humanos e ratos resistentes à insulina (3, 41);</p><p>além disso, o estrogénio e a aldosterona demonstraram</p><p>capacidade de modular a sensibilidade à insulina (1, 54). De</p><p>facto, os ratinhos com deficiência de aldosterona têm um</p><p>aumento da secreção de insulina estimulada pela glicose (55).</p><p>Em termos de etiologia do HYK, a resistência à insulina tem</p><p>sido sugerida como um fator predisponente para o HYK</p><p>porque promoveria a lipólise excessiva de TG adiposo pós-</p><p>parto (22, 32, 37), potencialmente sobrecarregando a</p><p>capacidade oxidativa hepática das vacas leiteiras e</p><p>promovendo a cetogénese</p><p>(91). De facto, as vacas com HYK têm valores reduzidos do</p><p>índice quantitativo de verificação da sensibilidade à insulina</p><p>(97) e redução da secreção de insulina estimulada pela glicose</p><p>durante o teste de tolerância à glicose intravenosa (25). Em</p><p>conjunto, estes resultados reforçam a importância da</p><p>resistência à insulina na etiologia do HYK e sugerem que a</p><p>importância relativa dos factores genéticos pode depender do</p><p>grupo de paridade.</p><p>Conclusões</p><p>No presente trabalho, a arquitetura genética da</p><p>suscetibilidade ao HYK em vacas Holstein no início do pós-</p><p>parto foi dissecada por GWAS, GWIS e análise de</p><p>enriquecimento de vias. Estas análises foram efectuadas num</p><p>fenótipo HYK determinado por medições repetidas da</p><p>concentração de BHB no sangue, o que é essencial para uma</p><p>avaliação precisa do HYK. Foram observadas evidências</p><p>marginais de uma associação entre o marcador ARS-BFGL-</p><p>NGS-91238 (cromossoma 10, par de bases 3856662) e a</p><p>suscetibilidade a HYK. Além disso, foram descobertas novas</p><p>provas de associações SNP dependentes da paridade com os</p><p>marcadores BovineHD0600024247 (cromossoma 6, par de</p><p>bases 86882515) e BovineHD1400023753 (cromossoma 14,</p><p>par de bases 81538205) com provas significativas e marginais,</p><p>respetivamente. Numerosos genes candidatos foram anotados</p><p>para as associações SNP e SNP dependentes da paridade que</p><p>foram previamente associadas a doenças e patologias</p><p>metabólicas humanas, tais como obesidade, T2D, resistência à</p><p>insulina e NAFLD. A análise de enriquecimento revelou que</p><p>as vias relacionadas com a adesão focal e a orientação axonal</p><p>podem contribuir para a etiologia do HYK. Além disso, a</p><p>variação genética nas vias relacionadas com a secreção e</p><p>sensibilidade à insulina pode afetar a suscetibilidade ao HYK</p><p>de forma dependente da paridade. Em conclusão, o presente</p><p>trabalho apresenta várias novas associações de SNP e vias</p><p>metabólicas que contribuem para o risco genético de</p><p>suscetibilidade ao HYK.</p><p>AGRADECIMENTOS</p><p>Os autores reconhecem e apreciam o apoio dos proprietários e dos pastores</p><p>das explorações leiteiras privadas, bem como da equipa de investigação do</p><p>Centro de Investigação de Lacticínios Emmons Blaine da Universidade de</p><p>Wisconsin-Madison. Para além disso, este trabalho não teria sido possível sem</p><p>a ajuda de numerosos estudantes de pós-graduação e de licenciatura,</p><p>especialmente R. C. Oliveira e</p><p>F. M. Rathbun. Finalmente, os autores agradecem a G. R. Wiggans, do Council</p><p>on Dairy Cattle Breeding, pelo fornecimento dos genótipos imputados</p><p>utilizados neste trabalho.</p><p>SUBVENÇÕES</p><p>Esta investigação foi apoiada pelo National Institute of Food and Agri-</p><p>culture (Washington, DC) através da USDA Agriculture and Food Research</p><p>Initiative Critical Agricultural Research and Extension (CARE; 2015-67028-</p><p>23572) e USDA Hatch grants (No. WIS01878) da Wisconsin Agri- cultural</p><p>Experiment Station (Madison, WI). Foi fornecido financiamento adicional</p><p>http://www.physiolgenomics.org/</p><p>360 HIPERCETONEMIA GWAS E GWIS</p><p>Physiol Genomics - doi:10.1152/physiolgenomics.00016.2020 - www.physiolgenomics.org</p><p>Descarregado de journals.physiology.org/journal/physiolgenomics (2804:014D:1A87:D742:C4C4:027A:2E93:E861) em 18 de junho de</p><p>2024.</p><p>pelo Programa de Investigação Cooperativa para o Desenvolvimento da</p><p>Ciência e Tecnologia Agrícolas (Projeto n.º PJ012078, Administração do</p><p>Desenvolvimento Rural, República da Coreia).</p><p>DIVULGAÇÕES</p><p>Os autores declaram não haver conflitos de interesses, financeiros ou outros.</p><p>CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES</p><p>H.M.W. e K.A.W. conceberam e projectaram a investigação; R.S.P.</p><p>realizou as experiências; R.S.P. e N.E.S. analisaram os dados; R.S.P.,</p><p>H.M.W. e K.A.W. interpretaram os resultados das experiências; R.S.P.</p><p>preparou as figuras; R.S.P. redigiu o manuscrito; R.S.P., N.E.S., H.M.W., e</p><p>K.A.W. editaram e reviram o m a n u s c r i t o ; R.S.P., N.E.S., H.M.W., e</p><p>K.A.W. aprovaram a versão final do m a n u s c r i t o .</p><p>REFERÊNCIAS</p><p>1. 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