Biologia Molecular - u01t02

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<p>Biologia molecular</p><p>Reação em Cadeia da Polimerase</p><p>Profª Dra. Maria Carolina Stipp</p><p>docente</p><p>pcr</p><p>https://shutr.bz/3I6kjWb</p><p>FONTE:</p><p>A PCR, ou reação em cadeia da polimerase, é uma das grandes inovações no campo de biologia molecular. Essa técnica permite que o DNA seja replicado (amplificado) de forma rápida e eficaz dentro de um tubo de ensaio. Ela usa o princípio da replicação do DNA. Você lembra como ela ocorre?</p><p>2</p><p>https://shutr.bz/3taK6Ir</p><p>replicação</p><p>FONTE:</p><p>A replicação é um processo semi-conservativo, onde uma dupla fita de DNA irá se “abrir ao meio” e duas novas fitas serão sintetizadas. A síntese das novas fitas ocorre com o uso da enzima DNA polimerase, que reconhece o nucleotídeo especifico da fita antiga, e adiciona o nucleotídeo complementar na fita nova. Por exemplo, se a fita molde (antiga) tiver um nucleotídeo Guanina (G), a DNA polimerase irá inserir um nucleotídeo Citosina (C) na fita nova que está sintetizando. Esse processo ocorre ao longo de todo DNA, de modo que ao final do processo, são geradas duas novas moléculas de DNA idênticas contendo uma fita molde (antiga) e uma fita complementar (nova).</p><p>3</p><p>https://shutr.bz/3I6kjWb</p><p>Dna e rna</p><p>FONTE:</p><p>É importante lembrarmos que a replicação in vivo ocorre com o auxilio de diferentes enzimas, como a RNA polimerase (primase), helicase, DNA girase, DNA polimerase e DNA ligase. Cada uma possui funções especificas e são essenciais para que a replicação ocorra de modo preciso.</p><p>DNA girase – enzima responsável por girar o DNA, que se encontra “enrolado em forma de fio de telefone”, para que ele fique reto durante a replicação.</p><p>Helicase – enzima que realiza o corte das pontes de hidrogênio entre as duas fitas do DNA, permitindo que seja formado um espaço entre elas, e que as demais enzimas consigam realizar a replicação em si.</p><p>RNA polimerase (primase) – enzima com função de adicionar os primers (iniciadores) nas pontas do DNA. Esses primers vão permitir que a enzima DNA polimerase adicione os demais nucleotídeos, uma vez que ela precisa de uma hidroxila livre para conseguir iniciar o processo.</p><p>DNA polimerase- enzima que adiciona os nucleotídeos de forma complementar, formando a nova fita do DNA.</p><p>DNA ligase- enzima que realiza a ligação entre os nucleotídeos da nova fita de DNA, e confere possíveis erros no DNA.</p><p>A DNA girase, helicase e RNA polimerase trabalham no estágio inicio da replicação, conhecido como iniciação. Já a DNA polimerase irá realizar o estágio de alongamento; enquanto a DNA ligase, participa do estágio de finalização da replicação.</p><p>4</p><p>https://shutr.bz/3q9xQWy</p><p>pcr</p><p>FONTE:</p><p>Agora que lembramos como a replicação acontece, podemos entender melhor como é possível replicar o material genético in vivo. Iniciamos escolhemos um par de primers específicos, que possuem uma sequencia de 18 a 22 nucleotídeos. Esses primers devem ser complementares a cadeia que se deseja amplificar. Ele é sempre desenhado no sentido 5’-3’.</p><p>Em seguida, são adicionados desoxinucleotídeos (dNTPS: A, T, G e C), a enzima Taq DNA polimerase, cofatores enzimáticos (Mg) e o DNA extraído.</p><p>A enzima Tar DNA polimerase é utilizada no processo, pois é a única capaz de aguentar as altas temperaturas exigidas para a desnaturação do DNA.</p><p>O conteúdo é inserido em um equipamento, que por sua vez, realizada três estágios:</p><p>Desnaturação: abertura da fita a 95ºC;</p><p>Anelamento: ligação dos primers no local específico do DNA, que ocorre a 60-65ºC;</p><p>Extensão – Os dNTPs são adicionados de forma complementar para enzima Taq DNA polimerase, que ocorre a 72ºC.</p><p>Esses estágios se repetem entre 20 a 40 ciclos, afim de obter um grande número de cópias de DNA.</p><p>5</p><p>https://shutr.bz/3tbNqD2</p><p>Transcrição reverSa</p><p>FONTE:</p><p>A RT-PCR, ou transcrição reversa é uma técnica que utiliza a enzima transcriptase reversa para converter uma molécula de mRNA (RNA mensageiro) em cDNA (DNA complementar). Ela é utilizada para avaliar o nível de expressão gênica de um tecido. Para essa avaliação precisamos usar mRNA, que indica quanto de um gene está sendo transcrito em uma célula. Mas o PCR não ocorre em uma molécula com fita simples, sendo necessária converte-la em fita dupla (cDNA).</p><p>Nessa técnica utilizamos Oligonucleotideos sintéticos (primers), enzima transcriptase reversa, dNTPs, amostra de RNA e cofatores enzimáticos.</p><p>Os primers irão permitir que a sequencia de mRNA específica do gene de interesse seja amplificada e transformada em cDNA.</p><p>Todo processo é automatizado, e em seguida, o material obtido pode ser amplificado por PCR e quantificado.</p><p>6</p><p>https://uniasselvi.me/3q42UXE; https://shutr.bz/3r7LLvP</p><p>Pcr qualitativo</p><p>Pcr quantitativo</p><p>FONTE:</p><p>PCR qualitativo avalia se houve amplificação do material, observado ao final da técnica por meio de um gel de eletroforese.</p><p>PCR quantitativo: detecta a amplificação em tempo real através de fluorescência e indica de forma numérica a quantidade de material que está sendo amplificado na reação.</p><p>7</p><p>https://bit.ly/3ndRv62</p><p>Pcr em tempo real</p><p>FONTE:</p><p>Essa técnica utiliza os mesmos princípios do PCR convencional, no entanto, o equipamento utilizado precisa ser capaz de detectar a fluorescência emita durante cada amplificação. Essa fluorescência é emita com o uso de sondas específicas que se intercalam às fitas de DNA que estão sendo amplificadas. Assim, ao detectar essa fluorescência, é possível detectar quanto do material genético está sendo amplificado ao longo dos ciclos.</p><p>8</p><p>https://shutr.bz/3f8B9XQ</p><p>Bons estudos!</p><p>FONTE:</p><p>9</p><p>Obrigada!</p><p>“</p><p>seuemail@uniasselvi.com.br</p><p>image2.jpg</p><p>image7.jpeg</p><p>image8.jpeg</p><p>image9.jpeg</p><p>image10.jpeg</p><p>image11.jpg</p><p>image12.jpeg</p><p>image13.emf</p><p>image14.jpeg</p><p>image15.emf</p><p>image6.jpg</p><p>image1.jpg</p>