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UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI 
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas 
Ana Mara Fonseca Nunes 
 
 
 
 
 
 
DESENVOLVIMENTO DE UMA METODOLOGIA ELETROANALÍTICA 
UTILIZANDO A VOLTAMETRIA DE PULSO DIFERENCIAL PARA A 
DETERMINAÇÃO DE BENZNIDAZOL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Diamantina 
 2021
 
 
 
 
 
Ana Mara Fonseca Nunes 
 
 
 
 
 
 
DESENVOLVIMENTO DE UMA METODOLOGIA ELETROANALÍTICA 
UTILIZANDO A VOLTAMETRIA DE PULSO DIFERENCIAL PARA A 
DETERMINAÇÃO DE BENZNIDAZOL 
 
 
 
 
Dissertação apresentada ao programa de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas da 
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e 
Mucuri, como requisito para obtenção do título de 
Mestre. 
 
Orientadora: Prof. Dr.a Andréa Renata Malagutti 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Diamantina 
2021 
 
Catalogação na fonte - Sisbi/UFVJM
A532
2021
Nunes, Ana Mara Fonseca 
 Desenvolvimento de uma metodologia eletroanalítica
utilizando a voltametria de pulso diferencial para a
determinação de benznidazol [manuscrito] / Ana Mara Fonseca
Nunes. -- Diamantina, 2021. 
 79 p. : il. 
 
 Orientadora: Prof.ª Andréa Renata Malagutti. 
 
 Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) --
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri,
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas,
Diamantina, 2021. 
 
 1. Doença de chagas. 2. Métodos eletroanalíticos. 3.
Amostras biológicas. 4. Nanossistemas lipídicos. I. Malagutti,
Andréa Renata . II. Universidade Federal dos Vales do
Jequitinhonha e Mucuri. III. Título. 
 
Elaborada pelo Sistema de Geração Automática de Ficha Catalográfica da UFVJM 
com os dados fornecidos pelo(a) autor(a). 
Bibliotecário Rodrigo Martins Cruz / CRB6-2886 
Técnico em T.I. Thales Francisco Mota Carvalho
09/08/2021 SEI/UFVJM - 0428811 - Pós-graduação: Folha de aprovação
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI
 
ANA MARA FONSECA NUNES
 
DESENVOLVIMENTO DE UMA METODOLOGIA ELETROANALÍTICA UTILIZANDO VOLTAMETRIA DE PULSO
DIFERENCIAL PARA A DETERMINAÇÃO DE BENZNIDAZOL
 
Dissertação apresentada ao programa
de Pós-Graduação em Ciências Farmacêu�cas da
Universidade Federal dos Vales do Jequi�nhonha e
Mucuri, nível de Mestrado, como requisito parcial
para obtenção do �tulo de Mestre em Ciências
Farmacêu�cas.
 
Orientadora: Profa. Dra. Andréa Renata Malagu� 
 
Data de aprovação 06/08/2021.
 
 
Prof. Dr. Lucas Franco Ferreira
Instituto de Ciência e Tecnologia - UFVJM
 
Prof. Dr. Wallans Torres Pio dos Santos
Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde - UFVJM
 
Profa. Dra. Andréa Renata Malagutti 
Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde - UFVJM
Documento assinado eletronicamente por Wallans Torres Pio dos Santos, Servidor, em 06/08/2021,
às 18:05, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539,
de 8 de outubro de 2015.
Documento assinado eletronicamente por Lucas Franco Ferreira, Servidor, em 06/08/2021, às 18:05,
http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2015-2018/2015/Decreto/D8539.htm
09/08/2021 SEI/UFVJM - 0428811 - Pós-graduação: Folha de aprovação
https://sei.ufvjm.edu.br/sei/controlador.php?acao=documento_imprimir_web&acao_origem=arvore_visualizar&id_documento=463232&infra_siste… 2/2
conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de 8 de
outubro de 2015.
Documento assinado eletronicamente por Andrea Renata Malagu�, Membro, em 06/08/2021, às
18:09, conforme horário oficial de Brasília, com fundamento no art. 6º, § 1º, do Decreto nº 8.539, de
8 de outubro de 2015.
A auten�cidade deste documento pode ser conferida no site
h�ps://sei.ufvjm.edu.br/sei/controlador_externo.php?
acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0, informando o código verificador 0428811 e
o código CRC FBE675CC.
Referência: Processo nº 23086.009158/2021-81 SEI nº 0428811
http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2015-2018/2015/Decreto/D8539.htm
http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_Ato2015-2018/2015/Decreto/D8539.htm
https://sei.ufvjm.edu.br/sei/controlador_externo.php?acao=documento_conferir&id_orgao_acesso_externo=0
 
AGRADECIMENTOS 
 
Agradeço a Deus por ter me concedido saúde para concluir esse trabalho em meio a 
esses tempos difíceis que estamos vivendo, no qual tivemos que nos isolar, nos adaptar e nos 
reinventar. 
Ao meu marido Ricardo, meu melhor amigo e incentivador, por todo apoio, carinho e 
compreensão, por nunca duvidar da minha capacidade e estar sempre ao meu lado. Obrigada 
por me ajudar a enxergar minhas falhas e também meus acertos, por ser meu exemplo, motivo 
de orgulho e admiração. 
A minha filha Sarah, por ser meu porto seguro, meu incentivo diário para superar 
dificuldades, obstáculos e desejar ser sempre melhor. 
Aos meus pais, Ataides e Neuza, e minha irmã Mariana, que mesmo distantes sempre 
acreditaram e apoiaram minhas decisões, sempre se fizeram presente em minha vida. 
Agradeço pelos conselhos, pelas críticas construtivas, por todo o carinho e amizade, por 
estarem sempre dispostos a me ajudar. 
A minha sogra, Cida, pelo apoio e amizade, por muitas vezes disponibilizar o seu 
tempo, cuidando muito bem da minha filha, para que eu pudesse me dedicar a esse trabalho. 
A minha orientadora, Andréa, por todos os ensinamentos, por todo o acolhimento e 
atenção dispensada, por estar sempre presente e disponível para me auxiliar. Agradeço 
também pela confiança e pela enorme contribuição na minha formação profissional. 
Ao professor Guilherme, pela atenção, ensinamentos e pelas amostras fornecidas para 
a realização desse trabalho. 
Aos demais professores do corpo docente dessa Universidade, que contribuíram de 
alguma forma com a minha formação acadêmica. 
Aos técnicos Dilton e Fernando, por toda a ajuda e conhecimentos compartilhados. 
A Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo auxílio 
financeiro em forma de bolsa de estudo concedida. 
A todos que de alguma forma, estiveram presentes nessa etapa da minha vida, que 
contribuíram direta ou indiretamente para a minha formação pessoal e profissional durante 
esses dois anos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“O sucesso é a soma de pequenos esforços repetidos dia após 
dia.” Robert Collier. 
 
 
RESUMO 
 
O benznidazol (BZN) é o único fármaco disponível no Brasil para o tratamento da doença de 
Chagas (DC) embora não seja o ideal, pois possui alta toxicidade, farmacocinética irregular e 
seu efeito na fase crônica da doença ainda é questionável. Tais fatores tornam necessário o 
desenvolvimento de métodos alternativos confiáveis e eficazes para a determinação analítica 
do fármaco em amostras biológicas e farmacêuticas. Sendo assim, o objetivo desse trabalho 
foi desenvolver um método eletroanalítico para a determinação do BZN em urina e em 
formulação farmacêutica usando a voltametria de pulso diferencial (VPD) e o eletrodo 
carbono vítreo (GCE). Inicialmente a voltametria cíclica (VC) foi empregada para realizar um 
estudo preliminar do perfil voltamétrico do BZN sobre a superfície do GCE e verificar a 
influência do pH, da velocidade de varredura, e do eletrólito suporte no comportamento do 
analito. Durante a varredura catódica por VC, verificou-se a presença de um pico bem 
definido irreversível no potencial de -0,58 V. Tendo como base esse pico catódico, um 
método eletroanalítico foi otimizado e validado em consonância com guias nacionais e 
internacionais para a determinação do fármaco por VPD. Este método foi aplicado em urina e 
em uma formulação farmacêutica de BZN incorporado a carreadores lipídicos 
nanoestruturados (CLN-BZN). Todos os paramêtros analisados foram atendidos de(nFE /2RT). 
E = amplitude de pulso 
 
3.7 Validação 
 
As técnicas analíticas descritas na farmacopeia brasileira para 
identificação do BZN são espectroscopia de absorção no infravermelho, 
espectroscopia de absorção no ultravioleta e cromatografia em camada 
delgada. Para a quantificação a técnica descrita é a espectroscopia de 
absorção no ultravioleta (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2019). As 
técnicas eletroanalíticas podem ser usadas como uma alternativa 
complementar conforme mencionado anteriormente, devendo, para isso, 
atender aos parâmetros de validação de método analítico. 
Validar um método analítico não é um processo simples e requer 
planejamento e tempo. Muitos parâmetros devem ser avaliados a fim de 
estimar o nível de aplicabilidade, relevância e significância estatística do 
método (RIBANI et al., 2004; VOIGT, 2018). Embora existam diferenças 
nos parâmetros técnicos definidos pelas varias agências reguladoras, o 
Conselho Internacional para Harmonização de Requisitos Técnicos para 
Registro de Medicamentos de Uso Humano (ICH) elaborou um guia, o guia 
Q2 (R1) intitulado “Validação de Procedimentos Analíticos: Texto e 
38 
 
metodologia” que é um guia internacionalmente reconhecido e descreve os 
parâmetros que devem ser considerados durante o exercício de validação 
(ICH, 2005). No Brasil, duas agências credenciadoras verificam a 
competência de laboratórios de ensaios: A Agência Nacional de Vigilância 
Sanitária (ANVISA), através da RDC n°166 de julho de 2017; e o Instituto 
Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO) 
através do documento DOQ-CGCRE-008) (RIBANI, Marcelo et al., 2004). 
Neste contexto, é importante ressaltar a diferença entre resoluções e guias; 
resoluções são normas jurídicas que devem ser obedecidas e os guias são 
documentos que sugerem uma linha a ser seguida sendo, portanto, abertos 
para interpretação. No Brasil, o DOQ-CGRE-008 (INMETRO) e a RDC 
166/2017 (ANVISA) estão alinhados com o guia Q2 do ICH. 
Os parâmetros mais comumente avaliados para validação de um método 
analítico, de acordo com esses documentos são: seletividade, linearidade, 
limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ), exatidão, precisão e 
robustez. A validação desse método foi realizada seguindo às resoluções dos 
órgãos fiscalizadores nacionais mencionados em consonância com as 
recomendações do Guia internacional ICH. 
3.7.1 Seletividade 
 
De acordo com o art. 19 da RDC 166/2017 da ANVISA a seletividade 
pode ser definida como: 
 
“A capacidade do método de identificar ou quantificar o analito de 
interesse inequivocamente, na presença de componentes que podem estar 
presentes na amostra, como impurezas, diluentes e componentes da matriz”. 
(RDC Nº 166/17). 
 
Assim sendo, a seletividade assegura que não haja interferência de 
outras espécies na identificação ou quantificação de determinado composto. 
Em eletroquímica a seletividade deve assegurar que o pico de resposta 
gerado no voltamograma corrente versus potencial seja exclusivamente do 
analito de interesse. 
 
 
 
39 
 
 3.7.2 Lineridade 
 
Ainda de acordo com a RDC 166/2017 da ANVISA o art. 23 diz 
que: 
 
 “A linearidade de um método deve ser demonstrada por meio da sua 
capacidade de obter respostas analíticas diretamente proporcionais à 
concentração de um analito em uma amostra.” (RDC 166/2017 ANVISA) 
 
A mesma resolução menciona, nos artigos 24 e 25 respectivamente, que 
deve haver uma relação linear em toda a faixa estabelecida para o método, 
devendo ser utilizadas pelo menos cinco concentrações diferentes da 
substância química em soluções preparadas no mínimo em triplicata. Para 
um método eletroanalítico a linearidade é uma medida de quão bem a curva 
de calibração da resposta eletroanalitica versus a concentração do analito se 
correlacionam (GUMUSTAS; OZKAN, 2011). Assim, o coeficiente de 
correlação (R) obtido na curva de calibração é um bom indicativo do quanto 
à reta pode ser considerada adequada como modelo matemático 
(INMETRO, 2020). Sendo recomendado um valor de R acima de 0,990 
pela ANVISA. 
 3.7.3 Limite de detecção (LD) 
 
Ainda de acordo com a legislação supracitada: 
 
 “O limite de detecção deve ser demonstrado pela obtenção da 
menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser 
detectado, porém, não necessariamente quantificado, sob as condições 
experimentais estabelecidas” (ANVISA RDC 166/2017 Art. 49). 
 
Várias abordagens podem ser empregadas para definir o limite de 
detecção do método, como a avaliação visual, relação sinal-ruído, estimativa 
a partir da curva analítica ou pelo desvio padrão do branco na curva 
analítica (ANVISA, 2017; INMETRO, 2020). Sendo esta última, utilizada 
para o cálculo do LD do presente método, de acordo com a Equação 5 
(fórmula 1 do anexo II RDC 166/2017). 
 𝐿𝐷 = 3,3 𝑥 𝑆𝑏𝑏 (5) 
40 
 
 
Sb = Desvio padrão de 10 brancos. 
b = coeficiente angular da curva analítica. 
3.7.4 Limite de quantificação (LQ) 
 
 “O limite de quantificação é a menor quantidade do analito 
em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão 
aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.” (ANVISA, RDC 
166/2017, Art. 55). 
 
Sendo assim, o LQ representa teoricamente a menor quantidade do 
analito que pode ser quantificada. As mesmas abordagens empregadas para 
definir o LD podem ser empregadas para definir o LQ. Para muitas 
aplicações farmacêuticas e biológicas, o LQ é um parâmetro mais útil do 
que LD (GUMUSTAS; OZKAN, 2011). O LQ do método foi obtido pela 
Equação 6 (fórmula 3 do anexo II RDC 166/2017). 
 𝐿𝑄 = 10 𝑥 𝑆𝑏𝑏 (6) 
3.7.5 Exatidão 
 
A exatidão é o principal requisito para o desenvolvimento de um 
método eletroanalítico e, frequentemente o mais difícil de ser determinado 
(GUMUSTAS; OZKAN, 2011). 
 
“A exatidão de um método analítico deve ser obtida por meio do 
grau de concordância entre os resultados individuais do método em estudo 
em relação a um valor aceito como verdadeiro” (RDC 166/2017 Art. 42). 
 
 
De acordo com a legislação vigente a exatidão pode ser obtida através de 
diferentes métodos; como por exemplo, utilizando materiais de referência 
com valores certificados para comparação com o método proposto, por meio 
de técnicas oficiais de análise referentes ao analito ou ensaios de 
recuperação (ANVISA, 2017; ICH, 2015; INMETRO, 2020). Sendo esse 
último, o mais comumente adotado por possuir vantagens como menor custo 
e possibilidade de ser feito em qualquer laboratório, uma vez que dispensa a 
41 
 
utilização de materiais certificados (RIBANI et al., 2004). A recuperação 
pode ser calculada pela Equação 7 (INMETRO): 
 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎çã𝑜(%) = 𝐶1− 𝐶2𝐶3 × 100 (7) 
 
C1 = concentração do analito na amostra fortificada 
C2 = concentração do analito na amostra não fortificada 
C3 = concentração do analito adicionado à amostra fortificada 
 
É importante que sejam estabelecidos critérios de aceitação para 
recuperação, na Tabela 3 temos os critérios de acordo com o INMETRO. 
 
Tabela 3 - Critérios de aceitação para ensaios de recuperação 
Analito (%) Razão do analito Unidade DPR (%) 
100 1 100% 98 – 102 
10 10-1 10% 98 – 102 
1 10-2 1% 97 – 103 
0,1 10-3 0,1% 95 – 105 
0,01 10-4 100 ppm 90 – 107 
0,001 10-5 10 ppm 80 – 110 
0,0001 10-6 1 ppm 80 – 110 
0,00001 10-7 100 ppb 80 – 110 
0,000001 10-8 10 ppb 60 –115 
0,0000001 10-9 1 ppb 40 –120 
Fonte: INMETRO, 2020. Adaptado 
 
3.7.6 Precisão 
 
“A precisão avalia a proximidade entre os resultados obtidos por 
meio de ensaios com amostraspreparadas conforme descrito no método 
analítico a ser validado” (RDC 166/2017 Art. 33). 
 
Sendo assim, a precisão descreve a reprodutibilidade das medidas, 
dependendo apenas da distribuição de erros aleatórios e não estando 
relacionada com o valor verdadeiro (SKOOG et al., 2006). As três maneiras 
mais comuns de expressá-la são por meio da repetibilidade, precisão 
intermediária e da reprodutibilidade. A repetibilidade (precisão intra-ensaio 
ou intra-dia) expressa à precisão nas mesmas condições de operação em um 
curto intervalo de tempo. A precisão intermediária (precisão inter ensaios ou 
42 
 
inter-dias) expressa variações ocorridas dentro do laboratório, como por 
exemplo: dias diferentes, analistas diferentes, equipamentos diferentes, etc. 
A reprodutibilidade expressa a precisão interlaboratorial, sendo assim não é 
um componente de validação de método executado por um único laboratório 
(ICH, 2015; INMETRO, 2020). Os valores para precisão são geralmente 
expressos como desvio padrão (DP) ou desvio padrão relativo (DPR) entre 
os resultados obtidos de uma série de medidas que foram realizadas 
exatamente nas mesmas condições (ANVISA, 2017; INMETRO, 2020). 
Numericamente, um valor alto para esses desvios indica que os resultados 
estão dispersos e consequentemente o método não é preciso. De acordo com 
o INMETRO é importante testar as concentrações baixa, média e alta da 
faixa de trabalho (INMETRO, 2020) e os critérios para aceitação da 
reprodutibilidade de acordo com o INMETRO estão descritos a seguir na 
Tabela 4. 
 
Tabela 4 - Critérios de aceitação para a reprodutibilidade 
Analito (%) Razão do analito Unidade DPR (%) 
 100 1 100% 1,3 
 10 10-1 10% 1,9 
 1 10-2 1% 2,7 
 0,1 10-3 0,1% 3,7 
 0,01 10-4 100 ppm 5,3 
 0,001 10-5 10 ppm 7,3 
 0,0001 10-6 1 ppm 11 
 0,00001 10-7 100 ppb 15 
0,000001 10-8 10 ppb 21 
0,0000001 10-9 1 ppb 30 
Fonte: INMETRO, 2020. Adaptado 
 
3.7.7 Robustez 
 
“A robustez é um parâmetro que indica se o método analítico tem 
capacidade de resistir a pequenas e deliberadas variações das condições 
analíticas” (RDC 166/2017). 
 
Assim a robustez de um método analítico representa a capacidade do 
método em não ser afetado por pequenas variações nos seus parâmetros de 
execução (INMETRO, 2020). De acordo com INMETRO trata-se de um 
parâmetro opcional dentro dos estudos de validação, muitas vezes estando 
43 
 
mais associado a estudos de otimização. Para avaliação da robustez do 
método os parâmetros a serem avaliadas dependem da técnica utilizada para 
a identificação/quantificação do analito, sendo que não há parâmetros pré-
estabelecidos pela legislação para métodos eletroquímicos. Além disso, 
devido à natureza das técnicas eletroquímicas, muitas vezes não há a 
possibilidade de se realizar certas variações, como por exemplo, alterar o 
eletrólito suporte já definido, a concentração hidrogeniônica do meio, 
parâmetros da técnica voltamétrica adotada, variar o pH do meio, entre 
outros (VOIGT, 2018). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
44 
 
4 - MATERIAIS E MÉTODOS 
 
 4.1 Equipamentos utilizados 
4.1.1 Potenciostato 
 
A metodologia foi desenvolvida utilizando-se para as medidas 
eletroquímicas um potenciostato/galvanostato PGSTAT 128 N Autolab 
Potentiostat (Eco-Chemie, The Netherlands) interfaciado pelo software 
NOVA® 2.1.4 instalado em um computador. (FIG. 8) 
 
Figura 8- Potenciostato/galvanostato Autolab® PGSTAT 128 N 
 
Fonte: A autora 
4.1.2 Célula eletroquímica e eletrodos 
 
A célula eletroquímica de três eletrodos utilizada para a realização 
das medidas voltamétricas foi composta pelos seguintes eletrodos: 
● Eletrodo de trabalho: GCE com área igual a 0,07 cm² 
● Eletrodo de referência: Ag/AgCl saturado comercial. 
● Contra eletrodo: Placa de platina de 1,00 cm². 
Os eletrodos foram colocados em um béquer de 25,0 mL e este 
dentro de uma célula de vidro com capacidade para 50,0 mL com uma 
tampa adaptada de polietileno contendo quatro orifícios, três para o 
posicionamento de cada um dos eletrodos e um para utilização do nitrogênio 
45 
 
gasoso (que foi utilizado antes de cada uma das análises durante 5 minutos 
para a remoção do oxigênio dissolvido). Para maior vedação entre a célula 
de vidro e a tampa foi utilizado plástico filme envolto, conforme pode ser 
visto na Figura 9. 
 
Figura 9 - Célula eletroquímica 
 
Fonte: A autora 
 
 4.1.3 pHmetro 
 
Os ajustes de pH do eletrólito foram realizados com utilização do 
medidor de pH de bancada da marca Tecnal, modelo Tec-5 previamente 
calibrado com soluções tampão padrão em temperatura ambiente. 
4.1.4 Agitador magnético 
 
A homogeneização das soluções foi realizada utilizando-se para essa 
finalidade o agitador magnético com aquecimento Tecnal modelo Te-0851. 
4.1.5 Evaporador rotativo 
 
Para a extração do BZN usado para as análises foi utilizado um 
evaporador rotativo Fisatom 802. 
4.1.6 Filtro de seringa micropore Millex 0,45 UI 
 
46 
 
Para a filtração das suspensões contendo CLN foram usados filtros 
de seringas, com membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofóbico de 
0,45µm da marca Merck millipore. 
4.1.7 Sonda de ultrassom de alta intensidade 
 
Durante o preparo das CLNs foi utilizada a sonda de ultrassom Q55 
sonicador da marca Qsonica para a homogeinização da emulsão. 
 
4.2 Extração e purificação do BZN 
 
O BZN foi extraído de comprimidos de 100 mg do laboratório 
LAFAPE e purificado seguindo a metodologia descrita por outros trabalhos 
do grupo (SILVA, 2019). Para a extração, quatro comprimidos de BZN 
foram triturados com o auxílio de gral e pistilo, transferidos para um béquer 
e solubilizados com metanol. Após essa etapa, a solução foi mantida sob 
agitação magnética durante 20 min. A suspensão foi filtrada em papel filtro 
quantitativo e o solvente removido em evaporador rotativo. O material foi 
recristalizado com uma mistura de metanol e água (1: 4) e colocados em 
banho de gelo. Os cristais resultantes foram filtrados a vácuo, e secos em 
um dessecador. O BZN foi armazenado em contêineres refrigerados no 
escuro. 
 
4.3 Preparo das CLN 
 
As CLNs foram preparadas pelo método homogeneização de fusão a 
quente associado à sonicação com sonda de ultrassom. A fase oleosa (FO) 
composta de Crodamol® e Compritol® e a fase aquosa (FA) contendo 
Super Refined Tween® 80, glicerol e água foram preparadas e pesadas 
separadamente. O BZN foi previamente solubilizado na FO fundida a uma 
concentração de 0,05%; e ambas as fases foram aquecidas a 85 ° C. Em 
seguida, a FA foi vertida lentamente sobre a FO e mantida sob agitação 
manual constante durante 2 minutos. A emulsão resultante foi 
imediatamente submetida à homogeinização com uma sonda de ultrassom 
47 
 
de alta intensidade por 10 minutos. A formulação resultante foi então 
resfriada a temperatura ambiente para a formação do CLN. 
 
4.4 Matérias primas, reagentes, e soluções 
 
4.4.1 Matérias primas 
 
O Super Refined Tween® 80 e Crodamol® foram fornecidos pela 
Croda Inc (Edison USA). O Compritol® pela Gattefossé (Lyon, France). 
 
4.4.2 Reagentes 
 
Todas as soluções foram preparadas a partir de reagentes de grau 
analítico (PA) e água deionizada fornecida por um sistema Milli-Q Plus 
(Millipore). Todos os reagentes utilizados para preparo da solução estoque, 
soluções eletrolíticas e solução para ajuste de pH, bem como suas fórmulas 
químicas, procedência e graus de pureza estão resumidos na Tabela 5. 
 
Tabela 5 - Lista dos reagentes químicos utilizados, procedência e pureza. 
Reagente Fórmula 
Química 
Marca Pureza (%) 
Ácido bórico H3BO3 Alphatec 99,5 
Ácido acético glacial CH3COOH Proquimios 99,8 
Ácido fosfórico H3PO4 Sigma-Aldrich 99,0 
Fosfato de potássio 
dibásico 
K2HPO4 Próquimios 99,0 
Fosfato de potássio 
monobásico 
KH2PO4 Alphatec99,0 
Hidróxido de sódio NaOH Vetec 97,0 
Álcool etílico CH3CH2OH NEON 99,8 
Ácido cítrico C6H8O7 Vetec 99,5 
Tetraidrofurano 
(THF) 
C4H8O NEON 99,0 
 
4.4.3 Soluções 
4.4.3.1 Solução estoque de BZN 
48 
 
 
A solução estoque de BZN 1,00 mmol L-1 foi preparada a partir de 
uma massa de 2,60 mg de BZN dissolvida em 10,0 mL de álcool etílico e 
mantida sob agitação constante no agitador magnético durante 10 minutos 
para a homogeneização. Após o preparo, a solução foi armazenada ao abrigo 
de luz e sob refrigeração em uma temperatura de cerca de 4,00 °C. A Figura 
10 mostra um esquema do procedimento de preparo da solução estoque de 
BZN. 
 
Figura 10 - Preparo da solução estoque de BZN 
 
 
4.4.3.2 Solução tampão Britton-Robinson (BR) 
 
A solução tampão BR 0,10 mol L-1 foi preparada a partir da mistura 
de quantidades equimolares dos ácidos fosfórico, acético e bórico (0,040 
mols de cada ácido) dissolvidos em 1,00 L de água deionizada fornecida por 
um sistema Milli-Q. Para o ajuste do pH foram adicionados pequenos 
volumes da solução NaOH 1,00 mol L-1 a solução tampão BR. 
 
4.4.3.3 Solução tampão fosfato 
 
Para o preparo da solução tampão fosfato 0,10 mol L-1 foram 
utilizadas quantidades equimolares de fosfato de potássio monobásico e 
fosfato de potássio dibásico (0,10 mols de cada) dissolvidos em 1,00 L de 
água deionizada fornecida por um sistema Milli-Q. Para o ajuste do pH 
foram adicionados pequenos volumes da solução NaOH 1,00 mol L-1 à 
solução tampão fosfato. 
4.4.3.4 Solução tampão McIlvaine 
 
49 
 
Para a obtenção da solução tampão McIlvaine foram utilizadas 
quantidades equimolares de soluções estoques de fosfato dissódico (0,20 
mol L-1) e ácido cítrico (0,10 mol L-1). O ajuste do pH foi feito seguindo o 
mesmo procedimento realizado para os tampões anteriormente descritos. 
 
 4.4.4 Preparo das amostras 
 4.4.4.1 Preparo das amostras de urina para a determinação do BZN 
 
As amostras de urina foram coletadas de voluntários saudáveis e 
mantidas sob-refrigeração à temperatura de aproximadamente 4,00 oC. Para 
a fortificação dessas amostras, inicialmente foi preparada uma solução de 
0,10 mmol L-1 de BZN, a partir da diluição da solução estoque descrita no 
item 4.3.3.1 em tampão BR pH 7. A partir dessa solução, foram então 
preparadas três amostras de urina fortificada nas concentrações de 30,0; 
60,0 e 90,0 μmol L-1de BZN; respectivamente. Cada uma dessas amostras 
foi então diluída na proporção de 1:10 no tampão BR 0,10 mol L-1 (pH = 
7,00) para a realização dos estudos de adição e recuperação pelo método 
proposto, obtendo dessa forma concentrações finais de 3,00; 6,00 e 9,00 
μmol L-1 de BZN na célula eletroquímica. A Figura 11 mostra um esquema 
do procedimento de preparo das amostras de BZN fortificadas com urina. 
 
 Figura 11- Preparo das amostras de BZN fortificadas com urina 
 
 
4.4.4.2 Preparo das amostras de CLN para a determinação do BZN 
 
Também foram feitas amostras de CLN branco (CLN-BR) 
fortificadas em três diferentes concentrações. Para essa finalidade foram 
utilizados três balões volumétricos de 10,0 mL. Inicialmente foram 
colocados os volumes de 160; 310 e 470 μL de CLN-BR em cada um dos 
50 
 
três balões, respectivamente. Em seguida foram adicionados volumes de 
THF em cada um dos três balões na proporção de 1:5 (5,00 μL de THF para 
cada 1,00 μL de CLN-BR) para dissolver a matriz lipídica. Então, a partir 
da solução estoque de BZN foram adicionados os volumes de 300; 600 e 
900 μL de BZN, em cada um dos três balões, respectivamente e o volume de 
cada balão completado com solução tampão BR 0,10 mol L-1 (pH = 7,00). O 
conteúdo de cada um dos balões foi transferido para um béquer e foi 
realizada a filtração de cada solução para remover os lipídeos precipitados, 
utilizando para essa finalidade filtro micropore 0,45µm e seringa de 1,00 
mL. Para os estudos de adição e recuperação do BZN nessa amostra, 1 mL 
desse filtrado foi coletado e diluído na solução tampão BR 0,10 mol L-1 (pH 
= 7,00) na proporção de 1:10. Obtendo concentrações finais de 3,00; 6,00 e 
9,00 μmol L-1 de BZN na célula eletroquímica. 
4.4.4.3 Preparo das soluções para o estudo de interferentes na amostra de 
CLN-BZN 
 
As soluções preparadas para avaliar o efeito de interferentes da matriz 
lipídica e dos solventes utilizados foram designadas: controle 1, controle 2, 
CLN-BR e CLN-BZN. A solução controle 1 foi preparada com 0,90 mL de 
etanol, 2,30 mL de THF e o volume final ajustado para 10,0 mL com o 
tampão BR 0,10 mol L-1 pH 7,00. A solução controle 2 foi preparada da 
mesma forma, porém sem a adição do THF. O CLN-BZN foi preparado 
conforme o procedimento descrito no item 4.3.4.2 na concentração de 9,00 
µmol L-1 e o CLN-BR foi preparado da mesma forma. A Figura 12 mostra 
um esquema do procedimento de preparo das amostras de BZN fortificadas 
com CLN. 
51 
 
Figura 12 - Preparo das amostras de BZN fortificadas com CLN 
 
 
4.5 Metodologia 
 
4.5.1 Determinação do BZN em urina 
 
Através do método de adição de padrão foi realizada a determinação 
do BZN nas amostras de urina. Para essa finalidade, 10,0 mL de cada uma 
das soluções descritas no item 4.3.4.1 foram adicionadas a célula 
eletroquímica. Então foram realizados VPDs no intervalo de varredura de 
Intervalo de varredura: -0,10 a -1,00 V. Posteriormente, foram realizadas 
adições sucessivas de 100 µL da solução BZN 0,10 mmol L-1 e registrados 
os voltamogramas obtidos após cada adição. 
 4.5.2 Determinação do BZN em CLN 
 
A determinação do BZN nas amostras de CLN foi realizada como 
descrito no item anterior, porém utilizando para essa finalidade as amostras 
descritas no item 4.3.4.2 e realizando a limpeza do eletrodo de trabalho 
entre as medições eletroquímicas. A limpeza do eletrodo foi feita 
colocando-o em um béquer com a solução tampão BR 0,10 mol L-1 pH 7,00 
e colocando esse béquer no ultrassom para sonicação durante 5 minutos. 
52 
 
 5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
5.1 – Voltametria cíclica (VC) 
 
5.1.1 – Perfil da redução do BZN sobre a superfície do GCE 
 
O estudo preliminar do perfil voltamétrico do BZN foi realizado por 
VC para analisar a redução desse analito sobre a superfície do GCE. O 
voltamograma cíclico foi obtido utilizando uma concentração de 1,00 x 10-
4mol L-1 do BZN registrado em tampão BR 0,10 mol L-1 (pH 7,00) no 
intervalo de varredura de 0,20 a -1,20 V. Como podemos observar na Figura 
13, o BZN apresentou um pico de redução irreversível e bem definido em 
cerca de -0,58 V. 
 
Figura 13 - Voltamograma cíclico do BZN 1,00 x 10-4 mol L-1 registrado em 
tampão BR 0,10 mol L-1 (pH 7,00). Eletrodo de trabalho: GCE. Eletrodo auxiliar: Platina. 
Eletrodo de referência: Ag/AgCl. Intervalo de varredura: 0,20 a -1,20 V. v = 100 mV s -1 
 
 
5.1.2 – Variação do pH 
 
Para avaliar a influência do pH na resposta eletroquímica do BZN, 
foi realizado o estudo da variação do pH do meio contendo esse analito na 
concentração de 1,00 x 10-4 mol L-1 no intervalo de 2,00 a 12,0 como pode 
ser visto no voltamograma cíclico da Figura 14. 
53 
 
 
Figura 14 - Voltamogramas cíclicos do BZN 1,00. x 10-4 mol L-1 registrados em 
tampão BR 0,10 mol L-1 em diferentes valores de pH. Eletrodo de trabalho: GCE. Eletrodo 
auxiliar: Platina. Eletrodo de referência: Ag/AgCl. Intervalo de varredura: 0,10 a -1,00. 
 
 
De acordo com o resultado apresentado na Figura 14, foi possível 
avaliar a relação entre a Ip e o pH. Esta relação é apresentada na Figura 15, 
onde, verifica-se que a Ip aumenta no intervalo de pH de 2,00 a 7,00 e a 
partir do pH 7,00 pode-se observar uma diminuição no valor corrente de 
pico. Então, para fins analíticos o pH 7,00 foi escolhido para ser utilizado no 
decorrer deste estudo devido a apresentar um maior valor de corrente de 
pico. 
 
Figura 15 - Relação corrente de pico(Ip) vs pH 
 
 
54 
 
Também, de acordo com o resultado apresentado na Figura 15, foi 
possível avaliar o efeito do pH no potencial de pico (Ep) de redução do 
BZN, como mostra a Figura 16. Verifica-se, nesta Figura, que o potencial de 
pico catódico do BZN (Epc) é deslocado para valores mais negativos com o 
aumento do pH até o pH 7,00 indicando que a transferência de elétrons é 
dependente do pH do meio. Para valores de pH maiores que 7,00 nenhuma 
variação significativa de Ep foi observada. 
 
Figura 16 - Relação potencial de pico (Ep) vs pH 
 
 
Adicionalmente, conforme podemos observar na Figura 16 existe 
uma relação linear entre pH e Ep até o pH 7,0. Essa relação pode ser 
representada pela equação de regressão linear obtida para a reta Ep vs pH 
dada a segui: 
 
Ep=-0,241(±0,009)-0,0575(±0,002)pH (8) 
 
Como pode ser visto na equação 8, a inclinação da reta no intervalo 
de pH de 2,00 a 7,00 foi aproximadamente 0,058V, que está próximo ao 
valor 0,059V esperado pela equação de Nernst. Isso sugere que o mesmo 
número de prótons e elétrons estão envolvidos na reação de redução do 
BZN. (WANG, 2000) 
Utilizando os valores de Ep e Ep/2 no pH 7,00 foi feito o cálculo do 
número de prontos e elétrons envolvidos na reação de redução, conforme 
segue: 
55 
 
|𝐸𝑝 − 𝐸𝑝 2 
⁄ | = 
47,7 m𝑉𝛼𝑛 |580 m𝑉 − (−556 𝑚𝑉)| = 
47,7 m𝑉𝛼𝑛 
|-24 mV| = 
47,7 𝑚𝑉𝛼𝑛 𝛼𝑛 = 47,7 m𝑉24 m𝑉 = 1,99 
Se 𝛼 = 0,50 (para compostos orgânicos) 𝛼𝑛 = 
1,990,50 = 3,98 ≈ 4 elétrons 
 
Esse resultado está de acordo, com o resultado descrito por La-Scalea et al 
(2002). De acordo com o mecanismo já descrito por esse autor, 
primeiramente, a redução do composto leva a formação de um derivado 
nitroso com o envolvimento de dois elétrons na reação. Esse derivado 
também se reduz, com o envolvimento de mais dois elétrons, levando a 
formação de um derivado hidroxilamina e totalizando quatro elétrons na 
reação química de redução. A Figura 17 mostra o mecanismo de redução do 
BZN. 
 
Figura 17 - Mecanismo de redução do BZN 
 
Fonte: HALL; WILKINSON, 2012. Adaptado 
 
 5.1.3 – Escolha do eletrólito suporte 
 
Após escolhido o pH 7,00 para ser utilizado no decorrer deste 
estudo, foi feita a escolha do eletrólito suporte para dar prosseguimento aos 
experimentos. Em sistemas eletroquímicos o eletrólito suporte é responsável 
pela manutenção da força iônica alta e constante na solução, eliminando a 
migração do analito para a superfície do eletrodo, e influenciando 
diretamente na intensidade da Ip (AGOSTINHO et al., 2004, SKOOG et al., 
2006), sendo um parâmetro importante sobre a resposta eletroanalítica. Para 
essa finalidade foram avaliadas três soluções tampão com capacidade 
56 
 
tamponante no pH 7,00: tampão BR, tampão Mcvaille (MV) e tampão 
fosfato, todos a 0,10 mol L-1, como mostra a Figura 18. 
 
Figura 18 - Voltamogramas cíclicos de 1,00. 10-4mol L-1 BZN em diferentes 
eletrólitos suporte. Intervalo de varredura: 0,10 a -1,00 V. Velocidade de varredura = 100 
mV s -1. 
 
 
Como pode ser observado na Figura 18, os três tampões utilizados 
apresentaram boas respostas analíticas para uma concentração 1,00 x 10-
4mol L-1 de BZN, onde verifica-se nos voltamogramas um pico de redução 
bem definido em aproximadamente -0,58 V. Porém, apesar das respostas 
analíticas serem muito próximas, o tampão BR apresentou uma intensidade 
de Ip um pouco maior, além disso, não foi possível continuar os 
experimentos utilizando o tampão fosfato (que seria mais fácil de preparar) 
devido a uma contaminação em um dos reagentes usados para prepará-lo, 
sendo por esse motivo escolhido o tampão BR para os demais experimentos 
a serem realizados. 
 
5.1.4 – Estudo da variação da velocidade de varredura 
 
Com o objetivo de avaliar a natureza do transporte do material 
eletroativo para a superfície do eletrodo foi feito um estudo da variação da 
velocidade de varredura por voltametria cíclica. Para essa finalidade foram 
obtidos os voltamogramas cíclicos de uma solução 1,00 x 10-4 mol L-1 de 
BZN, variando-se a velocidade de varredura de 10,0 a 800 mVs-1. O registro 
desses voltamogramas é mostrado na Figura 19, onde pode ser observado 
que com o aumento da velocidade de varredura ocorre também o aumento 
57 
 
na intensidade da corrente do pico; porém após a velocidade de 100 mVs-1 
ocorre uma grande perda na resolução da corrente de pico. 
 
Figura 19 - Voltamogramas cíclicos do BZN 1,00. 10-4mol L-1 registrados em 
tampão BR 0,10 mol L -1 pH 7,00. Intervalo de varredura: 0,10 a -1,20 V. Velocidades de 
varredura = 10,0 a 800 mV s -1. 
 
 
Na Figura 20 é possível observar que a Ip variou linearmente em 
função da raiz quadrada da velocidade de varredura. 
 
Figura 20 - Corrente de pico (Ip) em função da raiz quadrada da velocidade de 
varredura 
 
 
A relação linear entre Ip e a raiz quadrada da velocidade de varredura 
é típica para um sistema irreversível (WANG, 2000; PACHECO et al., 
2013), conforme mostrado na equação de Randles-Sevcik: 𝐼𝑝= -2,99 ×105 𝑛(𝛼 𝑛)12 𝐴[O]∞ 𝐷12 𝑉12, já abordada no tópico 3.6.1 (Equação 3). Além 
disso, ainda, de acordo com os critérios de reversibilidade em VC, esta 
58 
 
relação linear indica que o processo de transporte de massa do analito até a 
superfície do eletrodo é controlado por difusão (BARD, FAULKNER; 
2001). 
Outro critério de diagnóstico usado para confirmar a natureza do 
transporte de massa utilizando VC é através da análise da relação linear 
entre log (Ip) vs log(v). Quando se obtém uma relação linear entre log (Ip) 
em função de log (v) com coeficiente angular próximo de 0,50 o processo é 
controlado por difusão, para um coeficiente angular próximo de 1,00 o 
processo é controlado por adsorção (BARD, FAULKNER; 2001; 
COMPTON, 2018). Essa relação log Ip em função de log v é mostrada na 
Figura 21. 
 
Figura 21 - Log Ip em função de log v 
 
A equação matemática que representa a regressão linear mostrada na 
Figura 21 é dada a seguir: 
 
logIp = -4,18(±0,02)+0,44(±0,01)logv (9) 
 R = 0,998 
 
Como pode ser observado na Equação 9, o valor do coeficiente angular é 
próximo a 0,50 confirmando que o transporte de massa é controlado por 
difusão. 
 
 5.2 – Otimização dos parâmetros experimentais da VPD 
 
Como abordado anteriormente, a VPD foi a técnica eletroanalítica 
escolhida para a validação do método. O motivo da escolha da técnica VPD 
59 
 
ao invés de escolher a VOQ (voltametria de onda quadrada) deve-se ao fato 
de que a redução do BZN é um processo irreversível. Na técnica VOQ, a 
corrente resultante é dada pela diferença entre as correntes diretas e 
inversas. Sendo assim, quanto maior a reversibilidade da reação, maior é a 
contribuição da corrente inversa, o que aumenta significativamente a 
corrente resultante e a resposta em termos de intensidade de corrente. Para 
sistemas irreversíveis, no entanto, praticamente não há contribuição da 
corrente inversa medida por VOQ (SOUZA; MACHADO; AVACA; 2003). 
Por esse motivo, com o uso da VOQ o ganho de sensibilidade não é 
significativo para sistemas irreversíveis quando comparado ao uso da 
técnica de VPD, que é uma técnica com menos parâmetros a serem 
otimizados por isso foi escolhida neste trabalho. 
Depois da escolha da técnica, a primeira etapa no desenvolvimento 
de uma metodologia eletroanalítica é a otimização dos parâmetros 
experimentais a fim de se obter uma melhor resposta analítica para o 
método. Sendo assim, realizou-se o estudo da variação dos parâmetros da 
técnica de voltametria de pulso diferencial: velocidade de varredura (v) e 
amplitude de pulso, uma vez que estes parâmetros estão diretamente 
relacionados com a resposta analítica. A variação da velocidade de 
varredura foi feita variando simultaneamente o potencial depulso e o 
intervalo de tempo no software NOVA® 2.1.4. 
 
5.2.1 – Estudo da variação da velocidade de varredura (v) 
 
Foi realizado o estudo da variação da velocidade de varredura (v) a 
partir de voltamogramas de pulso diferenciais registrados para uma solução 
de BZN 1,00 x 10-4 mol L-1 em tampão BR 0,10 mol L-1 pH 7,00 variando-
se a velocidade de varrredura no intervalo de 1,00 a 10,0 mV s-1 enquanto a 
amplitude de pulso foi mantida constante em 30,0 mV. O resultado é 
apresentado na Figura 22. 
 
60 
 
Figura 22 - Voltamogramas de pulso diferencial de uma solução de BZN 1,00 x 10-
4 mol L-1 em tampão BR 0,10 mol L-1 pH 7,00; amplitude de 30,0 mV e com velocidades de 
pulso variando de 1,00 a 10,0 mV s -1. Intervalo de varredura: 0,10 a -1,20 V. 
 
 
A partir dos voltamogramas de pulso diferencial mostrados na Figura 
22 foi possível avaliar o efeito do aumento da velocidade de varredura na 
resposta da Ip (Figura 23). 
 
Figura 23 - Relação da dependência da corrente de pico (Ip) em função da 
velocidade do pulso. 
 
 
Conforme pode ser observado na Figura 23, houve um aumento 
significativo da intensidade da Ip até a velocidade de 6,00 mV s-1. Depois de 
atingido esse valor a intensidade da corrente se manteve praticamente 
constante até a velocidade de 10,0 mV s-1. Porém nesse valor de velocidade 
já ocorre a visível perda de resolução do voltamograma como pode ser visto 
61 
 
na Figura 22. Por esse motivo a velocidade de 6,00 mV s-1 foi escolhida para 
ser usada no desenvolvimento do método de análise do BZN. 
 5.2.2 – Estudo da variação da amplitude de pulso (a) 
 
Após o estudo da variação da velocidade de varredura (v), foi 
realizado o estudo da variação da amplitude de pulso (a). Para essa 
finalidade foram registrados os voltamogramas de pulso diferencial de uma 
solução de BZN 1,00 x 10-4 mol L-1 em tampão BR 0,10 mol L-1 pH 7,00 
com a velocidade do pulso mantida a 6,00 mVs-1 e variando-se a amplitude 
de pulso no intervalo de 10,0 a 100 mV, como mostra a Figura 24. 
 
Figura 24 - Voltamogramas de pulso diferencial de uma solução de BZN 
1,00 x 10-4 mol L-1 em tampão BR 0,10 mol L-1 pH 7,00; velocidade do pulso de 6,00 mVs-1 
e amplitude de pulso variando de 10,0 a 100 mV, registrados no intervalo de varredura de 
0,10 a -1,20. 
 
 
A partir dos voltamogramas de pulso diferencial mostrados na Figura 
21, foi avaliada a relação da corrente de pico catódica (Ipc) do BZN em 
função do aumento da amplitude (a), como apresentado na Figura 25. 
 
62 
 
Figura 25 - Dependência da corrente de pico (Ip) em função da amplitude de pulso 
(a) 
 
 
Como pode ser visto na Figura 25, houve um aumento da corrente de 
pico (Ip) com a variação crescente da amplitude de pulso até o valor de 100 
mV. Adicionalmente, verifica-se nos voltamogramas já apresentados na 
Figura 24 que o aumento de Ip em função do aumento da amplitude ocorreu 
sem perda da resolução do sinal voltamétrico, pois se verifica que não houve 
alargamento da base do voltamograma, que se manteve com o mesmo perfil 
em todo intervalo de amplitude estudado. Sendo assim a amplitude de 100 
mV foi escolhida para ser usada no desenvolvimento do método de análise 
do BZN. 
 
5.3 - Avaliação da linearidade do método 
 
Após a otimização dos parâmetros: velocidade de varredura 
(6,00 mVs-1) e amplitude de pulso (100 mV) da técnica de voltametria de 
pulso diferencial, foi realizado o estudo da variação de concentração do 
BZN utilizado o método de adição de padrão e foram registrados os 
voltamogramas de soluções de BZN no intervalo de concentração de 1,00 a 
10,6 µmol L-1 em solução tampão BR 0,10 mol L-1 pH 7,00 como mostra a 
Figura 23. 
 
 
 
 
 
63 
 
 
Figura 26 - Voltamogramas de pulso diferencial de soluções contendo BZN nas 
concentrações de (a) 1,00 (b) 1,96 (c) 2,91 (d) 3,85 (e) 4,76 (f) 5,66 (g) 6,54(h) 7,41 (i) 8,26 
(j) 9,09 (k)9,82 (l) 10,6 µmol L -1 registrados em tampão BR 0,10 mol L-1 pH 7,00; a 
v= 6,00 mV s-1 e amplitude de 100 mV. Intervalo de varredura: -0,10 a -1,00 V. 
 
 
A partir dos voltamogramas apresentados na Figura 26, e com a 
finalidade de avaliar a linearidade do método, foi construída uma curva 
analítica a qual relaciona a Ip medida em função do aumento da 
concentração de BZN, a qual é mostrada na Figura 27. 
 
Figura 27 - Curva Analítica: corrente de pico (Ip) em função da concentração do 
BZN. 
 
 
64 
 
É possível observar na Figura 27 que existe uma relação linear entre 
a Ip e a concentração do BZN em todo o intervalo de concentração estudado 
(1,00 a 10,6 µmol L-1). Essa relação linear é expressa pela Equação 10. 
 
Ip (μA) = -0,25 ± 0,01 [BZN] / μmol L−1 + 6,36 ± 0,01 (μA) (10) 
R=0,999 
 
A partir do coeficiente angular (b) da equação da curva analítica e do 
valor do desvio padrão (3,41 x 10-9) da medida de corrente de 10 
voltamogramas do branco (registrados no valor do Epc do BZN) foram 
calculados os limites de detecção (LD) e o limite de quantificação, usando 
as equações 5 e 6, respectivamente. O valor do LD calculado foi de 0,044 
µmol L-1 e o valor do LQ calculado foi de 0,135 µmol L-1 no intervalo de 
concentração de 1,00 a 10,6 µmol L-1. 
Considerando, a informação citada anteriormente, de que somente 
5,00% do fármaco é excretado em sua forma inalterada na urina, a 
concentração final de BZN na urina humana seria de aproximadamente 12,8 
µmol L-1. Levando em consideração o fato de que a amostra de urina 
necessita ser diluída dez vezes para a realização das análises é necessário 
que o limite de detecção seja menor do que 1,28 µmol L-1. Com isso, é 
importante ressaltar que mesmo sendo muito baixa a taxa de excreção do 
fármaco na forma inalterada na urina, o LD (0,044 µmol L-1) e o LQ (0,135 
µmol L-1) obtidos pelo método proposto são baixos o suficiente para que o 
BZN possa ser detectado e quantificado na urina humana, e até mesmo o 
menor sinal mensurável (menor ponto da curva analítica) está abaixo desse 
valor (1,00 µmol L-1), o que demonstra que o método desenvolvido é viável 
e altamente sensível para estes propósitos. 
 
 5.4 - Avaliação da precisão do método 
 
A precisão do método foi avaliada por meio da repetibilidade dos 
resultados de medidas realizadas em três níveis de concentrações (baixo, 
médio e alto) dentro do intervalo da curva analítica (1,96; 6,54 e 10,6 µmol 
L-1). Foram registradas oito medidas sucessivas da Ip em um mesmo dia (n = 
65 
 
8) para avaliar a repetibilidade intra-dia e três medidas em diferentes dias 
para avaliar a repetibilidade inter-dia (n = 3). Em ambos os casos o desvio 
padrão relativo (DPR) foi calculado e o resultado é apresentado na Tabela 6. 
 
Tabela 6- DPR intra-dia e inter-dia avaliados para três níveis de concentração de BZN 
Concentração 
BZN (µmol L -1) 
DPR intra-dia (%) 
n = 8 
DPR inter-dia (%) 
n = 3 
1,96 
 
1,48 1,24 
6,54 
 
1,53 1,27 
10,6 
 
2,45 1,62 
 
Conforme pode ser observado na Tabela 6, tanto os valores de DPR 
inter-dia como os valores obtidos intra-dia, para todas as concentrações 
avaliadas, apresentaram valores muito inferiores aos 11,0 % estabelecidos 
pelo DOQ- CGCRE-008 de 04/2020 do INMETRO, conforme abordado 
anteriormente na Tabela 4. Esse resultado comprova que o método analítico 
desenvolvido é preciso. 
 
 5.5 - Avaliação da seletividade do método proposto para análise de 
BZN em urina e na formulação farmacêutica 
 
5.5.1 - Estudo de interferentes na urina 
 
Para avaliar a seletividade do método para determinação de BZN em 
amostra de urina, foi realizado um estudo de interferentes com substâncias 
que estão presentes na urina humana (ácido cítrico, ácido úrico e ácido 
ascórbico). As soluções dos interferentes estudados foram preparadas na 
proporção de 1:500 (6,00 µmol L-1 BZN: 3000 µmol L-1 interferentes). Para 
avaliar a resposta voltamétricae a possível interferência dessas substâncias, 
foram registrados os VPDs na presença e na ausência dos interferentes e a 
resposta relativa foi obtida através da medida da diferença na intensidade da 
corrente do pico nas duas situações. Todas as medidas foram realizadas em 
66 
 
triplicata e a resposta foi expressa em porcentagem. Os resultados são 
apresentados na Tabela 7. 
 
Tabela 7 - Efeito de alguns compostos interferentes na determinação do BZN em urina 
Substâncias interferentes Resposta relativa (%) 
n = 3 
Ácido úrico 96,3 ± 2,47 
Ácido ascórbico 84,1 ± 3,70 
Ácido cítrico 110 ± 1,58 
 
É possível observar que as respostas relativas do BZN, mesmo na 
presença dos interferentes numa proporção de 1:500, foram satisfatórias. 
Conforme pode ser observado na Tabela 7, o ácido que interferiu na 
resposta em maior proporção foi o ácido ascórbico, que interferiu quase 
16% na resposta relativa do BZN. Vale ressaltar que essa interferência, 
apesar de diminuir a intensidade do sinal de resposta do fármaco, não 
impede que a análise seja realizada. Assim sendo, o método proposto é 
seletivo para determinação de BZN em amostras de urina. 
 
5.5.2 – Estudo de interferentes na formulação farmacêutica 
 
A seletividade do método para a análise de BZN na formulação 
farmacêutica foi avaliada através do estudo de interferentes dos 
componentes da matriz (CLN-BR) e dos solventes utilizados para a 
preparação da amostra. Para essa finalidade, VPDs foram registrados com as 
soluções: Controle 1, Controle 2, CLN-BR e CLN-BZN, as quais foram 
previamente descritas no item 4.3.4.3. Além de uma solução BZN obtida 
através da diluição da solução estoque, na mesma concentração que o CNL-
BZN (9,00 µmol L-1). O resultado desse estudo é apresentado na Figura 28. 
 
 
 
 
67 
 
 
Figura 28 - Voltamogramas de pulso diferencial registrados para as soluções 
Controle 1 (vermelho), Controle 2 (azul escuro), Solução BZN 9,00 µmol L-1 (preto), CLN 
– BR (verde), CLN- BZN (azul claro) em tampão BR 0,10 mol L-1 pH 7,00; a v= 6,00 mV 
s-1 e amplitude de 100 mV. Intervalo de varredura: -0,10 a -1,00 V. 
-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0
0,0
-0,8
-1,6
-2,4
 
 
-I
 /
 
A
E / (V) vs E
Ag/AgCl
 BZN solução 9 mol L
-1
 Controle 1 - etanol / tampão BR / THF
 Control 2 - etanol / tampão BR
 CLN-BR
 CLN-BZN
 
 
Como pode ser visto na Figura 28, o CLN-BZN e o THF apresentam 
sinais no mesmo potencial de pico do BZN, porém esse sinal representa no 
máximo 20% da resposta analítica do BZN e por esse motivo não interfere 
significativamente na análise. Além disso, é perceptível que apesar do CLN-
BZN estar presente na mesma concentração do BZN em solução, o CLN-
BZN apresentou uma Ip menor se comparado à solução de BZN em etanol. 
Apesar da diferença na intensidade da corrente de pico nas duas soluções 
contendo o BZN ter sido pequena (12%) esse fato sugere que o teor de 
encapsulação do BZN no CLN não correspondia a 100% na data em que foi 
realizada a análise. Esse dado é útil, pois pode ser usado para estimar a 
estabilidade da formulação CLN-BZN e determinar por quanto tempo a 
encapsulação é efetiva sem que haja alteração na concentração esperada de 
BZN. 
 
5.6 - Avaliação da exatidão do método proposto para análise de BZN 
 
5.6.1 - Adição e recuperação na amostra de urina 
 
68 
 
Para avaliar a exatidão do método proposto para detecção do BZN 
em urina, foram realizados testes de adição e recuperação. Para essa 
finalidade foram registrados VPDs de soluções obtidas a partir da diluição 
de amostras de urina que foram fortificadas com o BZN em três diferentes 
níveis de concentração dentro do intervalo da curva analítica (3,00; 6,00 e 
9,00 µmol L-1), com três replicatas em cada nível, de acordo com a RDC 
166/2007. O procedimento para o preparo dessas soluções está descrito no 
item 4.3.4.1. O percentual de recuperação foi calculado utilizando a fórmula 
abordada na Equação 7. O resultado está apresentado na Tabela 8. 
 
Tabela 8 - Resultados da adição e recuperação de BZN em amostras 
de urina 
 
[BZN] µmol L−1 Recuperação (%) 
n = 3 
3,00 97,7 ± 2,10 
6,00 101 ± 1,60 
9,00 104 ± 3,90 
 
Conforme os resultados apresentados, a aplicação da metodologia 
proposta para à análise do BZN em urina mostrou valores de recuperação 
próximos a 100% nos três níveis de concentração de BZN estudados. Oque 
comprova que o método apresenta boa exatidão para a quantificação do 
BZN nesse tipo de amostra. 
 
5.6.2 - Adição e recuperação na formulação farmacêutica 
 
Para avaliar a exatidão do método proposto para detecção do BZN na 
formulação CLN-BZN, também foram realizados testes de adição e 
recuperação. Para essa finalidade foram registrados VPDs de soluções 
obtidas a partir da diluição de amostras de CLN-BR que foram fortificadas 
com o BZN em três diferentes níveis de concentração dentro do intervalo da 
curva analítica (3,00; 6,00 e 9,00 µmol L-1), com três replicatas em cada 
nível. O procedimento para o preparo dessas soluções está descrito no item 
69 
 
4.3.4.2. O percentual de recuperação também foi calculado utilizando a 
fórmula abordada na Equação 7. O resultado está apresentado na Tabela 9 
 
Tabela 9 - Resultados da adição e recuperação de BZN 
[BZN] µmol L−1 Recuperação (%) 
n = 3 
3,00 105 ± 3,2 
6,00 91,5 ± 3,9 
9,00 82,6 ± 3,9 
 
Conforme os resultados apresentados, a aplicação da metodologia 
proposta também é adequada para a quantificação do BZN na formulação 
contendo CLN-BZN, uma vez que mostrou percentuais de recuperação 
adequados nos três níveis de concentração de BZN estudados, de acordo 
com os critérios r pelo INMETRO conforme foi abordado na Tabela 3. 
 
70 
 
 6 - CONCLUSÃO 
 
Através da resposta voltamétrica das soluções contendo o BZN na 
superfície do eletrodo de trabalho GCE foi possível concluir que o pH do 
meio influencia na transferência de elétrons durante a reação química de 
redução do analito em meio ácido, e que o mesmo apresenta uma melhor 
resposta em intensidade do sinal da Ip no pH 7,00. Também foi possível 
verificar que quatro prótons e quatro elétrons estão envolvidos nessa reação, 
caracterizada como irreversível e controlada por difusão. Além disso, foi 
possível concluir que o BZN apresenta uma resposta analítica semelhante 
em todos os eletrólitos suporte testados. 
Após a otimização dos parâmetros analíticos para a validação do 
método por VPD, foi comprovada a sua linearidade no intervalo de 1,00 a 
10,6 µmol L-1, e os valores de LD e LQ foram obtidos; 0,044 e 0,135 µmol 
L-1, respectivamente. Por meio de estudos de repetibilidade intra-dia e inter-
dia o método mostrou ser preciso, uma vez que apresentou um DPR menor 
que 2,50% para as três concentrações analisadas. A seletividade do método 
também ficou comprovada por meio do estudo de interferentes para as duas 
amostras testadas. Por fim, foi atestada a exatidão do método por meio de 
estudos de adição e recuperação em ambas as amostras analisadas, e os 
resultados foram satisfatórios dentro dos limites recomendados pela 
literatura. 
Sendo assim, o método desenvolvido é promissor, uma vez que 
atende todos os parâmetros estabelecidos pela legislação. Além disso, 
representa um método simples e de baixo custo que pode ser empregado 
como método alternativo para a detecção e quantificação de BZN na 
formulação farmacêutica CLN-BZN e em urina humana. 
 
 
 
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	1 - INTRODUÇÃO
	2 – OBJETIVOS
	2.1 - Objetivo geral
	2.2- Objetivos específicos
	3 - REFERENCIAL TEÓRICO
	3.1 Doença de Chagas
	3.2 Benzinidazol (BZN)
	3.3 NPL
	3.3.1 BZN incorporado ao CLN (CLN-BZN)
	3.4 Métodos de análise do BZN
	3.5 Métodos eletro analíticos - Breve histórico
	3.6 Métodos eletroanalíticos - Aplicação
	3.6.1 Voltametria cíclica (VC)
	3.6.2 Voltametria de pulso diferencial (VPD)
	3.7 Validação
	3.7.1 Seletividade
	3.7.2 Lineridade
	3.7.3 Limite de detecção (LD)
	3.7.4 Limite de quantificação (LQ)
	3.7.5 Exatidão
	3.7.6 Precisão
	3.7.7 Robustez
	4 - MATERIAIS E MÉTODOS
	4.1 Equipamentos utilizados
	4.1.1 Potenciostato
	4.1.2 Célula eletroquímica e eletrodos
	4.1.3 pHmetro
	4.1.4 Agitador magnético
	4.1.5 Evaporador rotativo
	4.1.6 Filtro de seringa micropore Millex 0,45 UI
	4.1.7 Sonda de ultrassom de alta intensidade
	4.2 Extração e purificação do BZN
	4.3 Preparo das CLN
	4.4 Matérias primas, reagentes, e soluções
	4.4.1 Matérias primas
	4.4.2 Reagentes
	4.4.3 Soluções
	4.4.3.1 Solução estoque de BZN
	4.4.3.2 Solução tampão Britton-Robinson (BR)
	4.4.3.3 Solução tampão fosfato
	4.4.3.4 Solução tampão McIlvaine
	4.4.4 Preparo das amostras
	4.4.4.1 Preparo das amostras de urina para a determinação do BZN
	4.4.4.3 Preparo das soluções para o estudo de interferentes na amostra de CLN-BZN
	4.5 Metodologia
	4.5.1 Determinação do BZN em urina
	4.5.2 Determinação do BZN em CLN
	5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO
	5.1 – Voltametria cíclica (VC)
	5.1.1 – Perfil da redução do BZN sobre a superfície do GCE
	5.1.2 – Variação do pH
	5.1.3 – Escolha do eletrólito suporte
	5.1.4 – Estudo da variação da velocidade de varredura
	5.2 – Otimização dos parâmetros experimentais da VPD
	5.2.1 – Estudo da variação da velocidade de varredura (v)
	5.2.2 – Estudo da variação da amplitude de pulso (a)
	5.3 - Avaliação da linearidade do método
	5.4 - Avaliação da precisão do método
	5.5 - Avaliação da seletividade do método proposto para análise de BZN em urina e na formulação farmacêutica
	5.5.1 - Estudo de interferentes na urina
	5.5.2 – Estudo de interferentes na formulação farmacêutica
	5.6 - Avaliação da exatidão do método proposto para análise de BZN
	5.6.1 - Adição e recuperação na amostra de urina
	6 - CONCLUSÃO
	REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASmaneira 
satisfatória, apresentando baixos limites de detecção e quantificação (0,044 e 0,135 µmol L-1 
respectivamente) e uma faixa linear no intervalo de concentração de 1,00 a 10,6 µmol L-1. A 
precisão foi avaliada por meio do valor do desvio padrão relativo (DPR) entre análises 
realizadas inter-dia e intra-dia, apresentando resultados inferiores a 2,50 %. Por meio do 
estudo de interferentes o método se mostrou seletivo para o BZN uma vez que não houve 
interferência significativa dos potenciais interferentes em nenhuma das amostras. A exatidão 
foi avaliada por estudos de adição e recuperação, onde foram obtidos percentuais de 
recuperação dentro dos limites recomendados pela literatura. Portanto, o método desenvolvido 
pode ser aplicado com sucesso como uma alternativa na determinação do BZN em urina e em 
CLN-BZN. 
 
Palavras chave: Doença de chagas. Métodos eletroanalíticos. Amostras biológicas. 
Nanossistemas lipídicos. 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
Benznidazole (BZN) is the only drug available in Brazil to treat Chagas disease (CD). 
However, it is not ideal due to its high toxicity, irregular pharmacokinetics, and effect on the 
chronic phase of the disease is still questionable. Such factors make it necessary to develop 
reliable and effective alternative methods for the analytical determination of BZN in 
biological and pharmaceutical samples. Therefore, this work's objective was to develop an 
electroanalytical method to determine BZN by differential pulse voltammetry (DPV) and 
glassy carbon electrode (GCE) in urine and in pharmaceutical formulation. Initially, cyclic 
voltammetry (CV) was used to determine the electrochemical behavior of BZN on the GCE 
surface and verify the influence of pH, scan rate, and supporting electrolytes. During the CV 
cathodic scan, we found a defined irreversible peak at a potential of -0.58 V. Based on this 
cathodic peak; an electroanalytical method was optimized and validated according to national 
and international guidelines for this drug determination by DPV. This method was applied in 
urine and in a pharmaceutical formulation of BZN incorporated into nanostructured lipid 
carriers (NLC-BZN). The results were satisfactory for the analyzed parameters, with low 
detection and quantification limits (0.044 and 0.135 µmol L-1, respectively) and a linear range 
in the concentration between 1.00 to 10.6 µmol L-1. The method's precision was assessed by 
inter and intraday repeatability voltammograms with results below 2.50%. Through the 
interferences studies, the methodology proved to be selective for BZN since there was no 
significant interference from potential interferences in any of the samples. Recovery tests 
showed that the accuracy was within limits recommended by the literature. Therefore, the 
developed method can be successfully applied as an alternative to determine BZN in urine 
and NLC-BZN. 
 
 
Keywords: Chagas Disease. Electroanalytical methods. Biologic samples. Lipid 
nanosystems. 
 
 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 
 
FIGURA 1 - CICLO DE VIDA DO T. CRUZI ................................................................................. 20 
FIGURA 2 - INCIDÊNCIA DA DOENÇA DE CHAGAS NO MUNDO .................................................. 21 
FIGURA 3 - SINAIS DE PORTA DE ENTRADA. (A) E (B) SINAL ROMAÑA. (C) E (D) CHAGOMA DE 
INOCULAÇÃO ................................................................................................................. 22 
FIGURA 4 - ESTRUTURA QUÍMICA DO BZN ............................................................................. 25 
FIGURA 5 - APLICAÇÃO DO POTENCIAL COM VARREDURA LINEAR PARA VOLTAMETRIA CÍCLICA
 ..................................................................................................................................... 34 
FIGURA 6 - VOLTAMOGRAMAS CÍCLICOS PARA CARACTERÍSTICOS PARA OS DIFERENTES 
SISTEMAS DE REAÇÕES ELETRÓDICAS.............................................................................. 36 
FIGURA 7 - (A) SINAIS DE EXCITAÇÃO PARA A VPD; ............................................................... 37 
FIGURA 8- POTENCIOSTATO/GALVANOSTATO AUTOLAB® PGSTAT 128 N ............................ 44 
FIGURA 9 - CÉLULA ELETROQUÍMICA ..................................................................................... 45 
FIGURA 10 - PREPARO DA SOLUÇÃO ESTOQUE DE BZN ........................................................... 48 
FIGURA 11- PREPARO DAS AMOSTRAS DE BZN FORTIFICADAS COM URINA.............................. 49 
FIGURA 12 - PREPARO DAS AMOSTRAS DE BZN FORTIFICADAS COM CLN ............................... 51 
FIGURA 13 - VOLTAMOGRAMA CÍCLICO DO BZN 1,00 X 10-4 MOL L-1 REGISTRADO EM TAMPÃO 
BR 0,10 MOL L-1 (PH 7,00). ELETRODO DE TRABALHO: GCE. ELETRODO AUXILIAR: 
PLATINA. ELETRODO DE REFERÊNCIA: AG/AGCL. INTERVALO DE VARREDURA: 0,20 A -1,20 
V. V = 100 MV S -1 .......................................................................................................... 52 
FIGURA 14 - VOLTAMOGRAMAS CÍCLICOS DO BZN 1,00. X 10-4 MOL L-1 REGISTRADOS EM 
TAMPÃO BR 0,10 MOL L-1 EM DIFERENTES VALORES DE PH. ELETRODO DE TRABALHO: 
GCE. ELETRODO AUXILIAR: PLATINA. ELETRODO DE REFERÊNCIA: AG/AGCL. INTERVALO 
DE VARREDURA: 0,10 A -1,00. ........................................................................................ 53 
FIGURA 15 - RELAÇÃO CORRENTE DE PICO (IP) VS PH .............................................................. 53 
FIGURA 16 - RELAÇÃO POTENCIAL DE PICO (EP) VS PH ............................................................ 54 
FIGURA 17 - MECANISMO DE REDUÇÃO DO BZN .................................................................... 55 
FIGURA 18 - VOLTAMOGRAMAS CÍCLICOS DE 1,00. 10-4MOL L-1 BZN EM DIFERENTES 
ELETRÓLITOS SUPORTE. INTERVALO DE VARREDURA: 0,10 A -1,00 V. VELOCIDADE DE 
VARREDURA = 100 MV S -1. ............................................................................................. 56 
FIGURA 19 - VOLTAMOGRAMAS CÍCLICOS DO BZN 1,00. 10-4MOL L-1 REGISTRADOS EM TAMPÃO 
BR 0,10 MOL L -1 PH 7,00. INTERVALO DE VARREDURA: 0,10 A -1,20 V. VELOCIDADES DE 
VARREDURA = 10,0 A 800 MV S -1. .................................................................................. 57 
 
FIGURA 20 - CORRENTE DE PICO (IP) EM FUNÇÃO DA RAIZ QUADRADA DA VELOCIDADE DE 
VARREDURA .................................................................................................................. 57 
FIGURA 21 - LOG IP EM FUNÇÃO DE LOG V ............................................................................. 58 
FIGURA 22 - VOLTAMOGRAMAS DE PULSO DIFERENCIAL DE UMA SOLUÇÃO DE BZN 1,00 X 10-4 
MOL L-1 EM TAMPÃO BR 0,10 MOL L-1 PH 7,00; AMPLITUDE DE 30,0 MV E COM 
VELOCIDADES DE PULSO VARIANDO DE 1,00 A 10,0 MV S -1. INTERVALO DE VARREDURA: 
0,10 A -1,20 V. .............................................................................................................. 60 
FIGURA 23 - RELAÇÃO DA DEPENDÊNCIA DA CORRENTE DE PICO (IP) EM FUNÇÃO DA 
VELOCIDADE DO PULSO. ................................................................................................. 60 
FIGURA 24 - VOLTAMOGRAMAS DE PULSO DIFERENCIAL DE UMA SOLUÇÃO DE BZN 1,00 X 10-
4MOL L-1 EM TAMPÃO BR 0,10 MOL L-1 PH 7,00; VELOCIDADE DO PULSO DE 6,00 MVS-1 E 
AMPLITUDE DE PULSO VARIANDO DE 10,0 A 100 MV, REGISTRADOS NO INTERVALO DE 
VARREDURA DE 0,10 A -1,20. ......................................................................................... 61 
FIGURA 25 - DEPENDÊNCIA DA CORRENTE DE PICO (IP) EM FUNÇÃO DA AMPLITUDE DE PULSO (A)
 ..................................................................................................................................... 62 
FIGURA 26 - VOLTAMOGRAMAS DE PULSO DIFERENCIAL DE SOLUÇÕES CONTENDO BZN NAS 
CONCENTRAÇÕES DE (A) 1,00 (B) 1,96 (C) 2,91 (D) 3,85 (E) 4,76 (F) 5,66 (G) 6,54(H) 7,41 (I) 
8,26 (J) 9,09 (K)9,82 (L) 10,6 µMOL L -1 REGISTRADOSEM TAMPÃO BR 0,10 MOL L-1 PH 
7,00; A V= 6,00 MV S-1 E AMPLITUDE DE 100 MV. INTERVALO DE VARREDURA: -0,10 A -1,00 
V. ................................................................................................................................. 63 
FIGURA 27 - CURVA ANALÍTICA: CORRENTE DE PICO (IP) EM FUNÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DO 
BZN. ............................................................................................................................. 63 
FIGURA 28 - VOLTAMOGRAMAS DE PULSO DIFERENCIAL REGISTRADOS PARA AS SOLUÇÕES 
CONTROLE 1 (VERMELHO), CONTROLE 2 (AZUL ESCURO), SOLUÇÃO BZN 9,00 µMOL L-1 
(PRETO), CLN – BR (VERDE), CLN- BZN (AZUL CLARO) EM TAMPÃO BR 0,10 MOL L-1 PH 
7,00; A V= 6,00 MV S-1 E AMPLITUDE DE 100 MV. INTERVALO DE VARREDURA: -0,10 A -
1,00 V. .......................................................................................................................... 67 
 
 
 
LISTA DE TABELAS 
 
TABELA 1 - PROPRIEDADES FISICO-QUÍMICAS DO BZN ............................................................. 26 
TABELA 2 - GRUPOS ELETROATIVOS. ...................................................................................... 32 
TABELA 3 - CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO PARA ENSAIOS DE RECUPERAÇÃO ................................. 41 
TABELA 4 - CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO PARA A REPRODUTIBILIDADE ........................................ 42 
TABELA 5 - LISTA DOS REAGENTES QUÍMICOS UTILIZADOS, PROCEDÊNCIA E PUREZA. ............... 47 
TABELA 6- DPR INTRA-DIA E INTER-DIA AVALIADOS PARA TRÊS NÍVEIS DE CONCENTRAÇÃO DE 
BZN ............................................................................................................................... 65 
TABELA 7 - EFEITO DE ALGUNS COMPOSTOS INTERFERENTES NA DETERMINAÇÃO DO BZN EM 
URINA ............................................................................................................................ 66 
TABELA 8 - RESULTADOS DA ADIÇÃO E RECUPERAÇÃO DE BZN EM AMOSTRAS ......................... 68 
TABELA 9 - RESULTADOS DA ADIÇÃO E RECUPERAÇÃO DE BZN ................................................ 69 
 
 
LISTA DE EQUAÇÕES 
 
Equação 1 – 𝐸 = 𝐸° − 𝑅𝑇/𝑛𝐹 ∑(𝜗𝑖 ln 𝑎𝑖) .......................................................................... 36 
Equação 2 – 𝐼𝑝= -2,69 × 105 𝑛32 𝐴𝐷12 [O]∞ 𝑉12 ..................................................................... 37 
Equação 3 – 𝐼𝑝= -2,99 × 105 𝑛(𝛼𝐶 𝑛)12 𝐴[O]∞ 𝐷12 𝑉12 ......................................................... 37 
Equação 4 – 𝐼𝑝 = 𝑛𝐹𝐴𝐷12𝐶√𝜋𝑡𝑚 [1−𝜎1+𝜎] .......................................................................................... 39 
Equação 5 – 𝐿𝐷 = 3,3 𝑥 𝑆𝑏𝑏 .................................................................................................... 41 
Equação 6 – 𝐿𝑄 = 10 𝑥 𝑆𝑏𝑏 .................................................................................................... 42 
Equação 7 – Recuperação(%) = 𝐶1− 𝐶2𝐶3 × 100 .................................................................. 43 
Equação 8 – y = -0,24 (±0,03) - 0,06 (±0,01) x ................................................................... 56 
Equação 9 – y = -4,18 (±0,02) + 0,44 (±0,01) x R = 0,998 ................................................. 60 
Equação 10– Ip (μA) = -0,25 ± 0,01 [BZN] / μmol L−1 + 6,36 ± 7,41 x 10-9(μA)................. 66 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 
 
 a Amplitude de pulso 
Ag/AgCl Prata/Cloreto de prata 
ai Atividade 
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária 
Bu4NBF4 Tetrafluorborato de tetrabutilamônio 
BZN Benznidazol 
b Coeficiente angular da curva analítica 
BR Britton-Robinson 
CCC Cardiopatia Chagásica Crônica 
 CLN-BR Carreadores lipídicos nanoestruturados - branco 
 CLN-BZN Carreadores lipídicos nanoestruturados incorporados ao Benznidazol 
DC Doença de Chagas 
DMSO Dimetilsulfóxido 
DNA Ácido desoxirribonucléico 
DTU Unidades discretas de tipagem 
DP Desvio padrão 
DPR Desvio padrão relativo 
EQM Eletrodos quimicamente modificados 
Ep Potencial de pico 
Epc Potencial de pico catódico 
FA Fase aquosa 
FO Fase oleosa 
GCE Eletrodo carbono vítreo (do inglês: glassy carbon electrode) 
GSH Glutationa Reduzida 
GSSG Glutationa Oxidada 
HPH Homogeneização de alta pressão 
i Corrente faradaíca 
IC Insuficiência cardíaca 
ICH Conferência Internacional de harmonização 
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, 
 Normalização e Qualidade Industrial 
Ipc Corrente de pico 
 
Ipc Corrente de pico catódico 
Ks Velocidade de transferência de carga 
LD Limite de detecção 
LQ Limite de quantificação 
Log P Coeficiente de partição 
Log D Coeficiente de distribuição 
mL Mililitro 
mV Milivolt 
NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato 
NFX Nifurtimox 
NLS Nanopartículas lipídicas sólidas 
NPL Nanopartículas lipídicas 
OMS Organização Mundial da Saúde 
pKa O negativo do logaritmo da constante de acidez, Ka 
R Coeficiente de correlação 
RDC Resolução da diretoria colegiada 
SCB Classificação biofarmacêutica 
SOD Superóxido dismutase 
SUS Sistema único de saúde 
T. cruzi Trypanossoma cruzi 
THF Tetraidrofurano 
v Velocidade de varredura 
v1/2 Raiz quadrada da velocidade de varredura 
V Volts 
VC Voltametria Cíclica 
VPD Voltametria de Pulso Diferencial 
µA Microampère 
α Coeficiente de transferência eletrônica 
 
 
 
 
SUMÁRIO 
1 - INTRODUÇÃO .................................................................................................. 15 
2 - OBJETIVOS ....................................................................................................... 17 
2.1 - Objetivo geral ....................................................................................... 17 
2.2- Objetivos específicos ............................................................................. 17 
3 - REFERENCIAL TEÓRICO................................................................................ 18 
3.1 Doença de Chagas .................................................................................. 18 
3.2 Benzinidazol (BZN)................................................................................ 24 
3.3 NPL ........................................................................................................ 27 
3.3.1 BZN incorporado ao CLN (CLN-BZN) ..................................................... 29 
3.4 Métodos de análise do BZN .................................................................... 29 
3.5 Métodos eletro analíticos - Breve histórico ............................................. 30 
3.6 Métodos eletroanalíticos - Aplicação ...................................................... 31 
3.6.1 Voltametria cíclica (VC)............................................................................33 
3.6.2 Voltametria de pulso diferencial (VPD) ..................................................... 36 
3.7 Validação ............................................................................................... 37 
3.7.1 Seletividade ............................................................................................... 38 
3.7.2 Lineridade ................................................................................................. 38 
3.7.3 Limite de detecção (LD) ............................................................................ 39 
3.7.4 Limite de quantificação (LQ)..................................................................... 40 
3.7.5 Exatidão .................................................................................................... 40 
3.7.6 Precisão ..................................................................................................... 41 
3.7.7 Robustez ................................................................................................... 42 
4 - MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................... 44 
4.1 Equipamentos utilizados ......................................................................... 44 
4.1.1 Potenciostato ............................................................................................. 44 
4.1.2 Célula eletroquímica e eletrodos ................................................................ 44 
 
4.1.3 pHmetro .................................................................................................. 45 
4.1.4 Agitador magnético ................................................................................... 45 
4.1.5 Evaporador rotativo ................................................................................... 45 
4.1.6 Filtro de seringa micropore Millex 0,45 UI ................................................ 45 
4.1.7 Sonda de ultrassom de alta intensidade ...................................................... 46 
4.2 Extração e purificação do BZN ............................................................... 46 
4.3 Preparo das CLN .................................................................................... 46 
4.4 Matérias primas, reagentes, e soluções. ................................................... 47 
4.4.1 Matérias primas ......................................................................................... 47 
4.4.2 Reagentes .................................................................................................. 47 
4.4.3 Soluções .................................................................................................... 47 
4.4.3.1 Solução estoque de BZN......................................................................... 47 
4.4.3.2 Solução tampão Britton-Robinson (BR) .................................................. 48 
4.4.3.3 Solução tampão fosfato........................................................................... 48 
4.4.3.4 Solução tampão McIlvaine ..................................................................... 48 
4.4.4 Preparo das amostras ................................................................................. 49 
4.4.4.1 Preparo das amostras de urina para a determinação do BZN ................... 49 
4.4.4.2 Preparo das amostras de CLN para a determinação do BZN.................... 49 
4.4.4.3 Preparo das soluções para o estudo de interferentes na amostra de 
CLN-BZN..................................................................................................................... 50 
4.5 Metodologia ........................................................................................... 51 
4.5.1 Determinação do BZN em urina ................................................................ 51 
4.5.2 Determinação do BZN em CLN ................................................................ 51 
5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 52 
5.1 – Voltametria cíclica (VC) ...................................................................... 52 
5.1.1 – Perfil da redução do BZN sobre a superfície do GCE .............................. 52 
5.1.2 – Variação do pH....................................................................................... 52 
 
5.1.3 – Escolha do eletrólito suporte ................................................................... 55 
5.1.4 – Estudo da variação da velocidade de varredura ....................................... 56 
5.2 – Otimização dos parâmetros experimentais da VPD .............................. 58 
5.2.1 – Estudo da variação da velocidade de varredura (v) .................................. 59 
5.2.2 – Estudo da variação da amplitude de pulso (a) ......................................... 61 
5.3 - Avaliação da linearidade do método ..................................................... 62 
5.4 - Avaliação da precisão do método .......................................................... 64 
5.5 - Avaliação da seletividade do método proposto para análise de BZN em 
urina e na formulação farmacêutica ......................................................................... 65 
5.5.1 - Estudo de interferentes na urina ............................................................... 65 
5.5.2 – Estudo de interferentes na formulação farmacêutica ............................... 66 
5.6 - Avaliação da exatidão do método proposto para análise de BZN........... 67 
5.6.1 - Adição e recuperação na amostra de urina ............................................... 67 
6 - CONCLUSÃO .................................................................................................... 70 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 71 
15 
 
 
1 - INTRODUÇÃO 
 
A doença de Chagas (DC) é uma doença de grande impacto social, 
especialmente em países da América Latina, estando no ranking da 
Organização Mundial da Saúde (OMS) entre as 17 doenças tropicais mais 
negligenciadas do mundo (FERREIRA et al., 2019). Atualmente, o 
benznidazol (BZN) é o único medicamento disponível para o tratamento da 
doença no Brasil e na maioria dos países da América Latina (RIBEIRO, V., 
et al., 2020 ). Trata-se de um derivado nitroimidazólico, usado 
especialmente na fase aguda da doença, na fase crônica ou em episódios de 
reativação, o BZN é menos eficaz e induz a inúmeras reações adversas 
(ALDASORO et al., 2018; COURA et al., 1997). 
Devido à importância mundial do controle da DC, especialmente na 
América latina, a falta de fármacos disponíveis para o tratamento desta 
doença e a toxicidade do BZN, se torna extremamente importante o 
desenvolvimento de um método eficaz de quantificação desse fármaco. As 
metodologias de análise recomendadas em monografias oficiais para 
análises farmacêuticas são, em sua maioria, realizadas empregando técnicas 
espectrofotométricas e cromatográficas (BRITISH PHARMACOPOEIA, 
2011; FARMACÓPEIA BRASILEIRA, 2019; UNITED STATES 
PHARMACOPEIA, 2011). Buscando métodos alternativos, as técnicas 
eletroanalíticas têm sido cada vez mais empregadas por analistas e vem 
ganhando espaço nos últimos anos como métodos alternativos e 
complementares de análises farmacêuticas (WANG, 2002). Essas técnicas 
são capazes de fornecer limites de detecção baixos e um amplo conjunto de 
informações capazes de descrever e caracterizar um sistema eletroquímico. 
Uma das principais vantagens dos métodos eletroquímicos quando 
comparados aos cromatográficos é a possibilidade de análise direta da 
amostra, sem a necessidade de etapas de separação preliminares (GALLI et 
al., 2006) o que pode levar a uma redução considerável do consumo de 
solventes durante a análise. Além disso, esses métodos possuem baixo custo 
16 
 
de instrumentação, simplicidade, alta sensibilidade, seletividade e rapidez de 
análise (WANG;COMPTON, 2021). 
A voltametria é uma técnica eletroanalítica baseada nos fenômenos que 
ocorrem na interface eletrodo de trabalho - solução. Entre os vários tipos de 
materiais que podem ser utilizados na fabricação de eletrodos de trabalho, o 
carbono apresenta vantagens como: baixo custo, ampla janela de potencial e 
atividade eletrocatalítica para uma variedade de reações redox. Além disso, 
é um material relativamente inerte. (MCCREERY, 2008). 
A partir de uma busca na literatura utilizando como fontes de busca o 
google acadêmico e o Science Research não foi possível encontrar trabalhos 
eletroquímicos para a determinação do BZN em nenhum tipo de amostra 
utilizando a técnica de Voltametria de Pulso Diferencial (VPD). Assim este 
trabalho apresenta pela primeira vez uma metodologia utilizando a técnica 
VPD para análise e determinação de BZN em amostras de urina e em uma 
formulação farmacêutica de BZN incorporado a carreadores lipídicos 
nanoestruturados (CLN-BZN) utilizando o eletrodo carbono vítreo (GCE) 
como eletrodo de trabalho. 
 
 
17 
 
2 – OBJETIVOS 
 
2.1 - Objetivo geral 
 
 Desenvolver uma metodologia eletroanalítica para a análise do 
BZN e aplicá-la na determinação do mesmo em amostras de urina e em 
CLN-BZN. 
 
2.2- Objetivos específicos 
 
● Determinar a resposta voltamétrica das soluções contendo o BZN e a 
influência do pH e dos diferentes eletrólitos nestas respostas; 
● Obter informações sobre o potencial redox e o número de elétrons para a 
reação química de redução do BZN; 
● Otimizar os parâmetros da técnica VPD; 
● Desenvolver uma metodologia eletroanalítica nas condições otimizadas 
para a quantificação do BZN; 
● Aplicar a metodologia desenvolvida na análise de urina 
● Aplicar a metodologia desenvolvida na análise de CLN-BZN 
 
 
 
 
 
18 
 
 3 - REFERENCIAL TEÓRICO 
 
 3.1 Doença de Chagas 
 
A DC é uma antropozoonose causada pelo protozoário Trypanosoma 
cruzi (T. Cruzi) que foi descoberta no Brasil em 1909 pelo médico Carlos 
Chagas (ECHEVERRIA; MORILLO, 2019; BERN et al., 2019; LIDANI et 
al., 2019). O médico, após isolar o T. cruzi, elucidou todo o ciclo biológico 
da doença e posteriormente identificou o vetor e o hospedeiro (BERN et al., 
2019; DIAS et al., 2009; LIDANI et al., 2019; RASSI JR ; RASSI; 
MARIN-NETO, 2010). Porém, há evidências de que a doença pode ter 
surgido antes de Cristo, uma vez que vários estudos isolaram o T. cruzi em 
tecido de múmias andinas pré-colombianas datadas de 7050 aC. 
(ECHEVERRIA; MORILLO, 2019 ). Há a estimativa de que cerca de sete 
milhões de pessoas em todo o mundo estejam infectadas com a doença, que 
é encontrada principalmente em áreas endêmicas de países da América 
Latina (WHO, 2021). 
O T. cruzi, possui capacidade de infectar qualquer célula, 
especialmente macrófagos, fibroblastos e células epiteliais (LIDANI et al., 
2019). Trata-se de um parasita intracelular hemoflagelado pertencente à 
ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae. (LIDANI et al., 2019; 
SOBRINHO et al., 2007). Ele faz parte de um ecossistema exclusivamente 
americano, e pode ser encontrado desde o sul dos Estados Unidos até o sul 
da Argentina e do Chile (SOBRINHO et al., 2007). O parasita possui três 
formas morfológicas principais durante o seu ciclo de vida: amastigota, 
epimastigota e tripomastigota. As duas primeiras são formas proliferativas 
que se replicam por fissão binária. A primeira é encontrada nas células de 
mamíferos e a segunda no intestino do vetor triatomíneo. A forma 
tripomastigota, é a forma infectante, não é replicativa e pode ser encontrada 
na corrente sanguínea do hospedeiro ou no reto e nas fezes de vetores 
(BERN et al., 2019; RASSI JR; RASSI; MARIN-NETO, 2010, LIDANI et 
al., 2019 ; SOBRINHO et al., 2007). 
O parasito é transmitido ao homem através de um vetor. Os insetos 
hematófagos transmissores da DC são conhecidos no Brasil principalmente 
19 
 
como “barbeiro” ou “percevejo”, porém recebem inúmeros nomes vulgares, 
dependendo do país e da região que se encontram. Trata-se de insetos 
pertencente à ordem Heteroptera, família Reduviidae, subfamília 
triatominiae (GALVÃO, 2014; VERMELHO; RODRIGUES; SUPURAN, 
2020). Aproximadamente 140 espécies de triatomíneos são capazes de 
transmitir o T. cruzi, mas as principais responsáveis pela transmissão desse 
parasita ao homem são aquelas propensas a habitar ambientes domésticos. 
Entre essas espécies estão o Triatoma infestans e Panstrongylus megistus 
em alguns países da América do Sul, Triatoma dimidiata no sul do México 
e América Central e Rhodnius prolixus na América Central e norte da 
América do Sul (RASSI JR; RASSI; MARIN-NETO, 2010). Embora o 
Triatoma infestans tenha sido erradicado do Brasil em 2006 (FERREIRA; 
SILVA, 2006), o país possui uma enorme diversidade de outas espécies, 
principalmente na região Nordeste. Essas espécies possuem hábitos 
noturnos e são comumente encontradas em ambientes domésticos e locais 
escuros, como fendas em paredes, atrás de móveis ou dentro de currais 
(BERN et al., 2019) sendo mais comum em áreas pobres e regiões rurais, 
priorizando pessoas socialmente excluídas (KIRCHHOFF, 1993). Sendo 
assim, a transmissão vetorial da DC está relacionada com os aspectos 
sociais, culturais e econômicos de uma população. Existem inúmeros 
mamíferos que são reservatórios da doença. Animais como macacos, 
gambás, tatus, roedores, preguiça e morcegos são reservatórios silvestres da 
doença; cães, gatos, ratos domésticos são exemplos de reservatórios 
domésticos (DIAS, 1992). 
O ciclo de vida do T. cruzi se inicia quando o triatomíneo se 
alimenta do sangue do homem ou animal infectado (CLAYTON, 2010). Ao 
se alimentar, o inseto elimina suas fezes e urina na pele do hospedeiro, que 
ao coçar o local da picada ou levar a mão nas mucosas permite a entrada do 
parasito na corrente sanguínea, nas formas tripomastigotas metacíclicas, que 
são capazes de invadir várias células. Dentro das células, o parasita assume 
a forma amastigota, que se multiplica por divisão binária e após a 
multiplicação se diferenciam novamente em tripomastigotas, que destroem 
as células e ficam circulantes na corrente sanguínea, podendo infectar novas 
células. A partir de então, se o triatomíneo picar um hospedeiro infectado e 
20 
 
ingerir os tripomastigotas circulantes, estes irão se diferenciar em 
epimastigotas no intestino médio do inseto, e essas epimastigotas 
posteriormente se multiplicarão e irão se diferenciar em tripomastigotas 
metacíclicas no intestino posterior do triatomíneo, dando início ao um novo 
ciclo de transmissão (PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 2018, RASSI JR; 
RASSI; MARIN-NETO, 2010). O ciclo de vida do T. cruzi está 
esquematizado na Figura 1. 
 
Figura 1 - Ciclo de vida do T. cruzi 
1-Picada do triatomíneo e passagem dos trypanosomas para o hospedeiro (na forma 
tripomastigota) pelas fezes do inseto. 2-Penetração das tripomastigotas nas células e 
diferenciação em amastigotas. 3- Multiplicação das formas amastigotas por divisão binária. 
4-As formas amastigotas intracelulares se transformam em tripomastigoas saem da célula e 
entram na corrente sanguínea. 4.1- As formas tripomastigotas podem infectar outras células 
e tornam a se transformar em amastigotas intracelulares, em novos locais de infecção. 
Podem ficar visíveis os sintomas clínicos nesse ponto. 5- Picada do triatomíneo (hospedeiro 
infectado) e ingestão de protozoários na forma tripomastigota pelo inseto. 6-Trypanosomas 
na forma epimastigota no estômago do inseto 7-Multiplicação dos trypanosomas no 
estômago do inseto.8-Trypanosomas na forma tripomastigota no intestino do inseto. 
 
 
Fonte: Wikpédia. Adaptado. 
 
Além deste ciclo de vida complexo, o parasita possui um polimorfismo 
genético considerável. As espécies de T. cruzi possuem uma grande 
variedade de genótipos e fenótipos relatados até agora. Atualmenteas cepas 
No triatomíneo No hospedeiro 
4.1 
Início da infecção 
Diagnóstico 
21 
 
do parasita são divididas em sete unidades discretas de tiapagem (Discrete 
Typing Unit - DTUs), designinadas de TcI até TcVI e a TcBat, identificada 
em morcegos recentemente (LIMA et al., 2014; VERMELHO; 
RODRIGUES; SUPURAN, 2020) e cada DTU contém várias cepas que 
possuem grande diversidade genotípica e fenotípica (VERMELHO; 
RODRIGUES; SUPURAN, 2020). 
Embora em menor proporção, a DC também pode ser transmitida por 
outros mecanismos, como; por via oral (através da ingestão de água ou 
alimentos contaminados), por transfusão sanguínea ou por transmissão 
vertical durante a gestação (ALDASORO et al., 2018; ECHEVERRIA, 
2019; BERN, 2019). A transmissão do T. cruzi por transfusão sanguínea é a 
principal forma de transmissão em países não endêmicos (PÉREZ-
MOLINA; MOLINA, 2018) e nas últimas décadas, um grande aumento no 
número de casos nesses países tem sido observado. Isso pode ser 
considerado como um impacto da migração legal e ilegal para esses países, 
tornando a doença um problema de saúde pública mundial (CONNERS et 
al., 2016). Nesse contexto, a doença já está presente em países não 
endêmicos da América do Norte, Europa e região do Pacífico Ocidental 
(LIDANI et al., 2019). (FIG. 2) 
 
Figura 2 - Incidência da doença de Chagas no mundo 
 
Fonte: Drugs for neglected disease initiative. Adaptada. 
 
A DC apresenta fisiopatologia complexa e apresenta duas fases: A 
fase aguda e a fase crônica. A primeira é caracterizada por uma alta 
parasitemia, geralmente assintomática (BARRETT et al., 2003; PÉREZ-
MOLINA; MOLINA, 2018). Quando ocorrem manifestações sintomáticas 
como febre prolongada, cefaleia e esplenomegalia, geralmente cessam em 
22 
 
60 dias, mesmo sem nenhum tratamento (BARRETT et al., 2003). Os sinais 
clínicos típicos nessa fase da doença são o sinal Romaña e o chagoma de 
inoculação (FIG. 3). (ALEXANDRE et al., 2014, Pérez-Molina; Molina, 
2018, RASSI et al., 2010). O sinal Romaña é o sinal de porta de entrada do 
parasita através das membranas oculares e é caracterizado por um inchaço 
indolor de uma ou ambas as pálpebras de um olho. O chagoma de 
inoculação é o sinal de porta de entrada do parasita através da pele e é 
caracterizado por uma lesão eritematosa, cercada por inchaço e indolor 
(RASSI et al., 2010). A doença aguda grave pode ocorrer em até 5% dos 
pacientes e inclui manifestações como miocardite aguda, derrame do 
pericárdico e meningoencefalite, podendo ser letal (PÉREZ-MOLINA; 
MOLINA, 2018). 
 
Figura 3 - Sinais de porta de entrada. (A) e (B) Sinal Romaña. (C) e (D) Chagoma 
de inoculação 
 
Fonte: RASSI et al., 2010. 
 
Com a diminuição da parasitemia para níveis indetectáveis, tem 
início a fase crônica, na qual estão presentes duas formas da doença: 
indeterminada (latente, pré-clínica) e determinada (clínica). A forma clínica 
se subdivide nas formas cardíaca, digestiva e cardiodigestiva (RASSI et al., 
2010). A forma indeterminada representa até 70% dos casos de pacientes 
chagásicos crônicos. Nesta forma da doença os pacientes que apresentaram 
ou não os sintomas durante a fase aguda, nunca desenvolverão a doença 
clinicamente aparente. Os pacientes que desenvolverão uma forma 
determinada da doença poderão desenvolver as formas cardíaca, digestiva 
(megaoesôfago e megacólon) ou cardiodigestiva. Isso pode ocorrer décadas 
https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/myocarditis
https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/pericardial-fluid
https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/pericardial-fluid
https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/meningoencephalitis
23 
 
após a infecção inicial (CARVALHO; GOLDENBERG; CAMPOS DE 
CARVALHO, 2017; RASSI et al., 2010; PÉREZ-MOLINA; MOLINA, 
2018.). 
A forma cardíaca, conhecida como cardiomiopatia chagásica crônica 
(CCC) geralmente manifesta-se por arritmias cardíacas, insuficiência 
cardíaca (IC) e tromboembolismo. As arritmias são responsáveis pela 
maioria das mortes na cardiomiopatia chagásica, podendo levar os pacientes 
a morte súbita. A IC é a segunda causa de morte mais comum, além de 
impactar negativamente a qualidade de vida do paciente. O 
tromboembolismo é responsável pelas mortes restantes, sendo o cérebro o 
local mais comumente afetado, causando acidentes vasculares cerebrais 
(CARVALHO; GOLDENBERG; CAMPOS DE CARVALHO, 2017). 
A forma digestiva é caracterizada pela formação de 
megacólon e megaesôfago. Isso ocorre devido à dilatação crônica destas 
vísceras por destruição dos plexos mioentéricos de Meissner e Auerbach. O 
Megaesôfago causa dificuldade de deglutição, dor epigástrica e 
regurgitação, podendo levar à desnutrição do paciente. O megacólon causa 
constipação grave e distensão abdominal, podendo levar a complicações 
como obstrução intestinal e/ou constipação crônica (CARVALHO; 
GOLDENBERG; CAMPOS DE CARVALHO, 2017; SALVADORI et al., 
2018). A forma cardiogestiva é a associação das formas cardíaca e digestiva 
(RASSI et al., 2010). 
Mesmo após mais de um século da descoberta da DC apenas dois 
fármacos têm se demonstrado eficaz contra o T. cruzi e são aprovados pela 
FDA (Food and Drug Administration) para o tratamento da doença: o 
nifurtimox (NFX) e o BZN (KRATZ, 2019; PERON et al., 2017; PÉREZ-
MOLINA; MOLINA, 2018; VERMELHO; RODRIGUES; SUPURAN, 
2020). O NFX foi o primeiro medicamento proposto para o tratamento da 
DC, age impedindo o metabolismo dos carboidratos do T. cruzi através da 
inibição da síntese do ácido pirúvico (BERN et al., 2019). O BZN é 
considerado o fármaco de primeira escolha, uma vez que o mesmo possui 
melhor tolerância e dados de eficácia mais abrangentes (BERN et al., 2019). 
Além disso, é único tratamento disponível no Brasil e na maioria dos países 
da América Latina atualmente (PERON et al., 2017; PÉREZ-MOLINA; 
24 
 
MOLINA, 2018). Os dois fármacos possuem reações adversas semelhantes. 
(VERMELHO; RODRIGUES; SUPURAN, 2020), porém o NFX possui 
menor tolerância digestiva, o que pode levar o paciente à anorexia (BERN et 
al., 2019; DIAS et al., 2016). Tanto o BZN quanto o NFX exibem alta taxa 
de cura na fase aguda da doença, porém ainda não há um consenso sobre a 
efetividade do uso dos mesmos na fase crônica. 
Muitos fármacos foram propostos como candidatos a tratamento da 
doença. Os azóis posaconazol e ravuconazol foram testados em estudos 
recentes, mas até então nenhum mostrou eficácia terapêutica aceitável. 
(BERN et al., 2019; KRATZ, 2019; VERMELHO; RODRIGUES; 
SUPURAN, 2020 ). Apesar disso, esses fármacos podem ser úteis em 
algumas situações específicas, como por exemplo, nas reativações em 
imunodeprimidos, se houver impossibilidade do uso do tratamento de 
escolha. Outros antifúngicos azólicos como cetoconazol, itraconazol, 
fluconazol e o alopurinol também podem ser utilizados nessas condições, 
uma vez que são reconhecidos como supressores da parasitemia por T. cruzi 
(DIAS et al., 2016). 
O fato de o parasita possuir uma grande diversidade genética torna mais 
difícil à descoberta de novos fármacos para o seu tratamento. Isso acorre 
porque os protocolos de triagem para obtenção de novas drogas incluem 
apenas cepas de referência contra T. cruzi e o critério para a escolha de uma 
cepa de referência não é científico, a seleção é baseada em disponibilidade e 
experiência histórica (VERMELHO; RODRIGUES; SUPURAN, 2020). 
 
3.2 Benzinidazol (BZN) 
 
O BZN [N-benzyl-(2-nitroimidazol) acetamida], (Figura 4) foi 
desenvolvido inicialmente, em 1972, no Brasil, pela farmacêutica Roche 
(Rochagan® e Radanil®). Atualmente é fabricado exclusivamente pelo 
Laboratório Farmacêutico do Estado de Pernambuco (Lafepe), no Brasil e 
pelo laboratório privado Elea (Abarax®), Argentina (RIBEIRO et al., 
2020). Em 2018 tornou-se comercialmente disponível nos Estados Unidos,onde é comercializado pela Exeltis, uma divisão americana da Insud Pharma 
(BERN et al., 2019). 
25 
 
É comercializado no Brasil nas dosagens de 100 e 12,5 mg, para uso 
adulto e pediátrico, respectivamente. A dose diária recomendada para o 
tratamento é de 5 a 10 mg por Kg (durante 60 dias). No Brasil o 
medicamento é distribuído gratuitamente pelo Sistema único de Saúde 
(SUS) e não há distribuição ao mercado farmacêutico geral (DIAS et al., 
2016; FERREIRA et al., 2019). 
 
 Figura 4 - Estrutura química do BZN 
 
 Fonte: STRECK et al., 2011 
 
O BZN é pouco solúvel em água, sendo muito solúvel em 
dimetilsufóxido (DMSO) e fracamente solúvel em solventes como etanol e 
metanol (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2019). Não há um consenso 
entre os autores sobre a sua classificação no sistema de classificação 
biofarmacêutica (SCB), havendo divergências entre diferentes trabalhos que 
analisaram as suas características. O SCB divide os fármacos em classes de 
acordo com a solubilidade aquosa e a permeabilidade intestinal. Alguns 
autores como De Moura et al. (2018) classificam o BZN como pertencente 
ao grupo II, fármacos com baixa solubilidade e alta permeabilidade; outros 
como Kasim et al. (2004) acreditam que o fármaco pertence ao grupo III, ou 
seja, alta solubilidade e baixa permeabilidade; de acordo com estudos de 
Maximiano; Costa; e Souza (2010) ele seria classificado como grupo IV : 
baixa solubilidade e baixa permeabilidade. Algumas propriedades físico-
químicas do BZN estão resumidas na Tabela 1, abaixo: 
 
 
26 
 
Tabela 1 - Propriedades fisico-químicas do BZN 
Solubilidade molar 1,50. 10-3 mol / L* 
Densidade 1,35 g/cm3** 
Coeficiente de partição (log P) 0,910 ± (0.554)* 
* Temp: 25,0 °C, pH 7,00 ** Temp: 20,0 °C, Press: 760 Torr 
Fonte: Dados obtidos do Scifinder (2021) 
 
O BZN é administrado por via oral, sua absorção é rápida e quase 
completamente pelo trato gastrointestinal. É metabolizado pelo fígado, com 
biotransformação parcial (RIBEIRO et al., 2009). Segundo um estudo 
realizado por PERIN et al. (2017) a biodistribuição do BNZ é extensa, 
atingindo órgãos como o coração e cólon, que são os órgãos mais relevantes 
afetados pela infecção pelo T. cruzi; esse estudo também sugere que o 
fármaco possui uma baixa biodisponibilidade e inadequada biodistribuição, 
devido a sua baixa solubilidade aquosa. O tempo de meia vida plasmática é 
de aproximadamente 12 horas, sendo o pico em 3,5 horas, com 
concentrações máximas de 2,20 μg / mL (MOLINA et al., 2017). Sua taxa 
de ligação a proteínas plasmáticas é de 44,0%, atingindo sua concentração 
máxima (2,22 a 2,80 μg/ml) em 2 a 4 horas (RIBEIRO, C., et al., 2009). É 
excretado pela urina e fezes, tanto na forma inalterada como de seus 
metabólitos (RAAFLAUB, 1980). De acordo com Workman et al., (1984) 
5,00% do fármaco é excretado em sua forma inalterada na urina. 
O mecanismo de ação do BZN até hoje não está completamente 
elucidado. Vários estudos têm atribuído diferentes mecanismos de ação ao 
BZN (TEMPERTON et al., 1998; PEDROSA et al., 2001; MAYA et al., 
2007; DIAS et al., 2009).O mais aceito sugere que o BZN atua após a sua 
ativação por uma reação catalisada por enzimas nitroredutases tipo I 
(TcNTR). Neste processo as TcNTR dependentes de NADH reduzem o 
resíduo 2-nitroimidazol do BZN a hidroxilamina em uma transferência de 
duas etapas (dois elétrons por etapa). A hidroxilamina é convertida em 
dialdeído glioxal, que é altamente reativo e capaz de formar ligações 
covalentes em DNA, RNA e proteínas do parasita, promovendo assim dano 
oxidativo e perda da capacidade de reprodução ao T. cruzi (CALDAS, 
SANTOS, NOVAES,2019; PAULAI, SERRANO, TAVARES, 2009; 
27 
 
RIBEIRO, C., et al., 2009 ; DIAS et al., 2009). Porém, devido a sua alta 
reatividade, essas espécies reativas formadas podem atuar também em 
outros sistemas, como por exemplo, no hospedeiro (humano), o que justifica 
os efeitos citotóxicos do medicamento (RIBEIRO, C., et al., 2009; DIAS et 
al., 2009). 
Como citado anteriormente o BZN possui efeitos citotóxicos, e esses 
são de grande relevância no tratamento. Ferreira et. al., (2019) evidenciam 
que 38% dos pacientes podem apresentar reações adversas ao tratamento, 
oque pode levar ao abandono do mesmo. Vários estudos foram realizados 
com pacientes durante o tratamento medicamentoso com o BZN para 
identificar a natureza dessas reações. As principais incluem Rash cutâneo, 
tremores, cefaleia, sintomas gastrointestinais, náuseas, vômitos, anemia, 
problemas respiratórios e até mesmo sintomas neurológicos. Essas reações 
variam de acordo com alguns fatores como idade do paciente e esquema 
terapêutico adotado (CHIAPPAUX et al., 2013 ; COURA et al., 1997; DE 
ANDRADE et al., 1996; ESTANI et al., 1988; MORILO et al., 2015). Uma 
alternativa para reduzir esses efeitos adversos seria a encapsulação desses 
fármacos em nanopartículas lipídicas (NPL). 
 
3.3 NPL 
 
As NPL são sistemas de liberação de fármacos, desenvolvidas nos 
anos 90, como um sistema alternativo de encapsulação de princípios ativos 
em relação aos sistemas coloidais tradicionais, como emulsões, lipossomas, 
nanoemulsões e nanopartículas (SOUTO et al., 2011). As NPL são capazes 
de aumentar a solubilidade e a permeabilidade do fármaco, além de 
direcioná-lo ao alvo específico diminuindo assim a sua toxicidade 
(ALMEIDA et al., 2017). Além disso, aumentam a estabilidade química do 
fármaco, pois são capazes de protegê-lo contra a degradação no trato 
gastrointestinal e durante o seu armazenamento (SHUKLA et al., 2018). O 
fato de a matriz lipídica ser feita de lipídios fisiológicos é uma vantagem, 
pois são biocompatíveis, oque diminui o risco de toxicidade aguda e crônica 
(MEHNERT; MÄDER, 2002). 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X12002815#!
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X12002815#!
28 
 
Nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) correspondem à primeira 
geração de partículas transportadoras lipídicas de matriz sólida (LOPES et 
al., 2018). Essas partículas possuem diâmetro entre aproximadamente 50 e 
1000 nm e são produzidas principalmente pelo método de homogeneização, 
geralmente pelo uso de homogeneização de alta pressão (HPH) 
(BATTAGLIA; GALLARATE, 2012; SHUKLA et al., 2018). As NLS 
possuem propriedades únicas, como grande área de superfície, alta 
capacidade para o carreamento de drogas, direcionamento específico do 
local de ação, facilidade de produção em larga escala usando a técnica de 
HPH e aumento da biodisponibilidade de qualquer agente terapêutico 
(GHASEMIYEH; MOHAMMADI-SAMANI, 2018; SHUKLA et al., 
2018). Os ingredientes gerais para a preparação das NLS incluem lipídios 
sólidos (triglicerídeos, ácidos graxos, esteroides ou ceras) surfactante(s) não 
iônicos e água (MEHNERT; MÄDER, 2002; SHUKLA et al., 2018). Os 
lipídios usados para a preparação dos NLS devem ser biocompatíveis, 
biodegradáveis e sólidos à temperatura ambiente (SHUKLA et al., 2018). 
Apesar de possuir muitas vantagens, esse tipo de NLP possui 
algumas limitações. Logo após a sua produção, o lipídio sólido recristaliza 
em formas polimórficas instáveis (α e β0) e com o tempo tendem a transitar 
para formas mais estáveis, que são as modificações βi e β. Essas transações 
polimórficas podem levar o fármaco a ser expelido da matriz, o que limita a 
sua capacidade de carreamento e ele pode não ser capaz de atingir os níveis 
terapêuticos desejados. Além disso, pode haver uma mudança no perfil de 
liberação do medicamento durante o tempo de armazenamento, o que 
contribui para uma diminuição da estabilidade física do NLS em longo 
prazo (LOPES et al., 2018). Os Carreadores Lipídicos Nanoestruturados 
(CLN) foram desenvolvidos como uma segunda geração de NLS, com o 
objetivo de contornar as limitações mencionadas (COLA et al., 2016; 
LOPES et al., 2018). Diferentedas NLS a fase lipídica dos CLNs é 
composta por uma mistura de um lipídeo sólido e um lipídio líquido (um 
óleo, por exemplo). A presença do óleo evita a recristalização perfeita do 
lipídio sólido, e apesar da inserção do óleo, a matriz lipídica continua sendo 
sólida em temperatura ambiente e corporal (LOPES et al., 2018). 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X12002815#!
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X12002815#!
29 
 
3.3.1 BZN incorporado ao CLN (CLN-BZN) 
 
Como se sabe, a solubilidade é um parâmetro fundamental para a 
avaliação da taxa de absorção, permeabilidade e biodisponibilidade de um 
fármaco. Sendo assim, através de tecnologias farmacêuticas que conseguem 
melhorar a solubilidade e consequentemente a dissolução do fármaco é 
possível aperfeiçoar seu potencial terapêutico e eficácia, além de obter uma 
redução de seus efeitos colaterais (DE MOURA et al., 2018). Neste 
contexto, e diante das vantagens expostas dos CLNs, Silva (2019) propôs 
um estudo com o objetivo de desenvolver, caracterizar e avaliar a eficácia 
tripanocida in vitro dos CLN contendo o BZN (CNL-BZN). Através das 
avaliações da estabilidade preliminar, da atividade hemolítica, da 
viabilidade celular e da atividade tripanocida; a autora verificou que esta 
formulação desenvolvida se mostrou promissora contra a forma amastigota 
do parasita e dessa forma apresenta potencial para o tratamento da DC. Esta 
formulação (CLN-BZN) foi utilizada no presente estudo para a 
quantificação do BZN. 
 
3.4 Métodos de análise do BZN 
 
Alguns trabalhos que tratam do desenvolvimento de métodos para a 
determinação e quantificação do BZN em diferentes tipos de amostras têm 
sido descritos na literatura, utilizando principalmente técnicas 
cromatográficas como HPLC-UV (BUFFER; CASTRO; FANELLI 2011; 
GUERRERO et al., 2011; MARSÓN et al., 2015; PADRÓ et al., 2015 
WALTON; WORKMAN 1986), HPLC-PDA (ALMEIDA et al., 2017), 
UHPLC-UV (DAVANÇO; DE CAMPOS; PECCININI, 2015) LC- MS/MS 
(MARTÍNEZ et al., 2015), LC-UV (PADRÓ et al., 2013); e 
Espectrofotometria UV-Vis (PINHO et al., 2016; STRECK et al., 2011). 
Uma busca na literatura utilizando como fontes de busca o google 
acadêmico e o Science Research revelou que existem poucos estudos 
empregando métodos eletroquímicos para o estudo do BZN. O grupo de La-
Scalea et al., (2002) investigou a redução eletroquímica do BZN a fim de 
obter informações sobre o seu mecanismo cinético e eletródico por VC 
30 
 
utilizando o GCE como eletrodo de trabalho; e o grupo de Arguelho; Silva; 
Stradiotto; (2001) utilizou a técnica VPD com a finalidade de esclarecer a 
ação citotóxica do BZN, usando um eletrodo quimicamente modificado 
(EQM), preparado pela modificação de um eletrodo de GCE com DNA. 
O único estudo eletroquímico com a finalidade de desenvolver um 
método para a quantificação do BZN em amostras reais foi encontrado no 
trabalho de Barbeira et al., (1999), onde os autores usaram a polarografia de 
pulso diferencial para desenvolver um método de análise do BZN em 
formulações farmacêuticas. O comportamento polarográfico do BZN foi 
estudado usando como eletrólito suporte uma solução de tetrafluorborato de 
tetrabutilamônio (Bu4NBF4 / 0,10 mol/L-1) solubilizado em uma solução de 
DMSO. Foram usadas a polarografia de pulso normal e de pulso diferencial 
no intervalo de potencial de -0,40 a -1,40 V e foi encontrado um pico de 
redução irreversível no potencial de -0,97V. A determinação nos 
comprimidos de BZN (100 mg) foi feita pelo método de adição padrão 
obtendo-se o intervalo linear de 1,00 x 10-6 a 5,00 x 10-3mol L-1, na qual 
foram obtidos um limite de detecção de 4,00 x 10-7 mol L-1 e um desvio 
padrão de 9,00 %. No entanto, como pode se verificar, a amostra analisada 
pelos autores é diferente das amostras empregadas no presente estudo, e 
além disso, os autores utilizam a técnica de polarografia que faz uso do 
eletrodo de mercúrio como eletrodo de trabalho, o qual está em crescente 
desuso atualmente devido, entre outros fatores, à toxidade do mercúrio 
(SOUZA et al., 2011). 
 
 3.5 Métodos eletro analíticos - Breve histórico 
 
A Eletroanalítica teve seu grande reconhecimento mundial em 1922 
quando Jaroslav Heyrovsky desenvolveu a técnica da polarografia que lhe 
rendeu o prêmio Nobel em 1959. Anos depois, Royce W. Murray, em 1975, 
trouxe um novo foco para a eletroanalítica propondo que a modificação do 
eletrodo de trabalho com imobilização ou incorporação de grupos químicos 
específicos poderia melhorar a detecção da técnica, a seletividade e a 
interação entre o analito e o eletrodo, gerando maior aplicabilidade analítica 
(ZANONI et al., 2017). 
31 
 
Ainda na década de 50, com o desenvolvimento das técnicas de 
pulso, houve um grande aumento de sensibilidade nas análises 
eletroanalíticas, uma vez que esta técnica é mais sensível do que a de pulso 
normal, pois ela possibilita a minimização da contribuição da corrente 
capacitiva no sinal obtido (SOUZA; MACHADO; AVACA; 2003). Além 
disso, o desenvolvimento sistemas eletroquímicos miniaturizados, fáceis de 
usar e “ecologicamente corretos” trouxe enormes avanços (WANG, 2002). 
Nos dias atuais, a evolução eletroanalítica é gigantesca, incluindo o 
desenvolvimento de eletrodos serigrafados (DOS SANTOS, 2019), 
eletrodos seletivos de íons de membrana, ultramicroeletrodos, o 
acoplamento de componentes biológicos com transdutores elétricos, 
(ZANONI et al., 2017; WANG, 2002) e a fabricação de dispositivos 
moleculares (PEREIRA et al., 2018, ZANONI et al., 2017; WANG, 2002). 
Essa ampla variedade de dispositivos levou ao aprimoramento das análises 
eletroanalíticas em várias áreas do conhecimento permitindo até mesmo a 
análise in situ, o que oferece inúmeras vantagens. Os sensores químicos 
amperométricos, por exemplo, dominam o mercado de sensores de glicose 
no sangue (WANG; COMPTON, 2021). Todos esses fatores levaram a um 
grande aumento na popularidade da eletroanálise e a sua expansão e 
aceitação para novas áreas e ambientes. 
 
 3.6 Métodos eletroanalíticos - Aplicação 
 
As técnicas eletroanalíticas são eficientes para determinação de 
analitos relacionando os processos e fatores que afetam o transporte de 
carga através da interface entre as fases químicas, como por exemplo, entre 
um condutor eletrônico (um eletrodo) e um condutor iônico (um eletrólito) 
(BARD; FAULKNER, 2001). As técnicas voltamétricas utilizam 
propriedades elétricas mensuráveis do composto em estudo como corrente, 
potencial e carga como parâmetros químicos. Sendo assim, em teoria, a 
única exigência para uma análise voltamétrica é que ocorra na solução em 
que o analito está presente um processo eletroquímico de oxidação ou 
redução mensurável em um tempo razoável (BASSET et al., 2002; GALLI 
et al., 2006). Isto significa que a técnica pode ser aplicada a maior parte dos 
32 
 
metais, ânions e a muitas espécies orgânicas (BASSET et al., 2002) . Na 
Tabela 2 temos um resumo dos principais grupos eletroativos. 
 
Tabela 2 - Grupos eletroativos. 
Grupos Eletrônicos Eletroativos 
Acetilenos 
Aldeídos 
Aromáticos conjugados 
Ácidos carboxílicos conjugados 
Compostos diazo 
Dienos: Ligações duplas conjugadas 
Dissulfetos 
Halogenetos 
Heterociclos 
Nitrilas 
Compostos nitro e nitrosos 
Peróxidos 
Quinonas 
Sulfetos 
Fonte: BASSET et al., 2002. Adaptado 
 
Os métodos eletroanalíticos podem ser divididos em interfaciais 
(baseados em fenômenos observados na interface entre a superfície do 
eletrodo e a fina camada adjacente) e não interfaciais (baseados em 
fenômenos que ocorrem no seio da solução). Entre os métodos interfaciais 
podemos distinguir os dinâmicos (na presença de corrente elétrica) e os 
estáticos (sem a presença de corrente elétrica). A voltametria esta entre as 
técnicas eletroanalíticas interfaciais dinâmicas (SCHRÖDER, 2017). 
Para a realizaçãode um experimento voltamétrico, usa-se uma célula 
eletroquímica contendo no mínimo dois eletrodos (eletrodo de trabalho e 
eletrodo de referência) imersos em uma solução contendo o analito e 
também um excesso de eletrólito não reativo chamado de eletrólito de 
suporte. O eletrodo de trabalho é aquele no qual o potencial é aplicado 
versus o eletrodo de referência e o analito é então oxidado ou reduzido 
(BASSET et al., 2002; SKOOG et al., 2013). A presença de um terceiro 
eletrodo na célula (contra-eletrodo) apenas assegura o sistema 
potenciostático (para que não haja passagem de corrente no eletrodo de 
33 
 
referência), a corrente de eletrólise flui então entre o eletrodo de trabalho e o 
contra-eletrodo (SKOOG et al., 2013; ALEIXO, 2003). Com a aplicação do 
potencial irá ocorrer à reação de oxirredução, e a transferência de elétrons 
que ocorre durante essa reação irá gerar uma corrente elétrica. O registro da 
corrente (i) em função do potencial é denominado voltamograma 
(PACHECO et al., 2013; ALEIXO, 2003, SKOOG et al., 2013) e a medição 
da grandeza dessa corrente pode ser relacionada com a quantidade de analito 
presente na solução (PACHECO et al., 2013 ; SKOOG et al., 2013). 
 
3.6.1 Voltametria cíclica (VC) 
 
A VC é geralmente a primeira técnica utilizada em um estudo 
eletroquímico. Trata-se de uma técnica muito útil para adquirir informações 
sobre os processos eletroquímicos, pois é capaz de informar sobre o 
comportamento redox de determinado composto químico em uma ampla 
faixa de potencial (BASSET et al., 2002; PACHECO et al., 2013). Assim 
sendo, a técnica fornece informações importantes sobre a termodinâmica de 
processos redox e da cinética de reações de transferência de elétrons do 
composto em estudo (SKOOG et al., 2006). Por esse motivo a técnica tem 
ganhado muito espaço nas áreas de eletroquímica, química inorgânica, 
química orgânica e bioquímica. 
Para obtenção de um voltamograma cíclico, um potencial é aplicado 
ao eletrodo de trabalho, e a varredura do potencial é feita linearmente a 
partir de um valor inicial para um limite pré-determinado, onde a direção da 
varredura é invertida (PACHECO et al., 2013; ALEIXO, 2003). Os 
produtos formados na varredura direta podem ser detectados na varredura 
inversa caso não sejam removidos do eletrodo ou alterados por uma reação 
química subsequente (PACHECO et al., 2013; KISSINGER, HEINEMAN 
1983). Geralmente o sinal de resposta para a VC é uma varredura de 
potencial linear com forma de um triângulo isósceles (FIG. 5). Podem ser 
feitas varreduras em sucessivos ciclos para desvendar informações sobre o 
mecanismo de ação do analito em estudo (SKOOG et al., 2006; 
MABBOTT, 1983). 
34 
 
 
Figura 5 - Aplicação do potencial com varredura linear para voltametria cíclica 
 
Fonte: WANG, 2000. Adaptado 
 
Para um sistema reversível os voltamogramas são caracterizados por 
apresentarem picos na varredura de potencial direta e inversa. Como para 
estes sistemas o potencial e a velocidade do processo de transferência de 
elétrons na superfície do eletrodo estão em equilíbrio, à atividade (𝑎𝑖) das 
espécies envolvidas na reação química pode ser calculada pela equação de 
Nernst (TOLEDO, 2006): 
 𝐸 = 𝐸° − 𝑅𝑇/𝑛𝐹 ∑(𝜗𝑖 ln 𝑎𝑖) (1) 
 
E0 é o potencial padrão de eletrodo, que é característico para cada semi-
reação 
R é a constante do gás ideal (8,314 J K–1 mol–1) 
T é temperatura (em Kelvin) 
n é número de mols de elétrons que aparecem na semi-reação 
F é a constante de Faraday (96,485 C por mol de elétrons) 
ln é logaritmo natural (2,303 log) ϑi são os números estequiométricos para as espécies oxidadas e reduzidas. 
 
Em sistemas reversíveis a cinética da reação de transferência de 
carga é rápida (Ks > 10-1 cm.s-1), logo, será a etapa de transferência de 
massa que irá governar o processo (PACHECO et al., 2013). Assim, a 
corrente de pico (Ip) é diretamente proporcional à concentração das espécies 
e à raiz quadrada da velocidade de varredura e pode ser calculada pela 
35 
 
Equação 2, conhecida como equação de Randles-Sevick (WANG, 2000; 
SKOOG et al., 2006): 𝐼𝑝= (2,69× 105 )𝑛32 𝐴𝐶𝐷12𝑣12 (2) 
 
A é a área do eletrodo (cm2) 
n é o número de elétrons transferidos 
C é a concentração da espécie eletroativa em solução (mol cm-3) 
D é o coeficiente de difusão (cm2 s-1) 
v é a velocidade de varredura (Vs-1) 
 
Sistemas irreversíveis não obedecem à lei de Nernst, pois neste caso 
a velocidade de transferência de elétrons é lenta, (quando comparada à 
velocidade de varredura, Ks Ks > 10-5 cm s-1), a corrente é 
controlada tanto pela etapa de transferência de massa como pela etapa de 
transferência de carga. Nesse caso, a equação de Nernst é apenas 
aproximadamente satisfeita. (WANG, 2000; PACHECO et al., 2013) 
A Figura 6 mostra os voltamogramas cíclicos hipotéticos observados 
para um sistema reversível, quase-reversível e irreversível. 
 
36 
 
Figura 6 - Voltamogramas cíclicos para característicos para os diferentes sistemas de reações 
eletródicas. 
 (a) VCs característicos de um sistema 
reversível (−) e quase-reversível (- -) 
(b) VC característico de um sistema 
irreversível 
Fonte: BRETT A; BRETT C, 1996. Adaptado. 
 
3.6.2 Voltametria de pulso diferencial (VPD) 
 
Como abordado anteriormente, a voltametria cíclica é uma técnica 
mais exploratória, muito usada para a obtenção de informações qualitativas 
sobre o analito (embora também possa ser usada para propósitos 
quantitativos). Para a quantificação de analitos geralmente são empregadas 
técnicas mais precisas e sensíveis como as técnicas de pulso (CROW, 1994; 
BRETT A; BRETT C, 1996). Na VPD ocorre à aplicação de um pulso de 
potencial de pequena amplitude superposto em uma rampa de potencial 
crescente, como mostra a Figura 7 (a). A corrente é medida em dois 
intervalos; antes e após a aplicação do pulso e o valor final da corrente é a 
diferença entre esses dois valores medidos (SOUZA; MACHADO; 
AVACA. 2003). Dessa maneira, a corrente capacitiva é compensada, pois 
os seus valores nos dois pontos onde a corrente é medida são muito 
próximos, o que contribui para um aumento da sensibilidade da técnica 
(ALEIXO, 2003; BARD; FAULKNER, 2001). O valor gerado pela 
diferença de correntes é plotado em um gráfico, gerando um voltamograma 
com a forma de uma curva gaussiana [FIG. 7 (b)] cuja área deste pico é 
diretamente proporcional à concentração do analito, de acordo com a 
Equação 4 (PACHECO et al., 2013). 
 
 
 
 
37 
 
Figura 7 - (a) Sinais de excitação para a VPD; 
(b) Forma de um voltamograma de pulso diferencial. 
 
Fonte: PACHECO et al., 2013. Adaptado 
 𝐼𝑝 = 𝑛𝐹𝐴𝐷12𝐶√𝜋𝑡𝑚 [1−𝜎1+𝜎] (4) 
 𝑡𝑚= tempo entre a segunda e a primeira leitura de corrente (s). 
 = exp