Aula 5 - Imunohematologia

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UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ (UNESA)
DISCIPLINA: IMUNOLOGIA CLÍNICA
Imunohematologia
Profa. Larissa Rodrigues Gomes
 
 
 
 
 
 
 
Conceitos Básicos 
 
 
Estudo dos antígenos presentes nas hemácias, dos anticorpos correspondentes e de seu significado clínico.
presença de antígenos nos glóbulos vermelhos e 
anticorpos no sangue.
interação entre estes antígenos e anticorpos.
grupos sanguíneos.
seleção de sangue de doadores
transfusão sanguínea.
incompatibilidade e reação transfusional.
Em Imuno-hematologia, procuramos pesquisar in vitro a interação entre os antígenos e anticorpos, seja para pesquisa dos antígenos (exemplo: na fenotipagem
direta ABO), seja para pesquisa de anticorpos regulares (exemplo: pesquisa de anticorpos ABO) ou irregulares (Exemplo: antígenos do sistema Rh) no soro dos
indivíduos, por meio do método de aglutinação de hemácias ou hemaglutinação, que culmina com a formação de aglutinatos de hemácias sensibilizadas por anticorpos.
Além dos sistemas ABO e Rh, há muitos outros tipos de antígenos de hemácias responsáveis por tipos sanguíneos menos conhecidos, tais como Kell, Duffy, Kidd, Lewis, MNs e Lutheran. Anticorpos contra esses antígenos eritrocitários também estão associados a diminuição da sobrevida das hemácias transfundidas e a reações transfusionais. A fenotipagem para esses antígenos é particularmente importante para pacientes politransfundidos.
Aglutinação de Hemácias (Hemaglutinação)
Hemaglutinação inespecífica ou pan-aglutinação: corresponde à aglutinação de hemácias sem anticorpos específicos ligados aos antígenos eritrocitários.
Hemaglutinação Específica: uma suspensão de hemácias em solução fisiológica (NaCl a 0,85%) constitui um sistema estável em que as células mantém certa distância umas das outras.
Os sistemas coloidais (como o sangue) são mantidos estáveis por meio de uma pequena carga elétrica que conserva as partículas afastadas umas das outras. Essa carga elétrica gera uma diferença de potencial na superfície das partículas coloidais.
A aglutinação é um fenômeno de mecanismo complexo, que leva à formação de grumos de células que denominados de aglutinatos. A aglutinação pode ser de dois
tipos:
Por redução da carga elétrica das hemácias;
Por variação da composição do meio;
Outros fatores como:
pH
Temperatura.
Concentração dos anticorpos.
Localização e número de sítios antigênicos.
Aglutinação de Hemácias (Hemaglutinação)
A interação entre as hemácias podem ser modificadas das seguintes formas:
Veja algumas situações em que esses fatores interferem:
a) Expressão fraca de antígenos, como ocorre por exemplo em alguns subgrupos do sistema ABO ou do sistema Rh (antígeno D fraco) que veremos mais adiante;
b) Hemácias de indivíduos heterozigotos para determinados genes produtores de antígenos apresentam uma menor quantidade de antígeno expressa (em comparação a indivíduos homozigotos) e, assim, a reação de aglutinação será mais fraca;
c) Antígenos poucos acessíveis na membrana eritrocitária também provocam fraca reatividade nos testes.
pH: a constante de equilíbrio é influenciada pelo pH. A ligação dos anticorpos aos antígenos eritrocitários é ótima em pH entre 6,5 e 7,5.
 Temperatura: os anticorpos possuem características próprias. Por exemplo, conforme vimos anteriormente, os anticorpos IgM reagem melhor entre 4ºC e 22ºC, e os IgG a 37ºC.
 Concentração dos anticorpos: é importante que se mantenha a relação ótima entre a quantidade de anticorpos e antígenos nos testes imuno-hematológicos, para que não ocorram falsos resultados. Por exemplo: excesso de anticorpos provoca o efeito prozona e nenhuma aglutinação é observada. Da mesma maneira, excesso de antígenos pode ocasionar que os anticorpos sejam insuficientes para promover a sensibilização e redução do Potencial Zeta até o ponto crítico.
 Localização e número de sítios antigênicos: a localização do antígeno e sua quantidade na membrana do eritrócito são importantes para propiciar melhor acesso dos anticorpos específicos e, portanto, uma reação de aglutinação mais intensa.
Antígenos eritrocitários
Os antígenos eritrocitários são herdados geneticamente e podem ser: proteínas,carboidratos ligados a proteínas (glicoproteínas) ou a lipídios (glicolipídios). 
 São estruturas macromoleculares localizadas na superfície da membrana eritrocitária e possuem funções fisiológicas específicas, podendo atuar na estrutura celular ou no transporte, por exemplo.
A diversidade dos antígenos de grupos sanguíneos, assim como qualquer traço biológico, é determinada pelo material genético. Os antígenos proteicos são produtos diretos dos genes. Já os antígenos carboidratos e lipídeos, apesar de não serem codificados diretamente, tem sua determinação genética dada de maneira indireta por meio da ação das enzimas (proteínas) que irão definir sua morfologia e função.
Nos indivíduos A e B, esses anticorpos naturais são predominantemente IgM. Os indivíduos de grupo sanguíneo O possuem ainda outro tipo de anticorpo natural,
designado anti-AB. Anti-AB é geralmente IgG e possui atividade sorológica não encontrada em misturas de anti-A e anti-B (de pessoas B e A, respectivamente).
Sistema ABO: História 
Karl Landesteiner (1900)
Era científica
Prêmio Nobel de Medicina em 1930
passo para transfusões de sangue mais seguras, revelando que as pessoas com o mesmo tipo sanguíneo ou com sangue compatível podem receber transfusões umas das outras.prêmio Nobel de Medicina em 1930
Em alguns casos, os glóbulos se aglutinavam, formando coágulos e/ou grânulos. Se isso ocorre dentro dos vasos sanguíneos, o fluxo de sangue é interrompido e a pessoa pode morrer. Em outros casos analisados, esse fenômeno não acontecia. O cientista explicou então por que algumas pessoas morriam depois de transfusões de sangue e outras não, possibilitando maior segurança em vários procedimentos cirúrgicos.
Estrutura dos antígenos eritrocitários 
- O gene H: L-fucose à galactose terminal. 
- O gene A: N acetil-D-galactosamina ao antígeno H, formando o antígeno A.
- O gene B: D-galactose ao antígeno H, formando o antígeno B.
- O gene O: produz uma transferase afuncional, que não modifica a substância precursora, permanecendo assim o antígeno H.
 O antígeno H serve como estrutura básica para a síntese dos antígenos A e B.
Os produtos primários dos genes ABO são enzimas glicosiltransferases, as quais adicionam carboidratos terminais a um substrato precursor na membrana da
hemácia, o antígeno H. O antígeno H, portanto, serve como estrutura básica para a síntese dos antígenos A e B.
Os antígenos ABO, H e Lewis NÃO estão restritos à membrana dos eritrócitos e podem ser encontrados em uma grande variedade de células como
linfócitos, plaquetas, endotélio capilar de veias e artérias, células sinusoidais do baço, medula óssea e mucosa gástrica.
Sistema ABO
Sem antígenos H, indivíduos com fenótipo Bombaim são incompatíveis com todos os tipos sanguíneos ABO (A, B, AB, O), pois produzem grandes quantidades de anticorpos naturais anti-H.
 O antígeno H serve como estrutura básica para a síntese dos antígenos A e B.
Cada porção da região variável pode se ligar a um tipo de antígeno, podendo haver a ligação do anticorpo a dois (bivalente) ou vários tipos de antígenos ao mesmo tempo (polivalente).
Sistema ABO
IAi
IBi
IAIB
IAi
IBi
ii
IAIB
AB
IAIA
IBIB
IAIB
00
ii
Cada porção da região variável pode se ligar a um tipo de antígeno, podendo haver a ligação do anticorpo a dois (bivalente) ou vários tipos de antígenos ao mesmo tempo (polivalente).
A maioria dos enxertos que são transplantados rotineiramente na medicina clínica é composta por enxertos de órgãos vascularizados, ligados diretamente à circulação do receptor. Em alguns casos, o receptor pode já possuir anticorpos circulantes contra antígenos do enxerto do doador.
A prova cruzada procura determinarse o receptor tem anticorpos que reagem contra os leucócitos do doador. Caso anticorpos desse tipo sejam encontrados, haverá uma séria contraindicação ao transplante da maioria dos órgãos sólidos, já que na ausência de qualquer tratamento haverá, quase certamente, rejeição hiperaguda
Sistema ABO
Na medicina transfusional, em geral, não é importante distinguir os subgrupos de A e de B. A transfusão de subgrupos normalmente não leva à reação transfusional.
Os antígenos ABO, H e Lewis NÃO estão restritos à membrana dos eritrócitos e podem ser encontrados em uma grande variedade de células como
linfócitos, plaquetas, endotélio capilar de veias e artérias, células sinusoidais, do baço, medula óssea e mucosa gástrica.
Exames imunohematológicos para qualificação do sangue do doador 
 
 
Segundo o atual regulamento técnico de procedimentos hemoterápicos, o serviço de hemoterapia realizará os seguintes exames imunohematológicos para qualificação do sangue do doador, a fim de garantir a eficácia terapêutica e a segurança da futura doação:
1) Tipagem ABO;
2) Tipagem RhD;
3) Pesquisa de anticorpos anti-eritrocitários
 irregulares.
O processo de liberação, quando realizado por meio de um sistema de informação e rótulo final pré-impresso, envolve as seguintes etapas:
Se o processo de liberação envolver um sistema de informação que cria automaticamente o rótulo final, cabe ao primeiro técnico rotular a bolsa, que
em seguida será conferida por um segundo profissional. Podem ocorrer casos em que o sistema dispõe de ferramenta de checagem de etiquetas (entre a fixada
pela coleta e a impressa no fracionamento) possibilitando que apenas um profissional tenha condições de rotular e liberar a bolsa, com a segurança necessária.
Testes imunohematológicos de aglutinação
Prova Direta: realizada para pesquisar a presença de antígenos na membrana de
hemácias (ex: pesquisa de aglutinogênios A ou B);
Prova Reversa: pesquisa em uma amostra de soro ou plasma a presença de anticorpos regulares contra antígenos eritrocitários;
Cada porção da região variável pode se ligar a um tipo de antígeno, podendo haver a ligação do anticorpo a dois (bivalente) ou vários tipos de antígenos ao mesmo tempo (polivalente).
Tipagem ABO
 
 
A tipagem ABO é definida através de prova direta e prova reversa.
► Prova direta:
1.
2.
O processo de liberação, quando realizado por meio de um sistema de informação e rótulo final pré-impresso, envolve as seguintes etapas:
Se o processo de liberação envolver um sistema de informação que cria automaticamente o rótulo final, cabe ao primeiro técnico rotular a bolsa, que
em seguida será conferida por um segundo profissional. Podem ocorrer casos em que o sistema dispõe de ferramenta de checagem de etiquetas (entre a fixada
pela coleta e a impressa no fracionamento) possibilitando que apenas um profissional tenha condições de rotular e liberar a bolsa, com a segurança necessária.
Tipagem ABO
 
 
O processo de liberação, quando realizado por meio de um sistema de informação e rótulo final pré-impresso, envolve as seguintes etapas:
Se o processo de liberação envolver um sistema de informação que cria automaticamente o rótulo final, cabe ao primeiro técnico rotular a bolsa, que
em seguida será conferida por um segundo profissional. Podem ocorrer casos em que o sistema dispõe de ferramenta de checagem de etiquetas (entre a fixada
pela coleta e a impressa no fracionamento) possibilitando que apenas um profissional tenha condições de rotular e liberar a bolsa, com a segurança necessária.
Soro anti-A
Soro anti-AB
Soro anti-B
Soro anti-AB
Soro anti-A
Soro anti-B
Soro anti-AB
Aglutinação
Não aglutina com nenhum soro
Prova Direta
A maioria dos enxertos que são transplantados rotineiramente na medicina clínica é composta por enxertos de órgãos vascularizados, ligados diretamente à circulação do receptor. Em alguns casos, o receptor pode já possuir anticorpos circulantes contra antígenos do enxerto do doador.
A prova cruzada procura determinar se o receptor tem anticorpos que reagem contra os leucócitos do doador. Caso anticorpos desse tipo sejam encontrados, haverá uma séria contraindicação ao transplante da maioria dos órgãos sólidos, já que na ausência de qualquer tratamento haverá, quase certamente, rejeição hiperaguda
Tipagem ABO
 
 
A tipagem ABO é definida através de prova direta e prova reversa.
► Prova reversa:
1.
2.
A e B
O processo de liberação, quando realizado por meio de um sistema de informação e rótulo final pré-impresso, envolve as seguintes etapas:
Se o processo de liberação envolver um sistema de informação que cria automaticamente o rótulo final, cabe ao primeiro técnico rotular a bolsa, que
em seguida será conferida por um segundo profissional. Podem ocorrer casos em que o sistema dispõe de ferramenta de checagem de etiquetas (entre a fixada
pela coleta e a impressa no fracionamento) possibilitando que apenas um profissional tenha condições de rotular e liberar a bolsa, com a segurança necessária.
Tipagem ABO
 
 
Não apresenta anticorpos
O processo de liberação, quando realizado por meio de um sistema de informação e rótulo final pré-impresso, envolve as seguintes etapas:
Se o processo de liberação envolver um sistema de informação que cria automaticamente o rótulo final, cabe ao primeiro técnico rotular a bolsa, que
em seguida será conferida por um segundo profissional. Podem ocorrer casos em que o sistema dispõe de ferramenta de checagem de etiquetas (entre a fixada
pela coleta e a impressa no fracionamento) possibilitando que apenas um profissional tenha condições de rotular e liberar a bolsa, com a segurança necessária.
Hemácia B
Hemácia-A
Hemácia-B
Aglutinação
Não aglutina com nenhuma hemácia
Aglutinação
Hemácia A
Prova Reversa
A maioria dos enxertos que são transplantados rotineiramente na medicina clínica é composta por enxertos de órgãos vascularizados, ligados diretamente à circulação do receptor. Em alguns casos, o receptor pode já possuir anticorpos circulantes contra antígenos do enxerto do doador.
A prova cruzada procura determinar se o receptor tem anticorpos que reagem contra os leucócitos do doador. Caso anticorpos desse tipo sejam encontrados, haverá uma séria contraindicação ao transplante da maioria dos órgãos sólidos, já que na ausência de qualquer tratamento haverá, quase certamente, rejeição hiperaguda
A e B
Sistema Rh
Ainda que mais de 50 antígenos estejam relacionados ao sistema Rh, a antígeno D é responsável pela grande maioria dos problemas clínicos associados a esse sistema.
 Apenas a classificação RhD (presença ou ausência do antígeno RhD), deve ser realizada obrigatoriamente nas rotinas pré-transfusionais e em doadores de sangue.
Na prática transfusional, o Rh é o sistema mais importante depois do sistema ABO, é implicado em casos de doença hemolítica do recém-nascido de intensidade variável, podendo ser grave e levar até mesmo ao óbito fetal, além de estar envolvido em reações transfusionais hemolíticas que podem ser graves.
Exames imunohematológicos para qualificação do sangue do doador 
 
 
Tipagem RhD;
1. Identificar dois tubos de ensaio, como RhD e CTL;
2. Aos dois tubos adicionar uma gota 5% em solução salina;
3. Ressuspender o sedimento, agitando delicadamente os tubos, e ler macroscopicamente a aglutinação;
4. Se o teste for negativo (aglutinação ausente), realizar teste para pesquisa de RhD fraco (continuação);
Soro anti-D
O processo de liberação, quando realizado por meio de um sistema de informação e rótulo final pré-impresso, envolve as seguintes etapas:
Se o processo de liberação envolver um sistema de informação que cria automaticamente o rótulo final, cabe ao primeiro técnico rotular a bolsa, que
em seguida será conferida por um segundo profissional. Podem ocorrer casos em que o sistema dispõe de ferramenta de checagem de etiquetas (entre a fixada
pela coleta e a impressa no fracionamento)possibilitando que apenas um profissional tenha condições de rotular e liberar a bolsa, com a segurança necessária.
Sistema Rh
O antígeno RhD apresenta um extenso polimorfismo e pode apresentar variações qualitativas e/ou quantitativas em sua expressão fenotípica.
O fenótipo D fraco corresponde a uma variação quantitativa do antígeno RhD.
5. Incubar ambos os tubos (D e CTL) por 15 minutos em banho-maria a 37ºC;
6. Lavar as hemácias de cada tubo três vezes, em solução salina;
7. A cada tubo, acrescentar duas gotas de soro antiglobulina humana de amplo espectro ou soro de Coombs (Anti-IgG);
8. Ressuspender o tubo, por agitação delicada, e examinar para aglutinação macroscópica;
anticorpo anti-D
Os anticorpos do sistema Rh, em especial o anti-D, não são naturais. Eles são sempre produzidos a partir de um estímulo imunológico
Exames imunohematológicos para qualificação do sangue do doador 
 
 
2) Tipagem RhD;
O processo de liberação, quando realizado por meio de um sistema de informação e rótulo final pré-impresso, envolve as seguintes etapas:
Se o processo de liberação envolver um sistema de informação que cria automaticamente o rótulo final, cabe ao primeiro técnico rotular a bolsa, que
em seguida será conferida por um segundo profissional. Podem ocorrer casos em que o sistema dispõe de ferramenta de checagem de etiquetas (entre a fixada
pela coleta e a impressa no fracionamento) possibilitando que apenas um profissional tenha condições de rotular e liberar a bolsa, com a segurança necessária.
O antígeno RhD será determinado colocando-se as hemácias com antissoro anti-RhD (Anti-D).
Se a reação for negativa para a presença do antígeno RhD, sempre será efetuada a pesquisa do antígeno D-fraco.
Para a realização da pesquisa de antígeno D-fraco, recomenda-se a utilização de, no mínimo, dois antissoros anti-RhD (anti-D). Os antissoros devem ser obtidos de linhagens celulares distintas incluindo a fase da antiglobulina humana.
Atenção!!!
Quando a tipagem RhD ou a pesquisa do antígeno D-fraco resultar positiva, o sangue deve ser rotulado como "RhD positivo".
Quando ambas as provas resultarem negativas, o sangue deve ser rotulado como "RhD negativo".
Antígenos eritrocitários 
Além dos sistemas ABO e Rh, há muitos outros tipos de antígenos de hemácias responsáveis por tipos sanguíneos menos conhecidos, tais como Kell, Duffy, Kidd, Lewis, MNs e Lutheran. Anticorpos contra esses antígenos eritrocitários também estão associados a diminuição da sobrevida das hemácias transfundidas e a reações
transfusionais. A fenotipagem para esses antígenos é particularmente importante para pacientes politransfundidos.
Pesquisa de anticorpos anti-eritrocitários irregulares
É feita através do Teste da Antiglobulina Indireto (TAI), também chamado de Coombs Indireto.
É indicativo da presença de um anticorpo irregular e pode ser realizado outro teste denominado de Identificação de Anticorpos Irregulares, onde se determina a especificidade deste anticorpo.
Anticorpos irregulares presentes no soro do receptor que podem reagir com as hemácias do doador.
37o C
Soro de Coombs: contém anticorpos anti-imunoglobulina humana, também chamado de soro de antiglobulina humana (AGH).
Pesquisa de anticorpos anti-eritrocitários irregulares (Teste da Antiglobulina Indireto )
a) Preparar uma suspensão salina a 5% com hemácias hemácias do grupo O, Rh positivo;
b) Colocar duas gotas da suspensão em um tubo e lavar três vezes com solução salina;
c) Adicionar duas gotas do soro a ser testado;
d) Misturar e incubar em banho a 37oC, durante 30 a 45 minutos;
e) A seguir, lavar as hemácias três vezes com solução salina e adicionar o soro anti-globulina humana (duas gotas);
f) Agitar e centrifugar a 1.000 r.p.m. por 15 segundos;
g) proceder a leitura.
Pesquisa de anticorpos anti-eritrocitários irregulares
Teste de antiglobulina direto ou Coombs Direto (TAD)
Soro de Coombs: contém anticorpos anti-imunoglobulina humana, também chamado de soro de antiglobulina humana (AGH).
Pesquisa de anticorpos anti-eritrocitários irregulares
Teste da Antiglobulina Indireto
Teste da Antiglobulina Direto
Prova de compatibilidade maior
Finalidade de determinar a presença de anticorpos pré-formados no sangue do receptor contra as células do possível doador: testa as hemácias do doador contra o soro do receptor.
Obrigada! 
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