Teste Imunoenzimático - ELISA

Prévia do material em texto

ENSAIO
IMUNOENZIMÁTICO
- ELISA
PROFª DRA. YRNA LORENA
Teste baseado na reação Antígeno- Anticorpo.
Baseia-se na quantificação de uma reação enzimática associada a
complexos imunes.
O teste detecta, identifica e quantifica o Antígeno ou o Anticorpo
utilizando um dos dois conjugados com enzimas.
O produto final corado surge por ação da enzima que converte um
substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado
pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora).
A quantidade de antígeno ou anticorpo do produto final corado, é
realizada através de um espectrofotômetro
O ELISA pode ser um teste tanto QUALITATIVO como QUANTITATIVO:
Qualitativo: negativo ou positivo
Quantitativo: utiliza-se equipamentos como espectrofotômetro ou leitor de microplacas por
absorbância
para medir a concentração do antígeno ou anticorpo
Tipos de ELISA:
ELISA direto
Para detecção direta, o antígeno aderido à placa é detectado por um anticorpo diretamente conjugado a
uma enzima.
Esse método de detecção possui baixa sensibilidade 
ELISA indireto
É o mais utilizado para detecção de ANTICORPOS.
Nesse método, o antígeno aderido à placa é detectado em dois estágios: 
Inicialmente, aplica-se um ANTICORPO PRIMÁRIO NÃO MARCADO que é específico para o
antígeno.
Em seguida, um ANTICORPO SECUNDÁRIO MARCADO COM ENZIMA se liga ao primeiro.
Placa já vem com o antígeno
ELISA sanduíche
O teste de sanduíche ou de captura, é indicado para a detecção de ANTÍGENOS.
 Pode também ser utilizado para detecção de Anticorpos.
O antígeno ou o anticorpo do paciente fica entre dois anticorpos.
Este é o ELISA mais comum, possui grande sensibilidade e poder de amplificação de sinal.
Como funciona?
Já tem um anticorpo de captura específico para o alvo já adsorvido em uma placa ( ou deixado
para adicionar à placa em overnight - sensibilizar à placa).
Posteriormente, a amostra é adicionada na placa (incubada) - o antígeno ou o anticorpo
presente na amostra irá
se ligar no anticorpo de captura .
Então, um outro anticorpo é adicionado à placa (anticorpo secundário - conjugado com a
enzima).
Adiciona-se então o substrato, e ocorre a mudança de coloração. 
ELISA de competição
Este método é mais utilizado para IDENTIFICAÇÃO DE ANTÍGENOS, mas também pode
ser empregado para a detecção
 de ANTICORPOS. 
Utiliza-se um antígeno marcado para competir com o alvo. O antígeno marcado se liga
menos quando houver mais
antígeno não marcado (da amostra) e assim, a cor fica mais fraca quando houver muito
do alvo na amostra.
É mais utilizado quando o alvo possui poucos epítopos de ligação ou é muito pequeno.
Leitura dos testes
Um teste positivo é visível ao olho nu, sendo que a cor, geralmente, é amarelo ou azul. 
Mas o resultado não é liberado apenas no “olhômetro”. É necessário quantificar o resultado,
e por isso existem os leitores de ELISA. 
Cada tipo de exame tem um protocolo de cálculo diferente.
 Geralmente, toda vez que se abre um novo kit, é necessário fazer uma curva de calibração
com todos padrões que vêm juntos.
 O aparelho pode liberar o resultado já pronto ou, dependendo do exame, 
ele irá liberar apenas o valor da absorbância e o biomédico terá que fazer os cálculos
manualmente.