elisa

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Elisa
ELISA é um teste sorológico imunoenzimático cuja metodologia se baseia em reações 
antígeno-anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas.
● Existem vários modelos de ELISA
● testes usando anticorpos como reagentes
● utilizam enzimas ligadas a um dos reagentes
.
A presença de antígenos e/ou anticorpos é revelada pela produção de cor com a 
adição do substrato da enzima e de uma substância cromógena, indicando uma 
reação positiva
● Detecta presença de antígeno em uma amostra
● Ferramenta de diagnóstico 
● Detecta possíveis alérgenos alimentares
● Pode ser usado em toxicologia como triagem presuntiva rápida para certas drogas.
● Usa placa com vários pocinhos
● O que for colocado vai se aderir ao poço 
Sensibilizar a placa: colocar o que quer no poço
Eli�� di����
1. Coloca antígeno nos poços
2. No ELISA vai ter um anticorpo comercial monoclonal (conjugado com uma enzima)
- Enzima serve para converter substrato em produto
- Coloca Ag para sensibilizar teste
3. Tira Ag usando tampão PBS
4. Coloca solução de bloqueio para impedir ligação inespecífica
5. faz lavagem com PBS para sair o que não se ligou
6. É adicionado anticorpo conjugado com enzima para formação de cor.
7. Coloca substrato para ocorrer cor.
8. É colocada solução de parada para enzima parar de formar produto
9. Vai ser gerada uma cor (+ cor + Antígeno)
10. Reação é medida no espectrofotômetro
Uma reação enzimática é utilizada para produzir cor e quantificar a reação, através da 
adição do substrato específico para a enzima utilizada.
 A leitura dos resultados se faz pela medida da ação enzimática sobre substrato 
cromogênico, levando a mudança de cor da solução quando há reação antígeno-anticorpo, 
configurando um resultado positivo.
Eli�� in����to
1. Triagem de sobrenadantes de anticorpos ou hibridomas para anticorpos específicos
Anticorpo secundário: monoclonal que reconhece porção constante do primeiro anticorpo
1. Sensibilização com Ag
2. Lavagem com PBS
3. Coloca tampão de bloqueio
4. Lavagem com PBS
5. Adição do anticorpo primário 
6. Lavagem com PBS
7. Adição do Ac secundário conjugado com enzima
8. Lavagem com PBS
9. Coloca substrato para enzima converter em cor a reação 
LAVAGEM COM TAMPÃO PBS É PARA MANTER pH
Indireto Dá mais cor
- Tem menos interação inespecífica 
Eli�� sa����c�e
1. Coloca anticorpo
2. Coloca antígeno
3. Coloca outro anticorpo conjugado
4. Coloca substrato para gerar cor
Depois do conjugado lava também
● Sensibilização com Ac de captura
● Incuba e Lavagem com PBS
● Coloca tampão de bloqueio (para não ocorrer reações inespecíficas)
● Lavagem com PBS
● Adição do Ag
● Lavagem com PBS
● Adição do Ac secundário conjugado com enzima para converter substrato em 
produto 
● Lavagem com PBS
● Coloca substrato para enzima converter em cor a reação 
Se esquecer de lavar: placa toda forma cor
- Lavagem tira o que não tá aderido à placa
Western Blotting
● Técnica lenta e mais rudimentar que a ELISA
● Em alguns laboratórios só precisa adicionar amostra que ele analisa e dá resultado
Usa enzima, anticorpo e antígeno 
● Etapa 1: preparar proteínas. 
- Quebrar antígeno em pedaços para liberar proteínas e colocar na membrana
- FEITO POR ELETROFORESE: aplicar corrente elétrica nas proteínas
- Tamanho das proteínas confirma diagnóstico 
Eletroforese
1. Usa tampão, gel, amostra…
2. Tem etapa do bloqueio para nao ter ligação inespecífica
3. Gel de poliacrilamida preparado
4. Proteínas são eletricamente carregadas e vão migrar no sentido pólo positivo
● É Técnica corrida: migração do polo negativo pro positivo 
● 2 etapa: separar tamanhos das proteínas no gel de agarose. Fracionamento de 
proteína
● 3a etapa: transferir proteínas para membrana de nitrocelulose
- Sanduíche: gel + membrana + papel filtro + esponja : tudo para apertar 
membrana contra gel e proteínas migrarem. 
- Bloqueio do papel: para não ter ligações inespecíficas 
● 4A ETAPA; antígeno já aderido ao papel, adiciona anticorpo na solução que vai 
reconhecer o antígeno específico, depois adiciina Ac secundario com enzima, que 
reconhece Fc do Ac primário.
- Adiciona substrato.
- enzima acoplada no Ac reagindo com esse substrato vai gerar cor indicando 
a presença da proteína que está sendo procurada
Kit para HIV e HTLV: os kits sempre tem o controle para avaliar bandas e diagnosticar.
- Pode indicar teste positivo, negativo ou inconclusivo( in
Diferenças para o Elisa
● Mais demorado (Se for manual) 
● Reconhece antigo usando anticorpo e o tamanho do Ag (elisa só reconhece)
● Resultado observado a olho nú
Se não tiver proteínas nas bandas: resultado negativo, pois indica que pessoa não teve 
contato com o antigeno
Isolamento de linfócitos
● Técnica simples
● Princípio: Separação de linfócitos por centrifugação e ≠ de densidade
● Estudo in vitro: cultivo, estimulo e pesquisa
● Pode Congelar células para estudo
● Baixo custo
● Quem for mais denso vai para o fundo
● Parte menos densa fica em cima
● Centrifugação para separar as fases
Separa glóbulos vermelhos dos brancos devido à diferença de densidade
- Em baixo células vermelhas
- Em cima fica glóbulos brancos 
- Mais acima plasma
● Esse meio é tóxico para células
● Mistura com PBS, células descem, ressuspende em PBS e vai lavando
1. Coleta sangue em tubo com heparina para impedir formação de coágulos
2. Coloca PBS(tampão em fosfato salino) e mistura com sangue
3. Colocar em outro tubo o Histopaque: para separar amostra por densidade
4. Coloca histopaque no congelador e depois coloca amostra no tubo Com 
histopaque
5. Colocar na centrifuga: 3 camadas (topo: sobrenadante, meio e fluido opaco com 
PBMC e o fundo é RBc)
6. Descartar Sobrenadante da amostra 
7. Transferir camada opaca de PBMC para outro tubo 
8. Adicionar PBS no tubo com PBMC, e centrifugar
9. Etapa de lavagem para tirar resíduo do histopaque
(adiciona e lava do PBS várias vezes
10. Congela ou usa amostra para alguma pesquisa
Lavagens: para o meio de separação não matar a célula. Pois é um meio tóxico 
Teste cutâneo
● Hipersensibilidade leva a processos alérgicos
● Falhas na tolerância leva a doenças autoimunes
● Hipersensibilidade é uma resposta imune exacerbada
● É consequência da resposta imune adaptativa
● Ocorre após contato com Antígeno, formando células de memória
Classificação : baseado no mecanismo efetor e no tempo de atuação 
● tipo I: IgE: hipersensibilidade imediata. 2 a 30 minutos.
- Causa alergias a comida, pólen, insetos…
● Tipo II: igG ou IgM- ocorre destruição da célula por fagocitose
- 5 a 8h de atuação 
- Ativa sistema complemento e Ac citotóxico
● Tipo III: causada por imuno complexos
- Ocorre artrites e glomerulonefrite
- 2 a 8 horas
● Tipo IV: células T atua em Ag específico
- Mediada por células
Teste cutâneo 
● Descobre alérgenos indutor da resposta 
● Teste cutâneo de Leitura Imediata (Prick Test) é um método que consiste na 
detecção de quais alérgenos (substâncias que podem induzir uma reação alérgica) 
que o indivíduo é sensível. Este teste é capaz de detectar sensibilidade a inalante ou 
alimentos
● O teste é realizado na região volar do antebraço (a parte que não costuma ter pelo), 
onde é aplicado, por meio de puntura, o controle negativo, o controle positivo 
(histamina) e o extrato do alérgeno. Aguarda-se 15 minutos para a leitura do 
diâmetro da elevação da pápula.
● O surgimento de uma pápula representa uma reação em que há presença do 
anticorpo IgE específico contra o alérgeno testado. Consideram-se positivos 
resultados cujo diâmetro da pápula é maior ou igual a três milímetros em relação ao 
controle negativo.
● A histamina sempre formará uma pápula maior ou igual a três milímetros. O 
significado do teste positivo relaciona-se a uma sensibilização e NÃO 
necessariamente à alergia.
● Existe uma variação desse teste chamada de “Prick to prick” em que, em vez da 
utilização de extratos, o alérgeno testado é oferecido na forma natural, como 
exemplo frutas e vegetais. Aplica-se o puntor na fruta ou vegetal fresco e, em 
seguida,na pele do antebraço do paciente. Este teste é utilizado para detectar 
sensibilização a frutas e vegetais.
● Geralmente, o Prick test demora, em média, de 30 a 40 minutos para ser realizado
● Testes por picada
Aplica-se uma gota do alergénio sobre a pele do braço e realiza-se uma picada leve, 
com uma lanceta especial, sobre cada gota.
São positivos se surgir uma borbulha no local da picada ao fim de 15 minutos.
Úteis para alergias respiratórias, alergias alimentares, alergias a medicamentos e 
alergias a veneno de himenópteros.
● Testes intradérmicos
Injeção intradérmica de uma pequenina quantidade do medicamento diluído, ou do 
veneno de himenóptero diluído, com aumentos progressivos da concentração até 
resultado positivo ou até atingir concentração máxima não-irritativa.
As leituras são realizadas aos 15-20 minutos para uma reação imediata, ou nos dias 
seguintes no caso de se tratar de uma reação tardia.
introdução por baixo da pele, com uma pequena agulha, de uma pequenina 
quantidade do alergénio diluído. Pode ser necessário ir repetindo as injeções 
intradérmicas com aumentos progressivos da concentração até resultado positivo ou 
até atingir concentração máxima não-irritativa. Existem várias concentrações que 
estão padronizadas, e que devem ser respeitadas para não provocar irritações de 
pele que não significam alergia.
É importante notar que existe o risco de reação generalizada com este tipo de 
procedimentos pelo que deverão ser realizados apenas por profissionais com 
experiência e em meio hospitalar. Estes testes são um pouco mais dolorosos, mas 
também podem ser realizados em qualquer idade, dependendo da tolerância 
individual. Possuem uma maior sensibilidade.
Também de administração intradérmica, existe o teste do soro autólogo, mas 
tem apenas utilidade em alguns tipos específicos de urticária e não é muito 
usado por rotina na prática clínica.
● Testes epicutâneos
Consiste em aplicar uns adesivos nas costas que ficam colados durante 48 horas. 
As leituras destes testes são feitas às 48, 72 ou 96h.
Estes tipos de teste são bastante úteis em dermatites de contacto alérgicas, e 
algumas reações a medicamentos tardias.
consistem na aplicação dos testes em formato de um adesivo nas costas. Estes 
testes são importantes no estudo da dermatite de contacto alérgica provocada por 
vários produtos que contactam com a pele, nomeadamente, metais, cosméticos, 
também medicamentos tópicos (em pomada ou creme). Devem ser feitos entre 6 
semanas a 6 meses após terminarem os sintomas.
Os resultados destes testes só são conhecidos depois de 48 e 96h após aplicação 
(ou 7 dias na suspeita de reação a corticosteroides) e a interpretação dos resultados 
requer experiência, sobretudo porque pode acontecer reação irritativa da pele que 
não significa alergia! O risco destes testes é baixo, mesmo em doentes com história 
de reações graves aos medicamentos. Resultados negativos falsos podem dever-se 
a má penetração cutânea (moléculas de maiores dimensões) ou baixa concentração.
Citometria de fluxo
● Cito: célula
● Metria: medida
● Fluxo: movimento
Técnica permite:
- Separar grupamentos celulares
- Quantificar células
- Classificar
Feito em partículas microscópicas suspensas em meio líquido
Usa: citômetro de fluxo
Permite medidas simultânea de múltiplas características de uma célula
- Tamanho relativo (FSC)
- Complexidade interna (SSC)
- Intensidade de fluorescência (FL)
Citometro de fluxo
● Sistema fluido: introduz e alinha as células para que sejam interceptadas por lasers
● Sistema óptico: gera e coleta sinais de luz
● Sistema elétrico: converte sinais ópticos em eletrônicos 
Detecção da dispersão lateral do laser
SSC (Complexidade interna)
Detecção da dispersão frontal do laser
FsC (tamanho)
● Projeção da sombra que a célula fez
● Tamanho proporcional a sombra que ela gera
Sistema de filtro e detectores
● Gera fluorescência 
● Cada fluorescência é avaliada nos fotodetectores específicos
● QUANTO MAIS FOTODETECTORES, MAIS PERCEPÇÃO DE ≠ Células
Quanto mais Complexidade da célula, + o SSC 
Utiliza Anticorpo monoclonal conjugado 
● Só reconhece 1 único epítopo
● Tem Fc (faz opsonização) Fab (reconhece epítopo)
Metodologia 
● Usa meios com célula no meio em suspensão (para células teciduais usa 
imunohistoquímica)
● Incubação para que complexo específico Ac-Ag não se desliguem
● Lavagem
● Ac-Ag específicos são observados
● Observa-se fluorescência das ligações 
Gráfico dot plot
● Observa grupos de células e número dessas células
● É um plano cartesiano
● Quanto mais para direita e acima: mais positivo para os dois
Aplicação da citometria
● Imunofenotipagem (define fenótipo celular- anticorpos)
- Análise da expressão de determinado antígeno celular 
- Ferramenta de diagnóstico de doenças onco hematológicas
- Importante para Diagnóstico, prognóstico e monitoramento da Terapêutica
● Análise de subpopulações linfocitárias
● Acompanhamento de pacientes com HIV+ - CD4/CD8 (detectar se tratamento 
estar funcionando nas células e se há depressão dos linfócitos)
● Análise do ciclo celular 
- Avalia aneuplodia
- Avalia número de cromossomos se está normal ou acima.
● Quantificação de células tronco
● Análises de moléculas de sinalização 
● Fatores de transcrição 
● Identificação de alvos Terapêuticos
- Identifica células para auxiliar a escolher a ferramenta pro tratamento das 
células afetadas
● Proliferação celular 
- Avalia se tem capacidade de gerar células filhas
● Apoptose/Necrose
● Separação celular
● Detecção e quantificação de citocinas
- baad dá estabilidade
- Ac se liga a baad
- Ag se liga a Ac e outro Ac se liga ao Ag formando sanduiche
Cell sorting
● Citometria que coleta células selecionadas
- Morfologia
- Bioquímica 
- Funcional
● células dentro de bolhas. Cada bolha trm carga determinada 
● A partir da carga atrai as células de interesse