Seminário

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Microcalorimetria biológica como método de investigação de novos agentes quimioterápicos
Bruno Campos
Bruno Castro
Isabela Valente
Mariá Andrade
Priscila Molinares
MONTARANIM. L. C., BEEZER, A. E., GIESBRECHT, A. M. Microcalorimetria biológica como método de investigação de novos agentes quimioterápicos. Química Nova. Outubro de 1993.
Introdução
Métodos microcalorimétricos
 
Técnica microbiológica
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Microcalorimetria é uma técnica analítica que registra o efeito do calor produzido por um processo metabólico microbiano que acontece numa cultura;
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Métodos espectofotométricos, as investigações em sistemas bioquímicos e biológicos usando métodos calorimétricos
Não requerem soluções ópticamentes límpidas
Pode ser usados sistemas não transparentes
Calorímetros
Termodinâmica de materiais
Metabolismo completo
Balanço de energia em animais
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Procedimentos clássicos de testes microbiológicos como o método de difusão em ágar, é amplamente estudado em testes de antibióticos.
Microcalorimetria biológica é uma técnica analítica que registra o calor produzido por um processo metabólico microbiano que acontece em cultura.
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Quando aplicados em estudos microbiológico
Identificação do micro-organismo;
Estudos metabólicos;
Efeitos de modificadores do processo metabólico
Antibióticos
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Microcalorímetro mais utilizado é isotérmico de condução de calor 
Neste trabalho foram utilizados microcalorímetros de fluxo.
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Figura 1. Curva dQ/dt para Saccharomyces cerevisiae crescendo anaerobicamente em glicose
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O crescimento de uma população de células é descrito por um aumento exponencial.
O crescimento de uma população homogênea de células dispersa em um meio líquido apropriado para o crescimento, é descrito por um aumento exponencial da densidade celular. A velocidade da produção de calor também é descrita pela mesma exponencial.
Quando o crescimento exponencial é limitado pela fonte de energia, a velocidade de produção de calor declina quando o substrato é exaurido e retorna para um valor básico.
É importante ter condições isotérmicas porque o microrganismo cresce a temperatura constante e seu metabolismo e subsequente inibição são melhor compreendidos como função da temperatura.
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Figura 2. Curva dQ/dt para Saccharomyces cerevisiae respirando em tampão ftalato a pH 4,5 contendo glicose
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Interação
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Experimento microcalorimétrico quantitativos conduzidos em condições padronizadas
Armazenagem do inóculo em nitrogênio líquido
Controle analítico do tempo
As interações foram analisadas em condições de crescimento e não-crescimento
Microcalorímetro biológico de fluxo
Metabolização de culturas de leveduras em tampão glicose-ftalato
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Exemplo
Adição de nistatina a células de leveduras metabolizando a 25ºC resultando em uma curva dQ/dt versus tempo.
A resposta biológica depende da concentração do agente e da natureza e concentração da droga.
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Figura 4. Curva dQ/dt: Efeito de alguns agentes antifúngicos (a) Controle (b) 5 nistatina, leucensomicina ( alta concentração) (c) pimaricina, leucensomicina 
( baixa concentração) (d) Clotrimazol
Objetivo
Reportar a atividade biológica de compostos dos tipos 1, 3, 4- tiadiazólico-2-aminida e 1,3, 4-triazólio-2-tiolato (Figura 8) contra Saccharomyces cerevisiae. Através dos resultados, verificar a aplicabilidade da microcalorimetria biológica como método de investigação de novos fármacos.
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Reportar a atividade biológica de compostos mesoisônicos dos tipos 1,3,4-tiadiazólico-2-aminida e 1,3,4-triazólio-2-tiolato contra Saccharomyces cerevisiae
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Materiais e métodos
A S. cerevisiae é armazenada em nitrogênio líquido e agitada continuamente;
As células recém preparadas e as congeladas foram incubadas em condições ótimas aeróbica e anaeróbica.
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Congelar e armazenar células em nitrogênio líquido é uma técnica útil para manter o inóculo estável, uma vez que diminui a atividade metabólica por diminuição da temperatura.
As células no reservatório são agitadas continuamente para ajudar na distribuição uniforme do inóculo (velocidade do resfriamento é de 9°C/min que é ótima para fungos).
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Figura 5. dQ/dt versus tempo: levedura metabolizando em tampão contendo glicose (a) incubação anaeróbica, reação de zero ordem (b) incubação agitada em ar (c) incubação oxigenada. A seta indica o ponto no qual a incubação foi apresentada ao calorímetro. 
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A área sob a curva dQ/dt versus tempo de células recém-preparadas e congeladas era proporcional ao número de células viáveis. 
A porcentagem de recuperação foi determinada comparando-se as áreas das respectivas curvas de células recém-preparadas e recuperadas de armazenagem: células armazenadas por 500 dias foram recuperadas em 93%.
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O calorímetro usado foi o LKB Flow Microcalorimeter;
A reação utilizando método de fluxo é iniciada fora do calorímetro em um vaso reacional e o meio reagente bombeado a velocidade constante através das unidades de troca de calor dentro do calorímetro via tubo de teflon;
A mistura reacional passa através do calorímetro por uma bomba peristáltica que utiliza tubos de teflon;
Velocidade de bombeamento: ¼ ciclo/min.
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Este calorímetro emprega duas células calorimétricas operando a temperatura constante (30°C).
O efluente do calorímetro pode ser desprezado ou reciclado para dentro do vaso de reação.
Diferentes velocidades de bombeamento podem ser obtidas (no trabalho foi adotada ¼ ciclo/min, que é o tempo necessário para que a mistura retorne ao vaso reacional).
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Experimento
Tampão ftalato (50mL) contendo diferentes volumes de inóculo é passado pelo calorímetro até estabelecer-se uma linha de base constante.
 Figura 6. Curva dQ/dt versus tempo para controle.
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Uma vez estabelecido o volume correto de suspensão de levedura a ser usado (curva (i)), o experimento é repetido com o solvente a fim de se obter a curva padrão (ii).
A curva de controle mostra uma pequena diminuição da produção de calor devido ao efeito do solvente, o que significa uma pequena redução da atividade metabólica da levedura.
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Experimento
O meio reacional, agitado continuamente, flui através do calorímetro e um gráfico dQ/dt versus tempo devido à entalpia do metabolismo da glicose é registrado.
Figura 9. Curvas dQ/dt versus tempo mostrando a tendência geral dos compostos mesoiônicos sobre S. cerevisiae. 
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Curva obtida quando a S. ceverisiae em tampão contendo glicose a pH4,5 foi colocado na presença de compostos mesoiônicos.
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Curva de crescimento de S. cerevisiae em fermentador de 1 L.
Figura 7. Curva de crescimento para S. cerevisiae NCYC 239 em cultura agitada aeróbica.
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A curva de densidade óptica versus tempo mostra duas séries de fases estacionárias.
A velocidade de crescimento primeiro é diminuída até, finalmente permanecer constante, originando a segunda fase estacionária. A segunda fase ocorreu a aproximadamente 20h depois de inoculação.
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Avaliação da atividade biológica de compostos mesoiônicos
As curvas representam respostas biológicas não muito efetivas;
Figura 9. Curvas dQ/dt versus tempo mostrando a tendência geral dos compostos mesoiônicos sobre S. cerevisiae. 
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2 características importantes: 
Foi possível identificar 2 comportamentos distintos, a curva modificada pela ação da droga está abaixo ou acima da curva de controle. A curva (iii) representa um resultado positivo da ação da droga enquanto que a curva (i) pode representar maior consumo da fonte de energia.
 As curvas são estacionárias, ou seja, paralelas à curva padrão (ii) que poderiam, no caso da curva (iii), representar uma atividade fungistática dos compostos mesoiônicos referidos sob as curvas.
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Resposta biológica
Conclusão 
Vários são os mecanismos utilizados na identificação de um novo fármaco;
É necessário uma triagem preliminar das substâncias para uma seleção dos compostos mais promissores;
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Referência Bibliográfica
MONTARANIM. L. C., BEEZER, A. E., GIESBRECHT, A. M. Microcalorimetria biológica como método de investigação de novos agentes quimioterápicos.
Química Nova. Outubro de 1993.