Biologia Molecular: PCR e Eletroforese

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Introdução à Biologia 
Molecular.
PROFA RESPONSÁVEL: DRA. ELIANE PATRÍCIA CERVELATTI
➢ OBJETIVOS
Descrever os princípios básicos sobre:
I) Análise do DNA após a sua extração 
II) Reação de PCR e sua utilização no diagnóstico 
molecular
III) Enzimas de restrição
▪ A obtenção do DNA que será analisado é uma etapa crucial
➢ INTRODUÇÃO
DNA
▪ Extração do DNA
➢ INTRODUÇÃO
Ressuspender em H2O ultra
pura e manter a -20 °C
Análise dos resultados
ELETROFORESE
ELETROFORESE
▪ Permite a separação de macromoléculas (proteínas e ácidos nucléicos) diferentes
tamanhos, carga ou conformação.
➢ INTRODUÇÃO
▪ Moléculas são colocadas em um campo elétrico e migram para o pólo positivo ou
negativo.
Proteínas (carga líquida negativa ou positiva)
DNA (carga negativa – grupo fosfato)
✓Moléculas com carga positiva pólo negativo;
✓Moléculas com carga negativa pólo positivo.
▪ Separa fragmentos de DNA de diferentes tamanhos.
▪ O DNA é carregado em um poço do gel e este é submetido a um campo elétrico.
➢ Técnica de eletroforese de DNA
Pólo negativo
Pólo positivo
• Moléculas maiores de DNA migram com mais dificuldade do que as menores.
Em corridas de eletroforese, o 
DNA menor sempre ganha!
Pólo negativo Pólo positivo
-
-
-
-
• Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel
agarose
acrilamida
➢ Aspectos gerais da eletroforese 
Possibilitam a separação dos fragmentos 
(eficiência depende da concentração do 
polímero)
Formam tramas de poros de 
tamanhos variáveis
➢ Materiais usados na eletroforese de gel de agarose:
Funcionamento da eletroforese
Fonte de eletroforese
Cuba de eletroforese (1); bandejas (2) e pentes (3) para montagem do gel
1
2
2
3
• Tampão de eletroforese (corrida)
Tris-acetato-EDTA (TAE) ou Tris-borato-EDTA (TBE).
• Tampão de amostra
material denso (glicerol por ex.) e com cor para ver migração da amostra.
➢ Materiais usados na eletroforese de gel de agarose:
• Corante fluorescente usado para corar ácidos nucléicos (ex: brometo de etídeo,
sybr green)
• Transiluminador (caixa de luz UV), usado para visualizar o DNA (sempre usar
proteção nos olhos )
➢ Materiais usados na eletroforese de gel de agarose:
▪ AGAROSE
➢ Aspectos gerais da eletroforese 
✓ Polissacarídeo extraído de alga marinha
✓ Não é tóxico
✓ Fácil preparo
✓ Concentração variável (ex: 0,5 a 2%)
➢ Preparo de um gel de agarose para DNA
➢ Preparo de um gel de agarose para DNA
➢ Preparo de um gel de agarose para DNA
➢ Preparo de um gel de agarose para DNA
➢ Preparo de um gel de agarose para DNA
➢ Preparo de um gel de agarose para DNA
Visualização do resultado: transiluminador
➢ Preparo de um gel de agarose para DNA
Visualização do resultado: transiluminador
➢ Preparo de um gel de agarose para DNA
➢ ANÁLISE DO TRAMANHO DOS FRAGMENTOS GERADOS
▪ Marcadores de peso molecular
Marcador de peso 
molecular 50pb
Marcador de peso 
molecular 100pb
Marcador de peso 
molecular lambda 
HindIII
➢ ANÁLISE DO TRAMANHO DOS 
FRAGMENTOS GERADOS
1. Tamanho da molécula de DNA
2. Concentração da agarose
➢ Parâmetros que interferem na migração 
do DNA no gel de agarose
➢ Definirá o tamanho dos poros a
serem atravessados pelas
moléculas em migração.
➢ Geis muito concentrados
oferecerão maior resistência à
migração das moléculas.
3. Corrente aplicada
- maior resolução dos fragmentos de DNA: géis não devem ser
submetidos a voltagens maiores que 5 V/cm
4. Temperatura
- géis contendo menos de 0,5% de agarose são muito frágeis e devem
ser corridos a 4 oC
➢ Parâmetros que interferem na migração 
do DNA no gel de agarose
REAÇÃO EM CADEIA DA 
POLIMERASE (PCR)
Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase
Chain Reaction) 
➢ Desenvolvida por Kary Banks Mullis em 1983
Nobel de química de 1993 pelo 
desenvolvimento dessa técnica
➢ Técnica rápida para a produção de cópias de DNA em laboratório
➢ Usa os elementos básicos da replicação natural do DNA
➢ Trabalha com amostras mínimas de DNA
Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase
Chain Reaction) 
Síntese de DNA realizada 
pelas células
Síntese de DNA realizada 
através do PCR 
• Primers
• nucleotídeos livres (A, T, C e G)
• DNA (molde)
• DNA polimerase
DNA polimerase
DNA 
helicase
primase
Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase
Chain Reaction) 
▪ Primers (oligonucleotídeos)
✓ Segmento de DNA (15 a 40 pb) 
✓ ‘Desenhado’ baseando-se na sequencia que se deseja amplificar
✓ Determinam a região do DNA que será copiada
✓ Adquiridos comercialmente
Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase
Chain Reaction) 
Exemplo: 5´ GCTAATCGTACCGAGACGCT 3´
• Apenas uma região de interesse será amplificada
Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase
Chain Reaction) 
➢ Etapas da Reação em Cadeia da Polimerase
➢ Consiste em 3 etapas básicas que se repetem de forma cíclica:
1. Desnaturação
2. Anelamento
3. Extensão
Mudanças cíclicas de 
temperatura
➢ Etapas da Reação em Cadeia da Polimerase
1. DESNATURAÇÃO 
• Temperatura elevada a 95 ou 94ºC
• Ocorre a separação das cadeias de nucleotídeos do DNA
➢ Etapas da Reação em Cadeia da Polimerase
2. ANELAMENTO
• Temperatura entre 55 a 70 ºC
• primers se ligam a região complementar no DNA molde
➢ Etapas da Reação em Cadeia da Polimerase
3. EXTENSÃO
• Temperatura: 72 ºC
• DNA polimerase realiza a síntese da cadeia complementar
➢ Etapas da Reação em Cadeia da Polimerase
REPETIÇÃO DO CICLO 30 A 35 VEZES
1. Desnaturação
2. Anelamento
3. Extensão
▪ Uso do termociclador:
Aparelho capaz de realizar mudanças cíclicas na temperatura de acordo com a
programação pré-estabelecida
Termociclador
➢ Etapas da Reação em Cadeia da Polimerase
Visualização dos produtos de PCR: eletroforese
➢ Biologia molecular no 
diagnóstico clínico: uso do PCR
• PCR é capaz de detectar e identificar quase todos os microrganismos que são
interessantes para fins clínicos
através da amplificação de qualquer fragmento de 
DNA desde que a sequência seja conhecida
➢ Biologia molecular no 
diagnóstico clínico: uso do PCR
❖ PCR permite a detecção rápida de microrganismos não cultiváveis
Ex: Treponema pallidum (bactéria agente da sífilis)
❖ PCR permite a detecção rápida de microrganismos de crescimento lento
Ex: Mycobacterium kansaii – lesões pulmonares
➢ Biologia molecular no diagnóstico de leishmaniose
• Mostra diferenças entre as espécies de Leishmania, além de ser utilizada para análise
de dados epidemiológicos, prognóstico e tratamento.
Fonte: Lipay, Monica V., N. e Bianca Bianco. Biologia Molecular - Métodos e Interpretação . Disponível em: Minha Biblioteca, Grupo GEN, 2015.
➢ Biologia molecular: uso do PCR na determinação do sexo do 
feto a partir da oitava semana de desenvolvimento
Cariótipo masculino Cariótipo feminino
➢ Biologia molecular: uso do PCR na determinação do sexo do 
feto a partir da oitava semana de desenvolvimento
• Uso de primers específicos para o cromossomo Y
• Quando a amplificação ocorre
• Quando a amplificação não ocorre
MENINA
MENINO
➢ ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
➢ ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: SÍTIOS DE RECONHECIMENTO
• Reconhecem e cortam sítios específicos de diferentes tamanhos (4 a 8
nucleotídeos) e composição de bases: sítio de restrição
➢ ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: NOMENCLATURA
EcoRI Escherichia coli
BamHI Bacillus amyloliquefaciens RH
BglII Bacillus globigii
PvuII Proteus vulgaris
HindIII Haemophilus influenzae Rd
HinfI Haemophilus influenzae Rf
Sau3A Staphylococcus aureus
AluI Arthrobacter luteus
TaqI Thermus aquaticus
HaeIII Haemophilus aegyptius
NotI Nocardia otitidis-caviarum
Enzima Microrganismo 
➢ ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: SÍTIOS DE RECONHECIMENTO
• Seqüência palindrômica: tem um eixo de simetria e a seqüência de bases de uma fita é
a mesma da fita complementar, quando lida na direção oposta.
HaeIII 5´GGCC 3´
3´CCGG 5´
HindIII 5´AAGCTT 3´
3´TTCGAA 5´
Enzima Sítio de restrição➢ ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: SÍTIOS DE RECONHECIMENTO
➢ ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: TIPOS DE CLIVAGEM
➢ Há 2 tipos distintos de clivagens:
✓ Os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da seqüência específica, gerando extremidades abruptas
✓ cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria, gerando extremidades coesivas.
➢ ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: FREQUENCIA DE CORTE
✓ Número e freqüência de ocorrência dos sítios de restrição depende do tamanho dos
sítios de restrição.
✓ Assumindo uma proporção de 50% G+C:
sítio de 4 bases deverá ocorrer a cada 44 = 256 bases
sítio com 6 bases a cada 46 = 4096 bases
sítio com 8 bases a cada 48 = 65536 bases
1 2
Eletroforese em gel agarose.
1 – DNA íntegro; 2 – DNA
digerido com a enzima SacI
➢ ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: ANÁLISE DOS RESULTADOS OBTIDOS
▪ Eletrofose: permite a separação dos fragmentos gerados de acordo com o tamanho de cada
um deles.
➢ ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: ligação de fragmentos para gerar um DNA 
recombinante
➢ Enzima DNA ligase
Restabelece as ligações entre os grupos fosfato 5´ e
hidroxilo 3´, numa reação dependente de ATP
➢ ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: ligação de fragmentos para 
gerar um DNA recombinante
Unir fragmentos com extremidades não compatíveis
A T C G G G G G C A T A C G 
T A C G C C C C G 
T A C G C C C C C
A G G T A A T G C G G G G G
➢ ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: ligação de fragmentos para 
gerar um DNA recombinante
Unir fragmentos com extremidades não compatíveis
Preenchimento com a enzima Klenow
União dos fragmentos com a enzima DNA ligase
A T C G G G G G C A T A C G 
T A C G C C C C G 
T A C G C C C C C
A G G T A A T G C G G G G G
A T C G G G G G C A T A C G 
T A C G C C C C G T A T G C
A T C G G G G G C A T A C G 
T A C G C C C C G T A T G C A G G T A A T G C G G G G G
T C C A T T A C G C C C C C
A G G T A A T G C G G G G G
T C C A T T A C G C C C C C
➢ ENZIMAS DE RESTRIÇÃO: ligação de fragmentos para 
gerar um DNA recombinante
Unir fragmentos com extremidades não compatíveis
Preenchimento com a enzima Klenow
União dos fragmentos com a enzima DNA ligase
A T C G G G G G C A T A C G 
T A C G C C C C G 
T A C G C C C C C
A G G T A A T G C G G G G G
A T C G G G G G C A T A C G 
T A C G C C C C G T A T G C
T C C A T T A C G C C C C C
A G G T A A T G C G G G G G
A T C G G G G G C A T A C G 
T A C G C C C C G T A T G C
T C C A T T A C G C C C C C
A G G T A A T G C G G G G G