Genômica - MicroRNAs, NGS, Método Sanger

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1 Genômica II – Resumo Prova II 
 
MicroRNAs (miRNAs): 
 São pequenos fragmentos de RNA não 
codificante 
 Geralmente com cerca de 22 
nucleotídeos de comprimento 
 Desempenham um papel crucial na 
regulação da expressão gênica 
 Atuam ligando-se a moléculas de RNA 
mensageiro (mRNA) e promovendo a sua 
degradação ou inibindo sua tradução em 
proteínas. 
Nematódeo Caenorhabditis elegans: 
 Indivíduos adultos com mutações no 
gene lin-4 não apresentavam estruturas 
típicas de adultos. 
 lin-4: regulava negativamente os níveis da 
proteína LIN-14, evidenciando o principal 
programa genético de transição de fases. 
 Pesquisa científica básica utiliza modelos 
biológicos; 
 1960 = Caenorhabditis elegans 
nematódeo hermafrodita de vida livre 
medindo 1 mm de comprimento com 
exatamente 959 células; 
 3 prêmios Nobel (2002, 2006 e 2008) 
 Ciclo de vida curto = 72 horas entre ovo, 
L1, L2, L3, L4 e adulto; 
 Mutações em genes específicos causam 
desenvolvimento precoce ou tardio; 
 Indivíduos adultos com mutações no 
gene lin-4 não apresentavam estruturas 
típicas de adultos; 
 
 
 
 
 lin-4 regulava negativamente os níveis da 
proteína LIN-14, evidenciando o principal 
programa genético de transição de fases; 
 
 No entanto, os níveis do mRNA da 
proteína LIN-14 se mantinham constantes 
durante as transições; 
 Controle pós-transcricional e na tradução; 
 Como que um gene afeta a produção de 
uma proteína? 
Primeiro avanço: 1993 
 Mutações no gene lin-4 não levavam a 
perda de função → não codificava para 
nenhuma proteína e era extremamente 
curto. 
 Transcritos de lin-4 eram 
complementares a região 3’ UTR de lin-14 
e altamente conservados em outras 
espécies de C.elegans; 
 
 Ainda que houvesse interação do 
pequeno RNA lin-4 com o mRNA de lin-14, 
a estabilidade não era afetada e os níveis 
se mantinham constantes; 
 
 
 
 
2 Biogênese II – Resumo Prova II 
 Ligação entre ambos apenas inibia a 
tradução devido ao não encaixe da 
maquinaria de tradução no citoplasma da 
célula; 
 Um novo tipo de mecanismo de controle 
da tradução! 
Segundo avanço: 2000 
 Outro pequeno RNA em C. elegans tinha 
alta complementariedade com sítios na 
porção 3’ UTR do gene lin-41 
 let-7 
 Controle da transição L4 -> adulto, 
causando um desenvolvimento anormal 
Terceiro avanço: 2000 
 Análise comparativa entre espécies 
distantes filogeneticamente; 
 Os pequenos RNAs faziam parte da 
estrutura de um RNA não codificante 
maior = precursores de pequenos RNAs. 
Quarto avanço: 2001 
 Transcrição 
 Maturação 
- Pri-miRNA por DROSHA 
- Pre-miRNA por DICER 
 Montagem do RISC 
 
Transcrição: se dá pela RNA Polimerase II, 
gerando um longo RNA em forma de grampo 
 miRNA primário = pri-miRNA 
 
 
Maturação: é um processo mediado por 
complexos enzimáticos para geração do 
miRNA maduro e ativo: 
 Processamento por DROSHA; 
 Exportação para o citoplasma; 
 Processamento por DICER; 
Ocorre no núcleo, onde é gerado um 
precursor do miRNA maduro = pre-miRNA 
 Processo chamado de cropping, sendo 
realizado pela enzima DROSHA 
 
Conservação da estrutura básica do mRNA 
primário (pri-miRNA): 
 Guias para ação precisa da DROSHA 
(núcleo) e da DICER (citoplasma). 
 Caule e laço (stem-loop): a estrutura 
primária dos pri-miRNAs possui uma 
região de caule e laço que é essencial 
para o reconhecimento e processamento 
pela maquinaria de RNA. 
 Extremidades 5' e 3': essas 
extremidades do pri-miRNA possuem 
sequências específicas que ajudam no 
reconhecimento pelos complexos de 
processamento. 
DROSHA: 
 É uma endonuclease RNase III que 
processa o pri-miRNA no núcleo; 
 Forma um complexo com a proteína 
DGCR8 (também conhecida como Pasha 
em alguns organismos), que reconhece a 
estrutura de caule e laço dos pri-miRNAs. 
 
3 Biogênese II – Resumo Prova II 
 
 O DGCR8 ajuda a DROSHA a identificar o 
local exato de clivagem, clivando-o em 
um pré-miRNA (pre-miRNA) de 
aproximadamente 70 nucleotídeos. 
 O reconhecimento da estrutura de caule e 
laço do pri-miRNA é crucial para a ação 
precisa da DROSHA. 
 pri-miRNA  pré-miRNA 
 
 
 
 
 DROSHA + DGCR8 
 Clivagem precisa; 
 11 pb acima da junção basal; 
 22 pb abaixo da porção do loop; 
 
 
 
 
Dicer: 
 Após ser exportado para o citoplasma 
(exportina 5), o pré-miRNA é processado 
pela endonuclease DICER, que cliva a 
estrutura de caule e laço do pre-miRNA 
para produzir um miRNA duplex de 
aproximadamente 22 nucleotídeos. 
 A especificidade da endonuclease DICER 
também depende da estrutura correta do 
pre-miRNA. 
 No citoplasma, essa enzima realiza o 
corte final do pre-miRNA. 
Dicer-1 atua como uma “régua molecular”: 
 Mede a distância entre o terminal 3' e o 
loop terminal do pre-miRNA, utilizando 
seus domínios PAZ e helicase. 
 Corta o pre-miRNA a uma distância fixa 
(aproximadamente 22 nt) do terminal 3' 
usando seus domínios RNase III. 
 Isso resulta na formação de um duplex de 
miRNA com cerca de 22 pares de bases. 
 
 
 
 
 
 
4 II – Resumo Prova II 
Montagem do Complexo 
Ribonucleoproteico RLC 
 O RISC Loading Complex (LRC) é crucial 
para o processo de silenciamento gênico 
mediado por miRNAs (microRNAs). 
 Dicer cliva o pre-miRNA no citoplasma 
para gerar um duplex de miRNA 
(dsmiRNA), que é um RNA de fita dupla. 
 TAR RNA-Binding Protein (TRBP): se liga 
ao dsmiRNA e ajuda a estabilizar o 
complexo. 
 TRBP também interage com Dicer, 
formando parte do complexo RLC. 
 
Complexo de Carregamento do RISC (RNA-
Induced Silencing Complex) 
 O RISC é o complexo final que executa o 
silenciamento gênico. 
 Além de processar o pre-miRNA, Dicer 
também é parte do complexo de 
carregamento do RISC, ajudando na 
montagem inicial do dsmiRNA. 
 O duplex de miRNA (dsmiRNA) é a forma 
de miRNA processada por Dicer, que será 
incorporada ao RISC. 
 TRBP continua associado ao dsmiRNA e 
Dicer, facilitando a passagem do 
dsmiRNA para o RISC. 
 
Passagem do dsmiRNA para o RISC 
 No RISC, uma das fitas do dsmiRNA, 
chamada de fita guia, é incorporada 
no complexo, e a outra fita, chamada 
de fita passageira, é geralmente 
degradada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Montagem final: 
 A fita guia do miRNA se associa a 
Argonauta (Ago), uma proteína central no 
RISC, formando o complexo RISC 
funcional. 
 Depois, direciona o complexo ao RNA 
mensageiro (mRNA) alvo, levando à sua 
degradação ou inibição de tradução, 
resultando em silenciamento gênico . 
 
 
 
5 Mecanismo de ação: II – Resumo Prova II 
 O RISC é qualquer complexo de 
silenciamento (seja, transcricional, pós-
transcricional ou traducional) que inclua a 
proteína Argonauta e um pequeno RNA 
para guia-la. 
 Depois de montado (miRNA maduro + 
Ago2) o mesmo é direcionado para o 
mRNA alvo... 
 Ação do microRNA 
 
 
 
 
 
 
 
 Complementariedade total leva a 
formação de dsRNA e clivagem 
enzimática; 
 
 
 
 
 Complementaridade parcial leva a 
inibição da tradução proteica; 
1. Ribossomo não consegue acessar o 
restante do mRNA: 
 
 
Competição pela estrutura 5’ Cap; 
2. CAP = Extremidade 5’ do mRNA ligado a 
uma Guanosina monofosfatada metilada; 
3. Domínio central da Ago2 semelhante ao 5’ 
CAP Binding Protein; 
4. Início da tradução não ocorre! 
 
 
 
 
 
 
6 Nomenclatura de genes II – Resumo Prova II 
Inibição da montagem dos ribossomos; 
 Ago2 é capaz de interagir e sequestrar 
eIF6 (eukaryotic translation inititation 
factor 6); 
 Não ocorre a interação entre as 
subunidades maior e menor dos 
ribossomos. 
 
 
 
Promoção da transcrição 
 2014 descrito que miRNAs podem 
interferir positivamente com a maquinaria 
de iniciação de transcrição; 
 miRNA let-7i interage com o TATA box, 
facilitando a montagem do complexo de 
pré-iniciação da transcrição; 
 Aumento do nívelde expressão do gene 
da IL-2 em 8 vezes. 
Gene Nomenclature Committee (GNC) 
padroniza e aprova nomes para genes: 
 Critérios de acordo com: 
 Estrutura 
 Organismo 
 Descoberta 
 Origem a partir do precursor 
 Homologia 
 Família 
 
 
Estrutura: 
 Pri-microRNA 
 Pre-microRNA 
 dsmicroRNA 
 microRNA 
Espécie: 
 ath-miR = Arabidopsis thaliana 
 dme-miR = Drosophila melanogaster 
 bta-miR = Bos taurus 
 ssc-miR = Sus scrufa 
 eas-miR = Equus asinus 
 hsa-miR = Homo sapiens 
Descoberta: 
 Ordem sequencial numérica de acordo 
com a descoberta e elucidação da 
estrutura do microRNA. 
Homologia: 
 Genes de miRNAs podem ser transcritos 
em vários miRNAs maduros com 
sequência não idêntica mas muito 
similares... 
 Recebem uma letra minúscula: 
 
Origem a partir do precursor: 
 miRNA maduro recebe ou 5p ou 3p após 
o nome 
 
 
7 Nomenclatura de genes II – Resumo Prova II 
Família: 
 miRNAs que possuem a mesma 
sequência de nucleotídeos em sua região 
seed. 
Região seed: geralmente compreende os 
nucleotídeos 2 a 7 ou 8 a partir da 
extremidade 5' do miRNA. 
 Altamente conservada evolutivamente. 
 A sequência específica de nucleotídeos 
na região seed determina a capacidade 
do miRNA de se ligar aos mRNAs alvo. 
 Essa região se pareia 
complementarmente com sequências-
alvo no mRNA, geralmente localizadas na 
região 3' UTR (região não traduzida) do 
mRNA. 
 A ligação da região seed do miRNA ao 
mRNA pode levar à repressão da tradução 
do mRNA em proteína, interferindo com a 
maquinaria ribossomal. 
 Sua interação com o mRNA alvo pode 
resultar na degradação do mRNA, 
diminuindo assim os níveis de proteína 
codificada. 
 
 
Técnicas para identificação: 
 Elucidar o papel dos microRNAs sobre 
um desfecho biológico; 
Investigações experimentais: 
 qPCR 
 Microarray 
 Sequenciamento 
 Predições in silico: 
 Screening inicial 
 Predição interação miRNA/mRNA 
 
 
 
Quantificação por métodos precisos: 
 Espectrofotometria e corrida 
eletroforetica em gel de agarose não são 
adequadas; 
 Fluorometria e eletroforese capilar 
microfluídica. 
Quantificação por qPCR: 
 Padrão ouro para análise da expressão 
gênica; 
 Problema dos microRNAs serem curtos 
demais e permitir o anelamento de 
primers... 
 
 Poliadenilação para criar um sítio de 
ancoragem para um primer universal 
(oligo dT): 
 
 
8 Nomenclatura de genes II – Resumo Prova II 
 
Poliadenilação: 
 Cauda de adeninas (poliA) é adicionada 
ao final 3' do RNA mensageiro (mRNA) 
recém-transcrito. 
 A cauda poliA da estabilidade e protege o 
mRNA da degradação por exonucleases. 
 Facilita o transporte do mRNA do núcleo 
para o citoplasma. 
 Ajuda na iniciação da tradução do mRNA 
em proteína. 
Steem loop: 
 Estruturas secundárias específicas do 
RNA formadas por uma sequência de 
nucleotídeos que se emparelha consigo 
mesma para criar uma haste (stem) com 
um laço (loop) no topo. 
 Iniciadores stem loop específicos ao 
microRNA de interesse... 
 Complementaridade entre a porção 3’ do 
iniciador e 3’ do microRNA. 
 
 
 
Microarray (Microarranjo): 
 Análise em larga escala (high throughput) 
 Mais laboriosa e onerosa 
- Marcação dos microRNAs na região 3’OH 
com fluoróforos: 
Sequenciamento de Nova Geração (NGS): 
 Análise em larga escala 
 Laboriosa e onerosa 
Plataformas: 
- 454 (Roche Technologies) 
- HiSeq e MiSeq (Illumina) 
- SOLiD (Life Technologies) 
 
 
 
 
 
 
9 Sequenciamento de DNA II – Resumo Prova II 
Anti-miRNAs: 
 
 Oligonucleotídeos artificias antissenso 
de microRNA... Bloqueia o efeito do 
miRNA 
 
 
Mimic-miRNA: 
 Oligonucleotídeos artificias idênticos ao 
microRNA; 
 Aumento da ação de repressão ou 
degradação sobre o mRNA alvo: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 Sequenciamento de DNA II – Resumo Prova II 
Sequenciamento de Sanger: 
 Também conhecido como método de 
terminação de cadeia; 
 Desenvolvido por Frederick Sanger (1977) 
 Revolucionou a biologia molecular, sendo 
a base para o Projeto Genoma Humano. 
 Antes desse avanço, o sequenciamento 
de DNA era um processo demorado e de 
baixa eficiência. 
 O método Sanger possibilitou a leitura 
precisa de sequências de nucleotídeos, 
permitindo grandes avanços em genética, 
biotecnologia e diagnóstico molecular. 
Conceitos Fundamentais 
 DNA é composto por quatro nucleotídeos: 
adenina (A), citosina (C), guanina (G) e 
timina (T). 
 A leitura da ordem desses nucleotídeos é 
fundamental para entender a estrutura 
genética de um organismo. 
 Reação de Polimerização: o método 
Sanger baseia-se na replicação in vitro do 
DNA, onde a enzima DNA polimerase 
adiciona nucleotídeos complementares a 
uma fita molde. 
 Didesoxinucleotídeos (ddNTPs): a chave 
do sequenciamento Sanger está no uso 
de nucleotídeos modificados chamados 
didesoxinucleotídeos (ddATP, ddTTP, 
ddCTP, ddGTP), que não possuem o 
grupo hidroxila (3'-OH), impedindo a 
adição de novos nucleotídeos e causando 
a terminação da síntese do DNA. 
Princípio do método: 
 Baseia-se na replicacão do DNA in vitro 
utilizando nucleotídos modificados 
(ddNTPs) que interrompem a síntese da 
fita de DNA. 
 Requer DNA molde, primer, DNA 
polimerase, dNTPs normais e ddNTPs 
marcados. 
 
 
1. Preparação da amostra: 
 
 Extração do DNA (células, tecidos, 
sangue, PCR). 
 Purificação (kits comerciais, métodos 
clássicos). 
 Amplificação por PCR (se necessário). 
 Purificação do produto da PCR ou DNA 
plasmidial. 
 Quantificação e normalização da 
concentração. 
 Seleção do primer específico para a 
reação (oligonucleotídeo curto) é 
desenhado para parear com a região de 
interesse. 
 Armazenamento adequado antes do 
sequenciamento. 
 
2. Reação de sequenciamento: 
 
 A amostra é misturada com: 
 DNA polimerase (para replicação); 
 Nucleotídeos normais (dNTPs) para 
síntese da fita complementar; 
 Didesoxinucleotídeos (ddNTPs) 
fluorescentes em baixa concentração; 
 Durante a replicação, quando um ddNTP 
é incorporado, a extensão da cadeia é 
interrompida. 
 
3. Eletroforese capilar: 
 
 Os fragmentos de DNA de diferentes 
tamanhos são separados por eletroforese 
capilar; 
 
11 Sequenciamento de DNA II – Resumo Prova II 
 Como os ddNTPs são marcados com 
fluorescência específica para cada base, 
um laser detecta a fluorescência e 
identifica a sequência do DNA. 
4. Análise dos dados: 
 O resultado é um eletroferograma – 
gráfico que representa a sequência de 
nucleotídeos do DNA analisado; 
 A leitura automatizada permite identificar 
mutações e variações genéticas com alta 
precisão. 
Característica Sequenciamento 
Sanger Manual 
Sequenciamento 
Sanger 
Automático 
Marcação Radioativa (P-32, 
S-35) 
Fluoróforos 
coloridos 
Separação Gel de 
poliacrilamida 
Eletroforese 
capilar 
Detecção Autorradiografia 
(filme 
fotográfico) 
Detector de 
fluorescência 
Leitura Manual, 
analisando 
bandas 
Software gera 
eletroferograma 
Tempo de 
análise 
Longo Rápido 
Precisão Baixa (sujeito a 
erro humano) 
Alta (análise 
automatizada) 
Segurança Uso de material 
radioativo 
Sem necessidade 
de radioatividade 
 
 
 
 
 
 
 
 
 O uso de dNTPs e ddNTPs faz com que, 
aleatoriamente, a reação de duplicação 
de DNA seja interrompida pela DNA 
polimerase, formando fragmentos de 
diferentes tamanhos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 Sequenciamento de DNA II – Resumo Prova II 
 
 
 
 
 
 
Sequenciamento manual x automático: 
 
Vantagens do Método de Sanger: 
 Alta precisão na leitura de sequências 
curtas e moderadas (até 1000 pb). 
 Baixa taxa de erro em comparação a 
métodos mais modernos. 
 Utilizado para validação de variantes 
identificadas por NGS (Next-Generation 
Sequencing). 
 Alta confiabilidade 
 Possibilidade de leituras com até 1 Kb. Baixo custo / amostra 
 Ideal para estudo de genes específicos. 
Limitações do Método de Sanger: 
 Baixa escalabilidade: não é ideal para 
sequenciamento de genomas inteiros. 
 Custo e tempo elevados para grandes 
volumes de amostras. 
 Sensibilidade reduzida para detecção de 
variantes de baixa frequência. 
 Baixo throughput. 
 Grande dificuldade para sequenciar 
genomas, transcriptomas e 
metagenomas. 
 No máximo 96 amostras por vez para a 
maioria dos equipamentos. 
 
Throughput refere-se à quantidade de dados 
que pode ser processada em um determinado 
período de tempo. 
 No caso do sequenciamento de Sanger, o 
processo é relativamente lento e 
laborioso comparado a métodos mais 
modernos, como o sequenciamento de 
nova geração (NGS - Next Generation 
Sequencing). 
 Isso ocorre porque o sequenciamento de 
Sanger sequencia o DNA de maneira 
linear e leitura por leitura, enquanto o NGS 
pode sequenciar milhões de fragmentos 
de DNA simultaneamente. 
Aplicações 
 Diagnóstico genético e identificação de 
mutações. 
 Confirmação de variantes em estudos 
genômicos. 
 Pesquisa em biologia molecular e 
evolução. 
 
 
 
 
 
13 Sequenciamento de DNA II – Resumo Prova II 
 
 
 
 
 
 
 
14 Sequenciamento de Nova Geração (NGS): II – Resumo Prova II 
 
 
Genômica – Histórico:
 1977 – Técnica de seqüenciamento de 
DNA – Método de Sanger 
 1991 – Projeto Genoma Humano 
 1995 – Primeiro genoma seqüenciado 
(Haemophylus influenzae) 
 2001 – Primeiro rascunho do Genoma 
Humano 
 2003 – Conclusão do seqüenciamento do 
Genoma Humano 
 2007 – Mais de 500 genomas 
seqüenciados 
 2012- Mais de 1000 genomas 
sequenciados. 
 
Segunda geração: 
Roche 454: 
 Primeira plataforma de Next Generation 
Sequencing (NGS). 
 Lançado em 2004 pela empresa Roche. 
 Utiliza como base o pirosequenciamento. 
 Leituras relativamente menores que as 
obtidas pelo método de Sanger (~700 
pb). 
Vantagens: 
 Tamanho de leitura comparável ao obtido 
pelo método Sanger. 
 Alto troughput. 
 Disponibilidade de vários tipos de 
bibliotecas (single-end, oaired-end, e 
mate-pair). 
Desvantagens: 
 Problema em regiões homopoliméricas. 
 
 
15 Sequenciamento de Nova Geração (NGS): II – Resumo Prova II 
Ilumina (Solexa): 
 Atualmente o padrão-ouro para muitas 
das análises de NGS. 
 Utiliza como como base o 
sequenciamento por síntese (SBS). 
 Três linhas de equipamentos: MiSeq, 
NextSeq e HiSeq. 
 Metodologia extremamente versátil e 
barata. 
 Leituras de 30 bp nas primeiras versões, e 
agora de 120x2 em HiSeq e 250x2 em 
MiSeq. 
SBS: 
 Preparação da Biblioteca: fragmentos de 
DNA são preparados e adaptadores são 
adicionados às extremidades. 
 Ligação ao Flow Cell: os fragmentos de 
DNA são ligados a uma superfície 
chamada flow cell. 
 Amplificação por Ponte: os fragmentos de 
DNA são amplificados em clusters 
através de um processo chamado 
amplificação por ponte. 
 Sequenciamento: os nucleotídeos 
marcados com fluorescência são 
incorporados aos fragmentos de DNA. 
Cada nucleotídeo emite um sinal de 
fluorescência diferente, que é detectado 
por uma câmera. 
 Leitura: a sequência de sinais de 
fluorescência é convertida em uma 
sequência de DNA. 
Vantagens: 
 Alto throughput (principalmente nas 
versões HiSeq). 
 Extremamente versátil. 
 Grande variedade de protocolos para 
sequenciamento e análise de dados. 
 Padrão da indústria. 
Desvantagens: 
 Problema em regiões com extremo de 
conteúdo GC (GC%). 
Solid: 
 Plataforma de sequenciamento de ultra-
high throughput. 
 Baseado em hibridização e ligação. 
 Permite o sequenciamento de genomas e 
transcriptomas com alta confiabilidade e 
cobertura (depth / coverage). 
 Trabalha com leituras extremamente 
curtas (30 - 50 bp). 
 Suporte à leituras mate-pair. 
 
 
 
Vantagens: 
 Alta cobertura. 
 Excelente para identificação de SNPs e 
INDELs. 
 Alta acurácia. 
Desvantagens: 
 Problemático para montagem de novo de 
genomas devido ao tamanho das leituras. 
 Grande volume de dados exige grande 
capacidade computacional. 
 
16 Sequenciamento de Nova Geração (NGS): II – Resumo Prova II 
 O equipamento e reagentes são caros se 
comparado às tecnologias Illumina Ion 
Torrent. 
Ion Torrent: 
 Plataforma de sequenciamento 
atualmente distribuída pela Thermo 
Fisher (antiga life technologies). 
 Baseada em sequenciamento 
semicondutor (por pH). 
 Plataforma focada em velocidade e 
praticidade (é considerada a mais rápida 
para sequenciamento de genomas). 
 Baixo custo. 
 
Vantagens: 
 Equipamentos e reagentes são baratos. 
 Menos de 1 dia para preparo do DNA e 
obtenção dos dados de sequenciamento. 
Desvantagens: 
 Problema com sequências 
homopoliméricas (da mesma forma que o 
454). 
 
Terceira geração: 
PacBio: 
 Primeira tecnologia comercial de terceira 
geração. 
 Possibilita a geração de reads com até 20 
Kb. 
 Baseada em sequenciamento de 
molécula individual em tempo real, e 
análise se cinética da polimerase. 
 
 
Vantagens: 
 Leituras longas facilitam o processo de 
montagem de genomas e transcriptomas. 
 Análise de cinética enzimática possibilita 
a identificação de modificações em 
bases, incluindo modificações 
epigenética 
Desvantagens: 
 As primeiras versões apresentavam uma 
alta taxa de erro (~10% daS bases). 
 Problemas com reads quiméricas que 
são formadas durante o preparo do DNA. 
 Custo elevado do equipamento e dos 
reagentes. 
Oxford Nanopore: 
 Sequenciamento baseado na análise do 
sinal elétrico gerado pela passagem de 
um fragmento de DNA por um poro 
proteico transmembrânico. 
 Tecnologia extremamente portátil. 
 Descartável. 
 Leituras > 20 Kb. 
 
 
 
17 Sequenciamento de Nova Geração (NGS): II – Resumo Prova II 
Vantagens: 
 Leituras longas e equiparáveis às da 
PacBio. 
 Equipamento barato (mas descartável) 
(~1000 dólares). 
 Portabilidade permite o uso do 
sequenciamento de nova geração em 
pesquisas de campo. 
Desvantagens: 
 Alta taxa de erros. 
 Ainda em estágio beta. 
 Poucos protocolos disponíveis. 
 
Bibliotecas de NGS: 
 São coleções de fragmentos de DNA 
preparados para serem sequenciados. 
 Elas são cruciais para o processo de NGS, 
pois a qualidade e a preparação da 
biblioteca impactam diretamente a 
eficiência e precisão do sequenciamento. 
Single-end: 
 Sequenciamento de apenas uma das 
extremidades dos fragmentos da 
amostra. 
 Forma mais simples (e barata) de 
biblioteca. 
 Também denominada “biblioteca de 
fragmento”. 
Paired-end: 
 Sequenciamento de ambas as 
extremidades dos fragmentos da 
amostra. 
 Sequências podem ser sobreponíveis ou 
espaçadas. 
 Disponível para 454 e Illumina, sendo hoje 
o padrão de fato. 
Mate-pair: 
 Similar ao sequenciamento paired-end, 
mas com um espaçamento maior entre 
as leituras. 
 Mais cara, e com maior taxa de erros 
(false-mates). 
 Também denominada “jump library”. 
 
 Biblioteca Sequenciame
nto 
Vantagens Uso 
Single-End Uma 
extremidade 
Simples, 
rápida, 
menos 
custosa 
Contagem de 
expressão 
gênica 
Paired-End Ambas as 
extremidades 
Melhor 
montagem 
de genomas, 
identificação 
de variantes 
estruturais 
Montagens de 
novo, estudos 
de genoma e 
transcriptoma 
Mate-Pair Extremidades 
distantes 
Detecta 
rearranjos 
estruturais 
complexos, 
fecha 
lacunas 
Estudos de 
genoma, 
montagem de 
novo, análise de 
variações 
estruturais 
 
Comparações: 
Característi
ca 
Illumina Ion Torrent PacBio 
Geração Segunda Segunda Terceira 
Tecnologia Sequenciamen
to por Síntese 
(SBS) 
Sequencia
mento por 
Semicondu
tores 
Sequenciam
ento de 
Molécula 
Única em 
Tempo Real 
(SMRT) 
Leituras Curtas a 
médias 
Curtas Longas 
Precisão Alta Moderada Moderada 
(melhorada 
com o 
tempo) 
Custo Elevado Relativame
nte baixo 
Relativamen
te alto 
Uso Genômicapessoal, 
estudos 
populacionais, 
análises de 
expressão 
gênica 
Aplicações 
clínicas e 
de 
pesquisa 
Montagem 
de genoma 
de novo, 
regiões 
repetitivas 
 
 
 
 
 
18 Sequenciamento de Nova Geração (NGS): II – Resumo Prova II 
Aplicações: 
Whole genome shotgun: 
 O sequenciamento shotgun de genoma 
completo (Whole Genome Shotgun 
Sequencing, WGSS) é uma abordagem de 
sequenciamento em que o genoma é 
fragmentado aleatoriamente em 
pequenos pedaços, que são então 
sequenciados. 
 As sequências resultantes são alinhadas 
e montadas para reconstruir o genoma 
completo. 
 
 
Pangenômica: 
 Se refere ao estudo completo do conjunto 
de genes de todas as cepas de uma 
espécie. 
 
SNPs e INDELs: 
 Identificação de polimorfismos de 
nucleotídeo único (SNPs) e 
inserções/deleções (INDELs). 
 Estudos de associação genômica ampla 
(GWAS), mapeamento de doenças, 
seleção assistida por marcadores. 
 
RNA-Seq: 
 Quantificação da expressão de genes em 
diferentes condições ou tecidos. 
 Estudos de regulação gênica, resposta a 
tratamentos, desenvolvimento de novos 
medicamentos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 Sequenciamento de Nova Geração (NGS): II – Resumo Prova II 
Questões Prova II – Genômica II: 
 
1. Explique o papel dos microRNAs (miRNAs) na regulação da expressão gênica, destacando 
os principais avanços na pesquisa sobre miRNAs em Caenorhabditis elegans. 
 
 
 
 
2. Compare a biogênese dos miRNAs com outros processos de controle pós-transcricional, 
explicando como os miRNAs influenciam a tradução de mRNAs específicos. 
 
 
 
 
3. Descreva o método de Sequenciamento por Síntese (SBS) utilizado pela plataforma 
Illumina e compare suas vantagens e desvantagens com outras tecnologias de 
sequenciamento de nova geração, como Ion Torrent e PacBio. 
 
 
 
 
4. Qual das seguintes opções descreve melhor o papel dos miRNAs? a) Codificação de 
proteínas específicas b) Degradação de mRNAs ou inibição de sua tradução c) Aceleração 
da síntese de proteínas d) Manutenção da estrutura do DNA 
 
 
 
 
5. Qual das seguintes enzimas é responsável pelo processamento inicial do pri-miRNA no 
núcleo? a) RNA polimerase II b) DROSHA c) DICER d) Argonauta (AGO) 
 
 
 
20 Sequenciamento de Nova Geração (NGS): II – Resumo Prova II 
 
6. No método de sequenciamento da Illumina, os fragmentos de DNA são ligados a uma 
superfície chamada: a) Flow Cell b) MiSeq c) PACBIO d) Polimerase 
 
 
 
7. Qual o papel dos ddNTPs? 
 
 
 
8. Compare as principais diferenças entre o sequenciamento de Sanger e o sequenciamento 
de nova geração (NGS) em termos de precisão, custo e throughput. 
 
 
 
9. Discuta as vantagens e desvantagens do sequenciamento de Sanger em relação às 
tecnologias de terceira geração, como PacBio e Oxford Nanopore, em aplicações de 
pesquisa genômica. 
 
 
 
10. Quais as vantagens do método de Sanger? 
 
 
 
11. Explique a biogênese de miRNAs e as enzimas relacionadas. 
 
 
12. Quais os mecanismos de ação dos miRNAs? 
 
 
 
21 Sequenciamento de Nova Geração (NGS): II – Resumo Prova II 
 
13. O que são anti-miRNAs? 
 
 
 
14. Quais são as técnicas para identificação de miRNAs? 
 
 
15. O que é o steem loop e qual sua importância? 
 
 
 
16. Qual a função da cauda poliA? 
 
 
17. Qual a diferença entre dNTPs e ddNTPs? 
 
 
 
18. Como funciona a eletroforese capilar e em qual método é usada? 
 
 
19. Quais as etapas do PCR? 
 
 
20. O que é uma biblioteca de NGS? Quais são elas e como funciona?