Sequenciamento de DNA e PGH

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Sequenciamento de DNA e 
Projeto Genoma Humano 
(PGH) 
Profa. Renata H. M. Sindeaux 
Método de Sanger et al. (Anos 70)- 
método “dideoxi” 
•  É um método enzimático utilizado para determinar 
a sequência de nucleotídeos de um fragmento de 
DNA através da adição de nucleotídeos modificados 
– dideoxinucleotídeos (ddNTPs); 
 
•  A sequência pode ser determinada por um 
fragmento clonado ou uma sequência alvo 
amplificada por PCR. 
ddNTPs (dideoxinucleotídeos) x 
dNTPs (desoxinucleotídeos) 
•  dNTPs: possuem o 
grupamento hidroxila no 
carbono na posição 3´; 
•  ddNTPs: incorporado a 
uma fita de DNA à 
interrompe abruptamente 
a síntese da cadeia. 
Componentes da reação de PCR de 
sequenciamento 
– DNA molde (amostra) 
– Enzima Taq DNA polimerase 
– Tampão 
– Mg+2 
– dNTPs 
– ddNTPs marcados (menor 
proporção) 
– Somente 1 primer 
•  PCR(de(sequenciamento:(
–  DNA!molde!(amostra),!
–  Enzima!DNA!polimerase,!
–  Tampão,!
–  Mg+2,!
–  dNTPs!
–  ddNTPs!
–  Somente!1!primer&
Sequenciamento!de!1º!geração!
Sanger!
A reação de sequenciamento 
•  Quatro reações base 
específicas paralelas 
são realizadas 
utilizando-se uma 
mistura de todos os 
quatros dNTPs e 
também uma 
PEQUENA 
proporção de um 
dos quatros ddNTPs. 
t a g a g a a a g c c c t g t g t c a g(
a t c t(c( t( t( t( c(
a t c t( Primer!
a( c( t( g(
c(
dNTP!
ddCTP!
5' 3' 
DNA molde 
3' 5' 
a t c t(
t a g a g a a a g c c c t g t g t c a g(
c( t( t( t( g( g( g( a( c(c(
A(
T(
C(
C( T( G(
T(
C(
T(
G/A(
A(
G(
C(
A(
5' 
3' 
Heterozigoto / 
locus variável 
Sequenciamento manual 
http://www.youtube.com/watch?
NR=1&gl=BR&hl=pt&v=f1ifyEJ2Gjs 
Sequenciamento automático 
 •  Os ddNTPs são marcados com fluoróforos de 
cores diferentes, separados por eletroforese 
capilar e detectator por laser. 
http://www.ib.usp.br/microgene/
atividades0popup.php?Arquivo=atividades-4-
Arquivo.swf 
Sequenciamento de 2º geração 
Illumina 
Genome Analyser IIx HiSeq 
MiSeq 
Sequenciamento de 2º geração 
Life 
Technologies 
Ion Torrent PGM 
SOLiD 
Ion Proton 
PROJETO GENOMA HUMANO (PGH) 
Histórico 
•  Projeto coordenado pelo Departamento de Energia 
e Instituto Nacional de Saúde dos E.U.A. (NIH) 
•  International Human Genome Sequencing 
Consortium: E.U.A., Reino Unido, Japão, França, 
Alemanha e China (principalmente). 
•  1986 –início do projeto piloto. 
•  1990 –início oficial. 
Objetivos 
•  Construir detalhadamente os mapas genético e 
físico do genoma humano; 
•  Determinar a seqüência completa dos ~ 3 
bilhões de pares de nucleotídeos do DNA 
humano; 
•  Localizar os cerca de 30.000 genes dentro do 
genoma humano; 
•  Executar análises semelhantes nos genomas 
de diversos organismos usados em laboratórios 
de pesquisas, como sistemas-modelo. 
Objetivos 
•  Estocar estas informações em banco de dados; 
•  Melhorar a tecnologia para pesquisa biomédica 
•  (para o seqüenciamento, bioinformática e 
computação – ferramentas para análises dos 
dados); 
•  Responder questões éticas, legais e sociais que 
surjam em decorrência das pesquisas do genoma 
humano; 
•  Identificar variações de sequências (Projeto de 
Diversidade Humana). 
Estratégias metodológicas: 
Shotgun 
Production�Sequencing�at�MIT’s�Whitehead�Institute
From�Gordon�et�al.,�Genome�Research�1998.
Sequence�Assembly
Quem coordenou o PGH? 
Publicações 
•  PGH: Nature, vol. 
409 (2001); 
•  Celera: Science, vol. 
291 (2001). 
Principais resultados 
•  3.000.000.000 pb; 
•  Estima-se que 99.9% da seqüência seja exatamente a 
mesma entre todos os seres humanos. 
•  Tamanho dos genes varia enormemente: gene médio: 
3.000 bases; 
 Maior gene conhecido: distrofina (2,4 milhões de bases). 
•  Número total de genes: estimado em torno de 30000 a 
40000(muito menor que as estimativas prévias de 80.000 
a 140.000. (Hoje sabe-se que é em torno de 25000). 
•  Mais de 50% genes encontrados ainda não tem função 
definida. 
Onde encontrar a sequência? 
•  University of Califórnia: 
 http:/genome.ucsc.edu 
 
•  The National Center for Biotechnology 
Information 
 http:/www.ncbi.nih.gov