TESE MÁRIO OFICIAL

Prévia do material em texto

Universidade do Estado do Rio Grande do Norte – UERN 
Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação – PROPEG 
Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Bioquímica e Biologia Molecular 
– PMBqBM 
 
 
MÁRIO LUAN SILVA DE MEDEIROS 
 
 
AÇÃO NEMATICIDA DAS LECTINAS WSMoL e cMoL DE Moringa oleifera 
SOBRE Haemonchus contortus 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Mossoró 
2020 
1 
 
 
 
MÁRIO LUAN SILVA DE MEDEIROS 
 
 
 
 
 
AÇÃO NEMATICIDA DAS LECTINAS WSMoL e cMoL DE Moringa oleifera 
SOBRE Haemonchus contortus 
 
 
 
 
 
Tese de Doutorado apresentada à 
Universidade do Estado do Rio Grande 
do Norte – UERN, como pré-requisito 
obrigatório para obtenção do título de 
Doutor em Bioquímica e Biologia 
Molecular. 
 
Orientadora: Profa. Dra. Michele 
Dalvina Correia da Silva 
 
 
 
 
 
 
Mossoró 
2020 
M488a Medeiros, Mário Luan Silva de
Ação nematicida das lectinas WSMoL e cMoL de
Moringa oleifera sobre Haemonchus contortus. / Mário
Luan Silva de Medeiros. - Mossoró, 2020.
101p.
Orientador(a): Profa. Dra. Michele Dalvina Correia da
Silva.
Tese (Doutorado em Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica e Biologia Molecular). Universidade do Estado
do Rio Grande do Norte.
1. Haemonchus contortus. 2. Lectina. 3. Moringa. 4.
Nematoide. 5. Índice de Motilidade. I. Silva, Michele
Dalvina Correia da. II. Universidade do Estado do Rio
Grande do Norte. III. Título.
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MÁRIO LUAN SILVA DE MEDEIROS 
 
 
AÇÃO NEMATICIDA DAS LECTINAS WSMoL e cMoL DE Moringa oleifera 
SOBRE Haemonchus contortus 
 
 
Tese de Doutorado apresentada à 
Universidade do Estado do Rio Grande 
do Norte – UERN, como pré-requisito 
obrigatório para obtenção do título de 
Doutor em Bioquímica e Biologia 
Molecular. 
 
Aprovado em _______/________/_________ 
 
Banca Examinadora 
 
___________________________________________________________________ 
Professora Dra. Michele Dalvina Correia da Silva (Orientadora) 
Universidade Federal Rural do Semi-Árido - UFERSA 
 
___________________________________________________________________ 
Professora Dra. Ana Carla Diógenes Suassuna Bezerra 
Universidade Federal Rural do Semi-Árido - UFERSA 
 
___________________________________________________________________ 
Professora Dra. Ana Cláudia de Oliveira 
Universidade do Estado do Rio Grande do Norte - UERN 
 
___________________________________________________________________ 
Professora Dra. Patricia Batista Barra Medeiros Barbosa 
Universidade do Estado do Rio Grande do Norte - UERN 
 
___________________________________________________________________ 
Professora Dra. Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho 
Universidade Federal de Pernambuco - UFPE 
3 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A mim, pelo esforço no planejamento e na 
execução. 
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AGRADECIMENTOS 
 
 
 Agradeço à minha fé, por me guiar e fazer aprender com os acertos e erros 
durante a execução da pesquisa. Agradeço também à minha família, por todos os 
ensinamentos e amor. 
À minha orientadora, Professora Doutora Michele Dalvina Correia da Silva, pela 
confiança e credibilidade ao meu trabalho, como também pela disposição no 
planejamento e execução desta obra. Agradeço também à equipe de alunos de 
iniciação científica e de pós-graduação do Laboratório de Biologia Celular e Molecular 
da UFERSA. 
À Professora Doutora Ana Carla Bezerra, da Universidade Federal Rural do 
Semi-Árido, pela colaboração incessante durante todo o processo de doutoramento. 
Às Professoras da Universidade Federal de Pernambuco, Luana Cassandra 
Coelho e Patricia Guedes Paiva, pela colaboração e incentivo no decorrer da 
pesquisa. Agradeço também ao Professor Thiago Napoleão e aos alunos de pós-
graduação, Robson Alves e Benny Oliveira. Muito obrigado. 
Agradeço aos Professores Carlos Campos e Jael Batista, da Universidade 
Federal Rural do Semi-Árido, pela grandiosa contribuição na execução e análise de 
parte dos dados da pesquisa. 
À minha família, formada pelo meu esposo, amigo e companheiro Emerson 
Medeiros, como também às minhas filhas não humanas Lassie Maria e Lilika Maria. 
Amo vocês! Agradeço também aos meus amigos e colegas; com amigos, a vida se 
torna bem melhor. 
À Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, pelo incentivo ao 
desenvolvimento de programas de Doutorado no País. À Universidade do Estado do 
Rio Grande do Norte, que contribuiu na construção dessa minha etapa profissional. À 
Universidade Federal Rural do Semi-Árido, pela contribuição do seu pessoal técnico 
e de laboratórios. Agradeço também à Coordenação de Apefeiçoamento de Pessoal 
de Nível Superior - Capes, por parte do financiamento deste trabalho. 
 Por fim, porém não menos importante, agradeço à todos os colaboradores que 
indiretamente auxiliaram no planejamento e execução dessa pesquisa. Muito 
obrigado. 
5 
 
 
 
RESUMO 
 
Haemonchus contortus é um parasito hematófago que causa danos à produção de 
animais ruminantes em todo o mundo. Aliado ao problema da resistência aos anti-
helmínticos, a busca por novos bioprodutos e seus efeitos biológicos contribuem para 
a descoberta de produtos alternativos nematicidas. Este estudo avaliou a ação 
nematicida das lectinas WSMoL – lectina solúvel de Moringa oleifera e cMoL – lectina 
coagulante de Moringa oleifera, em ensaios in vitro e in vivo. Nos ensaios in vitro, 
WSMoL e cMoL (500 μg mL-1) interferiram significativamente (p0,05) e 26,6 % (pdesenvolvidas com lectinas, a 
figura 1.8 apresenta os principais locais de atuação, propostos pelos pesquisadores, 
de lectinas com efeito anti-helmíntico sobre ovos e larvas de NGI. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
40 
 
 
 
 
 
Figura 1.8. Possiveis locais de atuação de lectinas anti-helmínticas. A. atuação da lectina no ovo – 
interação com a casca do ovo, com células embrionárias e com enzimas proteolíticas. B. atuação da 
lectina no desenvolvimento larval (estágio larval L1 para o L3) – interação com a cutícula do nematoide, 
com a boca e com receptores presentes no intestino. 
 
Fonte: Ilustração do Autor, 2020. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
 
 
1.7. OBJETIVOS DA PESQUISA 
 
1.7.1. Objetivo Geral 
Avaliar o efeito anti-helmíntico das lectinas WSMoL e cMoL purificadas da espécie 
Moringa oleifera sobre larvas em terceiro estágio e adultos da espécie Haemonchus 
contortus. 
 
1.7.2. Objetivos Específicos 
Verificar os efeitos nematicida in vitro das lectinas WSMoL e cMoL sobre larvas em 
terceiro estágio, com bainha e desembainhadas, da espécie Haemonchus contortus; 
Averiguar os efeitos nematicida in vitro das lectinas WSMoL e cMoL sobre parasitos 
adultos da espécie Haemonchus contortus; 
Avaliar o grau de infecção in vivo de parasitos de Haemonchus contortus em roedores 
expostos à lectina WSMoL; 
Examinar o grau de infecção in vivo de um pool de parasitos (contendo Haemonchus 
contortus, Trichostrongylus sp., Oesophagostomum sp. e Strongyloides sp.) em 
roedores expostos à lectina cMoL; 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
42 
 
 
 
CAPÍTULO 2 
___________________________________________________________________ 
 
IN VITRO EFFECTS OF Moringa oleifera SEED LECTINS ON Haemonchus 
contortus IN LARVAL AND ADULT STAGES 
 
2.1. INTRODUCTION 
 
The species Haemonchus contortus is the helminth parasite of higher infectious 
character in ruminants, causing damage to the production of these animals throughout 
the world, especially by the hematophagous habit (Hoberg et al., 2004; Hoste et al., 
2016). Morphophysiological characteristics confer high efficiency during the infection 
process, such as the presence of cuticle (which makes the infective larvae more 
resistant to the physiological and environmental conditions), the secretion of proteolytic 
enzymes (which destroy protein barriers during the infection process on the host), the 
presence of a dorsal lancet (responsible for damages to the animal and by the 
installation in the gastric mucosa) and resistance to anthelmintic (related to genetic 
mechanisms) (Monnig, 1950; Fetterer and Rhoads, 1993; Karanu et al., 1993; 1997; 
Jackson et al., 2012; Harder, 2016). 
These characteristics corroborate the increase of research in the screening of 
natural substances that interfere in the parasite life cycle (Hoste and Torres-Acosta, 
2011; Sandoval-Castro et al., 2012). With emphasis on the use of proteins such as 
lectins with nematicide action, experiments have been reported with different 
gastrointestinal nematodes in which a direct relationship has been pointed out between 
the ability of specific connection of these molecules and structures of the pathogen rich 
in carbohydrates and/or glycoproteins, resulting in inhibition of embryonic 
development, hatching of eggs and development of larval stages after hatching (Ríos-
De Álvarez, L, Jackson, F, Greer, A, et al., 2012; Heim et al., 2015; Medeiros et al., 
2018). 
Lectins are proteins of non-immunological origin with binding sites of specific 
recognition to carbohydrates, from which they are able to interact with cells, 
glycoproteins and carbohydrate-free (Coelho et al., 2017), offering a range of 
applications. Two lectins of plant origin, WSMoL (water soluble Moringa oleifera lectin) 
and cMoL (coagulant M. oleifera lectin), are under investigation regarding the 
43 
 
 
 
nematicide action. Both are isolated from seeds of M. oleifera Lamarck 1785, a native 
species from India and widely cultivated in tropical and subtropical countries (Coelho 
et al., 2009; Santos et al., 2009; Kuet, 2017). WSMoL is an acidic oligomeric protein 
(pH 4.5) of negative load, with a molecular mass of approximately 60 kDa and with 
peptide sequence similar to proteins MO2.1 and MO2.2; it presents specific activity 
decreased in the presence of fructose and pork thyroglobulin (Gassenschmidt et al., 
1995; Coelho et al., 2009; Moura et al., 2016). cMoL is a cationic protein, non-
glycosylated, active in the pH range from 4.0 to 9.0, thermostable, with a molecular 
weight of 26.6 kDa, with presence of amino acids such as glutamine, alanine and 
proline and with affinity for glycoproteins such as azocasein and asialofetuin (Santos 
et al., 2009; Luz et al., 2013). These lectins presented biological activities, such as 
insecticide, coagulant in water, bactericide, and nematicide (Coelho et al., 2009; 
Santos et al., 2009; Ferreira et al., 2011; Santos et al., 2012; Luz et al., 2013; Santos, 
N. D. et al., 2014; Moura et al., 2016; Medeiros et al., 2018), which makes promising 
the research of these molecules in studies that aim at natural alternative forms for the 
control of parasitic infections. 
This study reports the effect of lectins WSMoL and cMoL on the motility of H. 
contortus in third larval stage and the adult stage. 
 
2.2. MATERIAL AND METHODS 
2.2.1. Purification of lectins 
 
 
WSMoL was isolated according to Coelho et al. (2009). Seeds (10 g) of M. 
oleifera were triturated and homogenized in distilled water (100 mL) for 16 h at 28°C. 
Then, the solution was filtered in gauze and centrifuged (3.000 x g for 15 min at 4 ºC). 
The supernatant was subjected to a protein precipitation with ammonium sulphate at 
60 % saturation (for 4 h at 28 °C). The material was centrifuged and the precipitate 
obtained was solubilized in 0.15 M NaCl dialyzed and (in membrane with porosity to 
retain molecules of 3.5 kDa) against 0.15 M NaCl solution (for 6 h at 4 °C). The dialyzed 
protein fraction was chromatographed in chitin support (18 x 1.5 cm); the lectin 
adsorbed was eluted with 1 M acetic acid and the protein pool obtained was dialyzed 
against 0.15 M NaCl solution (for 6 h at 4 °C). 
44 
 
 
 
cMoL was isolated as described by Santos et al. (2009). Seeds were processed 
and homogenized in 0.15 M NaCl for 6 h at room temperature. Then the material was 
filtered and centrifuged (12.000 x g for 20 min at 4 ºC). The protein content was 
precipitated with 60 % of ammonium sulphate for 4 h at room temperature; the material 
was centrifuged, and the protein fraction obtained was dialyzed at 4 °C against distilled 
water (two exchanges) and then against 0.15 M NaCl solution (overnight). The dialyzed 
protein fraction was chromatographed on guar gel (10 x 1.0 cm) previously balanced 
with 0.15 M NaCl; the adsorbed cMoL was eluted with 1 M NaCl, and the pool of protein 
obtained was dialyzed against distilled water (four exchanges, 1 h each exchange). 
The collection was previously authorized by Chico Mendes Institute for Biodiversity 
Conservation (ICMBio) (authorization Nº. 36301-2) and National System for the 
Management of Genetic Heritage and Associated Traditional Knowledge (SisGen) (Nº. 
A6FC322). Herbarium specimens of the species previously deposited at Dárdano de 
Andrade Lima Herbarium of the Agronomic Institute of Pernambuco (IPA), located in 
Recife, Brazil (Herbarium specimen Nº 73.345). 
 
2.2.2. Declaration of Ethics 
 
The research was approved by the Ethics Committee on Animal Use (CEUA) of 
Rural Federal University of Semi-Árido (UFERSA) under the number 
23091.009318/2016-40 and in accordance with the Federal Law Nº. 11794/2009. 
 
2.2.3. Isolate and storage of Haemonchus contortus 
 
The isolate of H. contortus used in the tests was granted by EMBRAPA 
(Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) and stored at 10 °C until its use (one 
month).2.2.4. Unsheathing of L3 larvae of H. contortus 
 
L3 larvae were unsheathed and sterilized by means of incubation with 0.15 % 
(v/v) of sodium hypochlorite (NaClO) at 37 °C for 20 min (Nikolaou et al., 2002). After 
hatching, the unsheathed larvae (called xL3) were washed 5 times in saline solution 
(0.9%), through centrifugation (6000 RPM for 5 min) at room temperature (28 °C). 
45 
 
 
 
 
2.2.5. Index of L3 larvae motility and xL3 of H. contortus after incubation with the 
lectins 
 
The effect of WSMoL and cMoL on the motility of larvae of H. contortus in stage 
L3 was analyzed as previously described (Preston et al., 2015; Witola et al., 2016), 
with modifications. The larvae (L3 and xL3, in separate experiments) were transferred 
to 12-well sterile plates (20 larvae per well), containing 500 μL/well of medium Luria 
Bertani (called medium LB, consisting of 5 g of tryptone, 2.5 g of yeast extract and 2.5 
g NaCl dissolved in 500 mL of sterile distilled water and autoclaved with and 
supplemented with 2.5 µg mL-1 of amphotericin, 100 IU mL-1 of penicillin and 100 µg 
mL streptomycin), at 37 °C. Then, experimental groups were established with each 
lectin in concentrations ranging from 3.9 to 500 µg mL-1; the medium LB without adding 
lectin was used as a negative control. WSMoL and cMoL were tested individually in 
assays performed in triplicate for each lectin concentration analyzed. After 2, 4, 6, 8, 
12, 24 and 36 h of exposure of larvae L3 the lectins, the plates were shaken manually, 
and the motility was observed in inverted microscope (20x lens). The larvae xL3 motility 
was verified after 24, 48 and 72 h of exposure to the lectins. The motility index of larvae 
exposed to each lectin and the larvae of each control group was measured using as 
base the formula previously described (Hounzangbe-Adote et al., 2005): 
%MI (Motility Index %) =
number of movable larvae in the treatment 
total number of larvae
𝑥100. 
 
 
2.2.6. Isolation of adult worms of H. contortus and motility index after incubation 
with the lectins 
 
The effect of WSMoL and cMoL on the motility of adult worms of H. contortus 
was investigated based on the methodology previously described (Hounzangbe-Adote 
et al., 2005), with modifications. Adult worms were collected from autopsies of fresh 
abomasum of naturally infected goats, being washed with saline solution (0.9%) and 
taken to the laboratory. Adult female and male worms were identified in accordance 
with (Ueno and Gonçalves, 1998) separately and transferred to12-well sterile plates 
(10 worms per well), containing 500 µL/well of medium LB to 37 °C. Then, the 
experimental groups were established with WSMoL and cMoL, at concentrations of 1 
mg mL-1 and 500 µg mL-1; the medium LB without adding lectin was used as a negative 
46 
 
 
 
control. WSMoL and cMoL were tested individually in assays performed in triplicate for 
each lectin concentration analyzed. The adult larvae motility was verified after 2, 4, 6 
and 8 h of exposure to the lectins. The motility index of adult worms exposed to each 
lectin and the worms of each control group was calculated using as base the formula 
previously described (Hounzangbe-Adote et al., 2005): 
%MI (Motility Index %) =
number of movable larvae in the treatment 
total number of larvae
x100. 
 
2.2.7. Zymogram of proteases 
 
After 8 h of incubation with 1 mg mL-1 of the lectins WSMoL and cMoL 
(separately) or in the medium LB (negative control), 20 worms of the treatments (males 
and females separately) were collected and processed for obtaining extracts using the 
Tris buffer (0.1 M Tris-HCl, pH 8.0), followed by centrifugation (9.000 x g at 4 °C for 15 
min). The supernatant obtained in each case was collected and the protein 
concentration was determined using the Lowry method (Lowry et al., 1951). The 
protease activity of worm extracts was determined according to the methodology 
previously described (García-Carreño et al., 1993). Samples of the worm extracts (100 
µg of protein) were subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) at 12 
% to 4 ºC. After the buffer running, the gel was immersed in Triton X-100 to 2.5 % (v/v) 
prepared in 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) to remove the SDS; then it was incubated with 3 
% casein (p/v) prepared in 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) for 30 min at 4 °C and then for 90 
min at 37 °C to allow the digestion of casein peptides with protease activity. Finally, 
the gel was stained for 16 h using Coomassie Brilliant blue 0.02 % (p/v) prepared in a 
solution of acetic acid to 10 %, and then was bleached with a solution containing 40 % 
ethanol, 10 % acetic acid and 50 % of distilled water. Clear bands against the blue 
background showed protease activity. 
 
2.2.8. Electronic microscopy of adult worms of H. contortus after incubation with 
the lectins 
 
The worms exposed for 8 h to WSMoL and cMoL (1 mg mL-1) were fixed by 
incubation for 72 h with a glutaraldehyde solution 2.5 % (v/v) prepared in PBS 0.1 M, 
pH 7.4, and post-fixed by incubation for 1 h with a solution of osmium tetroxide at 1 % 
in PBS pH 7.4. Subsequently, the worms were subjected to a sequence of dehydration 
47 
 
 
 
by a gradual system of ethyl alcohol, dried and subjected to a coating with a layer of 
gold-palladium for 15 min (Quorum, Q150T ES), forming a layer of 20 nm. The worms 
were observed in scanning electron microscope (QUANTA- EGF) with a voltage of 10 
kV. 
 
2.2.9. Statistical analysis 
 
All the data obtained regarding the rate of larval motility and motility index of 
adult worms were analyzed by GraphPad Prism version 5.01 for Windows (GraphPad 
Prism Software, Inc™), by ANOVA and Bonferroni post-test, considering the 
significance level of 5% (pof paralysis of the male and female worms (p0.05] in the presence 
of WSMoL and 26.6 % in the presence of cMoL in female; Figure 2.4 B and D). 
 
2.3.3. Zymogram 
 
The zymogram performed with extracts of adult worms, male and female, 
exposed for 8 h the lectins WSMoL and cMoL or not exposed to lectins (negative 
control), revealed higher proteolytic activity in samples obtained from worms subjected 
to incubation with the lectins, both in extracts of male and female worms (Figure 2.5). 
 
2.3.4. Analysis by scanning electron microscopy 
 
Comparing to the control group (Figure 2.6 A and B), it was observed the 
presence of aggregates in the anterior part of the worms body treated with WSMoL 
(Figure 2.6 D), as also in the vulva of worms treated with cMoL (Figure 2.6 F). An 
irregular provision in pattern of the superficial cuticle of the crest along the body of 
nematodes treated with WSMoL (Figure 2.6 C), morphology changes in the vulva of 
females treated with cMoL (Figure 2.6 F) and distortion in the vertical strings (related 
to the nerve cords) of worms treated with cMoL (Figure 2.6 E). 
 
49 
 
 
 
2.4. DISCUSSION 
 
The nematicide effect of natural compounds is almost always associated with 
the presence of primary and secondary metabolites, in particular the phenols and the 
lectins (Hoste et al., 2006; Ríos-De Álvarez, L, Jackson, F, Greer, A, et al., 2012). 
Compounds rich in tannins are associated to the delay in embryonic development of 
gastrointestinal nematode eggs, but also in their development in larval stage (Hoste et 
al., 2006; Martínez-Ortíz-De-Montellano et al., 2013). Similarly, lectins were also 
reported regarding the harmful effect in early stages of development of these parasites, 
mainly due to their high specificity to regions rich in carbohydrates and/or glycoproteins 
in the nematode structure (Ríos-De Álvarez, L, Jackson, F, Greer, A, et al., 2012; Heim 
et al., 2015; Medeiros et al., 2018). Anyway, the important thing in the screening of 
nematicide is to identify the ability of these compounds to interfere in the nematode 
biological cycle. In this study, the motility of H. contortus in infective larval stage and in 
their adulthood (males and females) is highlighted. 
In the infective stage of H. contortus, motility is a characteristic of extreme 
importance in the infection process, as well as the presence of sheath, which gives 
stability in the face of environmental conditions (free phase) and in the beginning of 
infection process in the host (parasitic phase) (Fetterer and Rhoads, 1993; Fleming et 
al., 2006; Brunet et al., 2007; Page et al., 2014). In this study, the lectins WSMoL and 
cMoL showed an interference in the motility of infective larvae of H. contortus (with and 
without the sheath), and observed a lower index of motility in larvae without sheath 
exposed to cMoL. Unsheathed larvae without may become more sensitive to volatile 
anthelmintic (Molan et al., 2003); the test revealed that cMoL has greater paralyzing 
effect on the larvae without the sheath protection. 
In the tests of motility index in adult worms, it was observed that the lectins 
require a longer time of incubation with the females to reveal a significant motility, in 
comparison with the data obtained with the males, and that cMoL promoted a least 
percentage of motility in females than WSMoL. However, both lectins showed similar 
effect in tests of motility with the male worms. 
The anthelmintic activity of WSMoL has already been previously evaluated in 
tests of hatchability of eggs and larval development; WSMoL showed significant 
effects, being observed bioaffinity by components of eggs and larvae (Medeiros et al., 
50 
 
 
 
2018). This study is the first report of anthelmintic activity of cMoL; however, previous 
studies showed that the cMoL interfered in the activity of proteolytic enzymes (trypsin 
proteases and amylases) in tests with larvae of Aedes aegypti and Anagasta 
kuehniella (Agra-Neto et al., 2014) species, suggestive information for a possible 
nematicide action. 
Treatments with WSMoL and cMoL promoted an increase in the proteolytic 
enzyme activities of male and female worms of H. contortus, contributing with their 
nematicide effects. Dysfunctions in the activity of proteolytic enzymes can trigger 
different metabolic damages (López-Otín and Bond, 2008). Thus, the increase or 
decrease of the protease activity of metalloproteinases, cysteine-peptidases and 
serine peptidases can interfere in the nematodes development cycle, interfering with 
the vital functions of worms (Karanu et al., 1993; 1997; Laing et al., 2013; Medeiros et 
al., 2018). 
Several studies have already analyzed the motility of H. contortus in these 
stages of development, but the majority of studies used preparations of plants rich in 
secondary metabolites and not isolated compounds (Molan et al., 2003; Hoste et al., 
2009; Junwei et al., 2013; Martínez-Ortíz-De-Montellano et al., 2013; Marie-
Magdeleine et al., 2014; Andre et al., 2016; Kumarasingha et al., 2016; Castañeda-
Ramírez et al., 2017). In the infective stage, it has been observed that these 
preparations rich in secondary metabolites interfere in motility, probably because they 
have the ability to inhibit enzymes and the unsheathing (Molan et al., 2003; Castañeda-
Ramírez et al., 2017), and they may associate to proteins on the surface of the larvae 
and promote neurophysiological effects (Molan et al., 2003; Brunet et al., 2007; Iqbal 
et al., 2007). Whereas in adult stage, it has been observed that these compounds may 
promote the degradation and/or lesion of the cuticle, interfering in the permeability of 
the same, and cause changes in the external part of the female reproductive system, 
which may interfere with the function of expelling the eggs or even in their production 
(Hoste et al., 2006; Martínez-Ortíz-De-Montellano et al., 2010; Junwei et al., 2013; 
Martínez-Ortíz-De-Montellano et al., 2013; Andre et al., 2016). 
In this study, WSMoL and cMoL promoted a greater effect of paralysis in the 
nematodes in infective stage than in the adult stage, after a period of 12 h (infective 
larvae) and 8 h (adult worm) of exposure, respectively. In one study, it was observed 
a motility inhibition of 100 % of female worms of H. contortus after 12 h of incubation 
51 
 
 
 
with a preparation obtained from the species Spigelia anthelmia, containing condensed 
tannins; wrinkling of the cuticle has been suggested as favorable to paralysis of these 
worms (Ribeiro et al., 2017). A chemical preparation obtained from the latex of 
Calotropis procera (ethyl acetate extract) promoted a 80 % inhibition of motility of 
female worms of H. contortus shortly after 6 h of incubation (Cavalcante et al., 2016). 
Whereas the substances carvacryl acetate (semisynthetic) and carvacrol, which can 
be obtained from plant oils of genera like Origanum and Thymus, inhibited the motility 
of worms in 100 % and 41.8 % after 24 h of exposure, respectively, as well as the 
wrinkling of the cuticle (Andre et al., 2016). 
The microscopic analysis performed in this study showed morphological 
changes in worms exposed to WSMoL and cMoL, mainly in the standard provision in 
the cuticle crests and vulva morphology. Chlorine channels regulated by glutamate 
(GluCl) are a family of ionic channels present in the provision of vertical strings in 
nematodes and are important targets of paralyzing anthelmintic (Portillo et al., 2003). 
Damages to these channels may contribute to the motility dysfunction, as well as 
interfere in the worm reproduction and in their development. 
Thecuticular protein load is distinct in different developmental stages of 
nematodes, and interactions have already been observed among proteins on the 
surface of adult nematodes and infective larvae with a specificity lectin to N-
acetylglucosamine (WGA - wheat germ agglutinin) (Fetterer and Rhoads, 1993; Ríos-
De Álvarez, L, Jackson, F, Greer, A, et al., 2012). WSMoL and cMoL have the ability 
to interact with soluble N-acetylglucosamine and chitin (polysaccharide which has 
wastes from this monosaccharide) (Coelho et al., 2009; Santos et al., 2009; Oliveira et 
al., 2011; Paiva et al., 2011), and can therefore interact with the nematode cuticle, 
since the same contains regions rich in glycoproteins and lipids (Fetterer and Rhoads, 
1993; Molan et al., 2003). In addition, a molecular disorder in the cuticle can trigger 
paralysis in these worms, interfering in the motor functions and physiological 
characteristics (such as mobility, habit of feeding, reproduction and escape of the 
immune system) (Fetterer and Rhoads, 1997; Molan et al., 2003; Iqbal et al., 2007; 
Martínez-Ortíz-De-Montellano et al., 2013; Andre et al., 2016), suggesting that the 
interaction of lectins with the cuticle components is distinct in different stages of 
development of the nematode analyzed. 
52 
 
 
 
In the tests, the incubation time with the substance assayed is also important, 
and after a given time of incubation of adult worms under in vitro conditions, the viability 
can decline significantly, regardless of the action of the substance tested, as a result 
of physiological conditions required by the worms (such as the obtaining of nutrients 
by the cuticle and hematophagous habit) (Fetterer and Rhoads, 1993; Geary et al., 
1993). In this study, several incubation solutions were tested (PBS, NaCl 0.9% 
solution, distilled water and LB medium), and only the LB medium allowed better 
viability of worms in the negative control, after 8 h of incubation (data not shown). 
Another important aspect is that the different motility indices (after different exposure 
times to the lectins), observed in the tests with the infective larvae, can be explained 
by possible mechanisms of resistance against the lectins tested, since the larvae used 
in the tests were resistant to the main classes of anthelmintic; these data also showed 
that the effect of WSMoL and cMoL on the motility of infective sheathed larvae was 
reversible (Rudin, 1990; Maizels et al., 1993; Kumarasingha et al., 2016). 
The activity maintained at low pH of both lectins (WSMoL at pH 4.5 and pH 4.0 
cMoL in 9.0) (Santos et al., 2005; Santos et al., 2009), is a desirable characteristic for 
in vivo tests, either to evaluate anthelmintic action on the nematodes present in the 
rumen (usually a neutral pH) or in the abomasum (acid pH). In addition, WSMoL and 
cMoL showed no toxic effects evident in toxicity in vitro tests, as well as lack of in vivo 
toxicity of preparations with the seeds of M. oleifera, crediting the possibility of carrying 
out in vivo analyzes in experimental models involving their study before the species H. 
contortus (Rolim et al., 2011; Araújo et al., 2013; Luz et al., 2017). 
 
 
 
 
 
 
 
 
53 
 
 
 
Figure 2.1. Effect of WSMoL (Water Soluble Moringa oleifera Lectin) on the motility index (in 
percentage) of Haemonchus contortus larvae at stage L3 after 2, 4, 6, 8, 12, 24 and 36 h of exposure 
with concentrations from 3.9 to 500 μg mL-1 (* pthe assessment of natural products with 
nematicidal effect proven by in vitro assays. For studies seeking natural anti-helminthic 
59 
 
 
 
compounds against gastrointestinal nematodes of ruminants, rodent species such as 
rats, hamsters and gerbils may be used for this screening before starting in vivo studies 
on ruminants. These experimental models allow the reduction in the number of 
infective larvae, biochemical and immunological parameters resulting from infection, 
as well as safety in the use of the substance tested in vivo (Jesús-Gabino et al., 2010; 
Squires et al., 2010; Ostlind et al., 2013; Grando et al., 2016; Yang et al., 2017). In this 
study, the previously revealed in vitro nematicide activity of WSMoL was assessed in 
vivo, using Wistar rats infected with H. contortus as an experimental rodent model. 
 
3.2. MATERIAL AND METHODS 
3.2.1. Purification of WSMoL 
 
A plant exsiccata has already been deposited in the Dárdano de Andrade Lima 
herbarium of the Pernambuco Agronomic Institute (IPA), located in Recife, Brazil (No. 
73,345); the sampling was authorized by the Chico Mendes Institute for Biodiversity 
Conservation (ICMBio) (number 36301-2) and National System for the Management 
of Genetic Heritage and Associated Traditional Knowledge (SisGen) (Nº. A6FC322). 
WSMoL was isolated according to Coelho et al. (2009). Seeds (10 g) of M. 
oleifera were crushed and the powder obtained was homogenized in distilled water 
(100 mL) for 16 h at 4 °C; then the material was filtered in gauze and centrifuged (3000 
g for 15 min at 4 °C). The supernatant obtained was subjected to a protein fractionation 
using ammonium sulphate at 60 % saturation (for 4 h at 28 °C); the material 
was centrifuged, and the precipitate obtained was solubilized in 0.15 M NaCl 
and subjected to a thorough dialysis (in semipermeable cellulose membrane with 3.5 
kDa pores) against 0.15 M NaCl (for 6 h at 4 °C). The dialyzed protein fraction was 
chromatographed on chitin (18 x 1.5 cm); the column was equilibrated with 0.15 M 
NaCl, the adsorbed material was eluted with 1.0 M acetic acid and the protein pool 
obtained was dialyzed against 0.15 M NaCl (for 6 h at 4 °C). SDS-PAGE analysis 
confirmed WSMoL purification. 
 
3.2.2. Approval of the study by the Ethics Committee 
 
60 
 
 
 
The study was approved by the Ethics Committee on Animal Use (CEUA) of the 
State University of Rio Grande do Norte - UERN (number 009/2016) and the Rural 
Federal University of Semi-Árido - UFERSA (number 23091.009318/2016-40), in 
accordance with Federal Law Nº. 11794/2009 and National System for the 
Management of Genetic Heritage and Associated Traditional Knowledge (SisGen) (Nº. 
AB92790). 
 
3.2.3. In vivo experiment 
3.2.3.1. Haemonchus contortus 
 
The isolate of H. contortus used in the tests was ceded by EMBRAPA (Empresa 
Brasileira de Pesquisa Agropecuária) and stored at 10 °C until its use. 
 
3.2.3.2. Infection of Animals and Treatments 
 
The assay was performed as described by Ostlid et al. (2013) and Grando et 
al. (2016), with modifications. Twenty-five Wistar rats (Rattus norvegicus albinus) of 
both genders (weight range: 31-58 g) were obtained from the bioterium of the State 
University of Rio Grande do Norte - UERN. During the assay, the animals were 
maintained under controlled conditions of temperature (22±2 °C), humidity and 
photoperiod (12 h light/dark), with free access to water and food ad libitum. All 
animals were immunosuppressed with administration of dexamethasone (100 
µL, intramuscular) for five consecutive days (Jesús-Gabino et al., 2010). On the third 
day of immunosuppression, twenty animals were infected orally by gavage with 
approximately 1800 infective H. contortus larvae with sheath. 
The animals were divided into five groups (5 animals per group), which were 
subjected to treatments on the fifth, seventh and ninth day after infection (orally by 
gavage): infected negative control (administration of 0.1 mL of distilled water); infected 
(administration of 5 mg/Kg WSMoL); infected (administration of 2.5 mg/kg WSMoL); 
infected (administration of 1 mg/kg WSMoL); a non-infected negative control 
(administration of 0.1 mL of distilled water). Throughout the experiment, animals were 
observed for evidence of behavioral changes (such as irritation, anxiety, sedation, 
response to touch, contortions, tremors, convulsions, drowsiness, defecation and 
61 
 
 
 
diarrhea) and the progression of body weight was also observed. On the 10th day after 
infection, all animals (infected and non-infected group) were euthanized (through 
exsanguination with anesthesia, according to the code of ethics of the use of animals 
for research) and necropsied for the recovery of H. contortus larvae, collection of blood, 
feces, and organs. 
 
3.2.3.3. Recovery of Parasites and Analysis of the Anti-helminthic Effect of WSMoL 
 
The parasite recovery and count was performed throughout the digestive 
system of animals; the stomach and intestines were sectioned and washed with 4 % 
formaldehyde and the fluid collected was observed in an inverted optical microscope 
(40x objective), counting the total number of larvae in each experimental group. 
To assess the anthelmintic action of WSMoL, the reduction in the number 
of larvae was calculated by the formula (Jesús-Gabino et al., 2010): 
𝑅𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑖𝑜𝑛 (%) = (
(average number of larvae recovered in infected control group 
− average number of larvae recovered in infected group treated with WSMoL)/
average number of larvae recovered in infected control group
) 𝑥100 
 
3.2.4. Histological Analysis 
 
The histological analysis of organs harvested from all animals (stomach, 
intestines, spleen, kidney and liver) was performed by immersion in paraffin (organs 
were dehydrated in alcohol 80 % for 1 h, 90 % for 1 h, 95 % for 1 h, 100 % for 2 h, 
diaphanized in xylol (two passages of 2 h), and embedded in histological paraffin (two 
passes for 2 h in an oven at 60 °C), the blocks were sectioned into 4.0 µm thick sections 
with a Olympus microtome, model 4055 II, and stained with hematoxylin and eosin), 
and the histological sections analyzed in an optical microscope and images 
edited using AxioVision Program (ZEISS). 
 
3.2.5. Biochemical and hematological analyses 
 
Blood was collected by the portal vein and stored in EDTA-containing tubes with 
or without anticoagulant. The levels of serum glutamic oxaloacetic 
transaminase (SGOT), serum glutamic pyruvic transaminase (SGPT), total protein, 
albumin, globulin, alkaline phosphatase, and creatinine and urea were measured 
62 
 
 
 
through a Biosystems/LabMax 240 (Analisys Laboratório®) apparatus. RBC and 
hematocrit, leukocytes, platelets, mean corpuscular volume (MCV), hemoglobin, mean 
corpuscular hemoglobin (MCH) and mean corpuscular hemoglobin levels (MCHC) 
were measured through a Sysmex XS-800i apparatus (Analisys Laboratory®). 
 
3.2.6. Hemagglutinating Activity Test 
 
The hemagglutinating activity assay was performed with the extract obtained 
from fecal samples and with the serum of animals in each experimental group. The 
feces were homogenized in distilled water (1 g: 10 mL) for 16 h at 4 °C. Subsequently, 
the mixture was centrifuged (3000 g for 15 min at 4 °C) and the supernatant obtained 
was called feces extract. The hemagglutinating activity was assessed using microtiter 
plates. Aliquots (50 µL) of the feces extract of the serum were diluted serially in 0.15 
M NaCl; then, an aliquot of 50 µL of a suspension (2.5 % v/v) of rabbit erythrocytes 
fixed with glutaraldehyde was added to each dilution. The hemagglutinating activity 
(AH) titer was determined as the reciprocal of the highest dilution of the sample that 
promoted agglutination of erythrocytes. 
 
3.2.7. Statistical analysis 
 
Statistical analyses were performed using the means obtained from each groupin the assays. Analysis ANOVA followed by the Tukey test or Bonferroni test were used 
to verify differences between groups, considered significant when p 0.05; Figure 3.2 A and B). The infected group treated with 5 
mg/kg WSMoL had a significant increase in SGPT compared to the non-infected 
control group (p0.05; Figure 3.2 D and G). The levels of alkaline 
phosphatase and urea were not significantly changed in the infected control group 
64 
 
 
 
compared to the non-infected control group; however, there was an increase in the 
level of alkaline phosphatase in the infected group treated with WSMoL 2.5 mg/kg, 
compared to the non-infected control group (p0.05). The infected control group presented a 
significant decrease in red blood cells and in the hematocrit (pof WSMoL administered or the number of doses, because there was no 
significant change in this parameter in the groups of infected animals and treated with 
WSMoL in the other doses. Olayemi et al. (2016) observed that a dose of 1000 
mg/kg (oral) of a methanolic extract of M. oleifera seeds promoted anemia in rats, 
decreasing levels of hemoglobin, and considered the doses administered as 
being an important factor in this aspect. In another study, it was observed that M. 
oleifera seed extract and the lectin WSMoL did not promote hemolysis in a hemolytic 
assay, indicating that there was no damage to the red cell plasma membrane (Araújo 
et al., 2013). 
The infected animals, whether treated or not with WSMoL, showed a significant 
increase in the levels of globulin. In infected animals, the levels of globulin may be 
high, mainly due to the humoral immune response (Bordoloi et al., 2012; Santos, M. 
C. et al., 2014). In this study, there was no significant difference in the levels of 
lymphocytes and eosinophils between groups, indicating a possible lack of evidence 
of a systemic immune response after 10 days of infection. Furthermore, 
immunosuppression with dexamethasone may have hampered the immunologic 
responses. This is supported by (Yang et al., 2017), who did not observe significant 
changes in these parameters after 18 days of infection. 
The histological analyses revealed eosinophils and mast cells in the intestine 
and goblet cell hyperplasia in the infected control group, while in the infected group 
treated with WSMoL 2.5 mg/kg a moderate presence of eosinophils in the intestine 
was observed. Ríos-de Álvarez et al. (2012) observed an increase of eosinophils and 
mucin in intestines of small ruminants treated with the lectin phytohemagglutinin - PHA, 
considered an immunomodulatory effect. An increase in the production of mucus was 
evident in animals infected with gastrointestinal nematodes (Hoste, 2001; Ríos-De 
Álvarez, L. et al., 2012; Simpson et al., 2016). It was observed an immunomodulatory 
effect of WSMoL in human peripheral blood mononuclear cell assays, with activation 
of CD8 + T lymphocytes and production of cytokines such as TNF- α, IL-2, IL-6 and IL-
10 (Coriolano et al., 2018). These results support the data observed in this in vivo 
study, suggesting a possible immunomodulatory effect of WSMoL. 
67 
 
 
 
The absence of hemagglutinating activity in the extract of feces and in the serum 
of animals treated with WSMoL may be an indication that the lectin was degraded or 
was bound to a host tissue or nematode, contributing to the lack of toxicity of the 
lectin (Nciri and Cho, 2018) and corroborating the data of (Medeiros et al., 2018), who 
reported a high affinity of WSMoL towards the body content of the nematode. Studies 
have shown no toxicity of WSMoL and the extract obtained from M. oleifera seeds, and 
an anti-inflammatory activity of WSMoL (Ajibade et al., 2013; Araújo et al., 2013; 
Olayemi et al., 2016; Kim et al., 2018). 
 Despite this information, the 5 mg/kg dose of WSMoL administered in rodents 
experimentally infected with H. contortus, although reducing the number of recovered 
larvae by 74.7 %, may not be ideal given the biochemical, hematological and 
histological parameters analyzed. The administered WSMoL doses of 2.5 and 1 mg/kg 
were satisfactory in their ability to reduce the number of recovered larvae, while not 
promoting imbalance in the biochemical, hematological and histological parameters 
assessed. In summary, in vivo studies with WSMoL may help to identify the nematicidal 
effects of plant lectins, increasing the possibilities of anthelmintic compounds. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
68 
 
 
 
Table 3.1. Mean recovered larvae and percentage reduction in the number of larvae collected from 
Wistar rats experimentally infected with Haemonchus contortus infective larvae and treated with WSMoL 
(5, 2.5 and 1 mg/kg). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
WSMoL: Water Soluble Moringa oleifera Lectin. 
 
 
 
 
Table 3.2. Initial and final mean body weight of untreated infected animals, uninfected animals (negative 
control), and infected animals treated with 5, 2.5 or 1 mg/kg lectin WSMoL. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
WSMoL: Water Soluble Moringa oleifera Lectin. Data were presented as means ± standard deviation. 
ANOVA and Bonferroni's test (* pSignificant differences were revealed by Tukey post-test ANOVA (* palkaline 
phosphatase, creatinine and urea were measured using Advia 1800 automation. 
Hemocytes and hematocrit, leukocytes, platelets, mean corpuscular volume (MCV), 
hemoglobin, mean corpuscular hemoglobin (MCH) and mean corpuscular hemoglobin 
concentration (MCHC) were measured using ABX - Pentra 80 automation. 
 
4.2.5. Histological Analysis 
 
The processing for histological analysis of the organs collected from all animals 
(stomach, intestine, spleen, kidney and liver) was performed by the paraffin-immersion 
method (organs were dehydrated in 80 % alcohol for 1 h, 90 % for 1 h, 95 % for 1 h), 
100 % for 2 h, diaphonized in xylol in two baths of 2 h and impregnated with histological 
paraffin in two baths of 2 h in an oven at 60 °C), the blocks were sectioned using an 
Olympus model CUT 4055 II microtome in sections of 4.0 µm thickness; the histological 
77 
 
 
 
sections were stained with hematoxylin and eosin and then analyzed under an optical 
microscope and captured by the AxioVision (ZEISS) program. 
 
4.2.6. Hemagglutinating Activity Test 
 
The hemagglutinating activity (HA) assay was performed with the extract 
obtained from the feces and with the serum of the animals of each experimental group. 
The feces were homogenized in 0.15 M (1 g:10 mL) NaCl solution for 6 h at room 
temperature. Subsequently, the mixture was centrifuged (at 3000 g for 15 min at 4 °C) 
and the supernatant obtained was called stool extract. HA was evaluated using 
microtiter plates. Aliquots of 50 µL of fecal extract and animal serum were serially 
diluted in 0.15 M NaCl; then an aliquot of 50 µL of a suspension (2.5 %, v/v) of 
glutaraldehyde-treated rabbit erythrocytes was added to each dilution. The titer of HA 
was determined as the reciprocal of the highest dilution of the sample promoting red 
cell aggregation. 
 
4.2.7. Statistical Analyses 
 
Statistical analyses were performed using the means obtained from each 
experimental group. ANOVA analysis of variance followed by the Tukey test or 
Bonferroni test were used to verify the difference between the groups, being 
considered significant difference when p0.05; Figure 4.2 F and G). 
The groups infected and treated with 2.5 or 1 mg/kg cMoL significantly 
decreased the level of urea compared to the infected control group (p0.05). The infected control group showed a significant 
decrease in red blood cells (p0.05) (Table 4.3). 
No hemagglutinating activity was detected in the feces extracts and animal 
serum. 
 
4.4. DISCUSSION 
 
The anthelmintic activity of several natural products extracted from plants has 
already been reported (Garcia-Bustos et al., 2019; Oliveira Santos et al., 2019). 
However, few studies have observed the nematicidal effect in vivo of totally isolated 
substances. Medeiros et al. (2018) observed a nematicidal effect on eggs and larvae 
of a water soluble lectin obtained from Moringa oleifera seeds (called WSMoL), which 
interfered with larval development (250 μg mL-1; 55.8 % of undeveloped larvae) and 
hatching of nematode eggs (250 μg mL-1; 40.4 % of undeveloped eggs). Ríos-de 
Álvarez et al. (2012) found that 2.3 mg/kg PHA lectin (phytohemagglutinin), isolated 
from Phaseolus vulgaris, significantly interfered with the immune system (considered 
immunostimulant) of animals infected with Teladorsagia circumcincta and 
Trichostrongylus colubriformis. Meanwhile, 250 mg/kg carvacryl acetate (a substance 
obtained via acetylation of carvacrol, a phenolic monoterpene found in the essential oil 
of plants of the genera Origanum and Thymus) reduced by 65.9 % the number of 
nematode eggs in sheep naturally infected with Haemonchus spp. (90 %), 
Trichostrongylus spp. (7 %) and Oesophagostum spp. (3 %) (Andre et al., 2016). 
Similarly, thymol and thymolyl acetate (a substance obtained from thymol acetylation) 
reduced the number of eggs recovered from infected animals by 59.8 % (250 mg/kg) 
and 76.2 % (250 mg/kg), respectively (André et al., 2017). 
80 
 
 
 
In this study, 5 mg/kg cMoL reduced the number of larvae recovered from Wistar 
rats infected with a pool of nematodes containing Haemonchus contortus (68 %), 
Trichostrongylus sp. (27 %), Oesophagostomum sp. (3 %) and Strongyloides sp. (2 %) 
by 59.6 % and there was no evidence of toxicity according to the biochemical and 
histological parameters analyzed. The percentages of parasites identified by genus in 
the nematode pool obtained (by coproculture) to perform this in vivo test showed 
Haemonchus to be the most prevalent in natural infections, and this fact is corroborated 
by other studies (Arosemena et al., 1999; André et al., 2017). 
A significant increase in SGOT was observed in all infected animals, whether 
treated or not with 5, 2.5 or 1 mg/kg cMoL, while SGPT levels decreased significantly. 
Altered biochemical parameters, such as SGOTand SGPT, are evident in animals 
infected with gastrointestinal nematodes, and may indicate liver damage (Bordoloi et 
al., 2012). However, histological analyses of liver tissue showed no evidence of any 
toxic effect of the lectin on the organ that might have caused any injury to it. 
All infected animals analyzed in this study, treated or not with cMoL, showed a 
decrease in hemoglobin and hematocrit levels, being evidence of anemia. Anemia is a 
common feature associated with nematode infections, especially with Haemonchus 
contortus, and there may be a decrease in RBC, hematocrit, and hemoglobin levels 
(Bordoloi et al., 2012). This condition is due to the hematophagous habit of this parasite 
(Hoberg et al., 2004; Hoste et al., 2016). 
In this study, all infected animals, treated or not with lectin, showed an increase 
in the levels of total protein, globulin and albumin. Infected animals can present an 
increase in globulin, which is related to the amount of circulating protein and the 
immune response (Bordoloi et al., 2012; Santos, M. C. et al., 2014). Despite this 
increase, there was no evidence of lectinic activity in the serum of the animals, being 
indicative of an absence of toxicity (Nciri and Cho, 2018). An increase in leukocyte 
levels was found in animals infected and treated with cMoL, and may characterize an 
immunostimulant action. Moreover, the spleen of all animals treated with lectin 
presented white pulp hyperplasia, indicating an immunological stimulus. In a study of 
infected small ruminants treated with PHA lectin, an immunostimulant effect was also 
observed (Ríos-De Álvarez, L. et al., 2012). To date, there have been no studies on 
the immunomodulatory effect of cMoL in vivo, but a previous study found an 
81 
 
 
 
immunomodulatory effect of WSMoL, another lectin also isolated from M. oleifera 
seeds (Coriolano et al., 2018). 
In summary, cMoL reduced the number of larvae recovered from experimentally 
infected small rodents by up to 59.6 %. In addition, hematological and histological 
evidence suggests a possible immunostimulant effect in all animals infected and 
treated with lectin. These data increase the range of applications of cMoL, mainly 
aimed at the alternative control of gastrointestinal nematodes of small ruminants. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
82 
 
 
 
Table 4.1. Mean recovered larvae and percentage reduction in the number of larvae recovered from 
Wistar rats experimentally infected with a pool of Haemonchus contortus, Trichostrongylus sp., 
Oesophagostomum sp. and Strongyloides sp. infective larvae, either untreated or treated with cMoL (5, 
2.5 or 1 mg/kg). A group of uninfected animals (negative control) was also evaluated. 
 
 
 
 
 
 
 
 
cMoL: coagulant Moringa oleifera Lectin. 
 
 
 
Table 4.2. Initial and final mean body weight of Wistar rats experimentally infected with a pool of 
Haemonchus contortus, Trichostrongylus sp., Oesophagostomum sp. and Strongyloides sp. infective 
larvae, either untreated or treated with cMoL (5, 2.5 or 1 mg/kg). A group of uninfected animals (negative 
control) was also evaluated. 
 
cMoL: coagulant Moringa oleifera Lectin. Data were presented as mean ± standard deviation. Significant 
differences were revealed by ANOVA and Bonferroni's test (* pum indicativo de 
ação imunoestimulante de cMoL em roedores infectados experimentalmente com 
nematoides de pequenos ruminantes. 
Palavras-chave: Haemonchus contortus. Lectina. Moringa. Nematoide. Índice de 
Motilidade. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
 
 
ABSTRACT 
 
Haemonchus contortus is a hematophagous parasite that causes damage to the 
production of ruminant animals worldwide. Combined with the problem of resistance to 
anthelmintics, the search for new bioproducts and their biological effects contribute to 
the discovery of alternative nematicidal products. This study evaluated the nematicidal 
action of the lectins WSMoL – Water Soluble of Moringa oleifera Lectin and cMoL - 
coagulant of Moringa oleifera Lectin, in in vitro and in vivo tests. In in vitro assays, 
WSMoL and cMoL (500 μg mL-1) significantly interfered (p0.05) and 26.6 % (pexpostos as 
lectinas; 
Nos ensaios in vivo, realizados em modelo experimental utilizando de ratos 
Wistar infectados experimentalmente com Haemonchus contortus, as concentrações 
de 5 mg/kg, 2,5 mg/kg e 1 mg/kg de WSMoL foram capazes de reduzir em 74,7, 72,8 
e 66 %, respectivamente, o número de larvas recuperadas. Além disso, os parâmetros 
bioquímicos, hematológicos e histológicos analisados indicaram ausência de riscos 
na administração da lectina; 
cMoL reduziu o número de larvas recuperadas de ratos Wistar infectados 
experimentalmente (com um pool de nematoides contendo os gêneros Haemonchus, 
Trichostrongylus, Oesophagostomum e Strongyloides) em 59,6 %. Além disso, 
análises histológicas e parâmetros hematológicos evidenciaram um indicativo de 
efeito imunoestimulante nos animais infectados e tratados com cMoL; 
Esses dados contribuíram com a triagem de aplicações biológicas das lectinas 
WSMoL e cMoL isoladas de sementes de Moringa oleifera, principalmente voltadas 
as pesquisas de substâncias promissoras quanto a utilização como controle 
alternativo de nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes. 
 
88 
 
 
 
___________________________________________________________________ 
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	38b7be5154ea501a359d9f7dc0376c83340a217da4a5192f1012c6fd18cb1601.pdf
	Ficha Catalográfica
	8ec0112ef994c3e030090137c16133395d27fd52372673a19c3b005a5d4d84ea.pdfbiológicas .................................................................................................. 
 
26 
1.5 Principais classes de anti-helmínticos utilizados no tratamento de 
infecções por nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes, 
mecanismo de ação e proposta de mecanismos de resistência .............. 
 
 
33 
3.1 Mean recovered larvae and percentage reduction in the number of 
larvae collected from Wistar rats experimentally infected with 
Haemonchus contortus infective larvae and treated with WSMoL (5, 2.5 
and 1 mg/kg) ............................................................................................. 
 
 
 
68 
3.2 Initial and final mean body weight of untreated infected animals, 
uninfected animals (negative control), and infected animals treated with 
5, 2.5 or 1 mg/kg lectin WSMoL ................................................................ 
 
 
69 
3.3 Measured hematological parameters of Wistar rats experimentally 
infected with Haemonchus contortus infective larvae and treated with 
WSMoL (5, 2.5 and 1 mg/kg) ………………………………………………... 
 
 
81 
4.1 Mean recovered larvae and percentage reduction in the number of 
larvae recovered from Wistar rats experimentally infected with a pool of 
Haemonchus contortus, Trichostrongylus sp., Oesophagostomum sp. 
and Strongyloides sp. infective larvae, either untreated or treated with 
cMoL (5, 2.5 or 1 mg/kg). A group of uninfected animals (negative control) 
was also evaluated …………………………………………………………… 
 
 
 
 
 
82 
4.2 Initial and final mean body weight of Wistar rats experimentally 
infected with a pool of Haemonchus contortus, Trichostrongylus sp., 
Oesophagostomum sp. and Strongyloides sp. infective larvae, either 
 
 
 
12 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
untreated or treated with cMoL (5, 2.5 or 1 mg/kg). A group of uninfected 
animals (negative control) was also evaluated ……………………………. 
 
82 
4.3 Measured hematological parameters of Wistar rats experimentally 
infected with a pool of Haemonchus contortus, Trichostrongylus sp., 
Oesophagostomum sp. and Strongyloides sp. infective larvae, either 
untreated or treated with cMoL (2.5 or 1 mg/kg). Uninfected and infected 
groups were used as comparative controls ………………………………... 
 
 
 
 
83 
13 
 
 
 
SUMÁRIO 
 
 
CAPÍTULO 1 
REVISÃO DE LITERATURA 
 
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................ 16 
1.1. LECTINAS: UMA VISÃO BIOLÓGICA ................................................. 17 
1.1.1. 1.1.1. Aplicações Biotecnológicas .......................................................... 20 
1.2. Moringa oleifera: ASPECTOS GERAIS ............................................... 22 
1.2.1. Composição Química ..................................................................... 23 
1.2.2. Propriedades Biológicas ................................................................ 23 
1.3. AS LECTINAS WSMoL E cMoL .......................................................... 25 
1.4. Haemonchus contortus: BIOLOGIA DO NEMATÓIDE ........................ 27 
1.4.1. Aspectos Genéticos e Moleculares ............................................... 30 
1.5. ANTI-HELMÍNTICOS E MECANISMOS DE RESISTÊNCIA................ 32 
1.6. SCREENIG DE BIOPRODUTOS NEMATICIDAS ............................... 35 
1.6.1. Lectinas com Efeito Nematicida .................................................... 37 
1.7. OBJETIVOS DA PESQUISA ............................................................... 41 
1.7.1. Objetivo Geral ................................................................................. 41 
1.7.2. Objetivos Específicos ..................................................................... 41 
CAPÍTULO 2 
IN VITRO EFFECTS OF Moringa oleifera SEED LECTINS ON 
Haemonchus contortus IN LARVAL AND ADULT STAGES 
 
2.1. INTRODUCTION ................................................................................. 42 
2.2. MATERIAL AND METHODS ............................................................... 43 
2.2.1. Purification of lectins ..................................................................... 43 
2.2.2. Declaration of Ethics ...................................................................... 44 
2.2.3. Isolate and storage of Haemonchus contortus ............................ 44 
2.2.4. Unsheathing of L3 larvae of H. contortus ..................................... 44 
2.2.5. Index of L3 larvae motility and xL3 of H. contortus after 
incubation with the lectins ....................................................................... 
 
45 
2.2.6. Isolation of adult worms of H. contortus and motility index after 
incubation with the lectins ....................................................................... 
 
45 
14 
 
 
 
2.2.7. Zymogram of proteases ................................................................. 46 
2.2.8. Electronic microscopy of adult worms of H. contortus after 
incubation with the lectins ....................................................................... 
 
46 
2.2.9. Statistical analysis .......................................................................... 47 
2.3. RESULTS ............................................................................................ 47 
2.3.1. Index of L3 larvae motility and xL3 of H. contortus after 
incubation with the lectins ....................................................................... 
 
47 
2.3.2. Motility index of adult worms of H. contortus after incubation 
with the lectins .......................................................................................... 
 
48 
2.3.3. Zimogram ......................................................................................... 48 
2.3.4. Analysis by scanning electron microscopy ................................. 48 
2.4. DISCUSSION ....................................................................................... 49 
CAPÍTULO 3 
ANTHELMINTIC EFFECT OF A WATER-SOLUBLE Moringa oleifera 
LECTIN IN RODENTS EXPERIMENTALLY INFECTED WITH 
Haemonchus contortus 
 
3.1. INTRODUCTION ................................................................................. 58 
3.2. MATERIAL E METHODS ..................................................................... 59 
3.2.1. Purification of WSMoL .................................................................... 59 
3.2.2. Approval of the study by the Ethics Committee …………………. 59 
3.2.3. In vivo experiment .......................................................................... 60 
3.2.3.1. Haemonchus contortus .................................................................. 60 
3.2.3.2. Infection of Animals and Treatments ……………………………...... 60 
3.2.3.3. Recovery of Parasites and Analysis of the Anti-helminthic Effect of 
WSMoL …………………………………………………………………............. 
 
61 
3.2.4. Histological Analysis ...................................................................... 61 
3.2.5. Biochemical and hematological analyses ……………………….... 61 
3.2.6. Hemagglutinating Activity Test ……………………………………... 62 
3.2.7. Statistical analysis …………………………………………………….. 62 
3.3. RESULTS ............................................................................................ 62 
3.3.1. Recovery of Parasites and Assessment of the Anti-helminthic 
Effect of WSMoL ....................................................................................... 
 
62 
3.3.2. Histological Analysis ...................................................................... 63 
15 
 
 
 
3.3.3. Biochemical, Hematological and Hemagglutinating Activity 
Analysis ..................................................................................................... 
 
63 
3.4. DISCUSSION .......................................................................................64 
CAPÍTULO 4 
ANTHELMINTIC EFFECT OF A COAGULANT Moringa oleifera LECTIN 
(cMoL) IN EXPERIMENTALLY INFECTED RODENTS 
 
4.1. INTRODUCTION ................................................................................. 73 
4.2. MATERIAL AND METHODS ............................................................... 74 
4.2.1. Purification of cMoL ....................................................................... 74 
4.2.2. Ethics Committee ............................................................................ 74 
4.2.3. In vivo assays .................................................................................. 75 
4.2.3.1. Pool of Infective Nematode Larvae …………………………………. 75 
4.2.3.2. Experimental Infection of Animals and Treatment ………………… 75 
4.2.3.3. Recovery of Parasites and Analysis of the Nematicidal Effect of 
cMoL ……………………………………………………………………………... 
 
76 
4.2.4. Biochemical and Hematological Analyses ………………............. 76 
4.2.5. Histological Analysis ..........………………………………………….. 76 
4.2.6. Hemagglutinating Activity Test ……………………………………... 77 
4.2.7. Statistical Analyses …………………………………………………… 77 
4.3. RESULTS ............................................................................................ 77 
4.3.1. Parasite Recovery and Nematicidal Effect Analysis of cMoL …. 77 
4.3.2. Histological Analysis ……………………………………….…………. 78 
4.3.3. Biochemical, Hematological and Hemagglutinating Activity 
Analyses ………………………………………………………………………... 
 
78 
4.4. DISCUSSION ....................................................................................... 79 
CONCLUSÕES ........................................................................................... 87 
REFERÊNCIAS .......................................................................................... 88 
 
 
 
 
 
 
16 
 
 
 
CAPÍTULO 1 
___________________________________________________________________ 
 
REVISÃO DE LITERATURA 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
A problemática do parasitismo gastrintestinal em pequenos ruminantes é a 
maior causa de danos à saúde animal no mundo, principalmente quando se trata de 
regiões tropicais e subtropicais, sendo a economia drasticamente afetada (Vieira, 
2005; Hoste et al., 2012). O nematoide da espécie Haemonchus contortus é 
considerado o de maior patogenicidade e de infectabilidade, principalmente por 
apresentar hábito hematófago, causando edema, anemia, emagrecimento e até morte 
(Sotomaior et al., 2009). Além disso, o uso indiscriminado e a falta efetiva da correta 
administração (boas práticas operacionais) dos anti-helmínticos sintéticos se somam 
ao aumento de nematoides resistentes. Os anti-helmínticos sintéticos também 
apresentam um grau residual, para o animal e para o ambiente, preocupante frente à 
comunidade científica e popular (Hoste et al., 2012). 
Atrelado à problemática das parasitoses em pequenos ruminantes, o fator de 
resistência aos químicos sintéticos (além do seu grau residual) instiga a busca por 
controles alternativos ao uso de anti-helmínticos sintéticos. Atualmente, pesquisas 
voltadas ao uso de biomoléculas do tipo lectinas para tal fim vêm sendo desenvolvidas 
e ampliadas (Ríos-De Álvarez, L. et al., 2012; Heim et al., 2015; Batista et al., 2018; 
Medeiros et al., 2018). 
Lectinas são proteínas de origem não imune com atividade hemaglutinante e 
com sítios não catalíticos capazes de se ligarem reversivelmente a componentes de 
células, como carboidratos e também a glicoproteínas (Peumans and Van Damme, 
1995; Sharon, 2007); apresentam diversas aplicações biológicas, como atividade 
anticâncer (Monte et al., 2014), anti-inflamatória (Araújo et al., 2013), leishmanicida 
(Afonso-Cardoso et al., 2011), antimicrobiana (Moura et al., 2015), antiparasitária 
(Ríos-De Álvarez, L. et al., 2012) e inseticida (Oliveira et al., 2011). 
Estudos de Ríos-de Álvarez et al. (2012), Heim et al. (2015), Medeiros et al. 
(2018) e Batista et al. (2018), evidenciaram o potencial anti-helmíntico de lectinas, 
isoladas de vegetais e de fungos, sobre nematoides gastrintestinais (NGI) de 
17 
 
 
 
pequenos ruminantes. As lectinas promoveram efeitos interferentes na fase de 
desenvolvimento embrionário do ovo e estágios de desenvolvimento larval. 
A espécie Moringa oleifera Lamarck 1785 é um arbusto conhecido 
popularmente como moringa (Kuet, 2017), o qual apresenta em suas sementes 
proteínas do tipo lectinas (como a cMoL, WSMoL e MoL). Entre suas lectinas, 
destacam-se a WSMoL (water soluble Moringa oleifera lectin), com peso molecular 
em torno de 60 kDa, e a cMoL (coagulant Moringa oleifera lectin), uma lectina catiônica 
de 30 kDa. Estas lectinas já apresentaram efeitos diversos como coagulante, 
bactericida, inseticida e nematicida (Coelho et al., 2009; Santos et al., 2009; Ferreira 
et al., 2011; Santos et al., 2012; Luz et al., 2013; Santos, N. D. et al., 2014; Moura et 
al., 2016; Medeiros et al., 2018). 
Metodologias in vitro e in vivo estão atreladas à identificação de novos 
princípios ativos, bem como a ferramentas de biologia molecular, auxiliando na 
interpretação dos efeitos sistemáticos de moléculas sobre a eclodibilidade, a 
alimentação, a motilidade e o desenvolvimento larval de NGI (Chagas et al., 2011; 
Geary, 2016). Dessa forma, esta proposta de trabalho, baseada na utilização de 
biomoléculas como lectinas, buscou contribuir com as necessidades de 
desenvolvimento de estratégias de controle dos NGI da espécie Haemonchus 
contortus. 
 
1.1. LECTINAS: UMA VISÃO BIOLÓGICA 
 
O termo lectina foi utilizado inicialmente em 1954, por Boyd e Shapleigh, por 
terem verificado a capacidade das mesmas em diferenciar células sanguíneas do 
sistema ABO (Boyd and Shapleigh, 1954). Essa capacidade permite a dectecção de 
lectinas em ensaios de hemaglutinação com eritrócitos humanos ou de outras 
espécies, sendo de fácil aplicabilidade à triagem dessas biomoléculas (Figura 1.1). 
 
 
18 
 
 
 
Figura 1.1. Detecção da presença de lectina pelo ensaio de hemaglutinação com eritrócitos humanos 
ou de outras espécies. 
 
 
Circulos avermelhados representam os eritrócitos; estruturas em azul representam os carboidratos na 
superfície dos eritrócitos; estruturas em bege representam uma lectina. Fonte: Adaptado de Santos et 
al., 2014. 
 
Peumans e Van Damme (1995) e Van Damme et al. (1998) classificaram as 
lectinas em quatro grupos principais quanto à estrutura: as merolectinas; as 
hololectinas; as quimerolectinas e as superlectinas. A característica de especificidade 
das lectinas foi associada a uma região da proteína chamada de domínio de 
reconhecimento a carboidrato (DRC) ou domínio ligante; esta característica é utilizada 
para a classificação das lectinas quanto à estrutura e especificidade a carboidratos. 
As lectinas agrupadas como merolectinas apresentam um baixo peso molecular 
e não apresentam a capacidade de aglutinar eritrócitos, por conterem um único DRC. 
Como exemplo desse grupo, pode-se citar a lectina isolada do látex da seringueira, a 
heveína. A classe das hololectinas é considerada a maior classe, em relação ao 
isolamento a partir de vegetais, sendo constituída pelas lectinas que apresentam dois 
ou mais sítios de ligação a carboidratos, idênticos ou similares. Estes se ligam ao 
mesmo tipo de carboidrato ou de estruturas homólogas, sendo assim capazes de 
aglutinar células ou precipitar glicoconjugados. Exemplo desse grupo é a 
Concanavalina A, ou ConA, isolada da espécie vegetal Canavalia ensiformes (Zanetti, 
2007). As quimerolectinas são as lectinas que possuem pelo menos dois tipos de 
domínios funcionais diferentes, com atividades biológicas não similares, apresentando 
um ou dois DRC (Van Damme et al., 1998). Exemplo de quimerolectina é a ricina, 
isolada das sementes da Ricinus communis L. (Zanetti, 2007). Por fim, o grupo de 
lectinas que apresentam dois domínios de ligação estruturalmente diferentes e que 
19 
 
 
 
reconhecemcarboidratos diferentes é classificado como superlectinas (Van Damme 
et al., 1998). Como exemplo, pode-se citar a lectina da Tulipa gesneriana L., a TGL 
(Figura 1.2) (Oda et al., 1987). 
 
Figura 1.2. Classificação estrutural das lectinas em merolectina, hololectina, quimerolectina e 
superlectina. 
 
Fonte: Ilustração do Autor, 2020 e adaptada de Peumans e Van Damme, 1995 e Van Damme et 
al.,1998. 
 
As lectinas também são classificadas quanto à especificidade ao ligante, em 
ligantes de manose/glicose, manose/maltose, manose, galactose/N-
acetilgalactosamina, N-acetilglicosamina/N-acetilglicosamina, fucose e ácido siálico 
(Van Damme et al., 1998). 
As lectinas são distribuídas em todos os organismos (vegetais, animais, fungos, 
bactérias e vírus), desempenhando papel biológico diferenciado para cada espécie 
(Peumans and Van Damme, 1995). 
Em vegetais, a lectina da espécie Ricinus communis (conhecida popularmente 
como mamona), a ricina, foi a primeira a ser isolada, por Hermann Stillmark, em 1888. 
Essa lectina apresenta um peso molecular de 65 kDa, com especificidade a N-
acetilglicosamina, a galactose, a glicolipídeos e a glicoproteínas (Worbs et al., 2015). 
Acredita-se que as lectinas presentes em vegetais estão associadas a 
atividades de reserva, proteção contra patógenos microscópicos e predadores em 
geral (Peumans and Van Damme, 1995). Porém, pouco se sabe a respeito das vias 
20 
 
 
 
de efeito dessas biomoléculas em relação à funcionalidade nos organismos que as 
detêm. 
Diante desses fatos, a bioprospecção de proteínas do tipo lectinas vem se 
ampliando na comunidade científica com muitas pesquisas envolvendo diversas 
aplicações biológicas, como efeito imunomodulador (Dias-Netipanyj et al., 2016), 
inseticida (Coelho et al., 2009), anti-inflamatória (Araújo et al., 2013), antimicrobiana 
(Ferreira et al., 2011; Moura et al., 2015) e anti-helmíntica (Medeiros et al., 2018), 
contribuindo assim para o desenvolvimento da ciência, tecnologia e inovação no País. 
 
1.1.1. Aplicações Biotecnológicas 
 
As propriedades bioquímicas das lectinas têm possibilitado um grande arsenal 
de aplicações biológicas em diversas áreas de pesquisa, contribuindo com diferentes 
estudos no mundo todo. 
Peumans e Van Damme (1995) já relataram lectinas de plantas com atividade 
antiviral, reportando efeitos de inibição do processo de infecção e replicação; atividade 
antibacteriana, sendo citada uma relação entre glicoconjugados e proteínas 
específicas a carboidratos na extrutura externa de bactérias; atividade antifúngica, 
baseando-se em ligação de lectinas com carboidratos da superfície desses 
organismos, havendo alteração na estrutura e/ou permeabilidade da parede celular, 
principalmente as lectinas ligadoras de quitina; atividade inseticida, sendo efeito 
evidenciado pela ligação de lectinas no trato digestivo e a células ricas em 
glicoproteínas. 
Em um levantamento realizado em bases de dados como (PubMed - U.S. 
National Library of Medicine), entre os anos de 2008 e 2018, utilizando o termo de 
busca lectin, foi observado um total de 34.607 artigos, sendo que 2.772 eram artigos 
de revisão. Algumas das muitas revisões tratam dos efeitos biológicos diversos 
dessas biomoléculas com atividade antibacteriana, antifúngica, antiviral, anticâncer, 
inseticida e antiparasítica (Tabela 1.1). 
 
 
Tabela 1.1. Aplicações e efeitos biológicos de lectinas descritos em artigos de revisão. 
Aplicação Efeito biológico Referências 
21 
 
 
 
 
 
Antibacteriana 
 
Reconhecimento de epítopos de glicano na 
superfície das células, inibição de 
crescimento; interação com glicoproteínas, 
peptidioglicanos, lipopolissacarídeos e 
ácido teicurônico. 
 
 
(Coelho et al., 2018) 
 
Antifúngica 
 
Interações com carboidratos presentes na 
superfície das células fúngicas. Ligação à 
quitina presente na parede celular com 
desestabilidade morfológica. 
 
(Peumans and Van 
Damme, 1995) 
 
Antiviral 
 
Interações com proteínas e glicoproteínas 
do envelope viral e intereferência na 
glicosilação de proteínas do envelope viral. 
 
 
 
(Mitchell et al., 2017) 
 
Anticâncer 
 
Diagnóstico e terapêutica. Efeito citotóxico, 
antiproliferativo, apoptótico via caspases, 
inibição da angiogênese. 
 
 
 
 
(Estrada-Martínez et 
al., 2017) 
 
Inseticida 
 
Interação com diferentes glicoproteínas e 
glicanos, interferindo em processos 
fisiológicos. Resistência a atividade de 
enzimas proteolíticas digestivas; interação 
à membrana peritrófica com microfibrilas 
de quitina. 
 
 
(Macedo et al., 2015; 
Lagarda-Diaz et al., 
2017) 
 
Antiparasítica 
 
Identificação de parasitas, reconhecimento 
de moléculas de carboidratos na superfície 
celular; podendo causar interferência 
química ou de processos biológicos. 
 
 
(Iordache et al., 
2015) 
Tabela construida tomando como base informações contidas em artigos de revisão listados na coluna 
denominada Referências. 
 
 
Esses dados mostram a grande diversidade de aplicações biotecnológicas de 
lectinas isoladas de diversos organismos, validando o seu potencial de aplicabilidade 
a múltiplas áreas de pesquisa e de contribuição para a comunidade científica, como 
temática presente em milhares de publicações. 
 
22 
 
 
 
1.2. Moringa oleifera: ASPECTOS GERAIS 
 
A espécie Moringa oleifera é uma planta arbustiva originária do Sul da Ásia, 
crescida no noroeste da Índia e cultivada em diversos países (como Brasil, Argentina, 
Afeganistão, África e Paraguai). Descrita por Lamarck em 1785 e pertencente à família 
Moringaceae (a qual é formada por mais de 14 espécies), a moringa, árvore dos 
milagres, árvore da vida (como é conhecida popularmente, a depeder da região de 
cultivo), apresenta diversas utilidades apontadas pela comunidade popular, bem como 
verificadas pela comunidade científica (Yadav et al., 2013; Kansal and Kumari, 2014). 
Pertencente ao gênero Moringa, esse sendo formado por 13 espécies (M. 
oleifera, M. arborea, M. borziana, M. concanensis, M. drouhardii, M. hildebrandtii, M. 
longituba, M. ovalifolia, M. peregrine, M. rivae, M. ruspoliana, M. pygmaea e M. 
stenopetala), a M. oleifera apresenta características morfológicas expressivas, como 
altura média de 2-5 metros, folhas pequenas e esverdeadas formando ramos, flores 
de cor branco-amarelada de aproximadamente 1,5 cm de largura e 2,5 cm de 
comprimento, caule cinza esbranquiçado e sementes redondas ou triangulares, 
fechadas com uma casca fina acastanhada e protegidas por vagens longas, finas e 
amarronzadas (Figura 1.3) (Falowo et al., 2018). 
 
 
Figura 1.3. Planta Moringa oleifera e suas partes. 
A – vagem; B – sementes; C – flores; D – folhas; E – árvore completa. Fonte: Fotos do Autor, 2020. 
 
23 
 
 
 
1.2.1. Composição Química 
 
Um largo número de compostos químicos identificados nos tecidos da M. 
oleifera confirma a riqueza de possíveis aplicações, aqui com destaque para o seu 
potencial na tecnologia de alimentos. 
Nutricionalmente, M. oleifera é atribuída a uma fonte de mais de 90 compostos 
nutricionais, sendo que as proteínas comportam a maior percentagem, somada a 
diversos aminoácidos, lipídios, carboidratos, fibras, minerais (cálcio, magnésio, sódio, 
potássio, ferro, zinco, fósforo, enxofre e cobre) e vitaminas (A, complexo B, C e E). A 
tabela 1.2 mostra os principais componentes nutricionais representativos encontrados 
em alguns tecidos da M. oleifera (Brilhante et al., 2017). 
 
Tabela 1.2. Principais macronutrientes encontrados nas folhas, sementes e vagens da Moringa oleifera, 
expressos em gramas. 
Nutrientes Partes da M. oleifera 
Folhas Sementes Vagens 
Proteínas 25-30,3 29,4-38,3 6,7-43,5 
Lipídios 0,1-10,6 30,8-41,2 0,1-5,1 
Carboidratos 0,1-43,9 0,1-21,1 0,1-38,2 
Fibras 0,1-28,5 0,1-7,2 0,1-27 
Fonte: Adaptado de Brilhante et al., 2017. 
 
 
1.2.2. Propriedades Biológicas 
 
Diversos tecidos da M. oleifera jáforam avalidos quanto aos seus potenciais 
biológicos, apresentando um enorme arsenal de aplicações (Tabela 1.3). Por 
exemplo, as suas folhas e flores são utilizadas para a preparação de chás, para tratar 
problemas respiratórios; além disso, são ricas em minerais como o potássio e o cálcio 
(Price, 2007). As suas sementes são utilizadas em processos de floculação de 
material orgânico e de microrganismos em águas; essas águas, após tratamento com 
as sementes da moringa, se tornam apropriadas para o consumo humano e para a 
agricultura (Kalogo et al., 2000). De acordo com uma breve pesquisa realizada no 
banco de dados de patentes World Intellectual Property Organization, observou-se um 
24 
 
 
 
total de 130 depósitos de patentes com o termo Moringa, relatando uma gama de 
aplicações de partes da moringa em todo o mundo. Já no banco de dados do INPI 
(Instituto Nacional da Propriedade Industrial), foram encontrados 15 depósitos de 
patentes utilizando o mesmo termo. 
 
Tabela 1.3. Propriedades biológicas analisadas em diferentes tecidos da Moringa oleifera. 
Tecido da M. oleifera Atividade biológica 
 
 
 
Folhas 
Antiaterosclerotico 
Anti-inflamatório 
Anticâncer 
Antimicrobiano 
Antioxidante 
Hepatoprotetor 
Hipocolesterolemia 
Hipoglicemiante 
Hipolipidemia 
Imunomodulador 
Nefroprotetor 
Neuroprotetor 
 
 
Sementes 
 
Anti-inflamatório 
Anti-câncer 
Antimicrobiano 
Antioxidante 
Antitumoral 
Imunomodulador 
 
 
Flores 
Antimicrobiano 
Hepatoprotetor 
Nefroprotetor 
 
 
Raízes 
Anti-inflammatorio 
Antimicrobiano 
Hepatoprotetor 
Nefroprotetor 
 
 
Vagens 
Anticâncer 
Anti-inflamatorio 
Antimicrobiano 
Antioxidante 
Hipocolesterolemia 
Fonte: Adaptado de Brilhante et al., 2017. 
25 
 
 
 
 
 Muitos outros compostos já foram isolados na M. oleifera, sendo classificados 
como metabólitos secundários e somando mais de 200 compostos (como terpenos, 
hidrocarbonetos, álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos graxos e outros). Muitos desses 
isolados, foram descritos com atividades biológicas diversas, como antioxidantes, 
antimicrobianos, antivirais, antileucêmico, antianêmico, anti-inflamatório, antifúngico, 
anticâncer, antiulcerativa e antipirética (Falowo et al., 2018). Dessa forma, despertou-
se o interesse na comunidade cientifica, em se desvendar e elucidar os diversos 
efeitos biológicos dos tecidos da M. oleifera, em avaliações de caráter quantitativo e 
experimental. Dos tecidos da M. oleifera já foram isoladas algumas proteínas, como a 
lectina WSMoL (Santos et al., 2005), a lectina cMoL (Santos et al., 2009), a lectina 
MoL (Katre et al., 2008), a lectina MOSL (Asaduzzaman et al., 2018), a proteína 
Inibidor de protease (Bijina et al., 2011), a proteína MoFTI (Pontual et al., 2014) e a 
proteína Mo-CBP3 (Gifoni et al., 2012). Foi então verificada a presença de diversas 
macromoléculas, em especial, proteínas do tipo lectinas. 
 
1.3. AS LECTINAS WSMoL E cMoL 
 
WSMoL foi isolada por Santos et al. (2005), a mesma apresenta alta 
solubilidade em meio aquoso, sendo por isso nomeada como Water Soluble Moringa 
oleifera Lectin. Apresenta atividade hemaglutinante (AH) dependente de domínio de 
ligação a carboidratos e afinidade ao polissacarídeo quitina, sendo reduzida com a 
presença de frutose e da glicoproteína tiroglobulina. 
Com atividade otimizada em pH ácido (4,5), a lectina WSMoL é caracterizada 
como uma proteína ácida (pI 5.5; aniônica), com sequências peptídicas semelhantes 
a outras proteínas isoladas da M. oleifera (a MO2.1 e MO2.2, conforme depositado no 
banco de dados NCBInr - número de identificação gi|127215) (Gassenschmidt et al., 
1995; Santos et al., 2005; Coelho et al., 2009). Moura et al. (2016) mostraram que a 
WSMoL é um polipeptídio oligomérico que contém três bandas de 30, 20 e 10 kDa, 
respectivamente, apresentando assim 60 kDa de massa molecular. 
cMoL foi isolada por Santos et al. (2009), com a utilização de cromatografia de 
afinidade em coluna de guaran e com um rendimento de 59 %; apresenta atividade 
26 
 
 
 
hemaglutinante otimizada na presença de Ca2+, K+ e Mg2+, em faixa de pH de 4 a 9, é 
termoestável a 100 ºC, sendo considerada uma proteína básica (catiônica; pI 11.67), 
com uma massa molecular nativa de 30 kDa, com 101 aminoácidos e com 81 % de 
similaridade a uma proteína floculante de M. oleifera a M.O2.1. cMoL é um trímero de 
três subunidades de 11,928 Da, possuindo afinidade com a ovalbumina, azocaseína, 
asialofetuína e a galactose, considerados inibidores da sua AH. É denominada cMoL 
por apresentar atividade coagulante (coagulant Moringa oleifera Lectin) (Oliveira et al., 
2011; Paiva et al., 2011; Luz et al., 2013). 
Da WSMoL e da cMoL, atividades biológicas foram verificadas em 
experimentos diversos (como inseticida, anti-helmíntica, coagulante, bactericida) 
(Tabela 1.4), evidenciando o potencial biotecnológico dessas biomoléculas. 
 
Tabela 1.4. Lectinas isoladas da espécie Moringa oleifera e suas atividades biológicas. 
Lectina Tecido Atividade Biológica Referências 
WSMoL Sementes Inseticida 
 
 
 
 
 
 
Coagulante 
 
Bactericida 
 
 
Não tóxica em células de 
mamífero 
 
Não genotóxica in vitro 
Anti-helmíntica 
Imunomodulador 
(Coelho et al., 2009; 
Paiva et al., 2011; 
Santos et al., 2012; 
Agra-Neto et al., 2014; 
Santos, N. D. et al., 
2014; Alves et al., 
2020) 
(Ferreira et al., 2011; 
Moura et al., 2016) 
(Moura et al., 2015; 
Moura et al., 2017; 
Coriolano et al., 2019) 
(Araújo et al., 2013) 
 
 
(Rolim et al., 2011) 
(Medeiros et al., 2018) 
(Coriolano et al., 2018) 
cMoL Sementes Coagulante (Santos et al., 2009) 
27 
 
 
 
Inseticida 
 
Anticoagulante 
Potencial imunossupressor 
Propriedades anticâncer 
 
(Oliveira et al., 2011; 
Paiva et al., 2011) 
(Luz et al., 2013) 
(Araújo et al., 2013) 
(Luz et al., 2017) 
MoL Sementes ____________ (Katre et al., 2008) 
MOSL 
 
Sementes Propriedades anticâncer (Asaduzzaman et al., 
2018) 
WSMoL (Water Soluble Moringa oleifera Lectin); cMoL (coagulant Moringa oleifera Lectin); MoL 
(Moringa oleifera Lectin); MOSL (Moringa oleifera seeds lectin). 
 
É notório o arsenal de aplicações biológicas, evidenciadas experimentalmente, 
das lectinas obtidas das sementes da M. oleifera, demonstrando que é promissora 
sua avaliação quanto a outras aplicabilidades. 
 
1.4. Haemonchus contortus: BIOLOGIA DO NEMATÓIDE 
 
A ovinocaprinocultura representa um montante de milhões de reais na 
produção animal em todo o mundo. Esse número é representado principalmente, em 
termos de produção, por países tropicais e subtropicais, como o Brasil, no qual é 
estimado um total de 14 milhões de animais, sendo as regiões do Nordeste (Ceará, 
Bahia, Pernambuco e Piauí) e do Sul (Rio Grande do Sul) as de maior número. Com 
a expansão comercial desse sistema de produção no Brasil, o Ministério da 
Agricultura, por meio do Programa Nacional de Sanidade dos Caprinos e Ovinos – 
PNSCO, tem buscado a adoção de medidas sanitárias e de vigilância sanitária em 
defesa da saúde desses animais (Simplício et al., 2003; Mapa, 2017). Porém, 
problemas de parasitoses gastrintestinais continuam sendo a principal causa de danos 
à saúde dos pequenos ruminantes em todo o mundo, causando a perda de carne, leite 
e pele, os principais produtos comercializados desses animais; além de bilhões de 
dólares anuais (Vieira, 2005; Knox et al., 2012; Roeber et al., 2013). 
Diversos parasitos gastrintestinais estão presentes nas infecções dos 
pequenos ruminantes (Haemonchus contortus, Strongyloides papillosus, 
28 
 
 
 
Trichostrongylus colubriformis e Oesophagostomum colubianum), havendo destaque 
para a espécie Haemonchus contortus (Hounzangbe-Adote et al., 2005; Vieira, 2005). 
A espécie H. contortus (Rudolphi, 1803) é do filo Nematoda, da classe 
Secementea, da ordem Strongylida, da família Trichostrongylidae e do gênero 
Haemonchus, sendo considerada,pela maioria dos especialistas na área da 
parasitologia, como a de maior prevalência nas infecções (cerca de 80% do total do 
pool de parasitos presentes na infecção animal). H. contortus causa maiores danos à 
saúde animal, principalmente por apresentar hábito hematófago, provocando o 
surgimento de úlceras, hemorragia, anemia, perda de peso, infertilidade reprodutiva, 
diarreia, perda produtiva de carne e leite e, em alguns casos, a incidência de 
mortalidade também pode ser observada. Além disso, o parasito secreta proteases 
hemolíticas, que causam danos fisiológicos ao animal (Figura 1.4) (Arosemena et al., 
1999; Sendow, 2003). 
 
Figura 1.4. Patogêneses relacionadas à infecção de pequenos ruminantes com Haemonchus 
contortus. 
Fonte: Ilustração do Autor, 2020. 
 
Essa espécie é encontrada em regiões tropicais, montanhosas e frias, 
apresentando uma grande capacidade adaptativa, o que dificulta mais ainda a sua 
eliminação. Morfologicamente, H. contortus apresenta-se como um nematóide de 
corpo cilíndrico, avermelhado e de 10-30 mm de comprimento (sendo as fêmeas 
maiores que os machos). Possui uma cutícula formada por três camadas (composta 
principalmente por colágeno), havendo quatro mudanças de cutícula durante o seu 
29 
 
 
 
ciclo de vida. Essa cutícula lhe confere a resistência ao ambiente, bem como 
motilidade e capacidade de infecção (proteção contra enzimas digestivas) no 
hospedeiro (Sendow, 2003; Craig et al., 2007). 
O ciclo de vida (de 14 a 21 dias) é caracterizado por duas fases: uma fase 
parasitária e outra de vida livre. As fêmeas depositam cerca de 5,000 - 10,000 ovos 
por dia no abomaso do hospedeiro, sendo então evacuados junto com as fezes do 
animal. Os ovos medem cerca de 78 x 45 µm e eclodem em poucos dias à temperatura 
de verão (aproximadamente 27 ºC). Após a eclosão, as larvas juvenis se alimentam 
de bactérias no estrume, passando pela mudança de cutícula duas vezes até o estágio 
larval L3 (tempo de 4 a 6 dias). A larva L3 mede cerca de 0,69 mm; ela permanece na 
pastagem e, ao ser ingerida pelo ruminante, migra para o abomaso e penetra a 
camada epitelial, se desenvolvendo para o estágio larval L4. As condições ambientais 
no hospedeiro sinalizam condições ideais para os nematóides passarem para um 
próximo estágio larval; por isso, larvas L3 podem permanecer por meses alojadas no 
epitélio até receberem esses sinais de adequação de mudança de estágio para L4. As 
larvas alimentam-se no abomaso e passam por uma última muda, chegando ao 
estágio adulto e dando continuidade ao ciclo de vida (Figura 1.5) (Sendow, 2003). 
 
Figura 1.5. Representação geral do ciclo de vida do Haemonchus contortus. 
Fonte: Adaptado de Diagnosis of Veterinary Endoparasitic Infections (Dvei, 2016). 
30 
 
 
 
 
Assim, desvendar o padrão de expressão de genes envolvidos no ciclo 
biológico do parasito H. contortus pode ser útil nas aplicações/investigações 
biológicas das lectinas com atividade anti-helmíntica, considerando que há 
diferenciação de expressão gênica durante todo o ciclo do nematóide, com maior 
diversidade gênica durante as fases do ovo para o estágio larval L1 e do estágio larval 
L1 para o L3 (Laing et al., 2013; Schwarz et al., 2013). 
 
1.4.1. Aspectos Genéticos e Moleculares 
 
Estudos genéticos de nematoides estão levando ao desenvolvimento de 
conhecimentos sobre os eventos bioquímicos e moleculares intrínsecos ao seu ciclo 
biológico, à sua capacidade invasiva no hospedeiro e aos seus mecanismos de 
resistência aos produtos nematicidas (Preston et al., 2016). 
Atrelado a programas de bioinformática e sequenciadores genéticos, 
nematoides parasitos de interesse socioeconômico tiveram o seu genoma estudado 
(Preston et al., 2016). A sequência genômica das espécies Caenorhabditis elegans e 
C. briggsae, C. remanei, C. japonica, C. sp. PB2801, Pristionchus pacificus, 
Haemonchus contortus (Laing et al., 2013; Schwarz et al., 2013), Meloidogyne hapla, 
Brugia malayi e Trichinella spiralis deram início às descobertas fascinantes dos 
aspectos genéticos e moleculares dos nematoides. Necator americanus, Ancylostoma 
ceylanicum (Schwarz et al., 2013; Tang et al., 2014), Angiostrongylus cantonensis 
(Yong et al., 2015), Ascaris suum e Toxocara canis (Jex et al., 2011; Zhu et al., 2015), 
Dirofilaria immitis (Godel et al., 2012) e Loa loa (Desjardins et al., 2013), Trichinella 
spiralis (Mitreva et al., 2011) e Trichuris suis (Jex et al., 2014) também tiveram os 
seus genomas analisados. Esses estudos, além de desvendarem o funcionamento da 
biologia dos nematoides, vêm acatar investigações acerca de novas estratégias no 
controle desses parasitos (Preston et al., 2016). 
H. contortus teve o seu genoma sequenciado (GenBank: HF955515.1; 
GenBank: KE549796.1) em um projeto que teve/tem como objetivo analisar o genoma 
de nematoides de importância médica e veterinária, visando a auxiliar biologicamente 
a descoberta de genes e proteínas que irão fornecer informações preciosas para as 
31 
 
 
 
pesquisas voltadas à busca de alternativas medicamentosas, de vacinas e/ou de 
marcadores de diagnóstico no controle desses parasitos (Ncbi, 2019). 
O tamanho do genoma de um nematoide varia entre 50-250 Mb, no caso do H. 
contortus, cerca de 53 Mb, e possui um número de cromossomos haploides de 4-12 
(Leroy et al., 2003). Sugere-se que um número menor na população de nematoides 
(número esse que reflete nos indivíduos que contribuem com alelos diferentes para a 
próxima prole), possui um genoma maior. Parece que 30-50% dos genes em uma 
espécie são considerados espécie-específicos para aquele nematoide. Sequências 
de RNA no H. contortus sofrem um processo chamado de trans-splicing, o qual gera 
um único transcrito de RNA a partir de múltiplos pré-mRNA. Em relação à 
diferenciação sexual, a carga de cromossomo X é determinante; o nematoide com 
carga XX é hermafrodita, já quando há presença de XO, ocorre a formação de 
nematoides machos (Gilleard and Redman, 2016). 
Durante o ciclo biológico do H. contortus, há expressão de diferentes genes 
responsáveis pela produção de moléculas funcionais específicas para cada fase do 
ciclo do nematoide. Durante a embriogênese, o ovo não requer muita energia, 
utilizando uma reserva endógena, sendo que a transcrição de genes está associada 
aos processos de oxido-redutases, apoptose, desenvolvimento e morfogênese, 
replicação do DNA e desenvolvimento embriológico e larval. Do ovo para o estágio 
larval L1, há produção de moléculas relacionadas ao desenvolvimento muscular e à 
atividade motora. Da fase L2 para a L3, há genes envolvidos aos processos de oxido-
redução, transporte de oxigênio e moléculas associadas ao citocromo P450 (CYP 450 
– relacionado a processos de detoxificação de susbtâncias estranhas). A transição de 
L3 para L4 é marcada pela expressão de genes associados à atividade motora, 
complexo de miosina e locomoção e estresse oxidativo. Nessa fase, ocorre uma 
produção enriquecida de proteases e aminopeptidases, responsáveis pelo processo 
de infecção de tecidos no hospedeiro e pela ação anticoagulante e digestão de 
hemoglobina. De L4 para a fase adulta, há a associação de genes envolvidos na 
formação de ovos e na embriogênese (para as fêmeas) e de proteínas do esperma 
(para os machos) (Laing et al., 2013; Schwarz et al., 2013). 
O desenvolvimento de moléculas associadas à formação de colágeno e do 
desenvolvimento da cutícula também estão presentes durante as fases do ciclo 
biológico do H. contortus. A cutícula é o principal local de interação entre um 
32 
 
 
 
nematóide e o seu ambiente, e muitos genes estão implicados em escapar das 
defesas do hospedeiro por meio de secreção de proteínas da cutícula (Davis et al., 
2004; Harder, 2016). Na fase larval, a via produtora de energia é aeróbica e depende 
do ciclo do ácido cítrico, na fase adulta, o verme executa o metabolismo de 
caboidratos por viaanaerobica, via glicolítica, com a pretensão de obter energia para 
a produção de ovos e manutenção do sistema neuromuscular (Köhler, 2006; Harder, 
2016). 
 
1.5. ANTI-HELMÍNTICOS E MECANISMOS DE RESISTÊNCIA 
 
Os anti-helmínticos sintéticos ainda são os principais princípios ativos utilizados 
no controle das parasitoses gastrintestinais de caprinos, visto que a falta de uma 
padronização na formulação (componentes presentes, concentração efetiva, 
farmacocinética e farmacodinâmica) dos produtos naturais, com efeito anti-helmíntico, 
ainda sofre dificuldades (Ríos-De Álvarez, 2009). 
As principais classes de anti-helmínticos sintéticos se concentram nos 
benzimidazois (albendazol, fenbendazol e oxifendazol), imidazotiazóis (tetramisol e 
levamisol), e tetrahidropirimidinas (pirantel e morantel), lactonas macrocíclicas 
(ivermectina, abamectina, doramectina e moxidectina), derivados de amino-
acetonitrila (monepantel) e salicilanilídeos (closantel, disofenol e nitroxinil) (Coles et 
al., 2006; Sotomaior et al., 2009; Roeber et al., 2013; Sprenger et al., 2013). 
Os benzimidazois apresentam efeito nematicida com mecanismos de ação 
envolvidos com os receptores de β-tubulina, impedindo, assim, a polimerização dos 
microtúbulos, com consequente disfunção biológica e morte do parasito (Melo and 
Bevilaqua, 2002). Os benzimidazois também promoveram mudança transcricional de 
genes relacionados ao metabolismo de compostos químicos, como citocromo P450 e 
UDP glicosil transferase, em modelo Caenorhabitis elegans (Laing et al., 2010). 
Os imidazotiazóis possuem como sítio de atuação os recepetores nicotínicos 
de acetilcolina e essa ação promove uma despolarização neuromuscular, paralisando 
o nematóide (Mckellar and Jackson, 2004). 
As lactonas macrocíclicas, avermectinas e milbemicinas interagem 
seletivamente com canais de cloreto, hiperpolarizando o tecido e ocasionando inibição 
e paralisia do nematóide (Melo and Bevilaqua, 2005). As ivermectinas também 
33 
 
 
 
promoveram modificação em um grupo de genes, em modelo C. elegans, 
principalmente relacionados ao metabolismo de lipídios (Laing et al., 2012). 
As salicilanilidas interferem na fosforilação oxidativa, influenciando diretamente 
no mecanismo de geração de energia (Martin, 1997). 
Apesar da ampla variedade de princípios ativos, o seu uso indiscriminado e de 
forma constante, ou seja, os problemas operacionais, acarretaram o aparecimento de 
nematóides resistentes (Hounzangbe-Adote et al., 2005; Hoste and Torres-Acosta, 
2011). Essa resistência é caracterizada como sendo a capacidade que um grupo de 
nematóides apresenta de tolerar o anti-helmíntico a uma concentração que é nociva 
para um grupo de nematóides de mesma espécie, sensíveis ao mesmo composto. 
Tendo caráter genético, a resistência é passada para as novas proles, se 
segmentando para todas as classes de anti-helmínticos sintéticos (Kaplan, 2004; 
Chagas et al., 2011). 
A tabela 1.5 apresenta as principais classes de compostos com efeito anti-
helmíntico e os seus mecanismos de ação, bem como as suas respectivas propostas 
de mecanismos de resistência. 
 
Tabela 1.5. Principais classes de anti-helmínticos utilizados no tratamento de infecções por nematoides 
gastrintestinais de pequenos ruminantes, mecanismo de ação e proposta de mecanismos de 
resistência. 
Classe de 
anti-helmíntico 
Mecanismo de ação Propostas de 
mecanismos de 
resistência 
 
 
Benzimidazois 
Vincula-se à β-tubulina. Inibição 
da captação de glicose, da 
secreção de proteínas e da 
produção de microtúbulos, 
levando à morte do nematoide. 
 
Mutações no gene da 
β-tubulina causam 
alterações estruturais 
na β-tubulina. Como 
consequência, o anti-
helmíntico não pode 
mais se ligar ao seu 
sítio de ação. 
 
 
Imidazotiazóis/ 
Tetrahidropirimidinas 
Atua com efeito similar ao da 
acetilcolina, causando paralisia 
dos vermes, impossibilitando a 
realização das atividades 
biológicas. 
 
Mal compreendido; 
possível envolvimento 
de alterações 
estruturais no receptor 
de acetilcolinana, 
34 
 
 
 
impedindo a ligação 
do fármaco. 
 
 
 
Lactonas macrocíclicas 
(avermectinas/milbemici
nas) 
Provoca uma abertura de canais 
de cloro-glutamato (ClGlu). Isso 
leva a um aumento do influxo de 
íons Cl no interior da célula 
nervosa, paralisando o verme. 
 
Mal compreendido; 
possível envolvimento 
com mutações no 
gene da glicoproteína-
P, podendo causar 
ganho de função, 
levando a uma 
remoção mais rápida 
do anti-helmíntico do 
verme. 
 
 
Derivados de amino-
acetonitrila 
O modo de ação hipotético 
envolve 
subunidades de um receptor 
nematoide-específico de 
acetilcolina. 
Perda total ou parcial 
do gene que codifica 
um tipo particular de 
receptor de 
acetilcolina. 
 
Fonte: Adaptado de Roeber et al., 2013. 
 
Os mecanismos de resistêcia são considerados multifatoriais e incluem, por 
exemplo, mudanças nos sítios de ligação das drogas nematicidas (podendo ocorrer a 
diminuição da interação droga-sítio de interação), mudanças no metabolismo do 
químico exógeno (removendo ou inativando a droga), mudanças na distribuição da 
droga, aumento da expressão de sítios de atuação da droga (diminuindo a resposta 
da droga) e compensação de sítios similares aos sítios reconhecidos por drogas 
(fragilizando o efeito final da droga) (Harder, 2016). 
Além desses fatos, os anti-helmínticos sintéticos também apresentam um grau 
residual nos animais e no ambiente, que contribui para o desenvolvimento de 
desequilíbrio ambiental e prejudica a comercialização de alguns produtos (como a 
carne e o leite) dos animais (Mckellar, 1997; Ríos-De Álvarez, 2009; Hoste et al., 
2012). 
Todos esses aspectos vislumbram a bioprospecção de novas moléculas com 
efeito anti-helmíntico eficiente, não tóxicas para os organismos, e que apresentem 
características biodegradáveis nas mais diversas formas de administração; em 
especial, moléculas purificadas de vegetais, como as lectinas. 
 
35 
 
 
 
1.6. SCREENING DE BIOPRODUTOS NEMATICIDAS 
 
Atrelado à problemática das parasitoses em pequenos ruminantes, o fator de 
resistência aos químicos sintéticos (além do seu grau residual) instiga a busca por 
controles alternativos ao uso de anti-helmínticos sintéticos. O controle do H. contortus, 
por exemplo, é baseado na utilização de anti-helmínticos, como benzimidazois (por 
exemplo, albendazol), lactonas macrocíclicas (por exemplo, ivermectina e 
moxidectina) e derivados de amino-acetonitrilo (por exemplo, monepantel) (Preston et 
al., 2016). Pesquisas voltadas ao uso de biomoléculas para tal fim vêm sendo 
desenvolvidas e ampliadas, atreladas a metodologias de identificação de novos 
princípios ativos, bem como ferramentas de biologia molecular, auxiliando na 
interpretação do mecanismo de ação dessas moléculas sobre o nematoide (Ríos-De 
Álvarez, L. et al., 2012; Heim et al., 2015; Batista et al., 2018; Medeiros et al., 2018). 
Porém, as abordagens tradicionais na formulação de novos nematicidas (por exemplo, 
inibição do seu desenvolvimento e crescimento in vitro) não estão obtendo sucesso 
absoluto devido ao desconhecido cenário da biologia do nematoide na perspectiva 
bioquímica e molecular. O que está se evidenciando é a utilização do cenário 
genômico e transcriptômico do nematoide a fim de se verificar a capacidade 
interferente de novos bioprodutos na expressão de genes e/ou moléculas que 
exerçam funções essenciais ao ciclo biológico do nematoide, levando à sua morte, 
sem causar efeitos adversos no hospedeiro (Preston et al., 2016). 
Associada a essa abordagem, a tecnologia de visão computacional (utilização 
de programas computacionais associados a microscópios, por exemplo, na otimização 
de experimentos biológicos) vem somando às metodologias utilizadas na triagem de 
novos compostos anti-helmínticos. 
Preston et al. (2016) mostraram essa nova abordagem na triagem de novas 
moléculas nematicidas.São utilizados diversos compostos (chamados de biblioteca 
de novos candidatos) expostos a larvas de H. contortus em estágio larval L3 em placas 
de 96 poços, sendo observada a motilidade das larvas por visão computacional (após 
24, 48 e 72h); caso a substância apresente efeito sobre a motilidade, as larvas 
continuam incubadas com os produtos teste por mais 4 dias, a fim de se verificar o 
efeito sobre o desenvolvimento do nematoide para o estágio larval L4; o composto é 
36 
 
 
 
eleito eficaz e segue para os demais testes se causar efeito nocivo no valor de 70 % 
sobre o nematoide nas três réplicas dos testes. 
Atreladas a esses testes, demais análises e etapas experimentais podem ser 
somadas às propostas de Preston et al. (2016) (Figura 1.6). A expressão gênica de 
genes envolvidos na biologia do nematoide é verificada na presença do composto 
teste que passou pela fase inicial; essa expressão é analisada pela tecnologia da PCR 
real time ou qPCR, a qual vai validar as possíveis modificações na expressão de 
genes do H. contortus (nessa fase, é essencial a triagem de genes por BLAST (banco 
de database NCBI - National Center for Biotechnology Information - 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov) com a espécie C. elegans, por exemplo, para o desenho 
dos primers que serão utilizados na qPCR). Paralelamente, a química do composto 
teste pode ser analisada por técnicas diversas de cromatografia e espectroscopia (por 
exemplo, HPLC-MS – High-performance liquid chromatography - mass spectrometry), 
essa etapa se torna importante para a descoberta de grupos farmacofóricos que 
venham a ser os sítios químicos ativos na atividade nematicida. 
Na perspectiva das análises dos fatores farmacocinéticos (absorção, 
distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade), a administração do composto teste, 
em modelos in vivo com pequenos roedores, deve ser abordada. Já foi verificada a 
capacidade adaptativa de modelos de infecção com H. contortus em estágio larval L3 
em pequenos roedores (por exemplo, rato, hamster e gerbil) (Jesús-Gabino et al., 
2010; Ostlind et al., 2013; Geary, 2016; Grando et al., 2016), possibilitando assim a 
diminuição de animais de grande porte (pequenos ruminantes) antes mesmo de 
desvendar os fatores farmacocinéticos. 
Por fim, é evidente que essas etapas terão maior chance de sucesso com a 
colaboração entre pesquisadores de instituições públicas e privadas, visto que o 
objetivo comum é a descoberta de novos compostos nematicidas que atuem 
especificamente em H. contortus. No caso do Brasil, atrelar esse novo composto ou 
seu processo de obtenção, em um centro de incubação ou pedido de proteção do tipo 
patente (por exemplo, INPI - Instituto Nacional da Propriedade Industrial - 
http://www.inpi.gov.br/) é de extrema valia. 
 
http://www.inpi.gov.br/)
37 
 
 
 
Figura 1.6. Proposta das etapas experimentais na triagem de novos compostos nematicidas sobre 
Haemonchus contortus em modelos in vitro e in vivo. 
 
Fonte: Ilustração do Autor, 2020 e adaptado de Preston et al., 2016. 
 
Todos esses aspectos vislumbram a formulação de novas moléculas com efeito 
anti-helmíntico eficiente, não tóxicas para os organismos, e que apresentem 
características biodegradáveis nas mais diversas formas de administração. 
 
1.6.1. Lectinas com Efeito Nematicida 
 
 Lectinas apresentam uma capacidade específica e reversível de reconhecer e 
se ligar a carboidaratos e glicogonjugados, possibilitando interações diversas com 
uma ampla gama de diferentes células (Van Damme et al., 1998). Os nematoides, de 
forma geral, apresentam uma característica ímpar na sua constituição morfológica: 
uma camada cuticular rica em proteínas, glicoconjugados, carboidratos e lipídios 
(Fetterer and Rhoads, 1993; Brunet et al., 2011; Page et al., 2014). Associada à 
principal propriedade biológica das lectinas, essa cutícula torna-se uma das principais 
formas de interação lectina-nematoide, sendo que algumas drogas anti-helmínticas 
interagem com o nematoide via cutícula e outras via trato alimentar (Harder, 2016). 
 A cutícula, estruturalmente, é formada por três camadas principais: a camada 
basal e medial (rica em proteínas do tipo colágeno, cerca de 80%, e diferentes das 
encontradas em vertebrados – formada por uma extensão de glicina, prolina e 
38 
 
 
 
hidroxiprolina), uma camada externa e cortical (rica em proteínas do tipo não 
colágeno, como proteínas insolúveis conhecidas como cuticlinas; conferindo 
resistência aos estresses ambientais) e epícuticula (rica em moléculas de funções não 
estruturais, como glicoproteínas, maior parte, e lipídios) (Figura 1.7). Essa formação 
confere a forma do nematoide, o movimento e as interações funcionais com o 
ambiente, sendo o nematoide drasticamente afetado quando há desvios na 
normalidade dessas estruturas (Fetterer and Rhoads, 1993; Page et al., 2014). 
 
Figura 1.7. Organização estrutural da cutícula de nematoides. Epicutícula (contendo glicoproteínas e 
lipídios), camada externa e cortical (contendo proteínas do tipo não colágeno, como a cuticlina), 
camada média e basal (contendo proteínas do tipo colágeno) e hipoderme. 
 
Fonte: Ilustração do Autor, 2020 e adaptado de Page et al., 2014. 
 
 Dos estudos realizados com lectinas, com o propósito de aplicação anti-
helmíntica, ainda muito pouco foi explorado. Por exemplo, Ríos-de Álvarez et al. 
(2012) verificaram o efeito anti-helmíntico de lectinas de plantas, com afinidade a 
glicose/manose (ConA – concanavalina A), N-acetilglicosamina (WGA – aglutinina do 
germe do trigo) e fetuina (PHA-E3L – fitohemaglutinina E3L), sobre nematoides das 
espécies Teladorsagia circumcincta, Haemonchus contortus e Trichostrongylus 
colubriformis, através de ensaios de inibição da alimentação larval e localização de 
possíveis locais de ligação através de histoquímica. Foi observado que três das 
lectinas analisadas promoveram inibição da alimentação larval, como danos à cutícula 
(inchaço e perda da integridade), havendo como principal proposta de mecanismo de 
interação com o parasito a afinidade das lectinas com a cutícula de nematoides em 
estágio larval L1. 
 Heim et al. (2015) analisaram lectinas obtidas de fungos, frente a nematoides 
da espécie de H. contortus. O desenvolvimento das larvas foi o principal parâmetro 
observado, sendo que lectinas com afinidade a N-acetilglicosamina (CCL2 - lectina de 
Coprinopsis cinerea e MOA – aglutinina de Marasmius oreades), fucose (AAL – lectina 
39 
 
 
 
de Aleuria aurantia) e lactose (CGL2 – lectina de Coprinopsis cinerea) promoveram 
retardo no desenvolvimento de larvas em estágio L1 para o L3, como interação com 
moléculas presentes no trato digestivo de vermes adultos. Os autores sugeriram 
interações com glicanos presentes nos nematoides como sendo essenciais para os 
efeitos biológicos observados nos ensaios. 
 Medeiros et al. (2018), utilizaram uma lectina vegetal (WSMoL – lectina solúvel 
em água de Moringa oleifera; com afinidade a frutose e a N-acetilglicosamina) e 
verificaram que a mesma apresentou efeito anti-helmíntico em ensaios de 
eclodibilidade de ovos, desenvolvimento larval e atividade de proteases de 
nematoides dos gêneros Strongyloides, Oesophagostomum, Haemonchus e 
Trichostrongylus. Os autores sugeriram que a lectina pode interagir com receptores 
ricos em glicoconjugados presentes em células intestinais e em células embrionárias, 
bem como na cutícula das larvas. 
 Batista et al. (2018), através de docking molecular, verificaram a capacidade 
interativa da lectina vegetal ConBr (Conavalina brasiliensis; com afinidade a 
manose/glicose) com glicanos (ricos em trimanosideos) presentes na espécie H. 
contortus, bem como efeito significativo no retardo do seu desenvolvimento. Os 
autores sugeriram que o efeito inibitório no desenvolvimento das larvas está 
relacionado à interação da lectina com esses glicanos. 
 Diante dos dados apresentados nas pesquisas