Artigo I- Potencial Terapeutico de celulas tronco mesenquimais

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E DESENVOLVIMENTO NA REGIÃO CENTRO-OESTE
Potencial terapêutico de células-tronco mesenquimais no tratamento de lesões do tendão de Aquiles
Disciplina: CULTIVO E APLICAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO
Docente: Prof. Dr. Rodrigo Juliano Oliveira
 
Discentes: 	Suellen Alves da Silva
Ulisses Masseli Dias
CAMPO GRANDE – 2022
INFORMAÇÕES DO ESTUDO
Artigo : Potencial terapêutico de células-tronco mesenquimais no tratamento de lesões do tendão de Aquiles.
Autor: M.H.C .Vieira; R.J. Oliveira; L.P.M. Eça; I,S,O Pereira; L.C. Hermeto; R. Matuo, WS 
Orientador: Prof. Dr. Luiz Antônio Franco da Silva
Data de Publicação: 2014.
Tipo de Documento: Tese
Tipo de Estudo: genética e Pesquisa molecular
Publicado por: Universidade Federal Mato Grosso do Sul
Autores: 
INFORMAÇÕES DO ESTUDO
Palavras-chave: : Sistema musculoesquelético; Tendão de Aquiles, tendão calcâneo; Terapia celular; Cicatrização de feridas; Integridade genômica
Objetivo: o foi avaliar o potencial terapêutico das células tronco mesenquimais (CTMs) no tratamento de cortes transversais do tendão de Aquiles
Material e Métodos: Foram selecionados 30 coelhos machos adultos da raça Nova Zelândia com peso médio de 2,5 kg..
 Submetidos a tratamento das lesões via inoculação de células-tronco mesenquimais (CTMs) alógenas da medula óssea, associadas ou não a uma matriz extracelular composta por esponja de colágeno hidrolizada e liofilizada.
MATERIAL E MÉTODOS
Experimento 1
Grupos 1 e 2 - Foi realizado um corte transversal do tendão de Aquiles (CSAT), seguido de sutura em camadas, curativo local e confecção de gesso de perna longa. 
Grupos 3 e 4 - CSAT + Sutura - Foi realizado um CSAT, seguido de sua sutura. Posteriormente, foi realizada sutura em camadas, curativo local e confecção de gesso de perna longa.
Grupos 5 e 6 - CSAT + MSC - Foi realizado um CSAT, seguido do transplante de CTM. Posteriormente, foi realizada sutura em camadas, curativo local e confecção de gesso de perna longa
Autores: 
 Procedimento anestésico
Os animais foram anestesiados com cetamina (Rhobifarma Indústria Farmacêutica LTDA) e xilazina (Rhobifarma Indústria Farmacêutica LTDA) nas doses de 50 mg/kg e 10 mg/kg de peso corporal (pc), respectivamente, que foram administradas por via intramuscular, e a lesão do tendão foi tratados com uma dose de 5 mg/kg pc de morfina (Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos LTDA) por via subcutânea para a coleta de tecido adiposo e para realizar a lesão do tendão de Aquiles. 
INTRODUÇÃO 
Coleta de tecido adiposo
esterilização e antissepsia em ambiente cirúrgico, foi realizada depilação e incisão cirúrgica longitudinal de 2 cm com lâmina de bisturi (nº 24) na linha dorsal acima do ponto de maior acúmulo de tecido adiposo, aproximadamente 5 cm do oc ciput , no sentido craniocaudal.
INTRODUÇÃO 
 Sutura do tendão de Aquiles
A sutura do CSAT foi realizada de acordo com a técnica de Kessler modificada utilizando fio de náilon 3-0 (Mononylon) para sutura do tendão e 4-0 (Mononylon) para sutura do para tendão. 
INTRODUÇÃO 
Isolamento de MSCs
 A preparação do sedimento celular foi ressuspensa em 510 µL de DMEM a 1%. Uma alíquota de 10 µL foi coletada para determinar a concentração e viabilidade celular em uma câmara de Neubauer. Trypan Blue (LGC Biotecnologia) foi utilizado para a análise da viabilidade celular na proporção de 1:1. Uma concentração de 2,5 x 105 células foi semeada em frascos de cultura de tecidos.
INTRODUÇÃO 
Cultura e expansão clonal de MSCs
As MSCs foram semeadas a uma concentração de 2,5 x 105 células em frascos de cultura de 25 cm3 (TTP, Suíça) contendo 5 mL de DMEM com baixo teor de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina (DMEMsupl) e mantidos em uma incubadora de CO2 a 37°C e 5% de CO2 . O DMEMsupl foi trocado a cada 48 h e as duas primeiras trocas de meio foram precedidas por lavagem com 3 mL de PBS para remover detritos celulares e teciduais.
Em seguida, foi adicionado 1 mL de tripsina 0,25% (LGC Biotecnologia) e os frascos foram incubados por 2-3 min a 37°C.
INTRODUÇÃO 
Transplante de MSCs.
Células de segunda passagem foram utilizadas para o transplante autólogo in loco de CTM, que foi realizado imediatamente após a tenotomia, na concentração de 1,0 x 106 células em volume final de 0,1 mL por seringa de insulina com agulha 13 x 4,5 mm. Em seguida, a pele foi suturada com pontos simples com fio de náilon 4-0 (Mononylon) e curativo local, e foi realizada a confecção de gesso de perna longa
INTRODUÇÃO 
Imobilização por gesso de perna longa.
Os modelos número 6 (Cremer) foram preparados de acordo com as instruções do fabricante. Todos os animais foram imobilizados com a perna longa gessada, mantendo o tornozelo operado na posição equina.
INTRODUÇÃO 
Avaliação histológica.
Os animais foram eutanasiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital (100 mg/kg pc) ao final do período experimental. Os membros posteriores operados foram dissecados, preservando a integridade do tendão calcâneo, do qual foi retirado um fragmento com margem de 10 mm proximal e distal ao local do corte. 
As lâminas foram submetidas à avaliação histológica em sistema duplo-cego sob microscopia de campo claro
INTRODUÇÃO 
Análise estatística.
INTRODUÇÃO 
 	Experimento 2
As amostras de dois coelhos foram utilizadas para o desenvolvimento da diferenciação celular e avaliação da integridade genômica, mantendo-se as mesmas condições experimentais descritas para o Experimento 1.
INTRODUÇÃO 
Diferenciação adipogênica, osteogênica e condrogênica
Dois frascos de 25 cm2 e um tubo Falcon serviram como controles para os processos de diferenciação celular. 
Dois frascos de cultura e um tubo Falcon foram utilizados no procedimento de diferenciação celular. As células foram mantidas em DMEMsupl por 24 h durante a diferenciação adipogênica e osteogênica. 
Em seguida, o meio foi descartado e os meios dos kits de diferenciação de adipogênese e osteogênese STEMPRO (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) foram adicionados por 14 dias consecutivos, com trocas de meio duas vezes por semana. As células foram mantidas em DMEMsupl por 2 h para a diferenciação condrogênica.
INTRODUÇÃO 
Avaliação da integridade genômica.
O material foi avaliado em microscópio de fluorescência (Nikon, Japão) com aumento de 40X. Cinquenta células foram contadas por lâmina, que foram avaliadas usando o software Comet Assay IV (Perceptive Instruments Ltd, Reino Unido). A análise estatística foi realizada por meio do teste t de Student (P 0,05) para o segundo momento (28 dias) e/ou ao comparar os dois momentos dentro dos grupos
RESULTADOS
RESULTADOS
Experimento 2
A viabilidade celular das culturas utilizadas no Experimento 2, variando de 94 a 99% com uma média de 96,00 ± 1,08.
RESULTADOS
RESULTADOS
A qualidade de vida de muitos pacientes, principalmente atletas, pode ser diminuída pela ruptura do tendão de Aquiles. Além do trauma, outras doenças podem afetar o tendão, o que leva à perda da função muscular e incapacidade significativa se não fortratada (Thien et al., 2004)
uma questão chave é a incapacidade do tendão de se auto-regenerar para preservar a arquitetura original devido à alta densidade celular e baixa organização do colágeno, que estão relacionados a altas taxas de rerruptura (Józsa e Kannus, 1997; Morberg et ai., 1997). 
DISCUSSÃO
Embora as rupturas do tendão de Aquiles geralmente resultem de tendinopatia prévia e as fibras desgastadas sejam detectadas pela observação macroscópica, o principal modelo experimental utilizado em outros estudos, e também neste estudo, envolve um corte transversal do tendão a 10 mm de sua inserção no o calcâneo, que é o local correspon
DISCUSSÃO
No entanto, essa restrição expõe o paciente a riscos, incluindo aderências e reparos de má qualidade, e as propriedades biomecânicas e mecânicas dos tendões cicatrizados nunca atingem as dos tendões intactos (Winter et al., 1998). 
 Gossman et al. (1986) avaliaram o alongamento e a circunferência dos músculos sóleo e plantar de coelhos após uma imobilização gessada e notaram que nenhuma mudança ocorreu em nenhum músculo quando o músculo foi imobilizado na posição estendida. 
DISCUSSÃO
A análise histológica indicou que o processo inflamatório não apresentou diferenças entre os grupos nos dois momentos avaliados. No entanto, observou-se redução do processo inflamatório do 14º para o 28º dia de pós-operatório nos grupos CSAT e CSAT + CTM, quando comparados dentro do mesmo grupo. 
O grupo com menor organização estrutural das fibras colágenas foi o CSAT quando comparado aos grupos CSAT + Sutura e CSAT + MSC no tempo de 14 dias. Embora não tenham sido observadas diferenças estatisticamente significativas entre os grupos CSAT + Sutura e CSAT + MSC, uma tendência de maior organização foi observada no grupo CSAT + MSC.
DISCUSSÃO
	Portanto, com base nos padrões histológicos encontrados no presente estudo, os animais experimentais tratados com MSC, seguidos pelo grupo CSAT + Sutura, devem apresentar melhora na atividade biomecânica em comparação com o grupo CSAT, pois a neovascularização e a melhora na organização do colágeno ocorreram no antigos grupos; portanto, houve melhora na irrigação do tendão cicatrizado e melhor manutenção da arquitetura original do tendão. 
DISCUSSÃO
Uma discussão mais ampla sobre a terapia com células-tronco com MSCs e/ou outras células-tronco diz respeito ao grau de segurança para os pacientes. Uma questão pertinente é a qualidade do material genético das células cultivadas in vitro por longos períodos e em expansão clonal.
o método do cometa encontrou diversas aplicações, o que motivou sua escolha para a avaliação da integridade genômica das CTMs no presente estudo. A frequência de dano genômico na segunda passagem, ao medir a intensidade do DNA na cauda, foi 1,58 vezes maior do que o dano observado na primeira passagem, segundo os dados.
DISCUSSÃO
Esse resultado levanta questões sobre os protocolos utilizados; o protocolo com pH > 13 que foi utilizado no presente estudo deve ser um ensaio mais sensível do que aqueles que utilizam um tampão em pH 10.
deve-se notar que ocorreu um aumento de 1,58 vezes na intensidade da cauda de uma passagem para a segunda neste estudo, resultado que deve ser considerado para uma avaliação abrangente do processo. 
Além disso, a origem das células deve ser considerada, pois no presente estudo foram utilizadas células de tecido adiposo de coelhos, enquanto os demais pesquisadores utilizaram células humanas
DISCUSSÃO
. No entanto, encontraram uma frequência aumentada de danos mutagênicos e inferiram a possibilidade de transformação das CTMs em células com instabilidade cromossômica e/ou potencial maligno.
No entanto, o presente estudo também carece de dados suficientes para contraindicar a terapia com CTM, principalmente porque a relação custo-benefício foi favorável ao comparar a melhora histológica observada e a redução da chance de desenvolver tumores
DISCUSSÃO
Considerando os pontos citados, pode-se concluir que o transplante de CTM é uma boa alternativa para o tratamento da ruptura do tendão de Aquiles em coelhos. Além disso, os resultados do tratamento alternativo foram melhores do que aqueles relacionados ao uso do outro método padrão, ou seja, a sutura do tendão, pois esta está associada a um processo cirúrgico invasivo e possui fatores complicadores, incluindo ferida cirúrgica e inflamação causada pelos fios absorvíveis.
Conclusão 
o transplante de CTM tem a vantagem de evitar a cirurgia e a sutura do tendão e seus riscos. Além disso, este método apresenta uma melhor capacidade de cicatrização de feridas e manutenção da arquitetura original do tendão, dada a disposição das fibras colágenas, que tem importante potencial terapêutico.
Conclusão 
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