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Respostas às atividades da obra Biologia Molecular da Célula, 5a Edição Uma criatura do mar avistada entre as Antilhas e Nice, em 1562. Nunca saberemos exatamente o que a pessoa que desenhou esta figura realmente viu, mas é pouco provável que esta criatura tenha sido totalmente inventada. Qualquer um que tenha feito um curso de histologia sabe como é difícil aprender a observar e cap- tar detalhes relevantes e precisos a partir de uma cena não familiar. Isto é importante para os biólogos celula- res; é muito fácil interpretar o que não é familiar quando já se tem um conhecimento prévio, impossibitando a percepção de algo novo. Alberts-Resp_Book.indb 1Alberts-Resp_Book.indb 1 23.11.09 10:54:2923.11.09 10:54:29 Alberts-Resp_Book.indb 2Alberts-Resp_Book.indb 2 23.11.09 10:54:3023.11.09 10:54:30 Células e Genomas 1 1-1 Falso. Os conjuntos de genes da hemoglobina se originaram nos humanos da du- plicação a partir de um gene ancestral que codificava a proteína globina; portanto, eles são exemplos de genes parálogos. Os genes da hemoglobina α humana e dos chimpanzés são ortólogos, assim como os genes da hemoglobina β de humanos e de chimpanzés, etc. Todos os genes que codificam a proteína globina, incluindo o gene para a mioglobina, que apresenta uma relação evolutiva mais distante, são homólogos uns aos outros. 1-2 Verdadeiro. Nos organismos unicelulares, o genoma também é o material here- ditário, e qualquer modificação que ele sofra é repassada para a próxima gera- ção. As células germinativas geralmente estão isoladas no interior dos organismos multicelulares, minimizando o seu contato com células estranhas, vírus e DNA, protegendo assim as espécies dos efeitos de uma possível transferência genética horizontal. 1-3 Verdadeiro. Os genomas das bactérias são reduzidos ao essencial: apenas uma pe- quena porção se destina ao controle da expressão gênica. Já no genoma humano, apenas cerca de 1,5% das sequências de DNA codifica proteínas. 1-4 A resistência a mutações, observada no código genético, sugere que ele esteja su- jeito às pressões da seleção natural. Dessa maneira, a resistência a mutações é uma característica favorável do código genético, pois permite que os organismos mantenham informações suficientes para especificar fenótipos complexos. Esta lógica sugere que um evento aleatório – aproximadamente de um em um milhão – tenha sido responsável pelo surgimento de um código genético à prova de erros como o nosso. Contudo, na prática isto não é tão simples. Se a resistência a mutações for uma característica essencial de qualquer código genético, então os únicos códigos que observaríamos seriam aqueles à prova de erros. Um evento evolutivo menos rígi- do, que originasse um código mais sujeito a erros, poderia limitar a complexidade da vida. Existem diversas provas de que o código genético não é estático e responde às forças da seleção natural. Variantes do código genético já foram identificadas em mitocôndrias e no genoma nuclear de diversos organismos. Referência: Freeland SJ e Hurst LD (1998) The genetic code is one in a million. J. Mol. Evol. 47, 238-248. 1-5 Algumas hipóteses poderiam ser testadas: 1. Uma análise do conteúdo de aminoácidos poderia indicar se o conjunto de ami- noácidos utilizado pelos organismos sendo caracterizados difere ou não daquele utilizado pelos organismos da Terra. No entanto, mesmos organismos da Terra podem apresentar aminoácidos diferentes dos 20 mais comuns, como hidroxipro- linas, fosfosserinas e fosfotirosinas. 2. O sequenciamento do DNA da amostra a ser caracterizada permitirá a compara- ção da sua sequência de nucleotídeos com a sequência dos organismos da Terra. Uma análise cuidadosa da sequência poderia resolver este problema. 3. A análise do código genético do novo organismo pode ser uma boa abordagem. 1-6 “Alimentar-se” significa “obter energia livre ou substratos a partir de”, seja esta fonte a luz solar ou compostos químicos inorgânicos. No caso da fotossíntese, os fótons da luz solar são utilizados para excitar os elétrons de algumas moléculas, Alberts-Resp_Book.indb 3Alberts-Resp_Book.indb 3 23.11.09 10:54:3023.11.09 10:54:30 4 Capítulo 1 Células e Genomas criando espécies instáveis. Quando estes elétrons voltam ao seu estado natural, a energia liberada é aproveitada por mecanismos que direcionam a síntese de ATP. De modo similar, os organismos litotróficos obtêm energia livre pela oxidação de uma ou mais moléculas reduzidas obtidas das fendas termais (p. ex., H2S → S + 2H+), utilizando alguma molécula comum presente no ambiente como aceptora de elétrons (2H+ + ½ O2 → H2O). A energia liberada nestas reações de oxidação- redução (transferência de elétrons) é utilizada em reações que envolvam a síntese de ATP. 1-7 São possíveis quatro árvores filogenéticas (Figura R1-1). Os três grupos podem ter divergido de um ancestral comum ao mesmo tempo. As eubactérias e as arque- bactérias podem ter divergido dos eucariotos e então se separado. As eubactérias e os eucariotos podem ter divergido das arquebactérias e então formado ramos distintos. Ou ainda, as arquebactérias e os eucariotos podem ter divergido das eubactérias antes de divergirem entre si. Apesar de os eventos de transferência horizontal tornarem a análise filogenética mais complicada, acredita-se que as arquebactérias e os eucariotos se separaram das eubactérias e então as arquebac- térias divergiram do grupo dos eucariotos. 1-8 É pouco provável que qualquer gene tenha se originado com as características perfeitas para a sua função. Assume-se que genes altamente conservados, como os que codificam o RNA ribossomal, tenham sido otimizados por processos evo- lutivos mais rápidos durante a evolução do ancestral comum a arquebactérias, eubactérias e eucariotos. Uma vez que RNAs ribossomais (e os produtos de outros genes altamente conservados) participam nos processos fundamentais aperfei- çoados anteriormente, não houve pressão evolutiva para mudança. Já os genes menos conservados – ou seja, os que evoluem mais rapidamente – estão cons- tantemente sujeitos a ocupar novos nichos funcionais. Considere, por exemplo, a evolução dos diferentes genes da globina (veja a resposta da Questão 1.1). 1-9 A. Uma vez que os genes envolvidos nos processos de fluxo de informação estão menos sujeitos à transferência horizontal, as árvores evolutivas derivadas destes genes são mais confiáveis para estimar as relações evolutivas entre os organismos. Portanto, é provável que as arquebactérias tenham se separado dos eucariotos de- pois de ambos terem divergido do grupo das eubactérias. B. A complexidade é uma explicação lógica para as diferenças nas taxas de transfe- rência horizontal de genes. A transferência bem sucedida de um gene relacionado ao processo de fluxo de informação necessita que o seu produto gênico se encaixe em um complexo funcional preexistente, talvez suplantando a proteína original presente no organismo. Para que esta proteína se encaixe em um complexo pro- teico, é necessário que ela apresente superfícies de ligação complementares ao complexo, permitindo a sua interação correta. Já um produto gênico que desem- penhe uma reação metabólica independente pode ser perfeitamente funcional em qualquer organismo. Se esta reação metabólica conferir alguma vantagem adaptativa ao organismo que receber este gene (ou ao menos, não conferir des- vantagens), o gene em questão pode ser acomodado no genoma do organismo receptor. Referência: Jain R, Rivera MC e Lake JA (1999) Horizontal gene transfer among genomes: The complexity hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3801-3806. Figura R1-1 As quatro possíveis relações evolutivas entre archaea (A), eubactérias (B) e eucariotos (E) (Resposta 1-7). A B E A B E A E BA B E Alberts-Resp_Book.indb4Alberts-Resp_Book.indb 4 23.11.09 10:54:3023.11.09 10:54:30 Capítulo 1 Células e Genomas 5 1-10 A. A hipótese mais simples é que a transferência gênica tenha ocorrido no ponto in- dicado na Figura R1-2. As linhagens além deste ponto apresentam o gene Cox2 nuclear, enquanto as linhagens que se ramificam nos pontos anteriores não apre- sentam. B. Cinco gêneros (Lespedeza, Dumasia, Pseudeminia, Neonotonia e Amphicarpa) aparentemente possuem cópias funcionais dos genes mitocondrial e nuclear, conforme indicado em cinza na Figura R1-2. C. Dez gêneros (Eriosema, Atylosia, Erythrina, Ramirezella, Vigna, Phaseolus, Ortholobium, Psoralea, Cullen e Glycine) não apresentam o gene mitocondrial funcional. O número mínimo de eventos de inativação é quatro, conforme indica- do pelos quadrados na Figura R1-2. D. Seis gêneros (Calopogonium, Pachyrrhizus, Cologania, Pueraria, Pseudovigna e Teramnus) não apresentam a cópia funcional do gene nuclear. O número mínimo de eventos de inativação é cinco, conforme indicado pelos círculos na Figura R1- 2. E. Estes dados sugerem que a transferência de genes da mitocôndria para o núcleo não é um processo de apenas uma etapa; isto é, simultânea perda do gene mito- condrial e aparecimento deste gene no núcleo. Este é um cenário bastante impro- vável uma vez que as versões nucleares dos genes mitocondriais devem adquirir ainda sequências sinalizadoras que permitam o transporte das proteínas sinteti- zadas para a mitocôndria (veja o Capítulo 12 da obra). Os dados apresentados na Figura R1-2 indicam que o processo de transferência iniciou com o aparecimento do gene no núcleo. Esta primeira etapa não é acompanhada pela perda do gene mitocondrial. Uma vez que o gene nuclear esteja ativado, é observado um está- gio intermediário onde as duas cópias do gene estão ativadas. Posteriormente, uma das cópias é inativada. Se o gene nuclear for inativado, o processo de transfe- rência do gene é interrompido. Se o gene mitocondrial for inativado (geralmente por mutações pontuais), a transferência gênica pode continuar. O estágio final da transferência é a eliminação do gene mitocondrial não funcional, um processo que ocorrerá durante a replicação do genoma. Referência: Adams KL, Song K, Roessler OG, Nugent JM, Doyle JL, Doyle JJ e Palmer JD (1999) Intracellular gene transfer in action: Dual transcription and multiple silencing of nuclear and mitocondrial cox2 genes in legumes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 13863-13868. 1-11 A. Os dados da árvore filogenética (ver Figura 1-3, constante na obra, p. 43) indicam que o gene da hemoglobina de plantas tenha se originado por transferência hori- zontal. As sequências das hemoglobinas de plantas parecem ter divergido há mui- to tempo na escala evolutiva, no mesmo momento, ou ainda antes, do surgimento dos moluscos, insetos e nematoides. As relações evolutivas indicadas na árvore sugerem que o gene da hemoglobina surgiu a partir de algum ancestral comum. B. Se o gene da hemoglobina de plantas tivesse se originado de transferência hori- zontal a partir de um parasita nematoides, a sua sequência estaria agrupada com as sequências de genes de hemoglobina de nematoides na árvore filogenética da Figura Q1-3. 1-12 Três hipóteses gerais podem ser propostas. A hipótese do tempo de geração propõe que as diferenças nas taxas são conse- quência dos diferentes tempos de geração. Espécies como o rato, com tempo de geração mais curto, passarão por um número maior de gerações e divisões das células germinativas, e consequentemente por mais ciclos de replicação do DNA. Esta hipótese assume que os erros inseridos durante a replicação do DNA são a maior fonte de mutações. A hipótese da taxa metabólica afirma que espécies com maiores taxas de evo- lução apresentam maiores taxas metabólicas, gerando mais espécies reativas de oxigênio, a principal fonte de danos ao DNA. Isto é particularmente relevante quando consideramos genomas mitocondriais, uma vez que a mitocôndria é o Alberts-Resp_Book.indb 5Alberts-Resp_Book.indb 5 23.11.09 10:54:3023.11.09 10:54:30 6 Capítulo 1 Células e Genomas principal local de utilização de oxigênio e de geração de radicais livres nas cé- lulas. A hipótese da eficiência de reparo propõe que a eficiência de reparo do DNA danificado difere entre as linhagens. Espécies com mecanismos de reparo mais eficientes reduziriam a proporção de erros que levariam a mutações. Existem evi- dências experimentais de que estas diferenças nos sistemas de reparo existem, a partir de células humanas e de ratos em cultivo, mas não está claro se estas dife- renças existem também nas células germinativas destes organismos. Referência: Li WH (1997) Molecular Evolution, p. 228-230. Sinauer Associates, Inc.: Sunderland MA. Figura R1-2 Resumo da distribuição do gene Cox2 e seu transcrito, em um contexto filogenético, mostrando os locais mais prováveis de transferência gênica e o número mínimo de eventos de inativação do gene mitocondrial (quadrados) e do gene nuclear (círculos) (Resposta 1-10). O destaque em cinza indica os gêneros que aparentemente apresentam cópias funcionais dos ge- nes mitocondrial e nuclear. GENE RNA mt mtnuc nuc Pisum Clitoria Tephrosia Galactia Canavalia Lespedeza Eriosema Atylosia Erythrina Ramirezzella Vigna Phaseolus Dumasia Calopogonium Pachyrhizus Cologania Pueraria Pseudeminia Pseudovigna Ortholobium Psoralea Cullen Neonotonia Teramnus Amphicarpa Glycine + – + – + – + – + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + – + – + – + – + – + – + – + – + –+ – +– +– +– +– +– +– +– +– +– +– +– +– +– +– +– +– +– +– +– + – + – + – + – + – Transferência gênica e ativação Alberts-Resp_Book.indb 6Alberts-Resp_Book.indb 6 23.11.09 10:54:3023.11.09 10:54:30 Química Celular e Biossíntese 2 2-1 Verdadeiro. A cada meia-vida, metade da radiatividade restante diminui. Após 10 meias-vidas (1/2)10, apenas 1/1.024 da radiatividade original se mantém. 2-2 Falso. O pH da solução será próximo ao neutro (pH 7,0), pois poucos íons H� do HCl irão exceder o número de íons H� originados da dissociação das moléculas de água. Não importa o quão dissolvido esteja um ácido, ele não originará uma solução básica. Em concentração igual a 10�8 M, o pH da solução será 6,98. 2-3 Falso. A maioria das interações entre macromoléculas depende da habilidade de associação e dissociação rápidas, o que não é possível se estas moléculas intera- girem por ligações covalentes. No entanto, em situações onde uma grande esta- bilidade estrutural é necessária, como na formação da parede celular de plantas, bactérias e fungos, ou na matriz extracelular das células animais, algumas macro- moléculas podem se encontrar unidas por ligações covalentes. 2-4 Verdadeiro. A diferença entre animais e plantas é o modo como obtêm as molécu- las que serão oxidadas para consumo de energia. As plantas utilizam as reações de fotossíntese, e os animais precisam ingerir suas fontes de alimento. 2-5 Verdadeiro. As reações de oxidação-redução se referem às reações nas quais ocor- re transferência de elétrons entre moléculas. Uma reação de oxidação deve ser acompanhada por uma reação de redução, pois o número de elétrons deve ser mantido constante. 2-6 Falso. A constante de equilíbrio para a reação A ↔ B não é alterada. O acoplamen- to de reações pode transformar uma reação desfavorável em uma reação favorá- vel, por alterar a concentração dos produtos da primeira reação em relação aos seus substratos, mas não irá mudar o valor da sua constante de equilíbrio, pois, como o nome indica, este valor é constante. 2-7 Verdadeiro. Uma reação com valor negativo de ΔG°não irá ocorrer esponta- neamente caso a concentração de produto exceda a concentração esperada nas condições de equilíbrio. Já uma reação com valor positivo de ΔG° ocorrerá es- pontaneamente em condições onde exista excesso de substratos em relação à concentração esperada nas condições de equilíbrio. 2-8 Falso. A glicólise é a única via metabólica capaz de gerar ATP na ausência de oxi- gênio. Existem diversas situações de anoxia em que as células dependem da gli- cólise para a obtenção de energia. Por exemplo, em treinos intensos de corrida, a circulação não é capaz de manter condições adequadas de oxigenação nos mús- culos das pernas, que dependem então da glicólise, realizada a partir das molécu- las de glicogênio celular. Outro exemplo são as hemácias, que, por apresentarem mitocôndrias, não realizam metabolismo oxidativo. 2-9 Falso. Os átomos de oxigênio da molécula de CO2 não são oriundos dos átomos de oxigênio consumidos durante a oxidação da glicose. As moléculas de oxigênio utilizadas na fosforilação oxidativa originam moléculas de água. 2-10 A química orgânica realizada nos laboratórios raramente é realizada em água, de- vido à baixa solubilidade de alguns compostos e à reatividade da água com algu- mas reações. No entanto, a maior diferença entre a química orgânica das células Alberts-Resp_Book.indb 7Alberts-Resp_Book.indb 7 23.11.09 10:54:3023.11.09 10:54:30 8 Capítulo 2 Química Celular e Biossíntese vivas e a realizada em laboratório é a complexidade. Um fator essencial em labo- ratório é o uso de reagentes com alto grau de pureza; já nas células vivas, milha- res de reações distintas são realizadas simultaneamente e sem interferências. É a habilidade das enzimas de isolar ambientes ótimos através de catalisadores que permite a realização de tantas reações simultâneas. 2-11 A. O etanol em uma cerveja com graduação alcoólica igual a 5% está na concentra- ção 0,86 M. O etanol puro é 17,2 M ([789 g/L] � [mol/46 g]). B. No limite legal de 80 mg/100 mL, haverá uma concentração de etanol igual a 17,4 mM no sangue ([80 mg/0,1 L0 � [mmol/46 mg]). C. No limite legal (17,4 mM), o etanol de cervejas com graduação alcoólica igual a 5% (0,86 M) estará diluído 49,4 vezes (860 mM/17,4 mM). Esta diluição repre- senta 809 mL de cerveja em 40 L de água corporal, o que equivale a 2,3 cervejas de 355 mL. D. Aproximadamente quatro horas. Com duas vezes o limite legal, uma pessoa terá 64 g de etanol ([0,16 g/0,1L] � [40 L]). Uma pessoa é capaz de metabolizar 8,4 g de etanol por hora, levando 3,8 horas para metabolizar 32 g de etanol (equivalente à quantidade que excede o limite legal). 2-12 Quanto menor a meia-vida, maior o número de átomos que diminuirão por uni- dade de tempo, aumentando o número de dpm ou curies. Se átomos radiativos estiverem presentes em quantidades equimolares, aqueles com meia-vida mais curta apresentarão maior valor de dpm ou Ci/mmol – uma atividade específica maior. 2-13 A. Uma solução é considerada neutra quando as concentrações de H� e OH� são iguais. Isto ocorre quando a concentração de cada um destes íons é igual a 10�7 M, e seu produto equivale a 10�14 M2. B. Em uma solução de NaOH de 1 mM, a concentração de OH� é 10�3M. Portanto, a concentração de H� é igual a 10�11 M, o que corresponde a um valor de pH igual a 11. [H�] � KW [OH�] � 10�14 M2 � 10�11 M 10�3 M C. Um valor de pH igual a 5,0 corresponde a uma concentração de H� igual a 10�5 M. A concentração de íons OH– nesta mesma solução será igual a 10�9 M. 2-14 Os valores de pK, do menor para o maior, serão 4, 1, 2, 3. Considere o grupo carbo- xila da cadeia lateral do aspartato, ou ácido aspártico, na superfície de uma pro- teína, na ausência de outros grupos ionizáveis (condição 1). Nestas condições, o seu valor de pK será de aproximadamente 4,5, um valor maior do que o observado no aminoácido livre, pois não sofre a influência do grupo amino carregado positi- vamente. Se esta cadeia lateral se encontrar em um ambiente hidrofóbico, no in- terior de uma proteína (condição 2), o seu valor de pK será maior, pois a presença de um grupo carregado em um ambiente hidrofóbico é desfavorável. Havendo um segundo grupo negativamente carregado neste ambiente hidrofóbico (condição 3), o valor de pK da cadeia lateral do aspartato será ainda maior devido à repulsão eletrostática. Caso exista um grupo de carga positiva neste ambiente (condição 4), a atração eletrostática favorecerá a transferência de um próton, diminuindo o valor de pK da cadeia lateral do aspartato, mesmo quando comparado ao mesmo aminoácido exposto na superfície de uma proteína (1). 2-15 Se a atividade enzimática for dependente de uma alteração no estado de proto- nação de um resíduo de histidina, esta histidina deverá estar no seu estado pro- tonado (carregado), e a enzima será ativa em valores de pH menores que o pK da histidina (geralmente entre 6,5 e 7,0). Alberts-Resp_Book.indb 8Alberts-Resp_Book.indb 8 23.11.09 10:54:3023.11.09 10:54:30 Capítulo 2 Química Celular e Biossíntese 9 2-16 Antes de uma corrida, o corredor deve respirar rapidamente. Como uma corrida de curta distância resultará em uma diminuição do pH do sangue, o objetivo antes da corrida é aumentar o pH sanguíneo, aumentando o tempo que o atleta levará para atingir o estado de fadiga. Segurar o fôlego irá aumentar a quantidade de CO2 dissolvido no sangue, deslocando o equilíbrio da reação para a direita, aumentan- do a [H�] e diminuindo o pH do sangue. Ao respirar rapidamente, a concentração de CO2 do sangue diminui e desloca o equilíbrio da reação para a esquerda, dimi- nuindo a [H�] e aumentando o pH do sangue. 2-17 Os grupos funcionais das três moléculas estão indicados e devidamente denomi- nados na Figura R2-1. 2-18 O cálculo é feito do seguinte modo (utilizando a molécula de água como exem- plo): massa da água � 3 � 10�23 g ([18g/mol] � [mol/6 � 1023 moléculas]). v � (kT/m)1/2 v � v � 3,78 � 104 cm/seg As velocidades instantâneas para as moléculas de água, glicose e mioglobina são: 3,8 � 104 cm/seg, 1,2 � 104 cm/seg e 1,3 � 103 cm/seg. Convertendo estes valo- res em km/h, uma molécula de água se desloca em uma velocidade igual a 1.360 km/h, a glicose a 428 km/h, e a mioglobina a 47 km/h. Referência: Berg HC (1993) Random Walks in Biology: Expanded Edition, p. 5-6, Princeton University Press. 2-19 A termodinâmica considera o sistema como um todo, ou seja, inclui as moléculas de água. O aumento na entropia se deve principalmente ao efeito da polimeriza- ção das unidades de tubulina (hidrofóbicas) sob as moléculas de água adjacentes (que são ordenadas na proximidade dos microtúbulos). Estas moléculas de água não estão livres para interagir com as demais moléculas de água que as rodeiam, o que resulta em um aumento da entropia do sistema, excedendo a diminuição da entropia causada pela polimerização dos microtúbulos. 2-20 Toda população de moléculas de ATP disponíveis no corpo é reciclada 1.800 vezes por dia, um pouco mais de uma vez por minuto. A conversão de 3 moles de gli- cose em CO2 gera 90 moles de ATP ([3 moles de glicose] x [30 moles de ATP/mol de glicose]). O corpo contém 5 x 10–2 mol de ATP ([2 x 10–3 mol/L] x 25 L). Como a concentração de ATP não muda, cada molécula precisa ser reciclada 1.800 vezes por dia ([90 moles de ATP/dia] / [5 x 10–2 mol de ATP]). 2-21 O corpo humano consome cerca de 70 watts. watts � 109 ATP � 5 � 1013 células � mol � 12 kcal � 4,18 � 103 J corpo 60 seg célula corpo 6 � 1023 ATP mol kcal � 69,7 J/seg � 69,7 watts corpo corpo 2-22 Escalar o monte Matterhorn a partir do topo do monte Zermatt, uma distância vertical de 2.818 m, requer 496 kcal: trabalho � 75 kg � 9,8 m � 2.818 m � J � kcal seg2 kg m2/seg2 4,18 � 103 � 495,5 kcalEste valor equivale a 1,5 barra energética. Na realidade, o corpo humano não con- verte energia em trabalho com 100% de eficiência, e sim com aproximadamente 25% de eficiência, o que aumenta a necessidade calórica para cerca de 6 barras. O hidroxila carbonil piruvato sulfidril cisteína amino carboxilato fosforil 1,3-bifosfoglicerato carboxilato grupo carboxílico fosfórico do ácido anídricoO P OC C CH 2 CH 3 SH O C O– CH 2 CH 2 CH NH 3 + HO H O––O O O C C O– O– P O––O Figura R2-1 Grupos funcionais nas mo- léculas de 1,3 bifosfoglicerato, piruvato e cisteína (Resposta 2-17). Alberts-Resp_Book.indb 9Alberts-Resp_Book.indb 9 23.11.09 10:54:3123.11.09 10:54:31 10 Capítulo 2 Química Celular e Biossíntese Referência: Frayn KN (1996) Metabolic Regulation: A Human Perspective, p. 179. Londres: Portland Press. 2-23 Sob condições anaeróbias, as células não são capazes de utilizar piruvato e NADH. Os elétrons transportados pelo NADH são transferidos para a cadeia transporta- dora de elétrons da fosforilação oxidativa; na ausência de oxigênio, contudo, estes elétrons não são utilizados, assim como o piruvato, havendo então acúmulo de piruvato e NADH. O processo de fermentação combina estas duas moléculas em lactato ou etanol, que são exportados pela célula para o ambiente extracelular. Células que não realizam fermentação convertem rapidamente as suas moléculas de NAD� em NADH, que se acumula e inibe a glicólise na etapa de conversão de gliceraldeído-3-fosfato em 1,3-bifosfoglicerato. A fermentação regenera as molé- culas de NAD� pela transferência de elétrons das moléculas de NADH para piru- vato, permitindo a continuidade da glicólise. 2-24 Na ausência de oxigênio, a energia celular é obtida pela fermentação, o que requer um maior fluxo do ciclo glicolítico para gerar quantidades suficientes de ATP. Na presença de oxigênio, a célula é capaz de gerar ATP pela fosforilação oxidativa, que gera ATP de modo mais eficaz que a glicólise, e menos moléculas de glicose são necessárias para gerar a mesma quantidade de ATP. 2-25 Não é possível reverter esta reação em condições fisiológicas. O fluxo de reações ao longo de uma via metabólica requer que os valores de ΔG de todas as etapas sejam negativos. Reverter a reação G6P � ADP → glicose � ATP, com ΔG° � 4,0 kcal/mol, requer uma proporção de [glicose] [ATP] / [G6P] [ADP] menor do que 10�2,84 (0,0015) para atingir o equilíbrio da reação (ΔG � 0). ΔG � ΔG° � 1,41 kcal/mol log [glicose] [ATP] [G6P] [ADP] 0 � 4,0 kcal/mol � 1,41 kcal/mol log [glicose] [ATP] [G6P] [ADP] log [glicose] [ATP] � �4,0 kcal/mol � �2,44 [G6P] [ADP] 1,41 kcal/mol log [glicose] [ATP] � 0,0015 [G6P] [ADP] A concentração de ATP no interior de uma célula sempre excede a concentração de ADP, impossibilitando a reversão da reação. 2-26 A remoção de fragmentos de dois átomos de carbono a partir da extremidade car- boxílica é a única possibilidade que explica a diferença entre o metabolismo de ácidos graxos de cadeia par ou ímpar. Os dois átomos de carbono terminais não são removidos do ácido fenilacético, pois o anel benzênico interfere com o pro- cesso de fragmentação através de alterações induzidas no terceiro átomo, a partir da extremidade carboxílica. Como este carbono faz parte do anel benzênico no ácido fenilacético, ele não é metabolizado. Além de explicar a diferença no metabolismo de ácidos graxos de cadeia par e ímpar, os resultados de Knoop também indicaram a direção da degradação da cadeia do ácido graxo. Se a extremidade não ácida nos ácidos graxos fosse degra- dada inicialmente, a adição do anel benzênico impediria o seu metabolismo, ou o anel benzênico seria excretado sempre na mesma forma, independentemente do número de átomos de carbono presentes na molécula de ácido graxo. Referência: Knoop F (1905) Der Abbau aromatischer Fettsäuren im Tierkörper. Beitr. Chem. Physiol. 6, 150-162. 2-27 Os experimentos de alimentação cruzada indicam que as três etapas controladas pelos produtos dos genes TrpB, TrpD e TrpE estão arranjadas na seguinte ordem: X TrpE Y TrpD Z TrpB triptofano Alberts-Resp_Book.indb 10Alberts-Resp_Book.indb 10 23.11.09 10:54:3123.11.09 10:54:31 Capítulo 2 Química Celular e Biossíntese 11 Sendo X, Y e Z intermediários não identificados da via metabólica. A habilidade da cepa TrpE – de ser alimentada pelas outras duas cepas indica que TrpD– e TrpB– acumulam intermediários mais distantes da via metabólica do que a etapa controlada pelo gene TrpE. A habilidade da cepa TrpD– de ser alimentada por TrpB– e não por TrpE – situa este gene no meio da via. Como TrpB– não é capaz de ser alimentada por nenhuma outra cepa, isso indica que este gene controla a etapa mais próxima ao triptofano. Referência: Yanofsky C (2001) Advancing our knowledge in biochemistry, genetics, and microbiology through studies on tryptophan metabolism. Anuu. Rev. Biochem. 70, 1-37. Alberts-Resp_Book.indb 11Alberts-Resp_Book.indb 11 23.11.09 10:54:3123.11.09 10:54:31 Alberts-Resp_Book.indb 12Alberts-Resp_Book.indb 12 23.11.09 10:54:3123.11.09 10:54:31 Proteínas 3 3-1 Verdadeiro. Em uma folha �, as cadeias laterais dos aminoácidos de cada uma das fitas que a compõem estão posicionadas, alternadamente, acima e abaixo do plano da folha �. Cada fita de uma folha � pode ser considerada uma hélice na qual cada aminoácido apresenta uma rotação de 180° em relação ao aminoácido adjacente. 3-2 Verdadeiro. As alças que se projetam e circundam as proteínas geralmente apre- sentam diversos grupos químicos que permitem a interação de outras moléculas através de diversas ligações químicas fracas. 3-3 Verdadeiro. As enzimas apresentam números fixos de sítios de ligação. Quando a concentração de substrato for suficiente para que todos os sítios de ligação de uma proteína estejam ocupados, a velocidade máxima de reação que esta enzima catalisa não pode ser aumentada através do aumento da quantidade de substra- to. 3-4 Falso. O número de turnover é constante, pois ele corresponde ao valor de Vmáx dividido pela concentração enzimática. Por exemplo, um aumento de duas vezes na concentração da enzima induzirá um valor de Vmáx duas vezes maior, mas não afetará o número de turnover: 2 Vmáx/2 [E] � k3. 3-5 Verdadeiro. O termo cooperatividade indica que alterações conformacionais so- fridas por uma das subunidades que compõem uma proteína com estrutura qua- ternária são comunicadas às outras subunidades idênticas da molécula, induzin- do a mesma alteração conformacional em toda a proteína. 3-6 Verdadeiro. Cada ciclo de fosforilação e desfosforilação hidrolisa uma molécula de ATP; no entanto, isto não pode ser visto como desperdício de energia. Os ciclos de adição e remoção de fosfato permitem que as proteínas tenham suas ativida- des finamente reguladas em resposta a estímulos externos que exigem alterações rápidas no estado de metabolismo da célula. 3-7 Uma vez que cada posição em uma proteína de 300 aminoácidos pode ser ocupa- da por um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural, existem 20300 (o que equiva- le a 10390) proteínas possíveis. A massa de uma destas possíveis proteínas seria: massa � 110 d � 300 a � 10390 proteínas � g a proteína 6 � 1023 d massa � 5,5 � 10370 g Portanto, a massa de proteínas ultrapassaria a massa total observada no universo (1080 g) em um fator de 10290! 3-8 Em termos gerais, uma identidade de pelo menos 30% é suficiente para a identi- ficação de proteínas homólogas nas buscas em bancos de dados. As identidades entre 20 e 30% são problemáticas, pois as proteínas identificadas como possíveis homólogas podem ser falso-positivas, uma limitação da técnica.A busca por sequências de proteínas homólogas de relacionamento evolutivo mais distante é facilitada pelo uso de sequências de aminoácidos mais curtas, pois quando se Alberts-Resp_Book.indb 13Alberts-Resp_Book.indb 13 23.11.09 10:54:3123.11.09 10:54:31 14 Capítulo 3 Proteínas utiliza sequências inteiras normalmente a identidade é menor que 30%. Nestes casos, com a sequência completa, as porções não conservadas da proteína serão predominantes na comparação entre as sequências de proteínas dos bancos de dados. 3-9 A justaposição das porções N-terminal e C-terminal do domínio kelch o identifica como sendo do tipo encaixe. Os domínios do tipo em linha são caracterizados pela posição das porções N-terminal e C-terminal em lados opostos do domínio. 3-10 A. Estes dados são consistentes com a hipótese de que o comportamento de mola da molécula de titina se deve ao desenovelamento sequencial dos seus domínios Ig. Inicialmente, o fragmento continha sete domínios Ig, havendo sete picos no gráfi- co resultante de força versus extensão. Os picos resultantes observados correspon- dem ainda ao esperado em uma perda sequencial da estrutura secundária dos domínios da proteína. A adição de um agente desnaturante elimina os picos do gráfico, pois a proteína já terá perdido a estrutura dos seus domínios Ig, aumen- tando a extensão que ela atinge por unidade de força aplicada. Quando estes do- mínios são estabilizados por ligações entre eles e, portanto, se tornam incapazes de se desenovelarem, os picos desaparecem do gráfico e a extensão por unidade de força aplicada diminui. B. O espaçamento entre os picos, de aproximadamente 25 nm, corresponde quase perfeitamente ao valor calculado para o desenovelamento sequencial dos domí- nios Ig. Um domínio enovelado ocupa 4 nm, mas, quando desenovelado, os seus 89 aminoácidos alinhados ocupam cerca de 30 nm (89 � 0,34 nm), um aumento de 26 nm. C. A presença de picos separados indica que cada domínio se desdobra quando sub- metido a uma força característica, implicando que cada domínio apresenta uma estabilidade definida. A coleção de domínios se desdobra na ordem do menos ao mais estável. Assim, é necessário um pouco mais de força a cada vez para desdo- brar o próximo domínio. D. A quebra abrupta da força reflete uma característica importante das proteínas: a cooperatividade. As proteínas tendem a perder a sua estrutura terciária e secun- dária de um modo tudo-ou-nada. Um pequeno número de ligações de hidrogênio é responsável por manter a estrutura de um domínio (Figura R3-1), e o rompi- mento destas ligações desencadeia o processo tudo-ou-nada de perda da estrutu- ra tridimensional. Referência: Rief M, Gutel M, Oesterhelt F, Fernandez JM e Gaub HE (1997) Reversible folding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Scien- ce 276, 1109-1112. 3-11 A. Estima-se que a síntese de uma proteína composta por 10.000 aminoácidos ocorra da maneira correta em 37% das vezes. PC � (fc) n � (0,9999)10.000 � 0,37 Já a síntese de cada subunidade composta por 200 aminoácidos apresentará uma taxa de sucesso de 98% (PC � [fC] n � [0,9999]200 � 0,98). A formação de uma mis- tura de subunidades em ribossomos corretos seguirá a mesma equação (PC � [fC] n � [0,98]50 � 0,37). Portanto, a formação de um ribossomo a partir de subunidades tem a mesma taxa de sucesso que a sua formação a partir de uma única proteína. Figura R3-1 Ligações de hidrogênio que mantêm o domínio enovelado na sua conformação (Resposta 3-10). As ligações de hidrogênio indicadas (linhas em cinza), quando rompidas, induzem à perda da estrutura do domínio. Por meio da comparação desta represen- tação topológica com a estrutura tridi- mensional na Figura Q3-2A (p. 151 da obra), é possível identificar as duas pe- quenas fitas � que estão envolvidas na formação destas ligações de hidrogênio. N C Alberts-Resp_Book.indb 14Alberts-Resp_Book.indb 14 23.11.09 10:54:3123.11.09 10:54:31 Capítulo 3 Proteínas 15 B. A premissa apresentada em A de que subunidades corretas e incorretas são in- corporadas ao ribossomo com igual probabilidade não é verdadeira. Qualquer erro que interfira no enovelamento correto de uma subunidade, ou na habilidade desta subunidade de se ligar às demais, a elimina da formação do ribossomo. Por- tanto, a vantagem da síntese de subunidades não está na maior taxa de sucesso de síntese, e sim em permitir que um mecanismo de controle de qualidade rejeite as subunidades incorretas eficientemente. 3-12 A. As concentrações relativas das proteínas Src normal e mutante são inversamente proporcionais ao volume em que elas estão distribuídas. A proteína mutante Src está distribuída no mesmo volume celular, que é: Vcélula � (4/3)�r 3 � 4�(10 � 10�6 m)3/3 � 4,1888 � 10�15 m3 A proteína Src normal se encontra restrita à camada de 4 nm adjacente à membra- na, que apresenta um volume igual ao da célula, menos o volume de uma esfera com um raio 4 nm menor que o raio da célula: Vcamada � Vcélula � 4 �(r � 4 nm) 3/3 � Vcélula � 4 �([10 � 10 �6 m] � [4 � 10�9 m])3/3 � (4,1888 � 10�15 m3) � (4,1888 � 10�15 m3) Vcamada � 0,0050 � 10 �15 m3 Portanto, o volume da célula é 838 vezes maior que o volume da camada de 4 nm adjacente à membrana (4,1888 � 10�15 m3/0,0050 � 10�15 m3). Mesmo considerando as regiões internas da célula às quais a proteína Src mu- tante não tem acesso, como núcleo e organelas, a proteína mutante ainda apre- sentará concentração algumas ordens de magnitude a menos que a proteína Src normal. B. A proteína mutante Src não causa a proliferação celular, pois está presente em concentrações mais baixas na região onde o seu alvo X se encontra. Esta afirmati- va pode ser quantificada considerando-se o equilíbrio de ligação de Src e seu alvo X: Src � X → Src � X K � [Src – X] [Src] [X] A baixa concentração da proteína mutante nas regiões adjacentes à membrana irá deslocar o equilíbrio no sentido dos componentes livres, reduzindo a quantidade de complexos formados, resultando na ausência de efeito da proteína mutante em induzir a proliferação celular. 3-13 O anticorpo se liga à segunda proteína com uma constante de equilíbrio, K, igual a 5 � 107 M�1. Uma possível solução para este tipo de problema é considerar o valor de ΔG° relacionado ao valor do log K através de um fator ~2,3 RT, que equivale a �1,4 kcal/mol a 37°C. Desta forma, um aumento de 10 na constante de equilíbrio (um aumento de 1 no valor de log K) corresponde a um decréscimo de �1,4 kcal/mol no valor de ΔG°. Um aumento de 100 na constante de equilíbrio corresponde a um decréscimo de �2,8 kcal/mol no valor de ΔG°, e assim sucessivamente. Esta relação permite uma estimativa rápida das alterações induzidas na constante de equilíbrio por alterações na energia livre, e vice-versa. No problema apresentado, o aumento total no valor de ΔG° é igual a 2,8 kcal/mol, o que requer uma dimi- nuição de 100 vezes no valor de K, e a constante de equilíbrio para a ligação da segunda proteína é igual a 5 � 107 M�1. A solução deste problema requer o cálculo da variação da energia livre repre- sentada pela ligação da primeira proteína: ΔG° � �2,3 RT log K Substituindo K: Alberts-Resp_Book.indb 15Alberts-Resp_Book.indb 15 23.11.09 10:54:3123.11.09 10:54:31 16 Capítulo 3 Proteínas ΔG° � �2,3 (1,98 � 10�3 kcal/K mol) (310 K) log (5 �109) ΔG° � �1,41 kcal/mol � 9,7 ΔG° � �13,68 kcal/mol A energia livre associada à ligação da segunda proteína é obtida com a adição de 2,8 kcal/mol à variação de energia livre para a ligação da primeira proteína, com valor igual a –10,88 kcal/mol. Portanto, a constante de equilíbrio para a ligação da segunda proteína é: log K � (�10,88 kcal/mol)/(�1,41 kcal/mol) � 7,7 K � 5 � 107 M�1 3-14 Os valores calculadospara a fração ligada de tmRNA em função da concentração de SmpB são mostrados na Tabela R3-1. Também são mostrados os valores arre- dondados, mais fáceis de memorizar. Estas relações são úteis não apenas quando pensamos em valores de Kd, mas também para a cinética enzimática. A velocidade de reação expressa como uma fração da velocidade máxima é: velocidade/Vmáx � [S]/ ([S] � Km) tendo a mesma forma da equação para a fração ligada. Portanto, quando a con- centração de substrato, [S], é 10 vezes maior que a constante de Michaelis, Km, a velocidade é igual a 90% da velocidade máxima, Vmáx. Quando [S] é 100 vezes menor que o valor de Km, a velocidade é 1% da Vmáx. Estas relações também são válidas para a dissociação de grupos ácidos, HA, como função dos valores de pH. Quando o valor de pH se encontra 2 unidades acima do valor de pK, 99% dos grupos ácidos estão ionizados. Quando o valor de pH é 1 unidade menor que o valor de pK, 10% destes grupos estão ionizados. 3-15 Quando [S] � zero, a velocidade é igual a 0/Km e, portanto, igual a zero. Quando [S] � Km, a razão de [S]/([S] � Km) é igual a ½, e a velocidade é igual a 1/2 Vmáx. Em valores infinitos de [S], a razão [S]/([S] � Km) é igual a 1, e a velocidade é igual a Vmáx. 3-16 A. Uma enzima composta inteiramente por D-aminoácidos apresentará a mesma conformação da enzima composta por L-aminoácidos, sendo a sua imagem espe- cular exata. B. Espera-se que esta enzima correspondente à imagem especular seja capaz de re- conhecer a imagem especular do seu substrato. Desta forma, uma “D-hexoina- se” adicionaria um fosfato a uma molécula de l-glicose, mas não à molécula de d-glicose. Este experimento foi conduzido com a protease do HIV. A protease especular é capaz de reconhecer e clivar a estrutura especular do seu substrato. Referência: Milton RC, Milton SC e Kent SB (1992) Total chemical synthesis of a D-enzyme: the enantiomers of HIV-1 protease show reciprocal chiral substrate specificity. Science 256, 1445-1448. 3-17 A hemoglobina é capaz de ligar moléculas de oxigênio de maneira eficaz nos pul- mões, pois ali a pressão parcial de oxigênio é alta. Nos tecidos, a pressão parcial de oxigênio é mais baixa, pois ele está presente em concentrações menores, uma vez que é consumido constantemente no metabolismo. Em condições de menor pressão parcial de oxigênio, a hemoglobina libera estas moléculas. Este fenômeno, que é causado pelo equilíbrio de ligação, é favorecido por interações alostéricas entre as quatro subunidades que compõem uma molécula funcional de hemoglo- bina. 3-18 Uma hipótese viável seria o excesso de AMP mediar a inibição por retroalimenta- ção da enzima que converte E em F, e o excesso de GMP mediar a inibição por re- troalimentação da etapa que converte E em H. O intermediário E, que acumularia pela inibição destas enzimas, por sua vez mediaria a inibição por retroalimenta- ção da etapa que converte R5P em A. Diversas vias metabólicas, que se subdivi- Tabela R3-1 Valores calculados para a fração ligada em função da concentração de proteína (Resposta 3-14). [Proteína] Fração Ligada (%) Valores arredondados 104 Kd 99,99 99,99 103 Kd 99,9 99,9 102 Kd 99 99 101 Kd 91 90 Kd 50 50 10-1 Kd 9,1 10 10-2 Kd 0,99 1 10-3 Kd 0,099 0,1 10-4 Kd 0,0099 0,01 Alberts-Resp_Book.indb 16Alberts-Resp_Book.indb 16 23.11.09 10:54:3123.11.09 10:54:31 Capítulo 3 Proteínas 17 dem em duas ou mais vias distintas, são reguladas desta maneira. No entanto, a via de síntese de nucleotídeos de purina é regulada de um modo distinto (Figura R3-2). As moléculas de AMP e GMP regulam as etapas de E para F e de E para H, como descrito anteriormente, mas também regulam a etapa que converte R5P em A. Para evitar que o excesso de um destes nucleotídeos seja capaz de inibir toda a via, cada um deles, individualmente, é capaz de inibir a enzima que converte R5P em A em apenas 50% da sua atividade normal; somente quando os dois nu- cleotídeos estão presentes em excesso é que esta enzima – e toda a via metabólica subsequente – é completamente inibida. Figura R3-2 Padrão de inibição da via metabólica de síntese de nucleotídeos de purina (Resposta 3-18). R5P A B C D E H I F G 50% 50% 100% 100% AMP GMP Alberts-Resp_Book.indb 17Alberts-Resp_Book.indb 17 23.11.09 10:54:3123.11.09 10:54:31 Alberts-Resp_Book.indb 18Alberts-Resp_Book.indb 18 23.11.09 10:54:3123.11.09 10:54:31 DNA, Cromossomos e Genomas 4 4-1 Verdadeiro. Os homens possuem um total de 24 cromossomos diferentes (22 au- tossomos, um X e um Y) e as mulheres 23 cromossomos diferentes (22 autosso- mos e 2 cromossomos X). 4-2 Verdadeiro. Camundongos e humanos divergiram a partir de um ancestral co- mum. Suas sequências de DNA sofreram mutações aleatórias. As regiões que fo- ram conservadas são aquelas com funções importantes. Quando as mutações têm efeitos deletérios, a seleção natural se encarrega da eliminação. 4-3 Verdadeiro. A carga negativa do esqueleto de DNA pode ser neutralizada pelas cargas positivas das cadeias laterais básicas de lisina e arginina, que são os amino- ácidos presentes no cerne das histonas. 4-4 Falso. O movimento dos nucleossomos ao longo do DNA ou mesmo entre seg- mentos de DNA pode ser catalisado pelos complexos de remodelamento da cro- matina utilizando a energia da hidrólise de ATP. 4-5 Verdadeiro. A duplicação gênica permite que um dos dois genes sofra divergência, isto é, adquira funções diferentes, mas relacionadas. 4-6 O resultado não surpreenderia, pois o DNA do M13 é de fita simples, onde não ocorre o pareamento de A com T e G com C. Já em DNAs de fita dupla vale a regra de equivalência de moles entre A-T e G-C. 4-7 Os carbonos na ribose são numerados no sentido horário, iniciando com C1´, o carbono ao qual a base se liga, e terminando com C5´. 4-8 Como C sempre forma par com G nos DNAs de fita dupla, então a quantidade de G é igual a de C, ou seja, 20% em base molar. O restante é a quantidade de A e T, que também se equivalem, sendo de 30% cada. 4-9 O cromossomo intermediário e os locais de inversão estão indicados na Figura R4-1. 4-10 Um total de 1.360 nm de DNA dúplex reduzido a 50 nm de fibra de cromatina ([20 nucleossomos] x [200 pb/nucleossomo] x [0,34 nm/pb] = 1.360 nm) representa uma condensação de 27 vezes (1.360 nm/50 nm = 27,2). Esse nível de empacota- mento representa 0,27% (27/10.000) da condensação total que ocorre na mitose. Figura R4-1 Inversões e cromossomo intermediário na evolução do cromos- somo 3 em orangotangos e humanos. (Resposta 4-9).Orangotango Primeira inversão Intermediário Segunda inversão Humano Alberts-Resp_Book.indb 19Alberts-Resp_Book.indb 19 23.11.09 10:54:3123.11.09 10:54:31 20 Capítulo 4 DNA, Cromossomos e Genomas 4-11 Os efeitos biológicos da metilação das histonas dependem do local da metilação e dos aminoácidos ao redor do sítio. Isso determinará quais proteínas efetoras se ligarão e seus efeitos. 4-12 A presença de dois centrômeros torna o cromossomo instável, pois os microtúbu- los de cada polo se ligariam aos cinetocoros que estão associados com cromátides diferentes. Quando isso ocorre, cada cromátide será puxada para os polos opostos dos fusos com força suficiente para quebrar os cromossomos. 4-13 Todas as proteínas HP1 se ligam especificamente à forma dimetilada na lisina –9 do peptídeo N-terminal H3. Essa associação sugere que esta forma seja encontra- da na heterocromatina. Referência: Lachner M, O’Carroll D, Rea S, Mechtier K e Jenuwein T (2001) Methylation of H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature 410, 116-120. 4-14 Como os blocos dos gene Hox são ricos em segmentos não codificantes conser- vados e, provavelmente, elementos reguladores, as inserções de elementostrans- poníveis nesses blocos são eliminadas por seleção de purificação. Essas inserções provavelmente interrompem a regulação apropriada dos genes Hox. Referência: Lander ES et al. (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860-921. Alberts-Resp_Book.indb 20Alberts-Resp_Book.indb 20 23.11.09 10:54:3223.11.09 10:54:32 Replicação, Reparo e Recombinação de DNA 5 5-1 Esta afirmação pode ser verdadeira. A cada divisão celular existe a chance de ocorrerem mutações (6,4 mutações cada vez que o genoma é copiado). Dessa for- ma, normalmente duas células-filhas serão diferentes uma da outra e diferentes da célula parental. Ocasionalmente, o genoma pode ser copiado perfeitamente e dar origem a células-filhas idênticas. 5-2 Verdadeiro. Se a forquilha de replicação se mover 500 pares de nucleotídeos por segundo, o DNA à frente deve rotar a 48 revoluções por segundo ou 3.000 revolu- ções por minuto. 5-3 Verdadeiro. Considerando uma fita-molde simples e o sentido da transcrição sem- pre 5’-3’, a fita-líder sempre encontra uma fita descontínua, independentemente da origem. 5-4 Falso. O reparo de um erro em ambas as fitas de um dúplex requer a informação de uma cromátide-irmã ou de um homólogo, e o reparo de erro em uma fita simples depende apenas da informação contida nas duas fitas do DNA de hélice dupla. 5-5 A variação na frequência dos mutantes depende do momento em que ocorreu a mutação. Culturas com apenas uma mutação a adquiriram na última geração e culturas com muitas mutações a adquiriram na fase inicial do crescimento, antes de se dividirem várias vezes. Referência: Luria SE e Delbruck M (1943) Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics 28, 491-511. 5-6 Se as enzimas de reparo não distinguissem entre a fita-molde e a recém-sinte- tizada, haveria uma chance de apenas 50% do erro ser corrigido, resultando em 50% de mutantes e 50% de não mutantes na progênie, número equivalente ao do reparo indiscriminado. 5-7 A maioria dos nucleotídeos pareados incorretamente é removida pela exonuclea- se de reparo associada com a DNA-polimerase, mas as DNA-polimerases também são capazes de estender um iniciador mal pareado. Referência: Johnson KA (1993) Conformational coupling in DNA polymerase fi- delity. Annu. Rev. Biochem. 62, 685-713. 5-8 A forma de H representa a clivagem que ocorreu em um sítio dentro da bolha. Se as estruturas forem colocadas em ordem de acordo com o tamanho crescente da bolha (Figura R5-1), poderá ser visualizado um caso de replicação bidirecional a partir de uma única origem de replicação, provavelmente. Não se pode descartar a possibilidade de duas origens de replicação a pontos equidistantes do sítio de restrição usado. Isso pode ser esclarecido repetindo o experimento e utilizando uma enzima de restrição diferente. 5-9 Em vários locais nas células de vertebrados, a sequência CG é metilada. A desa- minação espontânea do C metilado dá origem a um T. Esse T é removido por uma DNA-glicosilase que o reconhece como mal pareado. Com o tempo, as mutações elevadas dos dinucleotídeos CG resultaram em sua perda preferencial, levando a sua subrepresentação no genoma humano. Figura R5-1 Replicação bidirecional a par- tir de uma única origem (Resposta 5-8). Alberts-Resp_Book.indb 21Alberts-Resp_Book.indb 21 23.11.09 10:54:3223.11.09 10:54:32 22 Capítulo 5 Replicação, Reparo e Recombinação do DNA 5-10 Caso as quebras com reparo impreciso estejam distribuídas aleatoriamente pelo genoma, então é esperado que 2% alterem genes ou reguladores importantes. Desta forma, as funções de cerca de 40 genes estariam comprometidas em cada célula. Como o genoma humano é diploide, para alguns loci o alelo não afetado seria suficiente para a função normal da proteína, já para outros a função poderia ser afetada. Referência: Lieber MR, Ma Y, Pannicke U e Schwarz K (2003) Mechanism and regulation of human non-homologous DNA end-joining. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 712-720. 5-11 Duas versões da junção Holliday dupla resultante de uma invasão de fitas estão mostradas na Figura R5-2. 5-12 A recombinação irrestrita entre sequências repetidas rearranjaria rapidamente o genoma, o que levaria a um grande número de descendentes inviáveis, colo- cando a espécie em risco. Essa calamidade é evitada pelo sistema de reparo de erros. As sequências repetidas diferem um pouco umas das outras. Quando os intermediários da recombinação se formam entre essas sequências, muitos erros estão presentes nas regiões de heterodúplex. Esses erros em grande quantidade são detectados pelo sistema de reparo, que aborta o processo de recombinação assegurando que as sequências em recombinação sejam bastante idênticas. 5’ 5’ 5’ 5’ ou 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ Figura R5-2 Junção Holliday dupla (Res- posta 5-11). A nova síntese de DNA está indicada por linhas onduladas. Alberts-Resp_Book.indb 22Alberts-Resp_Book.indb 22 23.11.09 10:54:3223.11.09 10:54:32 Como as Células Leem o Genoma: Do DNA à Proteína 6 6-1 Verdadeiro. Quando ocorre um erro na duplicação do DNA, isso poderá afetar to- das as células que se originarem a partir da célula que carrega a alteração. No caso de células mitóticas, as células-filhas e as gerações celulares posteriores serão po- tencialmente afetadas, e no caso de células da linhagem germinativa, o novo or- ganismo que for gerado carregará a alteração em todas as suas células. Quando se consideram erros de transcrição, apenas algumas moléculas de RNA produzidas vão conter estes erros. Como as moléculas de RNA geralmente apresentam uma meia-vida curta, sendo degradadas com relativa rapidez, e como também existem outros mecanismos de controle de qualidade em pontos posteriores da cascata, alterações na transcrição são menos “perigosas” do que alterações na duplica- ção do DNA. Entre as evidências que apontam para esta diferença entre as con- sequências de alterações sobre a duplicação e a transcrição salienta-se o fato de RNA-polimerases apresentarem uma taxa de erro de aproximadamente um erro a cada 104 nucleotídeos copiados, ao passo que as DNA-polimerases cometem um erro a cada 107 nucleotídeos. Assim, em termos de seleção natural, parece que erros cometidos por RNA-polimerases são mais tolerados do que erros cometidos por DNA-polimerases. 6-2 Falso. As sequências dos íntrons apenas são potencialmente menos importantes se não for considerada a ocorrência de splicing alternativo. Além disso, os íntrons devem ser removidos com total precisão para que não ocorram alterações na fase de leitura do mRNA resultante e consequente tradução de proteínas alteradas. Um outro fator associado aos íntrons tem relação com as sequências de microRNAs, que são sequências reguladoras da expressão gênica. Como pode ser percebido, a própria afirmação de que os íntrons são “lixo” genético está inadequada. 6-3 Falso. O pareamento oscilante ocorre entre a terceira posição do códon e a primei- ra posição do anticódon. Lembre-se sempre que a contagem dos nucleotídeos é feita na direção de 5� para 3� da fita de ácidos nucleicos que está sendo considera- da. 6-4 Falso. Este argumento sempre levou em consideração que poucos tipos de reações estão representados nas ribozimas das células atuais, mas sabe-se que muitos processos catalíticos nas células atuais são realizados por ribozimas (a tradução é o melhor exemplo). Além disso, experimentalmente já foi possível identificar diversas ribozimas com capacidades de catálise relativas a uma ampla gama de reações biológicas e tão ou quase tão eficientes quanto enzimas proteicas. Se as ri- bozimas estão subrepresentadas nas células modernas isso provavelmente ocorra devido à disponibilidade de 20 aminoácidos, em contrapartida às quatro bases.Essa diferença entre os componentes de ácidos nucleicos e proteínas permite po- tencialmente que as enzimas proteicas utilizem um número maior de estratégias catalíticas e lhes fornece maior possibilidade de ligação a diferentes substratos. 6-5 Na Figura Q6-1 (p. 409, do original), a RNA-polimerase deve estar se movimentan- do da direita para a esquerda e não apresenta possibilidade de girar livremente em torno da fita-molde, pois pode-se observar tanto supertorções positivas, a sua frente (representando uma compactação), quanto supertorções negativas, atrás dela (representando relaxamento da fita de DNA). Isso só está ocorrendo porque, Alberts-Resp_Book.indb 23Alberts-Resp_Book.indb 23 23.11.09 10:54:3223.11.09 10:54:32 24 Capítulo 6 Como as Células Leem o Genoma: Do DNA à Proteína como salientado anteriormente, algo impede que a RNA-polimerase gire livre- mente em torno do molde à medida que se movimenta sobre o DNA. Caso não houvesse esse impedimento, a RNA-polimerase poderia girar sobre a fita de DNA e não haveria nem compactação e nem relaxamento da fita e, consequentemente, não haveria formação das supertorções. Referência: Liu LF e Wang JC (1987) Supercoiling of the DNA template during transcription. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 84, 7024-7027. 6-6 A fosforilação do CTD permite o início da transcrição, pois libera a RNA-poli- merase das outras proteínas, fazendo com que ela possa movimentar-se sobre a fita-molde. Ao ocorrer a fosforilação do CTD, e a consequente dissociação destas proteínas, criam-se as condições para que um outro grupo de proteínas se asso- cie à RNA-polimerase. Estas novas proteínas associadas à RNA-polimerase são de extrema importância para o processamento da fita de RNA que está sendo sin- tetizada, e entre as funções que desempenham pode-se citar o capeamento da extremidade 5’, o splicing de íntrons e a poliadenilação da extremidade 3’. 6-7 Para responder esta questão, deve-se inicialmente considerar que a fase de leitura de qualquer um dos transcritos maduros originados é dada pelo éxon 1. Assim, seja qual for a sequência ou o número de nucleotídeos dos demais éxons, impre- terivelmente a fase de leitura já estará estabelecida quando a maquinaria de tra- dução alcançar um ponto determinado qualquer. As afirmações A e B “podem” ser verdadeiras, mas não são “obrigatoriamente” verdadeiras. Tanto no caso dos éxons 2 e 3 quanto no caso dos éxons 7 e 8, o importante é que a fase de leitura de- finida não seja alterada, visto que a sequência proteica deve ser a mesma para os segmentos do mRNA que correspondem aos éxons 1 e 10. Assim, se for utilizado o éxon 2 ou o éxon 3 (ou o 7 versus o 8), o importante é que a “entrada” no éxon a seguir respeite a fase de leitura normal (ou padrão) para aquele éxon, e isso só poderá ocorrer seguindo-se obrigatoriamente a afirmação C, ou seja, os éxons al- ternativos devem possuir um número de nucleotídeos que, quando dividido por três (o número de nucleotídeos em um códon), apresente o mesmo resto. Pode-se testar este exercício visto que a sequência do gene da -tropomiosina é conhe- cida: tanto o éxon 2 quanto o éxon 3 contêm o mesmo número de nucleotídeos (126), que é divisível por três, sem resto, e portanto permitem a entrada no éxon seguinte na mesma fase. Os éxons 7 e 8 também contêm o mesmo número de nucleotídeos, que dividido por três fornece um resto igual a um. Conforme salien- tado anteriormente, apesar de conterem o mesmo número de nucleotídeos (o que parece dar razão à resposta A), este fato não é obrigatório. Se o éxon 2 tivesse 126 nucleotídeos e o éxon 3 possuísse 129 nucleotídeos, a entrada no éxon seguinte ocorreria na mesma fase de leitura. 6-8 Como está sendo considerado que todas as mutações envolvem uma única altera- ção nucleotídica, consultando uma Tabela do código genético pode ser concluído que só os seguintes códons poderiam estar envolvidos: GUG para valina, GCG para alanina, AUG para metionina e ACG para treonina. Para que houvesse isola- mento de um mutante valina para treonina em um único passo, seria necessário que dois nucleotídeos adjacentes sobre o códon GUG (valina) fossem alterados (o primeiro G para A e o U para C), originando o ACG que codifica para treoni- na. Deve ser considerado que, apesar de estarmos trabalhando com mutagênese induzida, cada uma das alterações, individualmente, é resultante de um evento relativamente pouco frequente e que, portanto, a ocorrência de dois eventos de mutação em dois nucleotídeos adjacentes seria ainda menos frequente; ou seja, um duplo mutante deve ser bastante raro. 6-9 A tradução depende do encaixe dos tRNAs carregados no sítio adequado, encaixe este determinado pelo pareamento correto entre códon e anticódon. O EF-Tu po- siciona um tRNA-aminoacil (o tRNA carregado) no sítio aceptor do ribossomo e sofre hidrólise do GTP ligado, o que faz com que ele deixe o sítio, abandonando o tRNA-aminoacil. Como a taxa de hidrólise do GTP é mais rápida quando um pa- reamento códon-anticódon correto está formado, se um tRNA-aminoacil pareado incorretamente encontra-se no sítio aceptor, o GTP do EF-Tu demora mais tempo Alberts-Resp_Book.indb 24Alberts-Resp_Book.indb 24 23.11.09 10:54:3223.11.09 10:54:32 Capítulo 6 Como as Células Leem o Genoma: Do DNA à Proteína 25 para ser hidrolisado e, consequentemente, há uma maior possibilidade de que o tRNA-aminoacil deixe o sítio aceptor sem que tenha depositado ali sua carga. Este é, portanto, o primeiro momento de parada para controle da exatidão da síntese. O segundo momento refere-se ao tempo existente entre a dissociação do EF-Tu e a acomodação completa do tRNA no sítio A. Este intervalo também é menor quando há um pareamento correto entre códon-anticódon. Assim, tRNAs con- tendo um pareamento correto se acomodam no sítio A mais rapidamente (devido ao maior número de ligações de hidrogênio entre códon-anticódon), enquanto tRNAs pareados incorretamente apresentarão um maior potencial para a disso- ciação. 6-10 As proteínas normais e adequadamente dobradas possuem a maior parte dos aminoácidos hidrofóbicos no interior de sua estrutura, distante da água. É pos- sível encontrar proteínas com porções hidrofóbicas expostas, mas em geral estas proteínas correspondem a subunidades cuja formação de complexos com outras subunidades leva ao sequestro dos aminoácidos hidrofóbicos. Como geralmente não se encontram porções hidrofóbicas extensas na superfície de proteínas nor- mais (o que parece ser bastante lógico devido à necessidade de constante intera- ção das proteínas com seu microambiente), a presença deste tipo de região indi- ca que algo está errado na conformação da proteína em questão. Diversas são as possíveis razões para a presença de porções hidrofóbicas extensas na superfície de uma proteína, tais como um dobramento incorreto devido à síntese truncada da proteína ou a ocorrência de degradação ou outro incidente após sua saída do ribossomo. Pode-se imaginar também que esta é uma subunidade que ainda não encontrou seu par, seja devido a algum desequilíbrio na taxa de expressão das diferentes subunidades de um dado complexo proteico ou devido à incapacidade de interação com a subunidade adequada. Seja qual for a razão, estas proteínas serão identificadas pelas chaperonas. 6-11 As chaperonas são proteínas que desempenham uma atividade biológica pela interação com outras moléculas e consequentemente também devem ser dobra- das sob uma conformação específica e adequada para seu funcionamento. Como qualquer outra proteína, as chaperonas também são sintetizadas nos ribossomos. Quando uma proteína está sendo sintetizada nos ribossomos, ela entra em con- tato com as chaperonas Hsp70 e semelhantes a Hsp60, que as auxiliam a adotar um dobramento correto. As chaperonas que se encontram nos ribossomos não selecionam as moléculasque irão auxiliar de acordo com a função que eventual- mente desempenharão (seria impossível para as proteínas desempenharem suas funções no ribossomo, mesmo antes de estarem adequadamente dobradas). As- sim, sejam quais forem as moléculas que estão sendo sintetizadas (mesmo chape- ronas), elas serão auxiliadas no processo de dobramento por chaperonas Hsp70 e semelhantes a Hsp60 adequadamente dobradas que já estão presentes. Um im- portante ponto a salientar é que, na divisão celular, as células-filhas devem herdar uma certa quantidade de moléculas chaperonas funcionais da célula original para que possam dar seus primeiros passos no processo de síntese de proteínas ade- quadamente dobradas. 6-12 O RNA é capaz de atuar tanto no estoque da informação genética, atividade que ainda desempenha em certos organismos, como determinados vírus, quanto na catálise de reações químicas, atividade representada pelas ribozimas. Ou seja, o RNA apresenta características que o aproximam tanto do DNA quanto das proteí- nas. O somatório destas características nos permite imaginar um processo original de duplicação de moléculas de RNA que aliasse a atividade catalítica à manutenção desta informação (referente à capacidade catalítica) nas moléculas-filhas. A con- tinuidade deste processo de duplicação, a geração de novas moléculas-filhas e a incorporação de novas informações representariam os passos iniciais da evolução da vida naquele que é chamado o “mundo de RNA”. Como ainda hoje moléculas de RNA podem ser observadas atuando como catalisadoras de diferentes reações fundamentais nas células, esta proposta é bastante atraente e parece viável. Apesar de poder estocar informação, o RNA é uma molécula muito mais frá- gil que o DNA. Geralmente composta por uma fita simples, a molécula de RNA é mais sensível a lesões do que o DNA. No RNA, o grupo hidroxila no carbono 2 do Alberts-Resp_Book.indb 25Alberts-Resp_Book.indb 25 23.11.09 10:54:3223.11.09 10:54:32 26 Capítulo 6 Como as Células Leem o Genoma: Do DNA à Proteína açúcar ribose é um agente para a catálise da ligação fosfodiéster 3’-5’, que une os nucleotídeos adjacentes. Como o DNA usa desoxirribose, escapa deste mecanis- mo de quebra da cadeia. Além disso, como a hélice dupla do DNA é composta por duas fitas complementares, no caso de lesão ou mesmo de incorporação de um nucleotídeo errôneo durante o processo de duplicação do DNA, há a possibilida- de de que estes danos sejam reparados eficientemente pela comparação com a sequência da fita complementar. A própria composição de bases do DNA torna-o mais eficiente como estoque mais estável de informação. O uso de timina no DNA (no RNA é usada a uracila) estabelece uma proteção contra os efeitos da deamina- ção. A deaminação de T dá origem a uma base anormal (metil C), que é facilmente identificada como estranha aos ácidos nucleicos, ao passo que a deaminação de U dá origem a um C, que é uma base normalmente presente. 6-13 O sistema de complementaridade reversa faz com que uma molécula comple- mentar a este RNA possua uma sequência que formará um grampo bastante se- melhante ao desta molécula, como ilustrado na Figura R6-1. As estruturas destas duas moléculas em grampo serão bastante semelhantes, sendo idênticas nas regiões de fita dupla que envolvem pareamentos de base GC e AU tradicionais. As regiões de fita simples seriam distintas entre as duas molé- culas em grampo. Além dos pareamentos tradicionais de base (GC e AU), no RNA pareamentos GU também podem estar presentes e são estáveis. Desta forma, a molécula complementar à sequência de RNA que foi dada nesta questão formaria um grampo com um pareamento a mais do que o grampo da molécula original. Essa diferença está representada na Figura R6-1. 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ G GCACUCCGUCGGCAUGC CGUGAGGCAGCCGUACG C C C C U G G G A C U A C C G U G C C C C G G G A C G G A A GU U 3’ Figura R6-1 Estruturas em grampo formadas por uma fita de RNA, cuja se- quência foi dada na Questão 6-13, e sua fita complementar (sequência inferida a partir da sequência de RNA original for- necida). Na parte central da figura estão ilustradas as sequências de RNA de fita simples (emparelhadas para evidenciar sua complementaridade), e acima e abaixo estão ilustradas as respectivas estruturas em grampo derivadas. O pa- reamento incomum GU na estrutura em grampo, abaixo do dúplex, está salien- tado em um quadro tracejado. Alberts-Resp_Book.indb 26Alberts-Resp_Book.indb 26 23.11.09 10:54:3223.11.09 10:54:32 Controle da Expressão Gênica 7 7-1 Verdadeiro. Tanto o motivo hélice-alça-helice quanto o motivo zíper de leucina são motivos estruturais que permitem a formação de dímeros de proteínas regu- ladoras, de maneira que cada subunidade do par possa se posicionar no sulco maior da cadeia de DNA. 7-2 Falso. Apesar de existirem numerosos exemplos de rearranjos reversíveis como mecanismo regulador em procariotos, não existem evidências de que o mesmo ocorra em mamíferos. 7-3 Verdadeiro. Nas regiões não metiladas do genoma, a deaminação espontânea da citosina em uracila pode ser prontamente reconhecida e reparada. No entanto, a deaminação da base 5-metil-citosina origina uma timina, uma base de ocorrência normal no DNA, o que dificulta o reconhecimento deste dano pela maquinaria de reparo celular. Consequentemente, dinucleotídeos CG metilados foram elimina- dos da linhagem germinativa durante a evolução, deixando as chamadas “ilhas CG” associadas às sequências de promotores ativados. 7-4 Cada fosfato adicionado altera a carga da proteína em uma unidade, mas tem pou- co efeito sobre a sua massa molecular. Como consequência, as proteínas que di- ferem apenas no número de fosfatos adicionados irão apresentar a mesma massa, mas diferentes pontos isoelétricos, formando um conjunto de bandas horizontais, conforme mostrado na Figura R7-1. É importante ressaltar que um conjunto de bandas horizontais não prova que estas proteínas estejam relacionadas por fos- forilação; podem ser proteínas de mesma massa molecular e pontos isoelétricos distintos. Para resolver este problema, é possível tratar as amostras com fosfatase antes da separação por eletroforese. 7-5 A expressão gênica de células concerosas varia em apenas alguns oncogenes e genes supressores de tumores. Comparando a abundância de centenas a milha- res de mRNAs, como ocorre nos microarranjos de DNA, os padrões de expressão dos genes não alterados (a grande maioria) permitem a identificação do tecido de origem do câncer. 7-6 Sob condições específicas (mesma concentração de DNA e de proteínas regulado- ras), uma proteína encontrará o seu sítio de reconhecimento com a mesma eficá- cia no núcleo de uma célula eucariótica e no interior de uma bactéria. Considere o volume do núcleo de uma célula eucariótica, que é diretamente comparável ao interior de uma bactéria. Nestes volumes aproximados, a habilidade de uma pro- Figura R7-1 Proteínas em um gel bidi- mensional que podem diferir entre si apenas pelo número de fosfatos ligados (Resposta 7-4). Um pequeno conjunto de bandas horizontais, que pode es- tar relacionado por fosforilação, está destacado. Nem todos os conjuntos de proteínas estão indicados. m en or ácido básico m ai or Alberts-Resp_Book.indb 27Alberts-Resp_Book.indb 27 23.11.09 10:54:3223.11.09 10:54:32 28 Capítulo 7 Controle da Expressão Gênica teína reguladora de encontrar o seu sítio de ligação é equivalente. Desde que as concentrações de DNA e de proteínas reguladoras sejam as mesmas, o volume total da célula não fará diferença. Referência: Ptashne M (1986) A Genetic Switch: Gene Control and Phage λ, p. 114. Oxford, UK: Blackwell Scientific Press. 7-7 A. Algumas das moléculas de RNA-polimerasedesviaram do fluxo principal, pois se ligam ao DNA e deslizam antes de se desligarem e retornarem ao fluxo prin- cipal das moléculas. Esta ligação não deve ser específica, pois as moléculas de RNA-polimerase se deslocam por longas distâncias de DNA. Algumas regiões da molécula de RNA-polimerase, normalmente envolvidas na ligação a sequências promotoras, também estão envolvidas no seu deslocamento pela cadeia de DNA, pois esta ligação não específica é eliminada quando a RNA-polimerase encontra uma região da cadeia de DNA que contenha uma sequência promotora forte. B. O deslocamento ao longo da cadeia de DNA permite que proteínas que se ligam ao DNA em locais específicos possam encontrar seus alvos muito mais rapida- mente do que seria esperado através de uma difusão tridimensional, pois reduz a dimensão de busca pela região de ligação para apenas uma. Acredita-se que a maior parte das proteínas que se liga ao DNA em locais específicos acelere a sua ligação por deslocamento pela cadeia de DNA e transferência entre segmentos da cadeia. C. Se as sequências-alvo estiverem presentes em moléculas curtas de DNA, o tempo de busca por estas sequências será lento e muito próximo ao de uma busca tridi- mensional. Por outro lado, se estas sequências-alvo estiverem presentes em lon- gas moléculas de DNA, esta busca será acelerada pelo processo de deslocamento. Desta forma, proteínas que se ligam ao DNA em locais específicos encontrarão seus alvos mais rapidamente em uma população de longas moléculas de DNA. Referências: Kabata H, Kurosawa O, Arai I, Washizu M, Margarson SA, Glass RE e Shimamoto N (1993) Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science 262, 1561-1563. Shimamoto N (1999) One-dimension diffusion of proteins along DNA. J. Biol. Chem. 274, 15293-15296. 7-8 Um conjunto de células especializadas, localizadas no hipotálamo – as células do núcleo supraquiasmático (SCN, do inglês suprachiasmatic nucleus) – regula o ritmo circadiano. Estas células recebem estímulos da retina, não dos cones e bas- tonetes – as células responsáveis pela percepção da luz – mas sim de um subcon- junto de células do gânglio da retina, que também respondem à luz. Estes sinais originados na retina chegam às células do SCN, fornecendo informações sobre o ciclo de claro e escuro. Nas pessoas completamente cegas, estas informações do ciclo claro e escuro não chegam ao SCN, e estas células funcionam então em um ritmo próprio, um pouco mais longo que 24 horas, não reguladas por estímulos externos. Pessoas cegas normalmente apresentam períodos de insônia ou de sono durante o dia, consequência de oscilações no ritmo circadiano. Referência: Sack RL, Brandes RW, Kendall AR e Lewy AJ (2000) Entrainment of free-running circadian rhythms by melatonin in blind people. N. Engl. J. Med. 343, 1114-1116. 7-9 Estes resultados indicam que a síntese tecido-específica da ApoB100 nas células do fígado e da proteína ApoB48 nas células do intestino é resultado da diferença no processamento dos transcritos de RNA. Os resultados apresentados na Tabela Q7-1 (p. 498 da obra) mostram que o DNA oriundo do fígado e do intestino apre- senta a sequência oligo-Q, mas não a sequência oligo-STOP. Portanto, as diferen- ças observadas nos tecidos não podem resultar da presença de genes indepen- dentes. Como o mRNA ApoB do intestino apresenta um códon de parada onde o mRNA ApoB do fígado apresenta um códon da glutamina, as duas moléculas de mRNA não codificam a mesma proteína. As proteínas ApoB48 e ApoB100 não estão relacionadas por clivagens tecido-específicas. Um destes dois tecidos altera Alberts-Resp_Book.indb 28Alberts-Resp_Book.indb 28 23.11.09 10:54:3223.11.09 10:54:32 Capítulo 7 Controle da Expressão Gênica 29 um nucleotídeo específico durante a expressão do gene ApoB. Os resultados da Tabela Q7-1 mostram que as sequências complementares de nucleotídeos com o códon de terminação (oligo-STOP) estão presentes apenas no RNA intestinal. Portanto, o intestino altera especificamente um nucleotídeo na sequência do transcrito, o que marca uma das primeiras descobertas do processo de edição de sequências de RNA. Referências: Powell LM, Wallis SC, Pease RJ, Edwards YH, Knott TJ e Scott J (1987) A novel form of tissue-specific RNA processing produces apolipoproteins-B48 in intestine. Cell 50, 831-840. Chen S-H, Habib G, Yang CY, Gu ZW, Lee BR, Weng S-A, Silbermann SR, Cai S-J. Deslypere JP, Rosseneu M, Gotto AM, Li W-H e Chan L (1987) Apolipoprotein B-48 is the product of a messenger RNA with an organ-specific in-frame stop codon. Science 238, 363-366. Alberts-Resp_Book.indb 29Alberts-Resp_Book.indb 29 23.11.09 10:54:3223.11.09 10:54:32 Alberts-Resp_Book.indb 30Alberts-Resp_Book.indb 30 23.11.09 10:54:3323.11.09 10:54:33 Manipulação de Proteínas, DNA e RNA 8 8-1 Falso. Um anticorpo monoclonal reconhece um sítio antigênico específico, mas isso não significa que ele se ligará apenas a uma proteína específica. Os sítios an- tigênicos podem ser similares, mas não idênticos, podendo ligar o anticorpo com afinidades diferentes. Também não é incomum que diferentes proteínas tenham uma mesma sequência de 5 a 6 aminoácidos na sua superfície, ou seja, o mesmo sítio antigênico. 8-2 Falso. Nenhum instrumento é capaz de detectar menos do que uma molécula, ou seja, 1,7 yoctomol. Um yoctomol equivale a 0,6 molécula. Referência: Castagnola M (1998) Sensitive to the yoctomole limit. Trends Bio- chem. Sci. 23, 283. 8-3 Falso. A determinação das velocidades de associação e dissociação permite o cál- culo da constante de ligação por SPR, K = koff/kon 8-4 Verdadeiro. Se cada ciclo duplica a quantidade de DNA, então 10 ciclos equivalem a 210 amplificações, 20 ciclos a 220 e 30 ciclos a 230. 8-5 A tripsina é uma protease que cliva a maioria das proteínas. A colagenase é es- pecífica para o colágeno e o EDTA quela Ca2+, que é necessário para manter as caderinas unidas nas ligações entre as células. O tratamento não mata as células, pois os danos ocorrem nos componentes extracelulares que as células podem res- tabelecer. 8-6 Sim. Normalmente isso é feito pela introdução de anticorpos de uma espécie em uma segunda espécie, por exemplo, injetando anticorpos de camundongo em co- bras. Também é possível obter anticorpos contra anticorpos em uma mesma es- pécie. Nesse caso, a maior parte das moléculas injetadas será reconhecida como própria, mas a porção da molécula de anticorpo que se liga ao antígeno, idiotipo, poderá desencadear uma resposta imune. 8-7 A velocidade de sedimentação serve para separar componentes por tamanho ou forma. Durante a centrifugação, os componentes se moverão através de um gra- diente (normalmente de sacarose) de acordo com seu tamanho e forma. O equilí- brio de sedimentação separa os componentes por sua densidade de flutuação. Os componentes são centrifugados em um gradiente de sacarose até atingirem sua densidade de equilíbrio. Para separar duas proteínas de diferentes tamanhos a velocidade de sedimentação seria mais indicada. 8-8 A velocidade de sedimentação depende do tamanho e da forma da proteína. Como a hemoglobina tem uma forma mais esférica comparada com a forma mais alongada da tropomiosina, a hemoglobina tende a sedimentar mais rapidamente por sofrer uma menor resistência. A analogia deste efeito pode ser demonstrada como duas folhas de papel idênticas, uma amassada e outra enrolada. Deixando- as cair, a folha amassada atingirá mais rapidamente o chão do que a enrolada, o que é fundamentado pelos mesmos princípios. 8-9 A. Como mostrado na Figura R8-1A, no início o DNA está distribuído uniformemen- te na solução de CsCl de densidade uniforme. Após a centrifugação, o CsCl é em- purrado para baixo no tubo, formando um gradiente linear em equilíbrio (Figura
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