Apostila BIOLOGIA MOLECULAR E FARMACOGENÉTICA da faculdade Estácio

Prévia do material em texto

Introdução à Biologia Molecular 
 
 APRESENTAÇÃO 
 MÓDULO 1 
 MÓDULO 2 
 CONCLUSÃO 
DESCRIÇÃO 
A construção história da Biologia Molecular e seu emprego no estudo das 
moléculas presentes nas células responsáveis pela manutenção da vida, como o 
DNA, o RNA e as proteínas. 
PROPÓSITO 
Compreender como o RNA e o DNA foram descobertos e a importância destas 
moléculas para as células procariontes e eucariontes. 
OBJETIVOS 
Módulo 1 
Descrever a história da Biologia Molecular, a origem da vida e a organização 
gênica nos organismos 
Módulo 2 
Reconhecer alguns dos mecanismos de regulação da expressão gênica nos 
procariotos e eucariotos 
INTRODUÇÃO 
A Biologia Molecular é a área da Biologia que estuda as moléculas presentes 
nas células responsáveis pela manutenção da vida. Vamos iniciar nosso 
aprendizado sobre, possivelmente, as moléculas mais importantes para a 
existência da vida na Terra: Os ácidos nucleicos RNA e DNA. Você sabia que 
até mesmo os vírus, microrganismos intracelulares obrigatórios apresentam 
ácidos nucleicos? Não existe sequer um ser vivo que não tenha moléculas de 
RNA ou DNA. 
Vamos explorar um breve histórico sobre como começaram os estudos da 
Biologia Molecular, passando pela provável origem da vida na Terra, 
conhecendo as estruturas e composições dos ácidos nucleicos e observando 
como é dada a organização deste material em diferentes seres vivos. 
Aprenderemos alguns dos mecanismos de regulação gênica dos procariotos e 
os eucariotos e por fim noções de epigenética. 
Vamos juntos? 
MÓDULO 1 
Descrever a história da Biologia Molecular, a origem da vida e a 
organização gênica nos organismos 
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR 
Nosso histórico começa em 1869 com um bioquímico suíço chamado Johannes 
Friedrich Miescher (Figura 1). Em seus estudos, ele buscava determinar quais os 
componentes químicos que existem dentro dos glóbulos brancos (leucócitos), 
presentes no pus de feridas, que, de modo geral, possuem um núcleo grande e 
bem definido. No interior desse núcleo, ele observou uma grande quantidade de 
um composto ácido que continha átomos de nitrogênio e fósforo, nomeando-o 
de nucleína por estar localizado no núcleo. Mal ele sabia da importância desta 
descoberta! 
Figura 1: Friedrich Miescher. 
Diversos outros cientistas continuaram investigando o tal composto nucleína, 
entre eles Albrecht Kossel, que em 1880 demonstrou que na nucleína existiam 
diferentes bases nitrogenadas. Richard Altmann em 1889 conseguiu purificar 
a nucleína e nomeou o purificado de ácido nucleico. Com o tempo, os ácidos 
nucleicos foram ainda mais estudados, pareciam muito importantes já que 
praticamente todas as células possuíam esse material. Foram descobertas 
quatro diferentes bases nitrogenadas, as bases púricas: adenina e guanina e 
as bases pirimídicas: citosina e timina, todas com um glicídio 
desoxirribose (Figura 2). 
Figura 2: Nucleotídeo, contendo a base nitrogenada, o fosfato 
e a pentose. 
Essas bases podiam estar ligadas entre si, sempre obedecendo a um padrão, 
onde a adenina se associava à timina por 2 ligações de hidrogênio e a guanina 
se associava à citosina por 3 ligações, sendo esta interação a mais estável 
devido à maior quantidade de ligações (Figura 3). 
Figura 3: Bases nitrogenadas e suas 
interações por ligação de hidrogênio. 
O grupamento R nas riboses consiste em um OH e nas desoxirriboses de um H. 
Entretanto, havia um fato curioso: a presença de uma base diferente, chamada 
de uracila, em alguns desses materiais. Essa base apresentava uma ribose no 
lugar da desoxirribose e se ligava à timina no lugar da adenina. As moléculas 
que continham desoxirribose foram nomeadas de ácido desoxirribonucleico 
(ADN), em inglês Deoxyribonucleic Acid, o famoso DNA. As moléculas 
com ribose como glicídio foram nomeadas de ácido ribonucleico (ARN), em 
inglês Ribonucleic Acid, conhecido como RNA (Figura 4). 
Figura 4: Todas as bases 
nitrogenadas. 
Vamos agora juntar todos os conceitos estabelecidos para entendermos como é 
a estrutura do DNA e do RNA. Um nucleotídeo é um conjunto formado por uma 
base nitrogenada, que pode ser uma purina ou pirimidina. Dentre as purinas, 
temos a adenina e a guanina; entre as pirimidinas, temos a citosina e 
a timina, no caso de uma molécula de DNA, e o uracil(a), no caso de uma 
molécula de RNA. A ligação entre as bases é realizada entre a molécula de 
açúcar, de uma ribose para o RNA ou uma desoxirribose para o DNA, com o 
grupamento fosfato da base adjacente, na ligação conhecida como ligação 
fosfodiéster (Figura 5). 
Figura 5: Ligação fosfodiéster entre nucleotídeos da 
mesma fita de DNA. 
A estrutura do DNA se encontra em fita dupla. A união entre as duas fitas se dá 
por ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas, como demonstrado 
na Figura 3. 
Vamos voltar para a nossa história. Em 1953, uma dupla de cientistas, James 
Watson e Francis Crick, publicou um artigo na revista Nature chamado 
de Molecular Structure of Nucleic Acids. Eles eram contrários às ideias que 
existiam na época a respeito da estrutura do DNA. Entre os modelos antigos, o 
que mais se destacou foi o de Linus Pauling; ele acreditava que o DNA era 
interligado pelos grupamentos fosfatos, formando uma coluna. Watson e Crick, 
baseados em uma foto tirada por Rosalind Franklin, propuseram uma nova 
estrutura para essa molécula. A estrutura era uma dupla hélice, com as bases 
nitrogenadas purinas se ligando às pirimidinas no centro da hélice espiralada, 
sendo muito parecida com a que usamos até hoje (Figura 6). 
Figura 6: Foto de raios X tirada por Rosalind Franklin, 
responsável pelas conclusões de Watson e Crick. 
Com a estrutura do DNA resolvida e com o conhecimento sobre a química 
dessas moléculas, faltava agora entender a atuação e a organização delas nas 
células e porque eram tão importantes. Ao longo dos anos, o conhecimento 
sobre o DNA e o RNA vem crescendo. Hoje, com técnicas de sequenciamento 
do DNA, podemos, por exemplo, ver rapidamente se algum indivíduo possui 
propensão a determinado câncer analisando a sua sequência de DNA. Estamos 
começando a ter mais segurança na edição genética, e um dia poderemos curar 
doenças que ainda nem se manifestaram. 
Atualmente, podemos quantificar esse material genético que expressamos para 
diagnosticar doenças, como a COVID-19, e modificar outros organismos para 
que produzam nossas proteínas. É dessa forma que algumas das insulinas 
vendidas na farmácia são produzidas. Existem inúmeras possibilidades 
decorrentes do desenvolvimento da Biologia Molecular. 
A origem da vida 
A origem da vida sempre despertou curiosidade. Ao longo dos anos, existiram 
diversas teorias, algumas se provaram erradas e outras se mantêm até hoje. 
Você imagina como a vida começou? Vamos conhecer um 
pouco dessas teorias? 
Sabemos que átomos podem fazer ligações de maneira espontânea desde que 
estejam em um ambiente favorável e tenham afinidade um pelo outro, ou seja, 
ao se ligarem encontram uma estabilidade, assim são construídas as moléculas. 
Dentre as teorias existentes, uma delas, a teoria de Oparin e Haldane, era 
justamente a ideia da formação espontânea de pequenas moléculas orgânicas, 
as quais, com o tempo, passaram a se organizar de maneira cada vez mais 
complexa até se replicarem e evoluírem, formando as células primitivas. 
Em 1953, Stanley Miller tentou provar que era possível existir a criação 
espontânea de moléculas orgânicas na Terra, desde que o ambiente fosse 
favorável. Ele fez um experimento simulando como possivelmente era a 
atmosfera primitiva da Terra, cerca de 4 bilhões de anos atrás. No seu 
experimento, tinham moléculas, como gás hidrogênio, metano e vapor de água, 
que eram bastante comuns no ambiente primitivo. Esses gases, na presença de 
uma descarga elétrica, como um raio, ligavam-se formando diversas moléculas 
orgânicas, dentre elas os aminoácidos alanina, glicina e ácido aspártico (Figura 
07). 
Figura 7: Experimento de Miller. 
A teoria de Oparine Haldane continuou ganhando relevância à medida que 
novos estudos foram realizados, dentre eles os estudos do geólogo Michael 
Russell. Russell demonstrou que existem fontes de águas termais no fundo dos 
oceanos aquecidas pelo manto da Terra, que jorram água alcalina. Essas fontes 
são ricas em minérios de ferro, níquel e enxofre dissolvidos. A reação desses 
minérios com o gás carbônico, hidrogênio reativo e moléculas de água é capaz 
de produzir compostos orgânicos, como hidrocarbonetos e até mesmo 
nucleotídeos! 
Uma das descobertas mais incríveis sobre essas fontes termais são as reações 
químicas que lá ocorrem e como a geração dessas moléculas orgânicas 
acontece. As fontes termais são ricas em minerais, sendo assim, possuem um 
elemento que pode ser oxidado, como o ferro. O elétron oriundo da oxidação é 
carregado pelos núcleos metálicos desses minerais até chegar ao aceptor final 
de elétrons, este pode ser o monóxido ou o dióxido de carbono, que vai ser 
reduzido gerando a energia necessária para a confecção das moléculas 
orgânicas. 
Você já ouviu falar de um mecanismo parecido com esse 
anteriormente? Onde um elétron percorre uma cadeia até 
chegar ao seu aceptor gerando energia? 
Exatamente! É de maneira muito semelhante a esta que diversos seres vivos 
produzem energia como nós! Esse mecanismo ocorre durante a fosforilação 
oxidativa nas mitocôndrias, etapa metabólica da nossa respiração celular. Isso 
mostra um elo entre todos os nossos ancestrais, fortalecendo a hipótese de que 
a vida se originou dessas fontes de águas termais há muitos anos. 
No entanto, ainda temos diversas perguntas para serem respondidas. Nos dias 
atuais, essa é a teoria melhor aceita para a origem da vida (Figura 8). 
Figura 8: Fonte termal vulcânica, a possível origem da 
vida. 
A teoria da panspermia surgiu a partir da observação de compostos orgânicos 
presentes em meteoritos e ganhou força a partir de 1997 com a análise do 
Meteorito de Muchinson (Figura 9). Os pesquisadores encontraram diversos 
aminoácidos e adenina, presente no nosso DNA, que datavam de 
aproximadamente 7 bilhões de anos, sendo assim mais antigos que nosso 
próprio planeta, que possui cerca de 4,5 bilhões de anos. Apesar de muito 
interessante, essa teoria não possui evidências científicas suficientes para 
explicar a origem da vida no nosso planeta, diferente da teoria de Oparin e 
Haldane. 
Figura 9: Fragmento de meteorito. 
Entretanto, é muito interessante imaginar que, em outros lugares do Universo, 
existem compostos orgânicos e quem sabe até mesmo vida. Essas amostras 
extraterrestres evidenciaram também que é possível a criação de matéria 
orgânica, incluindo bases presentes no DNA e no RNA. 
Em um mundo onde existiam alguns nucleotídeos, aminoácidos e 
hidrocarbonetos, essas moléculas começaram a interagir entre si, formando 
cadeias cada vez mais complexas, ligações entre diferentes nucleotídeos 
formaram os primeiros RNAs e ligações entre diferentes aminoácidos formaram 
os oligopeptídeos. A interação entre os oligopeptídeos e o RNA leva a benefícios 
mútuos, gerando, por exemplo, estabilidade na estrutura de ambos, originando 
maiores quantidades de determinadas estruturas. Imagine essas diversas 
interações por milhares e milhares de anos, é natural que, com o tempo, 
estruturas mais complexas se formem e se mantenham. 
Hoje em dia, temos o conhecimento que tanto o RNA quanto pequenos 
peptídeos conseguem realizar reações químicas com diversas funções 
(neurotransmissores, hormônios, regulação gênica etc). Recentemente, foi 
descoberto que o RNA seria capaz até mesmo de se autorreplicar, gerando 
outras moléculas de RNA também capazes de se autorreplicarem, assim a 
evolução poderia acontecer ainda mais rápido, isso é o chamado “Mundo 
RNA”. 
Naquele mesmo ambiente, existiam outros compostos orgânicos, como os 
primeiros lipídeos oriundos dos hidrocarbonetos formados. 
Você já jogou um pouco de óleo na água? Sabe que não se 
misturam certo? 
Isso se dá a partir da característica anfipática dos lipídeos que, em um ambiente 
aquoso, tendem a formar micelas, estruturas circulares formadas naturalmente 
devido à forma que interagem com a água, expondo a parte hidrofílica e 
escondendo a parte hidrofóbica da água. 
Atenção 
Nem todos os lipídeos possuem características anfipáticas, portanto nem todos 
são capazes de formar estruturas de micelas. Dos lipídeos anfipáticos, o mais 
importante na formação da membrana celular é o fosfolipídeo. 
Desse modo, esses lipídeos formavam grandes micelas, originando 
“membranas” celulares rudimentares com moléculas de RNA em seu interior, 
surgindo as primeiras células primitivas, com material genético com capacidade 
replicativa. Hoje em dia, grande parte dos seres vivos ainda possui seu material 
genético disperso no citoplasma, chamamos esses organismos de procariontes 
ou procariotos (Figura 10). 
É importante ressaltar que, ao longo dos anos, o mundo RNA evoluiu, o DNA, 
constituído de uma dupla fita, é mais estável que o RNA. Sendo assim, possui 
uma maior confiabilidade para armazenar informações de um determinado ser 
vivo e tem as informações responsáveis pela manutenção da vida. O DNA passa 
pelo processo de transcrição que dá origem a um RNA mensageiro (RNAm), 
este pode ser traduzido e passa a ser uma proteína, unidade que vai realizar as 
funções que a célula precisa, como catalisar reações, servir para replicar o 
DNA, formar estruturas etc. 
Figura 10: Como poderiam ser as 
primeiras células vivas da Terra. 
ENTENDENDO MELHOR COMO A VIDA 
PODE TER SURGIDO 
Organização do material genético em procariotos 
Os procariotos são os organismos mais antigos da Terra. Todos são 
unicelulares e não possuem um núcleo organizado, ou seja, o seu material 
genético, o DNA, não é separado por uma membrana nuclear, chamada 
de carioteca, muito parecido com as primeiras células encontradas no nosso 
planeta. Esses organismos são os mais simples e toda a sua expressão 
gênica é diferente da nossa. Nós, seres humanos, pertencemos ao grupo dos 
eucariontes, temos o material genético separado do citoplasma pela carioteca 
(Figura 11). 
Figura 11: Núcleo disperso nas 
células procariontes e núcleo compartimentado pela carioteca nas células eucariontes. 
Antes de falar da organização do material genético dos procariotos, vamos 
conhecer alguns conceitos básicos para lembrarmos de certas nomenclaturas: 
 
O gene 
É um segmento codificante do DNA, ou seja, de fato, será transcrito e traduzido. 
 
O genoma 
Contém toda a informação hereditária, todo DNA que será passado da célula 
mãe para a células filha, incluindo os genes e as sequências não codificantes. 
 
O cromossomo 
É uma estrutura formada por uma molécula de DNA altamente compactada e 
associada a proteínas auxiliadoras, que ajudam a compactar e descompactar o 
DNA para facilitar o acesso de outras proteínas a essa região, por exemplo. 
Os procariotos possuem apenas um cromossomo linear ou circular que contém 
todo o seu material genético, chamado de DNA cromossomal. Além do 
cromossomo, eles também podem possuir elementos genéticos móveis 
(EGM), os responsáveis por transmitir algumas características genéticas a outros 
indivíduos vizinhos a fim de conferir alguma vantagem ou desvantagem. 
O cromossomo dos procariotos possui uma quantidade de DNA que pode variar 
entre 0,16 a 13 Mpb. Apenas para termos um exemplo, o DNA da bactéria E. 
coli possui cerca de 4,6 Mpb contido em uma célula de 2 μm! Esse volume só é 
possível devido ao alto grau de condensação do DNA. A condensação é feita 
através da formação de grandes alças na molécula de DNA, que originam alças 
menores, possibilitando que o DNA ocupe um menor volume na célula. As alças 
são formadas com o auxílio das proteínas DNA girase e topoisomerase l, a 
região formada por este único cromossomo condensado é chamada de 
nucleoide (Figura 12). 
Figura 12: Compactação do DNA 
procarionte. 
Os EGMs são partes fundamentais do DNA dos procariotos,mesmo não 
pertencendo ao cromossomo e possuem diversas funções que serão detalhadas 
posteriormente. É importante saber que existem diferentes tipos de EGMs, 
vamos estudar os três principais: plasmídeos, bacteriófagos e 
os transposons. 
Os plasmídeos são moléculas circulares de DNA fita dupla, independentes do 
cromossomo e possuem capacidade de replicação autônoma. Seu tamanho é de 
cerca de 1 a 35 kpb. Cada célula pode conter diversos ou nenhum plasmídeo, 
com uma ou várias cópias. Os plasmídeos são considerados elementos de 
herança extracromossômica, já que possuem replicação autônoma, 
independentemente do cromossomo. Eles também não são vitais, não causam 
malefícios à célula hospedeira, geralmente, possuem informações que serão 
aproveitadas para produção de toxinas, pilinas, adesinas e diversos outros tipos 
de proteínas que podem conferir algum tipo de vantagem para a célula 
hospedeira. Justamente por isso, podem ser chamados também de elementos 
genéticos acessórios (Figura 13). 
Figura 13: Plasmídeo e DNA bacteriano. 
Os plasmídeos não são normalmente sintetizados, e sim adquiridos através de 
um fenômeno chamado conjugação bacteriana, onde uma bactéria transfere os 
seus plasmídeos para outra e mantém uma cópia destes para si. Os plasmídeos 
são de grande importância na Biologia Molecular pela facilidade de manuseio e 
replicação. São utilizados como vetores onde uma sequência de interesse é 
inserida no plasmídeo, o qual é difundido entre os indivíduos de determinada 
colônia de bactérias. As bactérias, ao se replicarem, possibilitam originar uma 
grande quantidade de cópias da sequência de interesse. A partir disso, podemos 
purificar esse material e usar para os mais diversos fins. 
Exemplo 
Uma das formas de obtenção e produção de insulina é utilizando os plasmídeos 
como vetores. 
Os bacteriófagos podem se inserir no DNA cromossomal e se replicar junto 
com o organismo. Após a inserção, os genes contidos no bacteriófago são 
expressos e podem codificar fatores de virulência e toxinas entre outras 
proteínas. Eles são perigosos porque podem transformar uma bactéria não 
patogênica em uma bactéria patogênica. Alguns até mesmo podem produzir 
capsídeo viral e se multiplicar diversas vezes, iniciando um ciclo lítico que 
termina na eclosão da célula hospedeira (Figura 14). 
Figura 14: Bacteriófago. 
Os transposons são pequenas sequências de DNA que serão inseridas de 
forma aleatória no DNA do organismo hospedeiro, formando novos trechos de 
genoma, evento chamado de transposição e catalisado por enzimas chamadas 
de transposases. As transposases são capazes de cortar o DNA na região do 
transposon, liberando essas sequências, que se difundem pela célula. Os 
transposons são identificados a partir de mudanças fenotípicas nas bactérias. 
Como quase todo o DNA bacteriano é codificante, essas inserções podem 
causar algumas alterações funcionais no procarioto, como a perda de atividade 
enzimática. 
Existem três principais subgrupos de transposons: 
 As sequências de inserção (chamadas de IS, do inglês Insertion Sequence) 
 Os transposons compostos (simbolizados pela sigla Tn) 
 Transposons complexos ou elementos TnA 
Os ISs são os transposons mais simples, podem se inserir tanto no 
cromossomo quanto nos plasmídeos, possuem cerca de 700 a 2.500 pb e são 
nomeados pela sigla IS, seguido de um número, por exemplo IS3 ou IS37. Eles 
contêm os genes responsáveis pelo próprio mecanismo de transposição, que 
codificam as transposases e possuem sequências muito parecidas em suas 
extremidades para que a sua respectiva transposase corte essa região, 
liberando o IS para ser reinserido em um outro sítio. A transposição acontece no 
momento de abertura da dupla fita de DNA, que antecede a replicação, onde o 
transposon é inserido na fita de DNA e replicado junto com o DNA do procarioto 
(Figura 15). 
Figura 15: Estrutura esquemática do ISs. 
O segundo subgrupo é formado pelos transposons compostos (Tn), são 
chamados de transposons compostos porque são formados por duas sequencias 
de ISs em suas extremidades. Os Tn podem conferir vantagens a bactérias 
como, por exemplo, o caso do Tn9, que gera resistência ao antibiótico 
cloranfenicol. 
Os transposons complexos (TnA), o último subgrupo, possuem cerca de 500 
pb. Ao invés de ISs em suas extremidades, possuem pequenas sequências 
indicando o local de corte pela transposase. Os TnA induzem a replicação do 
procarioto com objetivo de se multiplicarem. 
É importante destacar que os EGMs possibilitam que as bactérias troquem 
informação genética de maneira muito rápida. Desse modo, caso apareça algum 
desses elementos como, por exemplo, a capacidade de gerar resistência a um 
antibiótico, logo todas as bactérias daquela colônia também ganham essa 
mesma resistência. Essas características foram fundamentais para a evolução e 
manutenção da vida dos organismos procariontes. 
Organização do material genético em eucariotos 
Conforme já aprendemos, a maior diferença entre procariotos e eucariotos é a 
presença da carioteca, uma membrana nuclear que engloba o material genético, 
isolando o citoplasma, no conjunto chamado de núcleo. O núcleo permite um 
maior nível de organização celular e modifica a organização e a estrutura gênica. 
Para começarmos a entender o nível de complexidade da organização do 
material genético em eucariotos, vamos a algumas contas básicas. 
Todo o genoma humano possui cerca de 3.2 Gpb, enquanto isso a 
espécie Polychaos dubium, um pequeno parasita unicelular eucarionte, possui 
670 Gpb, ou seja, cerca de 200 vezes maior que o nosso. A esse fenômeno 
damos o nome de paradoxo do valor C, onde a complexidade do organismo 
não está associada ao tamanho do seu material genético, uma vez que nós 
seres humanos somos mais complexos que este parasita. O paradoxo do valor C 
pode ser explicado pela maneira com que o DNA é codificado e processado. 
Outro fator relevante é o nível de compactação do DNA. Vamos agora fazer um 
comparativo entre duas células que já conhecemos os valores de pares de base 
existentes: a humana, com 3,2 Gpb, e a E. coli, com 4,6 Mpb. 
O DNA humano é contido em um diâmetro de cerca de 5 a 10 μm, enquanto 
na E. coli esse valor é de 2 μm, ou seja, um DNA 700 vezes maior ocupando um 
espaço quase semelhante ao da bactéria. Isso é possível graças a uma diferente 
forma de estruturação e compactação do DNA. 
O genoma dos eucariotos é compactado em cinco níveis diferentes. No primeiro, 
todo DNA, que possui 2 nm, é acoplado a proteínas chamadas histonas, essa 
estrutura é conhecida como nucleossomo. O nucleossomo possui 11 nm e se 
compacta formando uma estrutura solenoide de 30 nm. Essas histonas ficam 
bem juntas formando uma estrutura ainda mais densa como se fossem fibras. 
Nos terceiros e quartos níveis de compactação, são formadas alças dos 
solenoides (parecidas com as alças dos procariotos), as quais possuem 300 e 
700 nm, respectivamente. No último grau de compactação, ocorre a formação de 
uma alça ainda maior, 1.400 nm, que dá origem à estrutura chamada 
de cromátide cromossômica. Duas cromátides unidas por uma estrutura 
chamada de centrômero formam o cromossomo. O conjunto de cromossomos, 
ou seja, o DNA e as proteínas acessórias, principalmente, as histonas, formam 
a cromatina. O cromossomo também possui em suas extremidades 
os telômeros, que são estruturas fundamentais para a estabilidade do 
cromossomo e indicadores da idade celular, uma vez que um pequeno trecho 
desse telômero é perdido devido à forma com que o DNA replica (Figura 16). 
Figura 16: Compactação do DNA em eucariotos. 
O grau de compactação do DNA eucarionte pode variar de acordo com a fase do 
ciclo celular que se encontra, pois a cromatina se organiza de diferentes formas, 
obedecendo à necessidade de expressão gênica. Quando o DNA está menos 
condensado (um estado mais aberto), pode ser exposto a toda a maquinaria de 
transcrição e/ou replicação existente, e a cromatina se encontra em um estadode eucromatina. 
Quando o DNA está bastante condensado, a célula não consegue expressar 
ou replicar tal região, e ele se encontra no estado de heterocromatina. 
Há ainda a heterocromatina constitutiva, formada por trechos que nunca 
serão transcritos (Figura 17). 
Saiba mais 
Normalmente, chama-se estado de eucromatina/heterocromatina porque não é 
algo fixo. Logo, o mesmo trecho pode ficar ora em estado de eucromatina ora 
em de heterocromatina. Porém, não é errado chamar apenas de eucromatina ou 
heterocromatina. 
Figura 17: Transcrição do DNA 
descompactado. 
Os eucariotos possuem também um DNA extracromossomal, presente nas 
mitocôndrias e nos cloroplastos (nas células vegetais) e completamente 
independentes do DNA cromossomal. Existem teorias de que essas organelas 
eram outros organismos que acabaram sendo inseridos nas células eucariontes 
e lá permaneceram, pois o ambiente era favorável. Em troca do ambiente 
seguro, eles geravam energia para as células hospedeiras, formando uma 
relação de simbiose. 
VERIFICANDO O APRENDIZADO 
1. Estudamos as teorias do surgimento da vida e as características 
estruturais das moléculas que compõem o genoma. Sobre esses 
assuntos, leia as afirmativas abaixo e responda. 
 
I. A teoria de Oparin e Haldane era a mais aceita até a descoberta 
do meteoro de Murchinson, a partir de então a teoria mais aceita foi 
a da panspermia. 
II. A teoria mais aceita atualmente para a origem da vida na Terra é 
derivada da teoria de Oparin e Haldane, onde a vida surgiu de forma 
espontânea a partir de pequenas moléculas orgânicas. 
III. O RNA e o DNA são moléculas capazes de armazenar 
informação genética, entretanto o DNA é mais estável e se 
consolidou nesta função. 
IV. O mundo RNA dependia de organismos complexos. 
 
Estão corretas as afirmativas: 
 
I e II 
 
I e III 
 
II e III 
 
II, III e IV 
Responder 
Comentário 
2. Vimos as principais diferenças na organização das células 
procariontes e eucariontes. Sobre a organização nos eucariotos, 
como você espera que esteja organizado o DNA de uma célula 
pronta para se replicar? 
 
DNA completamente enovelado em estado de eucromatina. 
 
DNA parcialmente desenovelado, em estado de heterocromatina. 
 
DNA desenovelado, em estado de eucromatina. 
 
DNA desenovelado em estado de heterocromatina. 
Responder 
Comentário 
MÓDULO 2 
Reconhecer alguns dos mecanismos de regulação da expressão gênica 
nos procariotos e eucariotos 
INTRODUÇÃO 
Todos os seres vivos estão em um ambiente sujeito a constantes alterações. Às 
vezes, podem faltar nutrientes, ou a temperatura fica muito alta. Existem 
inúmeras possibilidades e nossos genes precisam responder a essas variações. 
Se faltar nutriente, o indivíduo que melhor conseguir economizar recursos, vai 
sobreviver; já aqueles que continuarem usando normalmente tendem a morrer. 
Portanto, há uma seleção natural daqueles que conseguem se adaptar 
rapidamente ao novo meio em detrimento dos que não têm essa habilidade. 
Você sabe que isso tem a ver com a capacidade dos 
mecanismos de regulação gênica? 
Poupar recursos depende que determinados genes que gastam muita energia 
fiquem menos ativos, mais condensados. Já genes responsáveis pelo 
armazenamento de recursos, como os que expressam as proteínas promotoras 
da formação do glicogênio, ficam mais ativos, ou seja, descompactados, para 
que a maquinaria de transcrição possa acessá-los. É importante ressaltar que 
existem ainda os genes que são essenciais para a manutenção da vida, 
chamados de genes constitutivos. Não podemos simplesmente economizar 
energia expressando uma menor quantidade desses genes, caso contrário, há 
uma alta possibilidade de isso levar à morte. 
Vamos agora entender os ajustes finos e as diferentes estratégias entre 
procariotos e eucariotos com relação à regulação da expressão gênica, 
começando pelos organismos procariontes. 
Mecanismos de regulação gênica em procariotos 
A regulação da expressão em procariotos pode acontecer em diferentes pontos, 
com maior custo energético, durante a estabilização da proteína, que é o 
produto da fase de tradução, ou durante a transcrição, com menor custo de 
energia, pois ainda não ocorreu a tradução do RNAm (RNA mensageiro). 
A transcrição ocorre a partir do acoplamento da RNA polimerase em uma 
sequência de DNA, chamada de região promotora. Todos os genes (sequências 
de DNA codificantes) possuem uma região promotora. Essa região pode 
inclusive favorecer uma maior ou menor expressão gênica, fazendo 
um controle negativo ou positivo, dependendo da ligação de determinadas 
proteínas conhecidas como fatores transcricionais, que inibem ou ativam a 
expressão gênica. 
Vamos ver um exemplo mais concreto desse conceito de regulação baseado 
em fatores transcricionais repressores (controle negativo) ou efetores 
(controle positivo). Uma regulação negativa pode acontecer de algumas 
formas. Um fator repressor se liga à região promotora e impede que a RNA 
polimerase acople na fita de DNA, inibindo a transcrição. Além disso, um fator 
repressor pode se ligar a um fator efetor, impedindo a sua atuação e diminuindo 
a expressão de determinado gene. O mesmo conceito pode ser aplicado 
inversamente, um fator efetor se liga à região promotora aumentando a 
transcrição ou pode se ligar a um fator repressor e impedir a inibição do gene 
(Figura 18). 
Figura 18: Regulação da expressão gênica negativa (esquerda) e positiva (direta). 
Antes de continuarmos, vamos relembrar a jornada que se inicia na molécula de 
DNA até a formação de uma proteína. Um complexo proteico chamado RNA 
polimerase (existem diferentes subtipos de polimerases, para fins didáticos, 
vamos considerar apenas como RNA polimerase) acopla na região promotora de 
um gene e começa a construção de um RNAm. Nos procariotos, a região 
codificante é chamada de operon e é composta por mais de um gene, 
geralmente, com função final relacionada (de uma mesma via metabólica), ou 
seja, todos os genes de um determinado operon irão formar proteínas com 
funções de alguma forma vinculadas umas às outras, como veremos em breve. 
O RNAm oriundo da transcrição de um operon é formado por mais de um gene e 
é chamado de RNAm policistrônico. 
De modo diferente, nos eucariotos, todas as regiões promotoras estão 
associadas a apenas um gene, logo o RNAm final possui informações apenas 
deste gene, sendo chamado de RNAm monocistrônico; apesar do RNAm dos 
eucariotos ser formado por apenas um gene, ele precisa ser processado para 
continuar a sua jornada (Figura 19). 
Figura 19: Diferenças no RNAm de eucariontes e procariontes. 
UTR é uma sigla do termo inglês untranslated region que significa região não codificante. 
Após a formação e o processamento do RNAm nos eucariotos, ele precisa sair 
do núcleo para encontrar o ribossomo. Nos procariotos, por não possuir 
carioteca, o RNAm encontra-se no citoplasma, e um RNAt (RNA transportador) é 
responsável por levar o RNAm contendo as informações do DNA para o 
ribossomo, local onde irá iniciar a tradução. O processo de tradução inicia a 
partir de um código de leitura presente no RNAm (conhecido como códon) e 
segue com a leitura das bases de três em três nucleotídeos até um determinado 
ponto onde teremos um códon de parada (Stop códon). Um conjunto de 3 bases 
de nucleotídeos traduzidas corresponde a 1 aminoácido, e a união dos 
aminoácidos origina uma cadeia polipeptídica, que é modelada por proteínas 
conhecidas como chaperonas, dando origem a uma proteína funcional. 
Vamos entender mais a fundo como o ribossomo traduz 3 bases de nucleotídeos 
em um aminoácido verificando o exemplo a seguir: 
Quando um ribossomo identifica os nucleotídeos UUA, insere um aminoácido 
a leucina a cadeia peptídica que está sendo formada. Os códons e seus 
respectivos aminoácidos são os mesmo para qualquer organismo, o código 
genético é universal. 
Atenção 
Todos os seres vivos compartilham o mesmo código de códons. Esse é mais um 
indício da teoria da evolução, segundoa qual todos nós viemos de um mesmo 
ancestral comum. 
Agora, podemos continuar falando sobre a regulação gênica dos procariotos. 
Para facilitar a compreensão, vamos ver um exemplo prático: a regulação 
do operon Lac da bactéria Escherichia coli. 
Esse operon é responsável pelo metabolismo da lactose, um açúcar importante 
para a nutrição dessas bactérias. O operon Lac é composto de diferentes 
trechos, em sequência, temos: 
1. P1, Promotor 1 (promotor do gene I) 
2. Gene I (gene repressor) 
3. O2, Operador 2 (operador secundário) 
4. P2, Promotor 2 (promotor dos genes Z, Y e A) 
5. O1, Operador 1 (operador secundário) 
6. Gene Z 
7. O3, Operador 3 (operador secundário) 
8. Gene Y 
9. Gene A 
Os promotores são responsáveis por iniciar a transcrição do gene adjacente. 
Os operadores são regiões regulatórias, onde podem ativar ou reprimir a 
transcrição do operon. Nesse caso, o O1 é um sítio em que o repressor Lac se 
liga e O2 e O3 são operadores secundários. Os operadores sempre se localizam 
próximos aos genes que regulam. Temos ainda os três genes estruturais LacZ 
(gene Z), LacY (Gene Y) e LacA (Gene A), que codificam as enzimas β-
galactosidase, permease e transacetilase e o Gene 1, que codifica o inibidor 
do próprio operon, este possui uma região promotora exclusiva para ele (Figura 
20). 
Figura 20: Operon Lac. 
Por ser um recurso muito valioso, as células tentam tornar o consumo de energia 
o mais eficiente possível. 
Na ausência de lactose, não existem motivos para que os genes Z, Y e A sejam 
expressos, uma vez que são ligados ao metabolismo da lactose, mas a 
expressão do gene I é constitutiva, ou seja, ele é sempre expresso mesmo 
quando não tem presença de lactose intracelular. O gene I dá origem a uma 
proteína repressora do promotor 2 (repressor Lac) que se liga à região do O1, 
inibindo a expressão de Z, Y e A, mesmo que a RNA polimerase acople em P2 
os genes não são expressos. 
A lactose não atua diretamente no operon Lac, entretanto, quando algumas 
moléculas de galactose entram na célula, as poucas enzimas β-galactosidase 
conseguem converter a galactose em alolactose; essa se liga ao repressor Lac, 
favorecendo uma mudança conformacional da proteína, que leva à 
desassociação entre o repressor e o operador 1, liberando o funcionamento da 
RNA polimerase, que transcreve os genes Z, Y e A (Figura 21). 
Figura 21: Esquema de regulação do operon Lac mediado pela lactose. Pol: RNA polimerase, mRNA lac: 
mRNA mensageiro lactose. 
Outra forma de regulação é a dependente de glicose, cuja presença inibe 
o operon Lac, pois a célula deve priorizar o metabolismo da glicose antes dos 
outros carboidratos. Quando os níveis de glicose estão baixos, ocorre a 
ativação do operon Lac, a indução é feita por uma pequena molécula efetora, 
o cAMP (AMP cíclico), e uma proteína regulatória chamada de CRP (sigla para 
cAMP receptor protein, ou seja, proteína receptora de cAMP, CRP, também 
pode ser chamada de CAP, catabolite activator protein). 
Vamos entender como isso acontece? 
Na ausência de glicose, a concentração de cAMP aumenta e essa molécula se 
liga ao CRP (CAP), formando o complexo CRP-cAMP (ou CAP-cAMP). O 
complexo se liga ao DNA em uma região operadora dependente de CAP-cAMP 
próxima ao operador 3, ativando a transcrição dos genes Z, Y e A, para a 
metabolização da lactose. Na presença de glicose, os níveis de cAMP 
diminuem e não é formado o complexo CAP-cAMP, logo o operon Lac fica 
inibido. É importante destacar que, quando os níveis de glicose estão altos, a 
presença de lactose, não leva à expressão dos genes Z, Y, A, devido à ausência 
do indutor CAP-cAMP. Esse fato é justificado pela necessidade do consumo de 
glicose antes da lactose (Figura 22). 
Figura 22: Regulação do operon Lac mediado por 
glicose. 
cAMP: AMP cíclico; CAP: proteína receptora de cAMP; Pol: RNA Polimerase; 
ATP: adenosina trifosfato; P: região promotora. 
A regulação gênica do metabolismo de lactose para as bactérias E. coli é de 
grande importância para a sobrevivência. Elas se adaptam ao meio e à presença 
de diferentes nutrientes, consumindo-os de modo inteligente. Estudar o operon 
Lac nos possibilita entender os principais métodos de regulação gênica em 
procariotos, pois ele engloba fatores repressores e efetores em diferentes 
estratégias e meios nutricionais. Agora, podemos ir adiante e aprender sobre a 
regulação gênica nos eucariotos. 
OPERONS 
MECANISMOS DE REGULAÇÃO GÊNICA EM 
EUCARIOTOS 
Os organismos eucariontes podem ser multicelulares, com cada célula com 
funções diferentes e atuando em locais diferentes. Entretanto, todas as células 
possuem o mesmo DNA. 
Vamos considerar a estrutura e a organização dos procariotos, seres 
unicelulares cujo material genético quase todo é codificante, têm 
os operons gerando RNAm policistrônico (não existem operons em organismos 
eucariontes), proteínas interligadas de uma mesma via metabólica sendo 
expressas, regulações básicas de ativação ou repressão genética e os 
promotores. As células procariontes funcionam muito bem ao pensar que são 
unidades individuais, buscando a sobrevivência. 
De modo diferente, se considerarmos os organismos multicelulares, eles 
possuem um maior nível de complexidade e, ao mesmo tempo, o percentual de 
gene codificante e não codificante é muito menor. Nos humanos, cerca de 2% do 
DNA é codificante. É um pouco contraintuitivo pensar que um organismo mais 
complexo, onde todas as células, mesmo com funções variadas, possuam o 
mesmo DNA, e este ainda por cima tem proporcionalmente uma menor 
porcentagem de genes codificantes. Vamos a um exemplo? 
Ao pensarmos em especialização celular, uma célula do seu intestino precisa 
absorver e transportar nutrientes com muita eficiência. Já uma célula da sua pele 
tem que se multiplicar mais, conferir resistência e acumular queratina. No 
entanto, ambos os tipos celulares têm os mesmos genes, praticamente todo o 
DNA é igual! Mas como isso é possível? 
O segredo desse paradoxo é a regulação gênica e o processamento do RNAm. 
Para podermos transcrever uma fita de DNA, primeiro, temos o acoplamento da 
RNA polimerase na fita dupla. Esse DNA precisa estar acessível à maquinaria de 
transcrição, logo em um estado descompactado. 
Atenção 
Durante todo o texto, utilizaremos o termo “maquinaria de transcrição”, o qual é 
mais correto, uma vez em que, nos eucariotos, apenas a RNA polimerase 
sozinha é incapaz de iniciar a transcrição, ela necessita do auxílio de fatores 
gerais de transcrição adicionais. 
A compactação e descompactação do DNA em eucariotos são dadas pelas 
proteínas histonas, sendo um tipo de regulação gênica. As histonas ditam a 
compactação da cromatina e são moduladas por pequenas alterações químicas 
em sua estrutura, sendo elas: metilação (adição de grupamentos metila 
favorecem a compactação do DNA pelas histonas, impossibilitando a atuação da 
maquinaria transcricional) e a acetilação (a adição de grupamentos acetil 
favorecem a descompactação do DNA, possibilitando a atuação da maquinaria 
de transcrição. Esse mecanismo é catalisado pelas proteínas histona acetil 
transferase (HAT) e é reversível) (Figura 23). Assim, uma das maneiras de 
regular o que vai ser expresso é dependente do padrão de acetilação/metilação 
de histonas. 
Figura 23: Acetilação de histonas mediada por histona acetil transferase (HAT). 
Voltando ao exemplo dado anteriormente, as células do seu 
intestino certamente possuem trechos do DNA menos compactados do 
que as células da sua pele. Esses trechos irão expressar proteínas 
responsáveis pela absorção dos nutrientes. Nas células da pele, os mesmos 
trechos irão estar com as suas respectivas histonas metiladas, ou seja, mais 
compactadas. 
Determinados fatores transcricionais podem promover a acetilação e a metilação 
das histonas de maneira direcionada, gerando especializações celulares. Em 
resumo, o padrão de histonas do seu DNA é um dos fatores que faz com que 
diferentes células tenham funções diferentes.Outro mecanismo de inibição da expressão gênica é dado pela metilação do 
próprio DNA, mais especificamente na posição 5 do anel de citosina, que 
dificulta a interação com a RNA polimerase, impedindo a transcrição (Figura 24). 
Figura 24: Citosina 
metilada na posição 5 do anel pirimidina. A metilação é a adição de um grupo metil (CH3) de forma 
covalente. Enzima responsável DNA metiltransferase (DNMT). 
As citosinas metiladas formam as chamadas ilhas CpG ou ilhas CG (ilhas 
citosina- guanina); essa metilação não é reparada pela maquinaria de 
reparo celular, não sendo transcrita e traduzida, constituindo assim partes não 
codificantes. No entanto, essa metilação pode ser passada para as células filhas 
no processo de replicação durante a multiplicação celular, garantido a sua 
hereditariedade. Elas se localizam, principalmente, próximas do sítio de início da 
transcrição de genes constitutivos. 
Nos eucariotos, ainda levando em consideração a regulação da transcrição, 
existem ainda as sequências reguladoras, bastante semelhante aos operadores 
dos procariotos. No entanto, nos eucariotos, essas sequências podem estar 
localizadas a milhares de pares de base de distância do promotor. 
Até agora vimos alguns fatores de regulação associados à transcrição do DNA, 
mas a expressão gênica dos eucariotos pode ser regulada em diversos outros 
pontos, como: no processamento pós-transcricional, na degradação do RNAm, 
na tradução, no processamento pós-traducional e na degradação e transporte da 
proteína gerada. 
Como sabemos, os eucariotos são organismos bastante complexos, existem 
milhares de diferentes interações. A cada dia, os cientistas descobrem novos 
conceitos e novas formas de regulação gênica. Por isso, vamos focar em 
algumas das regulações mais relevantes, como o splicing alternativo e a 
maturação do RNAm, a nível de processamento pós-transcricional, e nos recém-
descobertos miRNA (microRNA) e siRNA (small interference RNA), para 
degradação do RNAm. 
Agora, já sabemos por que todas as células, mesmo possuindo o mesmo DNA, 
têm especializações diferentes. Entretanto, falta ainda entender a proporção de 
DNA codificante e não codificante. Temos apenas 2% de DNA codificante, será 
que é suficiente para dar conta de toda complexidade de um organismo 
multicelular? A resposta é sim. Afinal, estamos vivos, não é? 
A chave para entender esse dilema está no splicing alternativo. Cada célula 
possui um padrão de splicing (conjunto de informação de como vai realizar esse 
processo) de acordo com suas funções, originando assim proteínas diferentes a 
partir do mesmo gene. Após a transcrição do gene, é formado um pré-RNAm, o 
qual é processado por um complexo de RNA e proteínas chamado de 
spliciossomo, onde, dependendo do padrão de splicing celular no momento da 
transcrição, alguns trechos do pré-RNAm são considerados éxons e outros são 
considerados íntrons. Os trechos íntrons são removidos do pré-RNAm e os 
trechos éxons são ligados pelo spliciossomo, gerando um pré-RNAm formado 
apenas com éxons, de acordo com o padrão de splicing (Figura 25). 
Figura 25: Diferentes isoformas do 
RNAm. 
Um mesmo gene pode dar origem a uma enorme quantidade de diferentes 
RNAm e, por consequência, proteínas diferentes. Desse modo, os eucariotos 
conseguem com uma quantidade relativamente baixa de genes codificantes 
gerar um número muito elevado de diferentes proteínas. 
Junto ao splicing alternativo, o pré-RNAm também precisa passar por um 
processamento, que o torna capaz de sair do núcleo para chegar ao ribossomo 
onde será traduzido. O pré-RNAm passa por duas etapas, uma adição do cap 5’, 
dada pela ligação de um nucleotídeo alterado, e o GMP metilado (Guanosina 
monofosfato metilada), na ponta 5’ do RNAm, por uma ligação trifosfato. O cap 5’ 
é fundamental para o reconhecimento do RNAm maduro, a exportação do RNAm 
para fora do núcleo e o endereçamento do RNAm em direção ao ribossomo. Ele 
promove a ligação na organela, além de também ter ação protetora. 
Você sabia 
A palavra cap significa boné e, nesse caso, pode ser traduzida para capacete 5’. 
Por isso, o nome cap 5’ ou capacete 5’, uma vez que esse nucleotídeo alterado, 
protege a perda de informação contida no RNAm oriunda da degradação pela 
ação de ribonucleases e fosfatases. 
A segunda etapa do processamento do RNAm é uma adição de uma cauda 
chamada de “poliA” na extremidade 3’ do RNA. A cauda tem esse nome por ser 
formada de 80 a 250 resíduos de adenina. A cauda também serve para proteger 
o RNAm de degradação enzimática durante todo o processo de locomoção em 
direção ao ribossomo, a cauda poliA é clivada por endonucleases quando o 
RNAm encontra o ribossomo. 
Uma vez com a adição do cap 5’ e da cauda poliA, o RNAm se torna maduro e 
pode ser traduzido pelo ribossoma no citoplasma. A regulação desse processo 
se dá pela remoção de uma dessas adições. Caso a célula não precise mais de 
determinada proteína, sinalizações regulatórias são enviadas para o núcleo, 
onde são removidas e o RNAm agora “não maduro” é degradado (Figura 26). 
Figura 26: Processamento do RNAm. 
A última regulação genética que iremos estudar é a mediada por pequenos 
RNAs: os miRNAs e os siRNA. 
Os miRNAs apresentam cerca de 19 a 28 pb (pares de base), são endógenos e 
formados a partir do pareamento imperfeito de uma fita dupla de RNA (double 
stranded RNA, conhecido como dsRNA). Esse pareamento gera uma estrutura 
em forma de grampo de cabelo, conhecida como hairpin, que é clivada por uma 
endonuclease dicer (endonucleases são proteínas que cortam a fita de RNA ou 
DNA de forma precisa) formando os miRNAs. 
Os siRNAs, com cerca de 22 a 23 pb, são exógenos (oriundos do RNA viral) ou 
endógenos (oriundos de retrotransposons) e formados a partir de um 
pareamento perfeito de uma dsRNA. Também são clivados pela 
endonuclease dicer, gerando esses fragmentos de siRNA. A regulação é dada 
pela ligação entre o miRNA ou siRNA no RNAm induzindo a degradação deste 
ou impedindo sua tradução (Figura 27). 
Figura 27: Mecanismo de ação do 
miRNA e siRNA. 
Os siRNA e miRNA foram recentemente descobertos e possuem um papel muito 
importante no controle da expressão gênica em eucariotos. No entanto, ainda 
estamos tentando entender melhor como funcionam, embora suas aplicações 
médicas pareçam ser muito promissoras. Imagine, por exemplo, uma pessoa 
que tenha o metabolismo alterado para produzir grandes quantidades de 
colesterol endógeno. Ela pode ter diversos problemas de saúde oriundos do alto 
colesterol. No futuro, talvez seja possível construir siRNAs específicos para 
silenciar a expressão de HMG-CoA redutase, principal enzima da síntese de 
colesterol endógeno, abrindo possibilidades para uma nova terapia genética. 
EPIGENÉTICA 
A genética é o estudo dos genes, das características hereditárias de 
determinados organismos, guardadas nas moléculas de DNA. A epigenética é o 
estudo das características que vão acima dos genes, pois “epi” deriva do radical 
grego que indica a posição superior. Essa ciência estuda as variações nos traços 
fenotípicos pela ação de fatores externos ou ambientais que afetam a expressão 
gênica de modo reversível. A compreensão da epigenética pode nos ajudar a 
estabelecer relações entre a forma com que vivemos e o surgimento de 
determinadas doenças. 
Relembrando o que estudamos anteriormente, como um 
neurônio sabe que tem que ser um neurônio e não um 
osteoblasto durante o desenvolvimento embrionário? 
A resposta está nos fatores de transcrição específicos de cada linhagem celular 
que leva a especialização destas células para a sua forma final e nas marcas 
epigenéticas no DNA. As marcas epigenéticas são características do material 
genético que possibilitam ou não sua expressão, seja por metilação do DNA, 
modificação de histonas (metilação ou acetilação) ou presença de mi e siRNA, 
que degradam o RNAm. 
A epigenética é tudo que está acima dos genes e estuda alterações na 
expressão gênica que não alteram a estrutura primáriada sequência de 
nucleotídeos. Na verdade, explora modificações no DNA decorrentes da 
interação do indivíduo com o ambiente. 
Exemplo 
Um indivíduo fumante consome grandes quantidades de nicotina, cuja molécula 
modifica o padrão metilação em diversos genes. Então, os genes que, em 
condições normais, não estariam sendo expressos passam a ser. E quais são as 
consequências dessa alteração na expressão gênica? 
É difícil precisar todas as alterações causadas por determinada substância no 
nosso organismo, temos milhares de diferentes células expressando diferentes 
proteínas. Entretanto, a comunidade científica estuda incansavelmente as 
diversas modificações genéticas causadas por alimentos, comportamentos, 
drogas etc. 
Agora, ainda utilizando o caso da nicotina como exemplo, é sabido que o cigarro 
faz mal à saúde e, segundo estudos, podem reduzir em cerca de 14 anos a 
expectativa de vida de adultos fumantes. Apenas nos Estados Unidos, o cigarro 
tem algum tipo de relação com a morte de 400 mil pessoas por ano. As 
consequências de fumar incluem câncer, doenças cardiovasculares e 
respiratórias. Muitas grávidas continuam fumando durante a gestação, sendo a 
causa de morte infantil evitável mais importante. O cigarro consumido pelas 
mães atrasa o desenvolvimento neural e cardiopulmonar do embrião. Essas 
crianças também tendem a ter uma maior frequência de doenças respiratórias 
como asma (Figura 28). No entanto, estudos recentes mostram que mães 
fumantes podem não só ter os filhos com asma, como também os netos, mesmo 
que as filhas não fumem. Além disso, foram encontrados alguns mecanismos 
epigenéticos nos filhos e netos de fumantes. 
Figura 28: Cigarro. 
Os conceitos sobre hereditariedade genética evoluíram com o passar dos anos, 
não apenas os genes são responsáveis por transmitir as informações dos pais 
para os filhos, mas também os padrões epigenéticos são fundamentais, os quais 
podem ser passados através de gerações. Marcações no DNA e nas histonas 
(acetilações e metilações) modificam o padrão de expressão genética, 
principalmente, no período de desenvolvimento embrionário, causando uma 
reprogramação gênica. 
As modificações epigenéticas ocorrem não apenas pela exposição recorrente a 
determinadas substâncias químicas, mas também devido a fatores ambientais e 
comportamentais. O holocausto durante a Segunda Guerra Mundial deixou 
marcas visíveis e invisíveis tanto nos que sofreram o horror nazista quanto em 
seus filhos e netos. As marcas invisíveis foram reveladas nos cromossomos, que 
representam um tipo de memória biológica do nosso organismo. Os 
sobreviventes do holocausto tinham pesadelos frequentes, ansiedade, 
depressão, dificuldade de ressocialização, entre outros distúrbios psicológicos. 
De alguma maneira, esses traumas se internalizaram e foram passados adiante, 
pois os descendentes da guerra tendem a ser mais vulneráveis ao stress e 
propensos a desordens mentais, evento conhecido como transmissão 
transgeracional de trauma (TTT). A TTT também já foi descrita na literatura a 
partir de indivíduos que sofreram abusos, refugiados, vítimas de tortura etc. 
(Figura 29). 
Figura 29: Soldado com stress pós-traumático. 
A compreensão da TTT trouxe avanços na vida de diversas crianças e adultos 
que passaram por eventos traumáticos, permitindo o diagnóstico e tratamento 
precoce das consequências do trauma, uma espécie de medicina epigenética. É 
importante lembrarmos que os mecanismos epigenéticos são maleáveis e 
podem ser alterados durante a nossa vida, dependendo de fatores químicos e 
socioambientais, que nos leva a boas perspectivas de tratamento. 
Diversas outras associações epigenéticas têm sido testadas. Compreender os 
ajustes finos desses mecanismos pode gerar uma revolução na maneira com 
que enxergamos a medicina e a genética. 
Podemos citar alguns exemplos, como: pessoas que sofreram fome durante os 
anos iniciais de suas vidas possuem um menor risco de câncer colorretal; 
crianças que passaram por trauma tendem a desenvolver depressão quando 
adultos devido a uma hipermetilação do gene NR3C1 (responsável pela 
expressão de receptores ligados ao stress); associação de metilação do DNA, 
formando ilhas CpG em determinadas regiões, é correlacionada com maior 
prevalência de diabetes tipo 2 e obesidade em populações árabes, dentre outros 
estudos. 
A terapia genética, com o uso de miRNA, siRNA e edição genética parece muito 
promissora, mas ainda são estudos preliminares e temos muitos mistérios a 
desvendar (Figura 30). 
Figura 30: Terapia genética. 
VERIFICANDO O APRENDIZADO 
1. Estudamos as regulações gênicas nos procariotos e vimos que 
existem operons, que são trechos responsáveis por alguma função 
biológica. Leia as afirmativas abaixo e responda. 
 
I. Considerando o operon Lac, a expressão do gene I é constitutiva, 
uma vez que não temos lactose sempre no meio intracelular. 
II. Em procariotos, os genes com funções de uma mesma via 
metabólica estão localizados próximos uns aos outros em 
um operon e transcrevem para um RNAm monocistrônico. 
III. O RNAm monocistrônico é capaz de ser traduzido em diferentes 
proteínas de uma mesma via metabólica. 
IV. O operon Lac tem seu funcionamento reprimido na presença de 
glicose, mesmo que com altas concentrações de lactose. 
 
Estão corretas as afirmativas: 
 
I, II e III 
 
II e III 
 
II, III e IV 
 
I e IV 
Responder 
Comentário 
2. A epigenética estuda como componentes externos e ambientais 
modificam nosso genoma através de determinadas marcações. São 
exemplos de marcadores epigenéticos que podem modificar a 
expressão de genes: 
 
I. Metilação do DNA, metilação de histonas e presença de miRNAs. 
II. Acetilação do DNA, splicing alternativo e presença de miRNAs. 
III. Ubiquitinação de proteínas, metilação de histonas e nicotina. 
IV. Metilação do DNA, stress e presença de miRNAS. 
 
Estão corretas as sentenças: 
 
I e II 
 
I 
 
III e IV 
 
II 
Responder 
Comentário 
CONCLUSÃO 
CONSIDERAÇÕES FINAIS 
Conhecemos como a Biologia Molecular foi estabelecida como ciência a partir da 
descoberta do DNA e do RNA, explorando principalmente a sua estrutura e a 
sua função. Além disso, vimos a teoria mais aceita, atualmente, para explicar 
como a vida surgiu no nosso planeta. Aprendemos como o material genético nos 
eucariotos e procariotos e como esses grupos se organizam e os diferentes 
mecanismos de regulação da expressão gênica. Por fim, todos os conceitos 
aprendidos sobre os eucariotos foram concatenados para termos uma noção 
sobre o que é a epigenética. A epigenética é uma ciência recente que estuda o 
comportamento de todos os componentes que estão presentes influenciando o 
genoma e, por consequência, influenciando na expressão gênica. 
PODCAST 
0:00 
24:46 
REFERÊNCIAS 
AL MUFTAH, W. A. et al. Epigenetic associations of type 2 diabetes and BMI 
in an Arab population. In: Clinical epigenetics, v. 8, n. 1, p. 13, 2016. 
ALBERTS, B. Molecular biology of the cell. 2018. 
AMBROS, V. The functions of animal microRNAs. Nature, v. 431, n. 7006, p. 
350-355, 2004. 
BETZ, F. Managing Science: Innovation, Technology, and Knowledge 
Management. 2011. 
BORGES-OSÓRIO, M. R.; ROBINSON, W. M. Genética Humana. 3 ed. Artmed 
Editora, 2013. 
COSTA, E. de B. O.; PACHECO, C. Epigenética: regulação da expressão 
gênica em nível transcricional e suas implicações. In: Semina: Ciências 
Biológicas e da Saúde, v. 34, n. 2, p. 125-136, 2013. 
DAHM, R. Friedrich Miescher and the discovery of DNA. In: Developmental 
biology, v. 278, n. 2, p. 274-288, 2005. 
DUBEY, R. C. D. K. ATB of microbiology. 1st edition, p.227-229. New Delhi: S. 
Chand & Company, 2015. 
GRINDLEY, N. D. F.; REED, R. R. Transpositional recombination in 
prokaryotes. In: Annual review of biochemistry, v. 54, n. 1, p. 863-896, 1985. 
HARTL, D.; RUVOLO, M. Genetics. Jones & Bartlett Publishers, 2012. 
HICKMAN, A. B.; DYDA, F. Mechanisms of DNA transposition. In: Mobile DNA 
III, p. 529-553, 2015. 
HUGHES,L. et al. Early life exposure to famine and colorectal cancer risk: a 
role for epigenetic mechanisms. In: PloS one, v. 4, n. 11, p. e7951, 2009. 
JACOB, F.; MONOD, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of 
proteins. In: Journal of molecular biology, v. 3, n. 3, p. 318-356, 1961. 
JOAQUIM, L. M.; EL-HANI, C. N. A genética em transformação: crise e revisão 
do conceito de gene. In: Scientiae studia, v. 8, n. 1, p. 93-128, 2010. 
KELLERMANN, N. PF. Epigenetic transmission of holocaust trauma: can 
nightmares be inherited. In: Isr J Psychiatry Relate Sci, v. 50, n. 1, p. 33-39, 
2013. 
LANE, N. The vital question: energy, evolution, and the origins of complex 
life. WW Norton & Company, 2015. 
LEHMAN, N. Cold-hearted RNA heats up life. In: Nature chemistry, v. 5, n. 12, 
p. 987-989, 2013. 
LESLIE, F. M. Multigenerational epigenetic effects of nicotine on lung 
function. In: BMC medicine, v. 11, n. 1, p. 1-4, 2013. 
MARSHALL, M. First life: The dawn of evolution. In: New Scientist, v. 211, n. 
2825, p. 32-35, 2011. 
MELAS, P. A. et al. Genetic and epigenetic associations of MAOA and 
NR3C1 with depression and childhood adversities. In: International Journal of 
Neuropsychopharmacology, v. 16, n. 7, p. 1513-1528, 2013. 
MILLER, S. L. et al. A production of amino acids under possible primitive 
earth conditions. In: Science, v. 117, n. 3046, p. 528-529, 1953. 
NELSON, D. L.; LEHNINGER, A. L.; COX, M. M. Lehninger principles of 
biochemistry. Macmillan, 2008. 
PARFREY, L. W.; LAHR, D. J. G; KATZ, L. A. The dynamic nature of 
eukaryotic genomes. In: Molecular biology and evolution, v. 25, n. 4, p. 787-
794, 2008. 
SUMNER, A. T. Chromosomes organization and function. In: Blackwell 
Science Ltd. a Blackwell Publishing company. United Kingdom, v. 1, p. 143-153, 
2003. 
VÁZQUEZ-SALAZAR, A.; LAZCANO, A. Early life: Embracing the RNA world. 
Current Biology, v. 28, n. 5, p. R220-R222, 2018. 
WATSON, J. D.; CRICK, F. H. C. Molecular structure of nucleic acids: a 
structure for deoxyribose nucleic acid. Nature, v. 171, n. 4356, p. 737-738, 1953. 
 
EXPLORE+ 
Para explorar mais os seus conhecimentos a respeito do assunto deste tema, 
recomendamos as seguintes leituras: 
 Cientistas encontram possível sinal de vida em Vênus, matéria de divulgação 
científica da revista Exame, escrita pela jornalista Tamires Vitorino. Nessa 
matéria, é abordada a descoberta do gás fosfina metabólito bacteriano em 
Vênus, indicando possível sinal de vida. 
 Michael Russell demonstrou que existem fontes de águas termais no fundo 
dos oceanos, aquecidas pelo manto da Terra, que jorram água alcalina. 
Essas fontes são ricas em minérios de ferro, níquel e enxofre dissolvidos. 
Para conhecer mais, leia o livro Questão vital: Por que a vida é como é?, de 
Nick Lane e Talita Rodrigues. 
 Para conhecer um pouco mais sobre os avanços da epigenética na área 
biomédica, leia o livro Epigenética aplicada à saúde e a doença de Elsner e 
Siqueira. 
 Para conhecer um pouco mais sobre a história da Biologia Molecular, visite a 
matéria do Rogerio Meneghini Os genes e o gene, publicada na revista 
FAPESP. 
 Qual foi papel de Roselind Franklin no modelo da dupla hélice do DNA de 
Watson e Crick? Para saber mais, visite o artigo As controvérsias a respeito 
da participação de Rosalind Franklin na construção do modelo da dupla 
hélice, de Marcos Rodrigues da Silva. 
 
CONTEUDISTA 
Eldio Gonçalves dos Santos 
Currículo Lattes 
Ao clicar nesse botão, uma nova aba se abrirá com o material preparado para impressão. Nela, 
acesse o menu do seu navegador e clique em imprimir ou se preferir, utilize o atalho Ctrl + P. 
Nessa nova janela, na opção destino, direcione o arquivo para sua impressora ou escolha a 
opção: Salvar como PDF. 
 
 
 
 
 
Isolamento de Ácidos Nucléicos 
 
 APRESENTAÇÃO 
 MÓDULO 1 
 MÓDULO 2 
 CONCLUSÃO 
DESCRIÇÃO 
Isolamento dos ácidos nucleicos: coleta, transporte e armazenamento de 
amostras; extração e quantificação de DNA e RNA; síntese de cDNA; desenho 
experimental. 
PROPÓSITO 
Compreender as etapas para o isolamento dos ácidos nucléicos, a partir do 
desenho experimental até a sua extração e quantificação é o primeiro passo 
para obtenção de amostras de qualidade para a realização dos métodos 
moleculares, garantindo, assim, resultados fidedignos. 
OBJETIVOS 
Módulo 1 
Descrever o desenho experimental e as fases pré-analíticas do isolamento dos 
ácidos nucleicos 
Módulo 2 
Descrever os procedimentos de extração e quantificação do DNA e RNA e 
síntese do cDNA 
INTRODUÇÃO 
A Biologia Molecular é responsável por estudar as moléculas que realizam a 
manutenção da vida. São elas: DNA, RNA e proteínas, que têm como função 
principal, considerando o dogma central da Biologia, armazenar informações e 
enviar essas informações para a síntese das proteínas que realizaram as 
funções celulares, respectivamente. 
Atualmente, os inúmeros avanços obtidos na área médica, na ciência animal e 
vegetal, são resultado da elaboração de técnicas moleculares que nos 
proporcionaram novas formas de estudar o DNA e o RNA. Técnicas essas que 
estão em constante evolução. 
No entanto, antes de analisar o material genético propriamente dito, é necessário 
extrair esse material das células. Para isso, é essencial que a coleta, o 
armazenamento, o transporte e o processo extrativo sejam realizados de 
maneira satisfatória e que tenhamos uma quantidade de material genético 
suficiente, de qualidade, livre de contaminantes e íntegro para realizar a análise. 
Você imagina como é feito o processo extrativo? Será que a extração de DNA ou 
RNA empregam a mesma metodologia? E o que é cDNA e qual sua 
importância? 
Vamos juntos, ao longo desta jornada, explorar todos esses questionamentos, 
visitando a coleta, transporte e armazenamento do material para análise 
molecular (fase pré-analítica). Após essa fase, vamos aprender sobre as 
técnicas de extração de DNA e RNA, quantificação, análise da pureza e, por fim, 
a síntese do cDNA. Além disso, estudaremos o desenho experimental e 
entenderemos a sua aplicabilidade, etapas e importância no desenvolvimento e 
conhecimento científico! 
MÓDULO 1 
 
Descrever o desenho experimental e as fases pré-analíticas do isolamento 
dos ácidos nucleicos 
 
1 – DESENHO EXPERIMENTAL 
O desenho experimental é um planejamento de um estudo realizado em 
algumas etapas e é uma ramificação do método científico, que é a ferramenta 
mais poderosa de todas para o avanço tecnológico da humanidade e muda até 
mesmo a forma que pensamos nas coisas do dia a dia. 
Veja a aplicação desse método em uma atividade do nosso cotidiano: 
Clique nas setas para ver o conteúdo. 
 
Leonardo tem o hábito de assistir ao telejornal todos os dias. Enquanto assistia 
ao programa, viu que o prefeito da sua cidade participou de uma pequena 
entrevista e fez algumas afirmações sobre o funcionamento da prefeitura 
naquele trimestre. 
 
Primeiro, Leonardo deve parar, pensar sobre tal afirmação e aplicar o método 
científico, observando o que foi falado e questionando “Será que é verdade o 
que o prefeito falou?” 
 
Em seguida, ele estabelecerá hipóteses: “É verdade que tal coisa aconteceu” 
ou “É mentira que tal coisa aconteceu”. 
 
A próxima etapa é realizar um experimento, que nesse caso é a busca de fontes 
confiáveis de notícia, com credibilidade, para identificar se o que o político falou 
é verdade ou não, analisar o discurso e, finalmente, Leonardo poderá tomar a 
sua conclusão baseado no método científico. 
 
Pronto! Agora ele pode validar a hipótese “É verdade” ou “É mentira” ao invés de 
simplesmente aceitar a afirmação dita. 
O método científico foi utilizado para produzir quase tudo que existe, indo do 
aparelho em que você está lendo este texto até a cadeira em que está 
sentado(a). Nós utilizamos esse método muitas vezes de forma inconsciente, 
mas temos que ter em mente que ele existe e que devemos pensar sempre de 
forma criteriosa. 
Resumindo, as etapas do métodocientífico são: observação, 
questionamento, hipótese, experimento, análise dos resultados e conclusão. 
Método científico. Fonte: EnsineMe. 
Agora que já entendemos o método científico, podemos falar sobre desenho 
experimental. Ele é um conjunto de etapas que devem ser realizadas para 
conduzir uma hipótese utilizando o método científico, com objetivo de 
estabelecer um resultado confiável e reprodutível. 
A reprodutibilidade é um dos pontos mais importantes da ciência. 
Exemplo 
Vamos entender melhor com um exemplo: 
Sua equipe do laboratório desenvolveu uma nova técnica de quantificação de 
DNA. Você deverá escrever sua metodologia passo a passo, com detalhes dos 
tipos de solventes necessários, as concentrações, pressão, temperatura de 
incubação etc. Os dados devem ser claros para que quando outra pessoa ler 
essa metodologia (por exemplo, alguém do outro lado do mundo, cinco anos 
depois) ela consiga chegar no mesmo resultado, considerando que todas as 
condições e manipulação foram realizadas conforme o descrito. 
As etapas do desenho experimental, são: 
Escolha uma das Etapas a seguir. 
1. Definir a relação causa-efeito 
2. Planejamento 
3. Execução 
4. Análise e interpretação 
5. Formular as conclusões 
A partir do desenho experimental, pretendemos dizer de que modo ou por que 
causas o fenômeno é produzido. Assim, a partir da ideia de relação de causa-
efeito em que se acredita que existe uma relação entre a construção da causa e 
o efeito observado, formulamos as hipóteses a serem testadas, temos os vários 
tratamentos (variáveis independentes) e executamos o experimento e 
observamos os resultados (variáveis dependentes). Se o experimento for bem 
elaborado e planejado, podemos formular conclusões a respeito da relação de 
causa-efeito para a hipótese estabelecida. 
1.1 – VARIÁVEIS DEPENDENTES E 
INDEPENDENTES 
Mas o que são variáveis dependentes e independentes? Para responder a essa 
pergunta, aprenderemos alguns conceitos essenciais para o desenho 
experimental! 
Sempre que fazemos um experimento, queremos verificar os seus resultados. 
Todos os resultados (outputs) são originados a partir das entradas do 
experimento (inputs). 
 
Considerando que eu quero extrair o DNA com sucesso, meu input vai ser o 
material coletado, por exemplo, o raspado da face interna da bochecha, e 
o output vai ser o DNA extraído desse material. 
Os inputs são suscetíveis às diversas variáveis. Elas são agrupadas em dois 
grupos: variáveis dependentes e variáveis independentes. 
Escolha uma das Etapas a seguir. 
Variáveis independentes 
Variáveis dependentes 
Exemplo 
O experimento será medir a concentração plasmática do meu colesterol. As 
variáveis independentes, ou seja, as que eu posso controlar, seriam: Fiz jejum? 
Me alimentei bem? Usei algum medicamento nos últimos dias? Essas perguntas 
irão influenciar diretamente no resultado do colesterol encontrado, ou seja, na 
minha variável dependente, que nesse caso é a concentração de colesterol 
dosada no soro. 
1.2 – HIPÓTESE NULA E HIPÓTESE 
ALTERNATIVA 
Após os resultados do nosso experimento, baseado nos dados coletados e 
processos realizados, como garantir que o dado obtido em uma amostra pode 
ser generalizado para toda a população e verificar se a hipótese inicial estava 
correta? 
Resposta 
Para tentar responder a essas perguntas, os cientistas utilizam modelos 
estatísticos e testes de hipóteses para analisar os dados e testar a validade 
desses resultados. Por meio da inferência estatística, os testes de hipótese são 
utilizados para tomar a decisão de aceitar ou rejeitar uma hipótese estabelecida 
no início do desenho experimental. 
Existem dois tipos de hipóteses: a hipótese nula (H0) e a hipótese alternativa 
(H1). 
 
Hipótese nula 
Indica que não há uma relação causa-efeito. 
 
Hipótese alternativa 
Afirma que existe uma relação causa-efeito, ou seja, rejeita a hipótese nula. 
Vamos entender melhor a partir de um exemplo: 
Para provar que existe um padrão, ou seja, uma relação causa-efeito, vamos 
estudar se, ao falar com um papagaio, ele repete exatamente o que eu falo. 
Nesse caso, minha hipótese inicial, aquela que eu quero provar, é que o 
papagaio repete o que eu falo. 
Para isso, o experimento será falar várias vezes para o papagaio a palavra 
Vasco e observar o que ele diz. Como resultado, podemos esperar que ele repita 
a mesma palavra (Vasco) ou não (Flamengo, ou qualquer outra palavra diferente 
de Vasco). Assim, teremos duas hipóteses: a hipótese nula (aquela em que não 
há relação causa-efeito), que ele não repete o que falamos, ou seja, ao ouvir 
Vasco, ele diz Flamengo. Quando isso acontece, dizemos que a H0 é verdadeira; 
E a hipótese alternativa (aquela que confirma a relação causa-efeito), em que 
ele repete o que estamos falando, ao ouvir Vasco, ele repete Vasco. Nesse 
caso, rejeitamos a H0 e a H1 é verdadeira. 
Objeto com interação. 
 
Hipóteses nula e alternativa. Fonte: EnsineMe. 
1.3 – TIPOS DE ERROS 
Todos os experimentos e análises de resultados são passíveis de erros de 
interpretação e/ou do processo realizado. Os erros são causados quando temos 
uma interpretação errônea dos dados, o que nos leva a rejeitar uma hipótese 
verdadeira (falso positivo) ou não rejeitar uma hipótese falsa (falso negativo). Os 
erros podem ser classificados como tipo 1 e 2, de acordo com a hipótese que 
será rejeitada. 
 A hipótese nula é verdadeira 
 
 
Decisão 
Decidimos rejeitar a hipótese nula. Erro tipo 1 (rejeição de uma hipótese nula verdadeira) Decisão corr
Aceita-se a hipótese nula. Decisão correta Erro tipo 2 (n
Erros do tipo 1 e 2. 
Vamos voltar ao exemplo anterior para entender melhor esses erros: 
Como aprendemos anteriormente, ao falar para o papagaio a palavra “Vasco” e 
ele repetir “Flamengo” ou qualquer outra palavra além de “Vasco”, a hipótese 
nula é verdadeira (sem relação causa-efeito). No entanto, quando falamos 
“Vasco” para o papagaio e ele repete outra palavra, enviesados para a obtenção 
de uma relação de causa-efeito, rejeitamos a H0, mesmo ela sendo verdadeira. 
Temos um erro do tipo 1 ou falso positivo. Nesse tipo de erro, a hipótese nula 
é verdadeira (ou seja, ele não repetiu a palavra Vasco) e nós a rejeitamos (pois 
entendemos Vasco). 
Vimos também que quando falamos Vasco e ele repete Vasco, a H0 é falsa. 
Qualquer outra palavra dita pelo papagaio torna a H0 verdadeira, pois ele não 
repetiu a palavra que queríamos (Vasco). No entanto, se ao falar Vasco ele 
repetir a exata palavra Vasco, e nós entendermos “Asco” por engano, vamos 
entender que a H0 é verdadeira, porém, neste caso, a hipótese nula é falsa, uma 
vez que ele de fato repete a palavra “Vasco”. Esse é um erro do tipo 2 ou falso 
negativo: aceitamos uma H0 verdadeira (pois entendemos que ele disse Asco), 
mas, na verdade, a hipótese nula era falsa (ou seja, ele disse “Vasco”). 
Você sabia 
Esses conceitos podem ser utilizados em qualquer desenho experimental e são 
muito comuns na área médica, principalmente em testes de diagnóstico clínico, 
onde kits de diagnóstico demonstram resultado positivo para uma doença 
inexistente ou resultado negativo, quando na verdade há presença de doença. 
Assista ao vídeo abaixo e entenda melhor o desenho experimental. 
1.4 – SELEÇÃO DE PARTICIPANTES 
A seleção dos participantes, população de estudo, deve ser a mais 
representativa possível, para termos uma menor chance de errar ao generalizar 
os resultados. 
A seleção de participantes de um estudo também pode ser chamada 
de amostragem, que pode ser não probabilística ou probabilística. 
A não probabilística ocorre quando a probabilidade da seleção de cada 
participante não é conhecida, a seleção da amostra depende do julgamento do 
pesquisador e esta pode ser feita pela amostragem por conveniência (o 
pesquisador escolhe quem está disponível) ou julgamento (o pesquisador 
escolhe quem ele acha interessante). 
Já na amostragem probabilística, cada elemento da população possui a mesma 
probabilidadede ser selecionado para compor a amostra. Nesse caso, a 
probabilidade da seleção de cada participante é conhecida. Por exemplo, em 
uma amostra aleatória simples com 10 participantes, a chance de um deles ser 
escolhido é 1/10, ou seja, 10%. 
A amostragem probabilística pode ser: 
Clique na barra para ver as informações. 
AMOSTRAGEM ALEATÓRIA SIMPLES 
Participantes são selecionados aleatoriamente em uma determinada população. 
Em uma população de 12 participantes, eu escolho 9 de forma aleatória, ou seja, 
ao acaso. Isso poderia ser realizado por sorteio, por exemplo. 
Amostragem aleatória simples. Fonte: Bakhtiar Zein/Shutterstock.com. 
AMOSTRAGEM SISTEMÁTICA 
O primeiro participante é selecionado a partir de um número preestabelecido e 
os outros participantes são escolhidos seguindo um mesmo coeficiente. 
Por exemplo, em uma população com 13 participantes, vamos padronizar um 
coeficiente de 3. Além disso, vamos utilizar a fórmula 1 + (K x N), onde K é meu 
coeficiente e N o número do participante. 
Se definimos o primeiro participante como o número 1 (poderia ser qualquer 
outro), quais seriam os outros participantes? 
 O segundo participante será o número 1 + o coeficiente (3) X a quantidade de participantes já escolhidos, 
assim teríamos 1 + 3 (coeficiente) X 1 (número já selecionado). Ou seja, o participante seria o número 4. 
 O terceiro participante será o número 1 + 3 x 2 = 7. 
 O quarto 1 + 3 x 3 = 10. 
 O quinto 1 + 3 x 4 = 13, fechando, assim, a amostra. 
Amostragem sistemática. Fonte: Bakhtiar Zein/Shutterstock.com. 
Com os conceitos básicos sobre desenho experimental estabelecidos, podemos 
seguir para as próximas etapas da fase pré-analítica do isolamento de ácidos 
nucleicos. Os conceitos aprendidos neste tópico são valiosos e podem ser 
utilizados em qualquer situação da vida, seja ela profissional ou do nosso 
cotidiano. 
2 – COLETA, TRANSPORTE E 
ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS 
BIOLÓGICAS DESTINADAS AOS TESTES 
MOLECULARES 
 
Atualmente, o mercado dos testes moleculares está em intensa expansão. O 
marketing feito pelos laboratórios, as divulgações promovidas por celebridades, 
as regulações nos preços dos testes, o desenvolvimento de marcadores e os kits 
acessíveis, entre outros fatores colaboram para o crescimento desse ramo de 
mercado. 
São várias as empresas fazendo testes utilizando material genético para 
diferentes fins, por exemplo, indicar a ancestralidade e a origem genética e 
apontar marcadores genéticos para doenças, além dos testes laboratoriais para 
diversos tipos de infecções (incluindo COVID-19). 
Saiba mais 
Num passado recente, pensar nesse tipo de tecnologia de diagnóstico era 
deixado para filmes de ficção científica, aqueles onde um médico high-
tech coleta o sangue do paciente, passa em uma máquina e depois de alguns 
segundos um papel é impresso indicando todas as doenças e quais 
medicamentos utilizar. 
Hoje em dia esse tipo de abordagem é real, ou pelo menos bem parecido com 
filmes, pois a população tem acesso aos testes de forma mais fácil e barata. É 
importante ressaltar que no Brasil existem algumas empresas com esse perfil! 
Sempre que pensamos nos testes moleculares, automaticamente temos a ideia 
de perfeição, por se tratar de tecnologia de ponta, pela propaganda ser sempre 
bem feita e por ser algo muito misterioso, de entendimento distante do senso 
comum. Apesar de muitos acharem que os resultados de testes genéticos são 
absolutos, isso não é uma verdade: eles estão sujeitos a erros assim como 
qualquer teste de laboratório e a maioria desses erros ocorrem justamente na 
fase pré-analítica (que compreende desde a coleta do material até o cadastro e 
armazenamento das amostras no laboratório, antes da análise propriamente 
dita). 
Você sabia 
Diferentes amostras biológicas podem ser coletadas para os testes moleculares, 
como sangue, escarro, amostra de tecidos, um fio de cabelo, dentre outras. A 
partir dessas amostras, podemos detectar a presença tanto do nosso material 
genético (DNA/RNA) quanto o de microrganismos, conseguindo verificar e 
quantificar a presença de vírus, bactérias, protozoários; analisar a predisposição 
ou estado de doenças genéticas; e fazer os famosos testes de paternidade. 
Além disso, é amplamente utilizado em perícias médicas: o jornalista Tim 
Lopes foi identificado com auxílio dos testes moleculares. 
É importante destacar que além das amostras biológicas, os testes moleculares 
podem ser realizados a partir de cultura de células e de microrganismos. Nesses 
casos, também é essencial os cuidados com a fase pré-analítica, para um 
resultado de qualidade. 
A coleta e manipulação de todas essas amostras, assim como na coleta de 
qualquer material biológico, deve ser realizada seguindo todas as normas de 
biossegurança, com utilização dos Equipamentos de Proteção Individual, para 
evitar contaminação. 
Além disso, as amostras devem estar devidamente identificadas com o nome do 
paciente e data da coleta, assinatura de quem coletou e um código numérico 
para dupla verificação. Amostras que não estiverem identificadas corretamente 
ou aquelas que apresentem características que impossibilitem o teste, como a 
presença de hemólise no tubo de sangue, devem ser descartadas. 
Alguns tipos de testes possuem critérios específicos de acordo com o 
procedimento realizado. É obrigação do laboratório deixar evidente para os 
pacientes os critérios de aceitação e exclusão de amostras para cada tipo de 
ensaio. 
 
A quantidade de material genético extraído depende diretamente do local de 
coleta, do número de células presentes e pode variar conforme a idade do 
paciente, além de depender diretamente das condições de transporte e 
armazenamento. 
Atenção 
Em algumas ocasiões, um resultado negativo em um exame pode ser resultado 
de um erro durante a fase pré-analítica, uma vez que o material genético tem 
que estar viável para conseguir realizar as técnicas moleculares que envolvem 
sua amplificação. É sempre preferível trabalhar com amostras frescas para 
melhorar o rendimento. 
Veja alguns cuidados para extração de amostras de DNA e RNA: 
Clique nas barras para ver as informações. 
EXTRAÇÃO DE DNA 
Para extração de DNA, a coleta deve seguir alguns cuidados, pois, no nosso 
organismo, existem moléculas capazes de degradar o DNA, como as 
desoxirribonucleases (DNases) que necessitam de íons metal para a sua 
atividade. Então, para inativação da enzima, pode ser necessária a utilização de 
agentes quelantes como o EDTA. Ela também é inativada pelo calor durante 10 
minutos a 65°C. 
EXTRAÇÃO DE RNA 
A coleta de amostras para a extração de RNA requer mais cuidados. O RNA é 
uma molécula altamente instável e que apresenta grande fragilidade e se 
degrada rapidamente pela ação de ribonucleases (RNase). Essas enzimas não 
precisam de cofator para se ativar, são estáveis, ficando ativas mesmo após a 
fervura e autoclavagem, e estão presentes em uma série materiais biológicos e 
na nossa pele. É muito importante a adição de agentes estabilizadores de 
RNA o mais rápido possível e que o recipiente utilizado seja certificado como 
Ribonucleases (RNase) free, ou seja, livre de agentes degradantes de RNA, 
estéril, e sempre deve ser manipulado com luvas! 
Vamos agora conhecer a peculiaridade de algumas amostras destinadas à 
extração do DNA/RNA. 
 
2.1 – SANGUE E ASPIRADO DE MEDULA 
ÓSSEA 
Amostras de sangue e aspirado de medula óssea precisam ser armazenadas 
junto a agentes anticoagulantes para manter a estabilidade da amostra, 
impedindo a coagulação sanguínea. Entretanto, a heparina (agente 
anticoagulante amplamente utilizado) é um potente inibidor de algumas técnicas 
moleculares, dentre elas o famoso PCR (Polymerase Chain Reaction). 
Você sabia 
A impossibilidade do uso de heparina fez com que outros anticoagulantes 
fossem preferíveis, normalmente são utilizados o EDTA (ácido 
etilenodiaminotetracético) ou o ACD (citrato de dextrose) para estas amostras. 
A coleta de amostras com o anticoagulanteEDTA, apesar de ser mais utilizada e 
indicada para amostras de sangue, também pode interferir em algumas 
metodologias, já que o EDTA pode inibir drasticamente a atividade da DNA 
polimerase se estiver em excesso. 
Quando o objetivo é a análise do DNA, o sangue total é estável por até 24 horas 
em temperatura ambiente. Na temperatura de 2°C a 8°C é estável por até oito 
dias. De forma diferente, o plasma fica estável apenas 5 dias na temperatura de 
2°C a 8°C, suportando tempos maiores se for congelado e a amostra deve ser 
transportada em ambiente refrigerado. 
Além disso, se congelada, é necessário que não haja ciclos de congelamento-
descongelamento. Para análise de RNA viral, o sangue deve ser centrifugado e 
o plasma transferido para outro tubo estéril e livre de RNases em até quatro 
horas da coleta. 
Para as amostras de aspirado de medula óssea, a seringa deve conter EDTA e 
após a coleta o aspirado pode ser armazenado por até 72 horas na temperatura 
de 2°C a 8°C. Caso seja necessário um maior tempo para o processamento, os 
eritrócitos precisam ser removidos e a amostra congelada a -20°C, assim a 
estabilidade do material permanece por meses. 
Atenção: ela só pode ser congelada após a remoção dos eritrócitos! 
Saiba mais 
1. Para a extração de RNA após a coleta, esta deve ser colocada imediatamente 
em solução estabilizante de RNA. Caso não tenha essa solução e não seja 
congelada, ela deve ser transportada em gelo seco e analisada em até 4 horas. 
2. O grupamento heme presente nas hemoglobinas pode inibir a reação de PCR, 
então amostras que tenham algum tipo de hemólise não são satisfatórias para 
análise. Além disso, caso haja necessidade de remoção dos eritrócitos, esta 
deve ser feita de forma cuidadosa, para evitar a hemólise e liberação do grupo 
heme e causar problemas nos testes moleculares. 
 
2.2 – AMOSTRA DE TECIDOS 
As amostras de tecido são preferíveis quando os agentes etiológicos estão 
alojados no tecido e/ou o diagnóstico das possíveis infecções seja difícil por 
meio da simples coleta de sangue. Além disso, essas amostras são a de escolha 
durante as autópsias e para a análise de tecidos tumorais para comparar o DNA 
das células tumorais com as normais. 
Saiba mais 
Para garantir uma boa análise, é recomendado coletar de 1 g a 2 g de tecido-
alvo. No entanto, a quantidade pode variar de acordo com o tecido. 
Apenas para termos uma ideia, 10 mg de tecido fornece cerca de 10 µg de 
material genético. Essa quantidade já é suficiente para análise, mas sempre 
devemos trabalhar com uma margem de segurança, pois possíveis perdas de 
material podem ocorrer. 
Para tecidos, o ideal, após a coleta por biópsia, é o rápido congelamento em 
nitrogênio líquido (-196°C) ou manter esse tecido em solução de preservação de 
ácidos nucleicos. Não é recomendável manter esse tipo de material em 
temperatura ambiente por muito tempo. 
Amostras pequenas devem ser embrulhadas em gaze umedecidas com salina 
para evitar ressecamento, além da solução de preservação de ácidos nucleicos. 
Tecidos sólidos apresentam muitas endonucleases e devem ser processados ou 
congelados o mais rápido possível! 
Atenção 
Tecidos de biopsia embebidos em fixadores utilizados para a preservação de 
tecidos para exame histopatológico não devem ser empregados para os exames 
de biologia molecular! 
A estabilidade do tecido depende do tipo de tecido coletado. 
Observe a estabilidade do DNA nas seguintes condições: 
Mantido em banho de gelo triturado ou refrigerado em temperatura entre 2°C e 8°C 
Congelado a -20°C 
Congelado a -70°C 
Se houver impossibilidade de congelar ou usar a solução preservadora, a 
amostra deve permanecer em ambiente com gelo, inclusive no transporte e ser 
processada em 24 horas para o isolamento do DNA. 
Quando a amostra for coletada para a extração do RNA, essa amostra deve ser 
rapidamente congelada em nitrogênio líquido (-196°C) antes de ser congelada a 
-70°C, processada em no máximo uma hora após a coleta ou colocada em 
solução estabilizadora do RNA. No momento da extração, as amostras não 
podem ser descongeladas, e sim homogeneizadas diretamente em solução 
adequada para a extração (chamado agente de extração, geralmente 
isotiocianato de guanidina). Os tubos de coleta também devem ser livres de 
RNases, estéreis e apenas manipulá-los com luvas, para evitar a degradação do 
RNA. 
Normalmente, na temperatura de -20°C as RNases ainda estão ativas, assim, é 
recomendado manter as amostras para análise de RNA em temperaturas ≥ -
70°C. 
 
2.3 – CÉLULAS BUCAIS 
A coleta das células bucais para a extração de DNA ou RNA pode ser realizada 
por meio de um raspado de células da parte interna da boca utilizando 
um swab ou a partir do bochecho. Para extração de RNA essa amostra deve ser 
inserida em um tubo contendo solução estabilizante de RNA/DNA. De forma 
diferente, amostras para extração de DNA podem ser secas ou estabilizadas e 
transportadas à temperatura ambiente. As amostras estabilizadas dentro do tubo 
possuem validade de até uma semana em temperatura ambiente, podendo ser 
transportadas sem maiores cuidados. 
Você sabia 
Alguns swabs mais longos também podem ser utilizados para coletar material 
presente na orofaringe e na nasofaringe para o diagnóstico de algumas doenças, 
em que o agente infectante colonize as vias respiratórias, como o novo 
coronavírus e o vírus influenza. 
 
Atualmente, as empresas enviam os kits de coleta para o paciente realizar o 
procedimento em casa: o swab deve ser esfregado na parte interna da 
bochecha, cerca de 10 vezes de cada lado e, em seguida, inserido no tubo que 
vem no kit contendo a solução estabilizante. Os erros mais comuns que ocorrem 
nesse tipo de abordagem são: o paciente descartar a solução estabilizante, a 
contaminação do swab com restos de alimentos, batom e em outros casos até 
mesmo o paciente não identificar corretamente o tubo. 
Deve-se evitar a coleta desse material após refeições, pois não é tão raro 
encontrar, nas amostras encaminhadas para o laboratório, o DNA de galinha nos 
testes onde supostamente era para ser feita a detecção de DNA de um ser 
humano. 
2.4 – COLETA DE LÍQUIDO 
CEFALORRAQUIDIANO (LÍQUOR OU LCR) 
O LCR quando coletado para análise do DNA deve ser coletado em frascos 
estéreis, transportado na temperatura de 2°C a 8°C e, caso não seja processado 
rapidamente, congelado na temperatura a partir de -20°C. Para análise de RNA, 
se o processamento não for realizado em até 4 horas, essa amostra deve ser 
congelada. No entanto, caso a amostra tenha eritrócitos, esses devem ser 
removidos antes do congelamento. 
Outras amostras também são utilizadas para a extração de DNA/RNA. Para 
conhecer mais sobre esse assunto, visite a revisão Coleta, transporte e 
armazenamento de amostras para diagnóstico molecular, presente no Explore 
mais! 
VERIFICANDO O APRENDIZADO 
1. Estudamos as diferenças entre hipótese nula e hipótese 
alternativa e os possíveis erros gerados a partir da interpretação 
errada dessas análises. O erro tipo 1 consiste em: 
 
Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é falsa. 
 
Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é verdadeira. 
 
Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula e a alternativa são 
falsas. 
 
Rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é falsa. 
 
Rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é verdadeira. 
Responder 
Comentário 
2. O armazenamento de amostras biológicas é fundamental para 
uma boa análise. Com base no que estudamos, qual seriam as 
melhores condições para armazenamento de uma amostra de 
tecido, por mais de 1 semana, para a extração de RNA? 
 
Após a coleta, manter em temperatura ambiente. 
 
Após a coleta, um rápido congelamento em nitrogênio líquido (-196°C), seguido 
do congelamento a -70°C. 
 
Após a coleta, colocar o tecido em um pote com formol, congelar em nitrogênio 
líquido (-196°C), seguido do congelamento a -70°C. 
 
Após a coleta, manterna temperatura de 2°C-8°C por 24 horas. 
 
Após a coleta, colocar o tecido em um pote com formol, congelar em nitrogênio 
líquido (-196°C), seguido do congelamento a -20°C. 
Responder 
Comentário 
MÓDULO 2 
 
Descrever os procedimentos de extração e quantificação de DNA e RNA e 
síntese de cDNA 
1 – EXTRAÇÃO DO DNA E DO RNA A 
PARTIR DAS AMOSTRAS COLETADAS 
Agora que conhecemos todas as etapas pré-analíticas, estamos prontos para 
colocar a mão na massa! Vamos então estudar de fato como é feita a extração 
do DNA e do RNA a partir das amostras coletadas para a obtenção do nosso 
material genético. 
No entanto, antes de começarmos a estudar a extração, é interessante relembrar 
que qualquer técnica ou procedimento utilizado no laboratório – seja ele qual for 
– é como fazer um bolo, e por isso devemos seguir uma determinada receita. 
 
 
No laboratório, chamamos a receita de POP (procedimento operacional padrão) 
e temos que ter os ingredientes (os reagentes) e os utensílios para fazer o bolo 
(os materiais e instrumentos). Ler a receita e fazer o bolo é um processo 
mecânico, qualquer pessoa com um mínimo de conhecimento e que saiba como 
manusear os instrumentos consegue seguir o passo a passo, e dependendo da 
experiência, vai conseguir ter um resultado satisfatório. 
No fim do procedimento, pode ser que saia um bolo maravilhoso ou pode ser 
que não saia. Dessa forma, percebemos que é importante saber qual é a função 
de cada componente do bolo para entendermos o processo como um todo. Caso 
o bolo saia pequeno, faltou fermento, se ele saiu seco é porque faltou leite, e 
assim temos uma noção de causa-efeito. O inverso também é válido: podemos 
saber tudo sobre como funcionam os ingredientes do bolo, o nome da levedura 
usada no fermento, a temperatura ideal para assar o bolo, qual a importância de 
cada componente na construção do bolo, mas se não soubermos como mexer o 
bolo ou como ligar o forno, o processo simplesmente não funciona! 
Assim como fazer um bolo, é de suma importância primeiro entender os 
conceitos teóricos da extração do DNA e depois ver como funciona o passo a 
passo da técnica. 
Atenção 
Antes de iniciar nos procedimentos, é importante ressaltar que após a obtenção 
de nossa amostra, devemos sempre tomar cuidado onde ela será manipulada e 
com a preparação dos reagentes, evitando, assim, a contaminação com 
materiais genéticos de outros organismos, ou até mesmo com enzimas que 
podem vir a degradar o nosso material de estudo e gerar resultados falhos. 
2 – PROCEDIMENTOS DE EXTRAÇÃO DE 
DNA 
As células eucariontes possuem uma membrana celular, formada por uma 
bicamada fosfolipídica, além de diversos elementos dispersos no citoplasma, 
como as proteínas, os carboidratos, as organelas, os lipídios e os elementos 
minerais (sódio, potássio, sais, magnésio, entre outros). Além disso, a célula 
eucarionte também possui uma membrana nuclear e dentro do núcleo estão as 
proteínas, DNA e RNA majoritariamente. 
Para a extração do DNA, todos os outros elementos são considerados 
contaminantes, até mesmo o RNA. Assim, a estratégia básica da extração de 
DNA é, então, separar o DNA de todos esses outros elementos que não são 
DNA. Existem algumas formas diferentes de se fazer isso, mas alguns 
procedimentos devem ser feitos independentemente da forma de extração. 
 
A partir da amostra de células, a primeira etapa a ser realizada é o rompimento 
da parede celular (quando as células são de origem vegetal ou fungos), da 
membrana plasmática e da membrana nuclear, liberando, assim, o material 
genético. Podemos fazer isso de diversas formas, a saber: com o uso de 
detergentes capazes de desestabilizar a membrana celular e nuclear, abrasão 
física, ação de enzimas capazes de degradar a membrana e/ou parede celular, 
pressão osmótica e aquecimento, entre outras. 
Quando a intenção é extrair o DNA, junto ao rompimento das membranas é 
importante adicionar uma enzima capaz de destruir outras proteínas 
(proteinases), principalmente para inativar todas as DNases, impedindo a 
degradação do DNA. Em seguida, para remover o RNA, que neste caso é um 
contaminante, basta adicionar RNase no meio. Nessa etapa já removemos 
lipídios, proteínas e o RNA, mas ainda faltam os carboidratos e os elementos 
minerais. 
Existem algumas formas de se realizar essa etapa, vamos conhecer as 3 
principais. São elas: 
Clique nas barras para ver as informações. 
ADIÇÃO DE SOLVENTE ORGÂNICO 
Podemos usar um solvente como o fenol ou o clorofórmio. É importante lembrar 
que já degradamos lipídeos e RNA, rompemos as membranas e, se for o caso, a 
parede celular. Mas o que acontece? 
O fenol ou clorofórmio tornam essas moléculas (assim como os carboidratos e 
todos os elementos minerais) insolúveis. Após a adição dos solventes, seguida 
da centrifugação, formam-se duas fases: 
 
1. Fase aquosa: DNA 
Na fase superior, o DNA, que não é solubilizado nos solventes (fenol ou 
clorofórmio), vai permanecer na fase aquosa. 
2. Fase orgânica 
Todos os outros elementos irão para a fase orgânica (inferior), como proteínas, 
lipídeos, RNA degradados, carboidratos e outros elementos minerais solúveis 
em fenol/clorofórmio. 
Assim, com auxílio de uma pipeta, podemos transferir a fase aquosa com o DNA 
para outro tubo. 
Saiba mais 
O RNA degradado se torna insolúvel, pois complexa com os outros elementos do 
citoplasma. Se estiver íntegro, ele pode ir para a fase aquosa, dependendo do 
pH do solvente orgânico. 
SOLUÇÃO CONCENTRADA DE NACL 
O cloreto de sódio concentrado é capaz de precipitar os elementos degradados 
do citoplasma, deixando o DNA íntegro na fase aquosa. Assim, basta centrifugar 
e remover a fase aquosa do pellet precipitado, ou seja, recuperar apenas o 
sobrenadante, pois nele estão nossas substâncias de interesse. 
COLUNA DE ADSORÇÃO DO DNA 
O DNA possui carga total negativa vinda do grupamento fosfato. Assim, 
podemos adicionar uma coluna com carga positiva (normalmente é utilizada uma 
coluna de sílica) no nosso tubo e centrifugar. Dessa forma, o DNA vai ficar retido 
na coluna devido à sua carga negativa e os outros elementos irão passar direto 
pela coluna, ficando no fundo do tubo. Para remover o DNA da coluna, usamos 
um tampão de eluição carregado negativamente em grande quantidade. 
Normalmente, são usados os tampões Tris-HCl ou o EDTA. Eles irão competir 
com o DNA pela ligação na coluna de adsorção e, como estão em grande 
quantidade, ganham a competição e se aderem à coluna expulsando o DNA. O 
procedimento é feito também por centrifugação, porém o material que sairá da 
coluna será rico em DNA. 
Saiba mais 
Se estiver íntegro, o RNA pode ser purificado dessa forma! 
Após a obtenção do DNA por qualquer um desses métodos supracitados, 
precisamos eliminar qualquer resíduo que por um acaso ainda esteja misturado 
ao DNA. Para isso, adicionamos isopropanol, que precipita apenas o DNA. Após 
centrifugação, como o DNA encontra-se precipitado, nosso DNA puro encontra-
se no pellet. 
Você sabia 
O pellet fica bem aderido no fundo do tubo, podemos lavar o tubo com etanol 
70%, por exemplo, para remover todos os reagentes e secar o tubo, que o DNA 
continua aderido ao tubo. 
A etapa final consiste em ressuspender DNA, em água ou em tampão de 
eluição, basta adicionar um pouco do líquido escolhido e forçar a quebra 
do pellet, no final de todo o protocolo teremos um tubo contendo apenas o DNA 
puro. 
 
Saiba mais 
O processo de extração de DNA nos plasmídeos é bem semelhante ao processo 
geral de extração de DNA. No entanto, depois da lise da membrana e 
precipitação das proteínas citoplasmáticas, é adicionada uma solução de NaOH 
com pH bastante básico a ponto de desnaturar o DNA cromossomal e o também 
o próprio DNA plasmidial. Em seguida, é adicionado uma solução ácida 
neutralizadora que regenera o DNA plasmidial, mas não o cromossomal. Assim, 
podemos então separar por centrifugação, pois o DNA do plasmídeo fica em 
suspensão enquanto o DNA cromossomal precipita. 
Agoraque sabemos os princípios teóricos da extração do DNA, vamos simular 
uma situação em que estamos no laboratório e temos que extrair o DNA de uma 
amostra coletada. Para isso, vamos utilizar o protocolo desenvolvido pela 
EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) (Adaptado de 
OLIVEIRA et al., 2007). 
Vamos ver se você consegue identificar e entender o passo a passo de um POP 
utilizado em uma situação real. Parece desafiador, mas não se assuste, vamos 
juntos. 
A primeira etapa é conferir todos os reagentes que vamos precisar. São eles: 
 Tampão de digestão. 
 Solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico (25:24:1). 
 Microtubos de polipropileno; Frascos e bastões esterilizados. 
 Solução Tampão TE (tris-HCL 10 mM; EDTA 1 mM com pH 8.0; tris = 
hidroximetil aminometano). 
 Etanol 70%; Etanol absoluto; Acetato de amônio 7,5 M; Micropipetas de 1 
mL, 200 μL, 100 μL e 10 μL. 
 Centrífuga. 
 Isopor com gelo. 
 Vidraria de laboratório; Banho-maria a 50°C. 
Após conferimos todo o material, vamos começar a extração do DNA de um 
tecido de origem animal, e que por isso não apresenta parede celular. 
Lembre-se de que nossa amostra depois da coleta tem que estar armazenada 
no gelo, para manter a temperatura entre 2°C a 8°C. 
Se o tecido for duro, devemos macerar, usando um bastão de vidro, e se tiver 
grande quantidade de líquidos, a amostra deve ser centrifugada para remover o 
líquido em excesso. Na primeira etapa da extração, adicionamos o tampão de 
digestão, na concentração de 1,2 mL de tampão para cada 100 mg de tecido. 
Em seguida, devemos deixar o tubo em banho-maria a 50°C por cerca de 8 a 16 
horas, para garantir a digestão completa das membranas plasmáticas e 
nucleares e proteínas. No final, o material apresentará um aspecto viscoso. 
Saiba mais 
O tempo de incubação no banho-maria varia de acordo com o tamanho da 
amostra. 
A segunda etapa é a extração do DNA com fenol e precipitação dos compostos 
indesejáveis. Para isso, o tubo é retirado do banho-maria e esperamos ele 
chegar a 37°C para adicionar 5 μL de RNase, e depois incubamos por 15 
minutos sob leve agitação. 
Saiba mais 
A adição de RNase é opcional, deve ser empregada quando o RNA é 
considerado um contaminante. 
Em seguida, a solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico é adicionada na 
proporção de 1:1 com a quantidade de amostra do tubo, ou seja, para cada 500 
μL de material, adicionamos 500 μL de solução de fenol. É importante 
atentarmos para o pH da solução de fenol, pois em pH abaixo de 7.0 o DNA é 
degradado e vai para a interface, região entre a fase orgânica e a fase aquosa, 
mas é preconizado para extração de RNA. Resumindo: a solução de fenol com 
pH em torno de 7.0 é usada para extração de DNA e em pH entre 4,5 e 5,5 é 
usado na extração de RNA, que veremos a seguir. 
Após a adição do fenol, homogeneizamos e centrifugamos o tubo por dez 
minutos a 1.700 g. Uma vez com as fases aquosa e orgânica bem definidas, 
separamos a fase aquosa contendo o DNA e descartamos a fase orgânica com 
todos os contaminantes. 
Atenção 
Nessa etapa, é importante separar bem as fases, pois o fenol pode ser um 
contaminante, então é recomendado centrifugar duas vezes. 
A terceira fase é a purificação do DNA por meio da precipitação com etanol. 
Antes de usarmos o etanol em si, adicionamos meio volume de acetato de 
amônio 7,5 M e dois volumes de etanol absoluto. 
Comentário 
Neste POP do EMBRAPA, o etanol é utilizado como agente precipitante do DNA, 
entretanto poderíamos utilizar o isopropanol também. 
Saiba mais 
A unidade volume é usada para padronizar as quantidades em qualquer sistema, 
supondo um volume de 500 μL de fase aquosa, meio volume significa 250 μL e 
dois volumes significam 1.000 μL. 
O acetato de amônio facilita a precipitação do DNA pelo etanol e o etanol 
absoluto, além de concentrar o DNA, também ajuda a remover os resíduos 
remanescentes de fenol e clorofórmio. Centrifugamos a amostra a 1.700 g por 
cerca dois minutos. Após a centrifugação, será possível visualizar o pellet bem 
aderido ao fundo do tubo. Removemos toda a solução alcoólica e depois vamos 
ressuspender o pellet em etanol 70%. Centrifugamos novamente a 1.700 g por 
dois minutos e tiramos o sobrenadante (uma dica é deixar o tubo aberto por um 
tempo, para o etanol evaporar por inteiro). Agora com o pellet limpo, a fase final 
é a adição do tampão TE, para facilitar a dissolução do DNA, ou ainda podemos 
deixar o tubo em banho-maria a 50°C por algumas horas. 
Comentário 
Vale lembrar que nesse exemplo estamos extraindo o DNA a partir de amostras 
de tecidos. No entanto, existem variações do protocolo. Mesmo que a amostra 
também seja proveniente de tecido, o protocolo pode ser modificado, com a 
utilização de outros reagentes. Entretanto, esse é o procedimento básico e em 
geral usado em laboratórios para extração de DNA. 
3 – PROCEDIMENTOS DE EXTRAÇÃO DE 
RNA 
O procedimento de extração de RNA é bem parecido com o método de extração 
de DNA, mesmo o RNA sendo mais frágil e demandando mais cuidados. Todo 
material que entra em contato com a amostra deve ser tratado com soluções 
neutralizadoras de RNase e possuir a característica de ser RNase free. Além 
disso, a amostra deve sempre ser refrigerada em nitrogênio líquido ou gelo para 
evitar a ação de alguma RNase remanescente. 
Vamos agora rever as três etapas do protocolo de extração de DNA, ressaltando 
quais são as diferenças entre a extração do DNA e RNA. 
Clique nas barras para ver as informações. 
PRIMEIRA FASE – QUEBRA DA MEMBRANA 
Pode ser feita de forma mecânica ao invés de utilizar o tampão de digestão, 
usando um pistilo, bastão ou sonicador. Esta técnica apresenta uma vantagem: 
por ser mais rápida, diminui a chance de degradação do RNA. 
SEGUNDA FASE – EXTRAÇÃO DO RNA 
Não são utilizadas as RNases. A solução de fenol/clorofórmio na extração de 
RNA deve ter pH ácido (entre 4,5 e 5,5) para que o RNA fique na fase aquosa e 
o DNA fique na interface (essa fase intermediária só é formada durante a 
extração do RNA devido ao pH ácido). 
TERCEIRA FASE – PURIFICAÇÃO DO RNA 
É muito parecida com a do DNA, a diferença está no armazenamento: para RNA 
é preferível utilizar nitrogênio líquido. 
 
Extração de DNA/RNA 
1. Amostra inicial com as células digeridas 
 
Adição de solução fenol/clorofórmio 
2. Centrifugação da amostra, formando duas fases: orgânica (em amarelo no 
fundo do tubo) e aquosa (em azul acima da fase orgânica). No tubo A temos 
DNA e RNA dissolvidos na fase aquosa e no tubo B o DNA degradado fica na 
interface. 
 
 
 
3. A fase orgânica é descartada, permanecendo apenas a fase aquosa no tubo. 
 
Adição de acetato de amônio e etanol absoluto 
4. Após centrifugar, ocorre a formação de um pellet no fundo do tubo. Todo o 
líquido restante é descartado. 
 
 
 
5. O pellet é ressuspendido em tampão TE e agora o DNA ou RNA pode ser 
armazenado. 
Assista ao vídeo abaixo e conheça a importância do DNA na Biologia Molecular, 
entendendo como o material genético obtido será utilizado. 
4 – ARMAZENAMENTO DO DNA E DO RNA 
PURIFICADOS 
Após o isolamento (purificação), o DNA e o RNA precisam receber cuidados 
imediatos. Para o DNA, devemos armazená-lo em um tubo 
de plástico (preferencialmente de propileno) vedado a fim de evitar 
evaporação, hidrofóbico, em uma temperatura abaixo de 0°C. Dessa forma, 
diminuímos a atividade biológica das DNases. 
O DNA purificado é mantido em solução tampão tris-EDTA, com pH 7,2. A 
validade do DNA nestas condições é bastante alta. Confira: 
Temperatura ambiente 
Temperaturas baixas de 2°C a 8°C 
Congelado a -20°C 
Congelado a -70°C 
Atenção 
O DNA purificado é bastante resistente, uma vez que a sua solução não 
contenha água, pois a água quando congela forma cristais que podem danificar 
os materiais orgânicos. 
Após a extração do RNA, ele deve ser armazenado como um precipitado em 
etanol a 70% congelado na temperatura de -70°C. Alguns estudos mostram que 
após 2 meses,mantido na temperatura de -20°C, o RNA não perde sua 
integridade. No entanto, é importante destacar que na temperatura de -20°C 
ainda temos uma atividade RNases, sendo assim mais recomendado o 
congelamento em temperaturas de -70°C ou inferior. Assim como no DNA, os 
tubos devem ser de plástico estéril e manuseados com luvas limpas por uma 
solução de água com dietilpirocarbonato (composto capaz de eliminar RNases 
dos tubos) ou então por tubos com garantia de serem RNase-free. 
O etanol auxilia na precipitação do RNA, ajudando a concentrá-lo. Dessa forma, 
o RNA fica menos suscetível a agentes degradantes. 
5 – QUANTIFICAÇÃO, ANÁLISE DE PUREZA 
E INTEGRIDADE DO MATERIAL 
MOLECULAR 
A extração do DNA/RNA é sem nenhuma dúvida um dos processos mais 
importantes da Biologia Molecular, pois esses materiais servem de matéria-prima 
para diversas outras técnicas da Biologia Molecular, como a reação da cadeia da 
polimerase (PCR), sequenciamento, clonagem, hibridização, entre outras. Uma 
boa extração determina a qualidade do resultado dessas técnicas. O controle de 
qualidade da extração é dado pela quantificação, pureza e integridade desses 
materiais. 
Vamos entender melhor esses procedimentos? 
 
Quantificação 
Na quantificação determinamos a quantidade de DNA/RNA extraído da amostra 
inicial. A técnica mais utilizada é a fluorometria. Nesta técnica, uma pequena 
alíquota da amostra é transferida para outro tubo, onde é adicionada uma 
solução e um agente fluorescente capaz de se ligar entre as bases do DNA e 
RNA. 
Quando o agente fluorescente (fluoróforo) se liga a algo (DNA ou RNA), ele 
emite fluorescência e assim podemos medir, com ajuda de um aparelho 
(fluorímetro), a quantidade de fluorescência da amostra. 
A quantidade de fluorescência da amostra é diretamente proporcional, ou seja, 
quanto maior for a fluorescência, maior é a quantidade de DNA ou RNA. 
Uma vantagem dessa técnica é que ela é simples e, após a quantificação, 
sabemos se temos a quantidade de material suficiente para as próximas etapas. 
Além disso, podemos utilizar diferentes agentes fluorescentes: um específico 
para DNA e outro específico para RNA. Assim, podemos quantificar o quanto 
temos de cada um desses materiais moleculares. 
Quantificação do DNA fluorescente. Na 
foto temos o gráfico de duas amostras de DNA diferentes. Tradução: dsDNA = double-strand DNA; 
A1=amostra 1; A2=amostra2. Fonte: Yurij Kot/Wikimedia/Attribution-Share Alike 4.0 International 
Pureza 
Na pureza podemos avaliar se um DNA ou RNA apresenta contaminantes. A 
pergunta aqui é: Será que com o material extraído temos também fenol, álcool, 
proteínas, RNA (quando o desejo é DNA) e algum reagente residual? 
Para essa análise, a técnica mais utilizada é a espectrofotometria. 
Antes de entender a técnica, é importante lembrar que luz visível é uma pequena 
parte de todo o espectro de radiação eletromagnética existente, compreendendo 
comprimentos de onda entre 380-750 nm. Os comprimentos de ondas inferiores 
estão na zona de espectro da ultravioleta (UV) e superiores na zona de 
infravermelho. Quando uma luz branca passa por um prisma, ela se decompõe 
em raios de luz de diferentes comprimentos de onda, variando do vermelho ao 
violeta. Em um arco-íris, por exemplo, enxergamos 7 diferentes cores, cada uma 
dessas cores representa uma diferente faixa de comprimento de onda. 
Comprimento de onda no espectro da luz. UV e 
infravermelho não são visíveis. Fonte: Fulvio314/Wikimedia/Attribution-Share Alike 4.0 International 
Além disso, é importante relembrar que todo o composto químico apresenta a 
capacidade de absorver, transmitir ou refletir a luz em um determinado 
comprimento de onda. 
Assim, a espectrofotometria tem como princípio básico utilizar a capacidade das 
moléculas orgânicas de absorverem (absorbância) ou transmitir (transmitância) 
luz em determinado comprimento de onda, em um equipamento chamado de 
espectrofotômetro. 
A partir dela, podemos identificar os componentes em uma solução, pois as 
biomoléculas apresentam espectros característicos ao UV, visível ou 
infravermelho. Por exemplo, já é estabelecido que as proteínas absorvem 
comprimentos de onda de 280 nm; o RNA e DNA absorvem no comprimento de 
onda de 260 nm e o fenol e outros constituintes no comprimento de onda de 230 
nm. 
Saiba mais 
Além da possibilidade de indicar a biomolécula presente, podemos quantificá-la. 
Na prática, a quantidade de luz absorvida é diretamente proporcional à 
concentração da substância, assim, quanto maior for a concentração, maior é a 
absorção de luz (medido pela densidade óptica – OD). 
Confira o passo a passo para a realização dessa técnica: 
Escolha uma das Etapas a seguir. 
Etapa 01 
Etapa 02 
Etapa 03 
Etapa 04 
Atenção 
Lembre-se de que isso depende do comprimento de onda que estamos 
pesquisando (280 nm, 260 nm ou 230 nm)! Novamente, aqui, quanto maior for a 
absorção de luz, maior a quantidade de determinado material. 
Na figura a seguir, vemos um resultado de uma análise espectrofotométrica, 
mostrando um pico de absorção da luz no comprimento de onda 260 nm, o que 
indica a presença de DNA ou RNA. 
Resultado de uma análise de espectrofotometria. Fonte: 
Vossman/Wikimedia/Attribution-Share Alike 4.0 International 
Com os resultados, podemos verificar a pureza a partir da razão (divisão) da 
densidade óptica (OD) no comprimento de onda 260 nm pela OD no 
comprimento de onda 280 nm. 
Dizemos que o material genético está puro quando essa relação é maior ou igual 
a 1,8. Valores inferiores a esse indicam contaminação com proteínas e que o 
processo extrativo não foi realizado de forma correta. Outra forma de verificar 
essa pureza seria pela razão entre a OD 260 nm OD 230 nm, com material 
genético considerado puro quando estiver na faixa entre 1,8-2,2. 
Integridade 
Integridade avalia se o DNA/RNA extraído está íntegro. Essa avaliação é feita a 
partir da técnica de eletroforese. A eletroforese é uma técnica com uma enorme 
quantidade de variações e desdobramentos e é utilizada para os mais variados 
objetivos. Aqui iremos nos ater ao princípio básico da técnica e a sua aplicação 
no controle da integridade do material que foi extraído. 
Esta técnica consiste na migração e separação de moléculas de acordo com a 
carga após a geração de um campo elétrico. Ela utiliza diferentes meios de 
suporte, como fitas ou membranas de poliacetato de celulose e géis de agarose, 
que apresentam poros por onde as moléculas devem passar. 
Saiba mais 
No nosso organismo, as moléculas apresentam diferentes cargas. O DNA/RNA, 
devido ao grupamento fosfato, apresenta carga negativa. Além disso, as 
moléculas são separadas pelo tamanho. 
Para isso, uma pequena quantidade de amostra é aplicada em um gel, 
geralmente a agarose, inerte (que não reage com a amostra) em um poço (local 
de aplicação da amostra). Em seguida, é gerado um campo elétrico onde um 
polo do gel fica com a carga negativa (local onde a amostra é aplicada) e outra 
positiva. Como o DNA/RNA possui carga negativa, migrará para o polo positivo 
através do gel. No entanto, esse gel apresenta poros, conferindo resistência ao 
movimento das moléculas. Assim, moléculas mais pesadas e maiores ficarão 
presas no gel, enquanto as menores e mais leves migram com mais facilidade 
no gel. 
Esquema da eletroforese para DNA. Fonte: Cecierj.edu. 
Após a eletroforese, podemos detectar o DNA/RNA pela coloração (normalmente 
é utilizado o brometo de etídio, um corante que intercala no DNA) e visualização 
de bandas de DNA em um equipamento chamado transiluminador. Se a amostra 
estiver íntegra, verificamos apenas uma marca (banda) intensa no gel de 
eletroforese. No entanto, caso a nossa amostra esteja fragmentada, essa banda 
se apresenta “espalhada” (arraste) ao longo do comprimento do gel, indicando 
que existem diversos fragmentos, ou seja, o DNA/RNA não está íntegro. 
 
Bandas bem definidas 
 
Bandas com arraste 
Gel de eletroforese (DNA fragmentado). Fonte: Mohammed_Al_Ali/Shutterstock.com6 – SÍNTESE DE CDNA 
Como aprendemos anteriormente, existem várias técnicas na Biologia Molecular, 
PCR, sequenciamento, clonagem e hibridização que são dependentes da 
matéria-prima (DNA, na maioria dos casos). Essas técnicas podem ser utilizadas 
para diferentes fins, mas nem sempre a simples extração de DNA/RNA é 
suficiente para analisar o que se deseja. 
Vamos supor que queremos verificar se a expressão de uma proteína x está alta 
ou baixa nas células de um tecido. Para isso, extraímos o DNA e o material 
purificado representa todo o DNA da célula, incluindo o gene x, responsável pela 
expressão da proteína x. Entretanto, a detecção do gene x não indica muito 
sobre a expressão da proteína, uma vez que não conseguimos saber se ele foi 
transcrito, se o splicing alternativo gerou a proteína correta, se o RNAm foi 
devidamente processado. Neste caso, o ideal é avaliar o RNAm, já processado, 
sem a presença de íntrons. 
Além disso, algumas técnicas utilizam apenas o DNA para realizar a 
amplificação e detecção, como PCR. 
Por exemplo, queremos ver se uma pessoa tem uma infecção pelo novo 
coronavírus (Sars-CoV-2), um vírus de RNA. Nesse caso, a amostra extraída é o 
RNA viral, mas é inviável a sua detecção, pois precisamos de grandes 
quantidades de material, preferencialmente de DNA, por ser mais estável. Logo, 
o material precisa ser multiplicado o suficiente para poder ser devidamente 
analisado. Para isso, usamos a técnica do PCR, que consiste em amplificar uma 
amostra de DNA. 
 
Então fica uma dúvida: como fazer essa análise, pois segundo o dogma central 
da Biologia, o DNA é transcrito em RNA e o RNA é traduzido em proteína. 
Essa questão foi resolvida por meio de outro vírus, o vírus da imunodeficiência 
humana (HIV), que revolucionou a Biologia Molecular. Vamos entender como? 
Este é um vírus de RNA, que após a penetração na célula alvo, injeta o RNA 
viral no citoplasma. Lá, uma proteína do vírus chamada transcriptase 
reversa converte o RNA em DNA, esse DNA entra no núcleo e outra proteína 
chamada integrase junta o DNA do vírus com o da célula-alvo. Agora, a célula-
alvo é capaz de transcrever o DNA viral (presente no genoma da célula 
hospedeira) em RNA viral, que forma outro vírus de HIV, e assim continua o 
processo de infecção. 
Comentário 
Nesse processo, algo muito curioso acontece: a transcriptase reversa do vírus é 
capaz de alterar o dogma central da Biologia, transformando o RNA em DNA. 
E se usássemos essa polimerase na Biologia Molecular para gerar DNA a partir 
de, por exemplo, um RNA mensageiro (RNAm)? E assim foi feito. 
O DNA obtido a partir do RNA é chamado de cDNA (DNA complementar). 
Recebe esse nome pois é complementar ao RNA molde. 
A construção do cDNA é feita em um tubo contendo: 
 
1) RNA molde: é a sequência de RNA usada para a construção do cDNA. 
2) Transcriptase reversa: é a polimerase capaz de transcrever o RNA em cDNA. 
3) Nucleotídeos (A, T, C, G): são unidades funcionais para a síntese do cDNA. 
4) Íon bivalente de magnésio (Mg2+): é um cofator essencial para o 
funcionamento da transcriptase reversa. 
5) Primers: são pequenos fragmentos de DNA fita simples que se 
complementam ao RNA para dar início à transcrição reversa. 
6) DNA polimerase: responsável por sintetizar o DNA a partir dos nucleotídeos 
presentes. 
A síntese do cDNA começa pelo anelamento do primer no RNA, seguido pelo 
acoplamento da transcriptase reversa e início da sua atividade, formando o 
cDNA no sentido 5’ – 3’. Uma fez formado o cDNA, o fragmento de RNA usado 
como molde é degradado pela RNase H, um domínio do próprio complexo da 
transcriptase reversa. 
Síntese do cDNA. Fonte: Lokeshthimmana/Wikimedia/Atribuição-CompartilhaIgual 4.0 Internacional 
Durante a construção do cDNA, uma etapa crítica para termos um cDNA de boa 
qualidade é a construção do primer. Existem três estratégias gerais de 
construção de primers: 
Clique nas barras para ver as informações. 
OLIGO DT 
É o primer formado por vários nucleotídeos do tipo timina que se anela a cauda 
poli-A do RNAm maduro. Ele é preferencialmente utilizado quando queremos 
fazer cDNA de RNAm. Para o oligo dT é importante que o RNAm esteja íntegro, 
uma vez que ele se anela na extremidade 3’ do molde. Se o RNAm estiver 
fragmentado, o cDNA vai ser feito apenas de um pequeno trecho e talvez seja 
não funcional. 
RANDÔMICO 
Este primer é feito de pequenas sequências aleatórias que se anelam a qualquer 
RNA presente, incluindo rRNA (RNA ribossomal) e tRNA (RNA transportador). 
Ele é indicado para amostras de sequência desconhecida ou de difícil 
manipulação. 
ESPECÍFICO 
É o primer construído especificamente para um determinado RNA, sendo 
utilizado quando se tem um alvo determinado, por exemplo, diagnosticar um 
RNA viral. O primer é desenhado de forma complementar ao RNA viral. Por isso, 
ao término da reação, só teremos cDNA se o primer encontrar o seu RNA alvo. 
Para o primer específico, é fundamental que toda a sequência do DNA/RNA seja 
conhecida. 
Atenção 
É importante ressaltar que os três tipos de primers podem ser combinados, 
formando um primer com um trecho oligo dT e outro trecho específico. Dessa 
forma, teremos uma transcrição da porção 3’ de um RNA molde específico ou 
oligo dT com um randômico, para tentar formar cDNA de qualquer RNAm do 
material inicial. A combinação de primers depende de criatividade do 
pesquisador e da sua capacidade de otimizar a síntese do cDNA. 
Neste ponto, temos então uma fita de cDNA íntegra, recém-formada pela 
transcriptase reversa e uma fita de RNA ligada ao cDNA parcialmente degradada 
pela RNase H. Assim, sintetizamos um RNAm maduro, sem a presença de 
íntrons. Esses fragmentos de RNA serão utilizados como primers de iniciação 
pela DNA polimerase que irá construir o DNA complementar ao cDNA. 
Com isso temos finalmente a fita dupla de DNA formada. 
Formação da fita dupla 
de cDNA. Fonte: EnsineMe. 
Na figura vemos que o RNAm se liga ao primer oligo dT. Em seguida, a 
transcriptase reverse sintetiza uma fita de cDNA (sequência de bases 
representada pela linha azul), a partir do primer oligo dT ligado ao RNAm. A 
RNAse H quebra o RNAm associado ao cDNA recém sintetizado. Os dNTPs 
presentes no meio reacional são usados para a construção de uma nova fita de 
DNA complementar ao cDNA, pela ação da DNA polimerase. Com isso, a fita 
dupla de cDNA é formada. 
A construção de cDNA tem como funções principais: 
 Possibilitar a construção de uma biblioteca genômica, estabelecendo 
relações de quais genes podem expressar quais proteínas, o que pode ser 
aplicado para elaboração de terapias, estudo de espécies, doenças etc. 
 Possibilitar a amplificação de RNA pela PCR. 
 Determinar o nível de expressão gênica de uma determinada proteína no 
organismo. 
 O cDNA pode ser utilizado na clonagem, criação de bibliotecas, testes 
de microarranjo, detecção de SNP etc. 
VERIFICANDO O APRENDIZADO 
1. Vimos que existem diferentes técnicas para avaliação da 
qualidade das amostras de DNA e RNA obtidas. Além disso, vimos 
que uma das técnicas é a mais utilizada para quantificar as 
amostras. Sobre esse assunto, marque a alternativa correta: 
 
Espectrofotometria: conseguimos quantificar a partir do valor de luz refratada. 
 
Eletroforese: quantificamos a partir do tamanho da banda final gerada. 
 
Fluorometria: quantificamos a partir da intensidade da fluorescência. 
 
PCR: quantificamos a partir da quantidade de DNA final gerado. 
 
Precipitação em NaCl: quantificamos a partir do tamanho do pellet gerado. 
Responder 
Comentário 
2. A síntese de cDNA é fundamental para determinadas análises, 
como medir a expressão de determinado gene. Com base no que 
estudamos, qual dos itens abaixo não é necessário para a 
construção do cDNA? 
 
Transcriptase reversa 
 
Nucleotídeos 
 
Solução de fenol/clorofórmio 
 
RNA molde 
 
Mg2+ 
Responder 
Comentário 
CONCLUSÃO 
CONSIDERAÇÕES FINAIS 
Ao longo desta jornada, aprendemos que é possível usar ométodo científico 
para quase todas as ações do nosso dia a dia. Vimos também que o desenho 
experimental é uma ramificação do método científico. Visitamos todas as suas 
etapas, variáveis, hipóteses, erros e o tipo de amostragem que devemos utilizar 
para chegar a uma conclusão confiável. 
Com o desenho experimental em mente, partimos para as etapas pré-analíticas 
de transporte, coleta e armazenamento do material biológico seguido da 
extração de DNA e RNA e o controle de qualidade do purificado obtido. 
Por fim, entendemos a importância do cDNA e a técnica de construção do cDNA. 
Esse foi, sem dúvida um marco que possibilitou o aprofundamento de diversas 
técnicas da Biologia Molecular. Ao longo dos anos, a Biologia Molecular está 
sendo desenovelada, mostrando a sua face e permitindo que você adentre ainda 
mais em seus conceitos. Agora é com você continuar esta jornada! 
PODCAST 
0:00 
21:56 
REFERÊNCIAS 
AL SOUD, W. A.; RADSTROM, P. Purification and characterization of PCR-
inhibitory components in blood cells. In: J Clin Microbiol, v. 39, p. 485-93, 
2001. 
AUSUBEL, F. M. Current protocols in molecular biology ‒ 1987‒1988. 
Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, 1987. 
BELOTSERKOVSKII, B. P. et al. Polypropylene tube surfaces may induce 
denaturation and multimerization of DNA. In: Science, v. 271, p. 222, 1996. 
FEIGELSON, H. S. et al. Determinants of DNA yield and quality from buccal 
cell samples collected with mouthwash. In: Cancer Epidemiology and 
Prevention Biomarkers, v. 10, n. 9, p. 1005-1008, 2001. 
GUBLER, U.; HOFFMAN, B. J. A simple and very efficient method for 
generating cDNA libraries. In: Gene, v. 25, n. 2-3, p. 263-269, 1983. 
LAZAR, J.; FENG, J. H.; HOCHHEISER, H. Research methods in human-
computer interaction. Burlington, Massachusetts: Morgan Kaufmann, 2017. 
MELO, M. R. et al. Coleta, transporte e armazenamento de amostras para 
diagnóstico molecular. In: Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina 
Laboratorial, v. 46, n. 5, p. 375-381, 2010. 
NUOVO, G. J. In situ detection of PCR-amplified DNA and cDNA: a review. In: 
Journal of Histotechnology, v. 17, n. 3, p. 235-246, 1994. 
OLIVEIRA, M. C. de S. et al. Fundamentos teórico-práticos e protocolos de 
extração e de amplificação de DNA por meio da técnica de reação em 
cadeia de polimerase. Embrapa Pecuária Sudeste - Livro científico, 2007. 
RODRIGUES JR, J. F. Pesquisa Experimental. 2018. In: Escrita Científica 
USP, S.d. 
SANTELLA, R. M. Approaches to DNA/RNA extraction and whole genome 
amplification. In: Cancer Epidemiology and Prevention Biomarkers, v. 15, n. 9, 
p. 1585-1587, 2006. 
SHOKERE, L. A.; HOLDEN, M. J.; JENKINS, G. R. Comparison of fluorometric 
and spectrophotometric DNA quantification for real-time quantitative PCR 
of degraded DNA. In: Food control, v. 20, n. 4, p. 391-401, 2009. 
VISVIKIS, S.; SCHLENCK, A.; MAURICE, M. DNA extraction and stability for 
epidemiological studies. In: Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 
(CCLM), v. 36, n. 8, p. 551-555, 1998. 
 
EXPLORE+ 
Para saber mais sobre os assuntos tratados neste tema, assista: 
 Ao vídeo Como é feito um TESTE DE DNA? 
 Ao vídeo Eletroforese horizontal de DNA em gel de agarose. 
Leia: 
 Aprenda a fazer extração de DNA em casa, Hemocentro da FMRP-USP, e 
conheça a técnica de extração utilizando cebola e materiais que temos 
dentro de casa. 
 O artigo Coleta, transporte e armazenamento de amostras para diagnóstico 
molecular, de Murilo Rezende Melo e colaboradores (2010). 
 
CONTEUDISTA 
Eldio dos Santos 
Currículo Lattes 
Ao clicar nesse botão, uma nova aba se abrirá com o material preparado para impressão. Nela, 
acesse o menu do seu navegador e clique em imprimir ou se preferir, utilize o atalho Ctrl + P. 
Nessa nova janela, na opção destino, direcione o arquivo para sua impressora ou escolha a 
opção: Salvar como PDF. 
 
 
 
 
 
< 
Sequenciamento, Clonagem e Técnicas de Hibridização 
 
 MÓDULO 0 
 MÓDULO 1 
 MÓDULO 2 
 CONCLUSÃO 
DESCRIÇÃO 
Introdução aos métodos de sequenciamento de material genético, tecnologia do 
DNA recombinante e técnicas de hibridização de ácidos nucleicos. 
PROPÓSITO 
Compreender as metodologias de estudo e análise da sequência de DNA, uma 
ação importante para entender a sua manipulação para fins de biotecnologia, 
bioinformática, diagnóstico e outras aplicações, como pesquisa. 
OBJETIVOS 
Módulo 1 
Distinguir as características dos principais métodos de sequenciamento do DNA 
Módulo 2 
Reconhecer as principais técnicas de clonagem molecular, suas formas de uso e 
suas vantagens e desvantagens 
Módulo 3 
Identificar os métodos de hibridização de ácidos nucleicos, suas diferenças e 
aplicações na rotina do biologista molecular 
INTRODUÇÃO 
As características hereditárias são passadas de geração em geração através do 
material genético, codificado em nosso DNA. Existe um grande interesse em 
conhecermos a fundo o nosso DNA, que tem sido alvo de estudos cada vez 
maiores e mais profundos desde sua descoberta, na década de 1950. 
O conhecimento do DNA humano e de outros organismos trouxe consigo 
múltiplas aplicações, que vão do conhecimento em si ao entendimento de 
doenças genéticas, estudo comparativo entre espécies, ferramentas em 
biotecnologia e bioinformática e discussões éticas. Tudo isso foi possível graças 
às técnicas em biologia molecular que precederam e inspiraram o 
desenvolvimento do sequenciamento, como as técnicas de restrição enzimática, 
de clonagem molecular e de hibridização. Atualmente, elas são protagonistas e 
trabalham em conjunto para o avanço da ciência, da biotecnologia e da saúde 
humana e animal. 
MÓDULO 1 
 
Distinguir as características dos principais métodos de sequenciamento do 
DNA 
PRINCÍPIOS DO SEQUENCIAMENTO 
A quantidade de conhecimento que temos sobre o genoma humano e de outras 
espécies aumentou extraordinariamente a partir do desenvolvimento de 
tecnologias de sequenciamento do DNA. A maior iniciativa para sequenciamento 
de genomas foi o Projeto Genoma Humano, que gerou uma quantidade de 
informação gigantesca. Atualmente, sabemos que o genoma humano tem mais 
de 3 bilhões de pares de bases e que 99,9% da população humana compartilha 
o mesmo DNA. Ainda assim, não sabemos a função de aproximadamente 
metade dos genes descobertos. 
 
A informação genética está contida no DNA (ácido desoxirribonucleico), uma 
longa molécula que é formada por nucleotídeos. Para entendermos como as 
técnicas a serem exploradas neste conteúdo funcionam, precisamos relembrar 
alguns conceitos-chave do DNA e da biologia molecular. 
DNA: construção complexa 
O primeiro deles é a ideia de que o DNA é uma construção complexa, como uma 
casa luxuosa. Por mais luxuosas que sejam, as casas são feitas de tijolos, que 
são as unidades mínimas na nossa metáfora. No DNA, as unidades básicas são 
os nucleotídeos. Cada nucleotídeo tem três regiões principais: 
1 
Um açúcar chamado de desoxirribose (por não conter oxigênio no segundo 
carbono da ribose). No terceiro carbono da desoxirribose, temos um álcool 
orgânico (grupamento hidroxila) importante para a replicação. 
 
2 
No quinto carbono da ribose, temos um grupamento fosfato. 
 
3 
No primeiro carbono da ribose, temos uma base nitrogenada (Adenina, Timina, 
Citosina, Guanina - A, T, C, G). (Figura 1). 
Figura 
1. Os nucleotídeos. 
As bases nitrogenadas são a principal diferença entre os nucleotídeos de DNA e 
são as responsáveis por codificar a informação genética. Afinal, precisamos ter 
pelo menos algumas letras diferentes para codificarmos uma informação no texto 
complexo que é o nosso genoma. Em uma fita dupla de DNA, as bases 
nitrogenadas estão livres e pareiam entre si − purinas (A e G) com pirimidinas (T 
e C) −, graças ao que chamamos de complementariedade das fitas de DNA. 
Isso garante que a informação genética seja estável e permite a replicação (ou 
duplicação) do DNA com o mínimo de erros possível. 
Veja o esquema mostrando a estrutura do DNA e pareamento das basespor 
complementariedade. Note as pontes de hidrogênio duplas (seta azul) entre 
Adenina e Timina, e triplas (seta preta) entre Citosina e Guanina. 
Figura 2. Pareamento das bases nitrogenadas. 
Replicação do DNA 
O segundo conceito que precisamos revisar é o da replicação do DNA. A DNA-
polimerase é uma enzima capaz de sintetizar uma nova fita de DNA a partir de 
um DNA molde. Suas principais funções são reconhecer o nucleotídeo lido na 
fita molde, pareá-lo com seu nucleotídeo complementar e fazer a junção desse 
segundo nucleotídeo à fita que está sendo sintetizada. 
Atenção 
Essa junção do nucleotídeo é feita a partir da energia presente no grupamento 
trifosfato no quinto carbono do nucleotídeo livre e a hidroxila livre do terceiro 
carbono da desoxirribose do nucleotídeo que já faz parte da fita em síntese. 
Essa ligação é chamada de fosfodiéster e é uma ligação covalente, ou seja, forte 
e difícil de ser quebrada. 
Agora que sabemos esses aspectos do DNA e de sua replicação, podemos 
conhecer as técnicas para identificação dos nucleotídeos que os formam. 
SEQUENCIAMENTO SANGER ORIGINAL 
Uma das primeiras técnicas de sequenciamento de DNA a ganhar grande 
espaço no mundo científico foi desenvolvida na década de 1970 pelo cientista 
Frederick Sanger e, até os dias atuais, o chamado Sequenciamento Sanger é 
uma das técnicas mais robustas e precisas em uso. 
Nesse método, Sanger e seus colegas usaram nucleotídeos especiais, com duas 
grandes diferenças dos nucleotídeos normais que encontramos nas células: os 
nucleotídeos que Sanger usava eram marcados com radioisótopos, de forma 
que eles pudessem identificar qual base nitrogenada foi adicionada; já as 
desoxirriboses foram modificadas pela retirada da hidroxila no terceiro carbono, 
o que impede a adição de nucleotídeos novos pela polimerase. Por isso, o 
Sequenciamento Sanger leva o nome oficial de terminação de cadeia, 
ou dideoxy (pela falta de duas (di-) hidroxilas, no segundo e terceiro carbonos da 
ribose – os ddNTP). 
 
Figura 3. 
Representação esquemática de um Didesoxinucleotideo (ddNTP), sem um OH no carbono 3 (cinza) e um 
desoxinucleotídeo (dNTP). 
Em um Sequenciamento Sanger, precisamos amplificar o DNA-alvo a ser 
sequenciado. Normalmente, usamos um produto de PCR como amostra, pois 
precisamos de grande quantidade de DNA-alvo. Mesmo assim, o 
Sequenciamento Sanger exige uma reação de amplificação independente, e, por 
isso, é classificado como um sequenciamento por síntese – SpS. 
A amplificação feita no Sequenciamento Sanger original contava com uma DNA-
polimerase e seu tampão, iniciadores (oligonucleotídeos curtos que se ligam 
especificamente ao DNA-alvo a ser amplificado), desoxirribonucleotídeos 
trifosfato (dNTPs) e ddNTPs. 
Como a marcação radioativa era a mesma para cada nucleotídeo, a identificação 
de qual ddNTP havia sido adicionado se dava pela separação física, em tubos 
diferentes, dos ddNTPs marcados. Assim, o Sanger original tinha quatro tubos 
diferentes, cada um contendo polimerase, iniciadores, tampão, os 4 nucleotídeos 
(dNTPs) e um didesoxinucleotídeos (ddNTP), marcado com radioatividade. 
Exemplo 
Por exemplo, em um dos quatro tubos, tínhamos dATP (desoxirribonucleotídeo 
trifosfato de adenina), dCTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato de citosina), dTTP 
(desoxirribonucleotídeo trifosfato de timina) e dGTP (desoxirribonucleotídeo 
trifosfato de guanina) e um didesoxirribonucleotideo trifosfatado de guanina 
(ddGTP) marcado com radioisótopo; nos outros, estavam presentes os mesmos 
dNTPS e em cada um ddNTP diferentes (adenina, tirosina e citosina). 
A cada ciclo de amplificação, os dNTPs são adicionados até que o ddNTP 
marcado com radioisótopo seja adicionado, o que faz com que a adição de 
nucleotídeos à fita nova seja parada apenas para aquela fita. As outras fitas que 
estão sendo sintetizadas na mesma reação continuam sendo sintetizadas até 
que o ddNTP seja adicionado. Dessa forma, temos sequências de DNA de 
diferentes tamanhos, todas terminando em um ddNTP marcado com 
radioisótopo. Assim, sabemos qual ddNTP terminou a cadeia, pois eles estão em 
tubos separados! 
Da mesma forma que revelamos o resultado de uma PCR convencional 
separando o produto amplificado em um gel de agarose através da eletroforese 
e corando-o com um agente intercalante de DNA que seja fluorescente, a 
revelação do Sequenciamento Sanger também se baseava na separação por 
eletroforese e revelação. 
Quando o gel de agarose polimeriza, forma uma malha frouxa, que não é estreita 
o suficiente para separar sequências com diferenças de até um único 
nucleotídeo (ou ddNTP, no caso do Sequenciamento Sanger) que precisamos 
detectar. Então, usamos outro tipo de gel, ou polímero: a poliacrilamida, feita a 
partir da polimerização da acrilamida/bisacrilamida, que nos dará uma malha 
muito mais intricada (forma poros regulares e de tamanho uniforme) e capaz de 
distinguir pequenas diferenças no tamanho do DNA. 
Cada um dos quatro tubos de sequenciamento diferentes, contendo os ddNTPs 
marcados, usará um poço no gel de poliacrilamida para sua resolução. 
Esperamos que, em cada tubo, os ddNTPs tenham sido usados mais de uma 
vez. Então, desejamos ver múltiplas bandas em cada uma das linhas do gel 
correspondentes a cada ddNTP utilizado. 
Além disso, como a intenção do gel é a separação dos produtos por tamanho 
quando submetidas a uma corrente elétrica, as moléculas de DNA menores 
migram mais rapidamente pelo gel e, por isso, estão localizadas mais abaixo do 
que as moléculas maiores. Finalmente, a revelação é feita através da emissão 
de radioatividade, que ficava impressa em um filme de raios X, e, em seguida, a 
sequência é montada a partir dos tamanhos de DNA obtidos (Figura 4). 
Figura 4. Sequenciamento Sanger manual e imagem real do sequenciamento. 
A partir da Figura 4, vemos que cada ddNTP marcado com radioisótopos foi 
colocado em tubos separados e, após eletroforese em gel de poliacrilamida, 
foram obtidos diferentes tamanhos de DNA. Após revelação (Figura 4, à direita), 
a sequência é montada de forma manual a partir desses tamanhos. 
Automação do Sequenciamento Sanger 
A técnica original de sequenciamento Sanger era bastante trabalhosa e exigia 
um nível de complexidade muito grande. Além de serem quatro tubos, os 
ddNTPs radioativos precisavam ser manipulados em ambiente controlado por 
oferecerem risco à saúde dos trabalhadores, e tudo era feito manualmente, 
inclusive a interpretação do gel de poliacrilamida para determinação da 
sequência. Isso trazia imensas limitações ao uso do sequenciamento. Por isso, 
os pesquisadores automatizaram o sequenciamento para reduzir custos, riscos e 
tempo de execução, além de, claro, aumentar a precisão na determinação das 
bases em sequência. 
Para que a automatização fosse bem-sucedida, entretanto, eles precisaram 
modificar algo crucial: o uso de radioisótopos. Por serem a maior limitação da 
técnica, eles foram substituídos por fluoróforos. O uso destes na marcação dos 
ddNTPs concedeu outra grande vantagem: além de serem mais seguros, podem 
ser utilizados vários fluoróforos que se excitam e emitem fluorescência em 
comprimentos de onda diferentes ao mesmo tempo. Isso permite que vários 
fluoróforos sejam usados na mesma reação, abolindo o uso de quatro tubos. 
Com cada ddNTP marcado com fluoróforo de cor diferente, o sequenciamento é 
mais seguro e mais barato, pois já não precisamos lidar com a segurança extra 
contra a radioatividade e reduzimos a reação a um único tubo. 
Com o uso de quatro fluoróforos, um para cada ddNTP e em um único tubo de 
amplificação, outra limitação ao uso do sequenciamento foi superada: a forma de 
leitura. 
Relembrando 
Na técnica original 
Os resultados eram lidos manualmente, combinando os fragmentos de tamanhos 
diferentes em ordem até que o quebra-cabeça fosse montado. E, em muitos 
casos, não era trivial diferenciar qual era a próxima banda, especialmente 
quando a sequência era mais longa e ainda demandavamuito tempo para a 
leitura e a interpretação. Além disso, o gel de poliacrilamida várias vezes não era 
preciso na diferenciação dos tamanhos de DNA e apresentava baixa resolução 
durante a leitura. 
Na automação 
A leitura dos fragmentos com terminação em ddNTPs marcados com fluoróforos 
passou a ser feita por eletroforese em capilar, ou seja, em um tubo 
extremamente fino contendo um polímero semelhante à poliacrilamida pela qual 
cada fragmento passa, um de cada vez. 
À medida que cada fragmento passa pelo capilar, um laser incide sobre a 
sequência, e os ddNTPs marcados emitem fluorescências em comprimentos de 
onda diferentes que são detectadas por um aparelho. Os aparelhos mais 
modernos conseguem sequenciar cerca de 900 pares de base (pb) em uma 
cadeia, e possuem múltiplos capilares para a leitura de dezenas de amostras 
diferentes. O aparelho também processa e filtra a fluorescência de ruído 
(ou background) de cada ddNTP lido e nos fornece uma representação gráfica 
da sequência e de sua qualidade. 
A representação gráfica é o resultado que iremos analisar, e seu nome oficial é 
eletroferograma. Este consiste em picos coloridos, em que a altura do pico 
representa a qualidade da leitura – picos mais altos possuem melhor qualidade e 
são mais confiáveis (ou seja, a probabilidade de a fluorescência da detecção 
estar errada é muito pequena), e cada cor representa uma base nitrogenada 
diferente detectada por fluorescências distintas (Figura 5). 
Figura 5. Esquema do Sequenciamento Sanger automatizado. 
Sequenciamento de Nova Geração (Next Generation Sequencing) 
Enquanto a técnica de Sanger era aperfeiçoada e automatizada, outros esforços 
para sequenciamento de DNA apareceram. Durante essa época, surgiu 
o pirosequenciamento, capaz de detectar a produção de um fosfato livre – ou 
pirofosfato –, decorrente da adição de um nucleotídeo. 
O pirofosfato é produzido quando o trifosfato da extremidade 5’ de um 
nucleotídeo é clivado e dá energia à ligação fosfodiéster catalisada pela DNA 
polimerase. Assim, o pirosequenciamento também é um sequenciamento por 
síntese (SpS), como o Sanger. Porém, dispensa o uso de ddNTPs marcados 
com radioisótopos ou fluoróforos, assim como eletroforese em capilar. O 
pirofosfato é detectado ao ser convertido em ATP por uma enzima (ATP 
sulfurilase). O ATP é, então, usado pela luciferase, uma segunda enzima que 
oxida a luciferina, um substrato em oxiluciferina, e, durante essa transformação, 
ocorre a formação de luz, que pode assim ser quantificada. 
No pirosequenciamento, cada dNTP é adicionado separadamente à reação, de 
forma que se saiba qual foi o nucleotídeo inserido que gerou luz. Os 
nucleotídeos que não foram usados são degradados por uma terceira enzima, a 
apirase. O ciclo se repete com o próximo nucleotídeo (Figura 6). 
Figura 6. Esquema das etapas da reação de pirosequenciamento. 
A partir da Figura 6, observamos que o DNA genômico é clivado, ligado a 
adaptadores e imobilizado em microesferas (beads), nas quais acontecerá a 
amplificação do DNA por PCR em emulsão (que vamos entender a seguir). No 
sequenciamento, vemos cada novo nucleotídeo adicionado pela DNA polimerase 
e detectado pela emissão de luz decorrente da liberação de um pirofosfato. 
Com a criação do pirosequenciamento, surgiu uma nova geração de 
sequenciamento (NGS – Next Generation Sequencing). Nessas metodologias, 
usamos o conceito de formação de bibliotecas de DNA para o sequenciamento. 
Vamos entender como: 
1 
As bibliotecas são formadas por meio da “quebra” do DNA extraído, seja por ele 
ter sido digerido em pequenos fragmentos usando enzimas, seja por ter sido 
clivado usando métodos físicos, como a sonicação. 
 
2 
O DNA fragmentado é ligado a adaptadores, que são pequenas sequências 
sintéticas, conhecidas e exógenas, usadas na identificação das amostras. Cada 
extremidade (5’ e 3’) do DNA fragmentado em uma biblioteca se liga a um 
adaptador distinto, com sequências de DNA diferentes. 
O uso de adaptadores permitiu o sequenciamento de regiões do DNA que não 
tínhamos conhecimento suficiente para desenharmos oligonucleotídeos 
iniciadores, e foi desenvolvido ainda na era Sanger. 
 
3 
Os adaptadores imobilizam o fragmento de DNA e auxiliam o início da síntese, 
pois se ligam por complementariedade a oligonucleotídeos iniciadores aderidos a 
microesferas, de forma que cada microesfera tenha apenas um fragmento de 
DNA ligado a ela. 
 
4 
Cada microesfera será depositada em um micropoço (em um microchip), local 
onde ocorrerá uma PCR diferente, chamada de PCR em emulsão (ou em 
gotícula de óleo-água). 
 
5 
Assim, cada microesfera terá várias cópias idênticas do mesmo DNA. Isso é 
importante para amplificação do sinal emitido pelo pirofosfato, que precisa ser 
suficiente para que nossos métodos de detecção disponíveis consigam captar 
esse sinal. 
 
6 
Em seguida, as fitas duplas ligadas à microesfera são desnaturadas em fitas 
simples, e estarão prontas para iniciarmos a reação de sequenciamento. 
 
7 
Na etapa de sequenciamento, um único dNTP é adicionado por vez à reação. 
Assim, quando o dNTP complementar à sequência-molde é adicionado pela 
polimerase, o pirofosfato liberado na formação da ligação fosfodiéster dá energia 
para a reação luminosa ocorrer, que é, por sua vez, detectada por um sensor. 
 
Esse sistema permite a existência de milhares de microesferas, cada uma com 
uma sequência de DNA única, amplificada e sequenciada. Assim, milhões de 
pares de base podem ser sequenciados muito mais rapidamente do que pelo 
método de Sanger. 
O mesmo princípio de criação de bibliotecas de DNA com o uso de 
adaptadores, imobilização e sequenciamento por síntese foi aperfeiçoado e 
modificado posteriormente. Um dos métodos mais famosos e mais usados é o 
sequenciamento Illumina/Solexa. 
Nessa técnica, a biblioteca de DNA é ligada aos adaptadores. Vamos entender 
como isso é feito: 
1 
Os fragmentos de DNA são anelados a iniciadores aderidos a uma placa 
(chamada de célula de fluxo ou flowcell) por meio dos adaptadores, e a síntese 
por ponte de DNA começa usando dNTPs normais. 
2 
Na síntese por ponte, cada extremidade do DNA contém adaptadores diferentes 
capazes de se anelar aos primers complementares já aderidos à placa. 
3 
A DNA polimerase sintetiza todas as fitas complementares, formando 
agrupamentos (ou clusters, em inglês) de DNA idênticos, que são desnaturados 
em fitas simples e usados como molde para a etapa do sequenciamento (Figura 
7). 
Veja a representação esquemática da amplificação por ponte da técnica de 
sequenciamento Illumina/Solexa: 
Após formação da biblioteca de DNA ligada a adaptadores (rosa e verde), o 
DNA-alvo é fragmentado e ligado aos iniciadores aderidos na placa através de 
complementariedade com os adaptadores, para que a amplificação por ponte 
aconteça. 
Figura 
7. Esquema da amplificação pela técnica de sequenciamento Illumina/ Solexa. Na foto, os adaptadores estão 
em verde e rosa. 
O sequenciamento em si é efeito de forma semelhante ao Sanger, em que 
didesoxinucleotídeos (ddNTPs) marcados com fluoróforos são adicionados à 
reação, causando a terminação da polimerização. No caso do sequenciamento 
Illumina, os nucleotídeos marcados com fluorescência são terminadores 
reversíveis da polimerização, ou seja, após uma simples lavagem, o 
sequenciamento pode continuar com a incorporação de novos nucleotídeos 
marcados com fluoróforos feita pela DNA polimerase. 
A fluorescência de cada ciclo é obtida em diferentes comprimentos de onda para 
cada ddNTP e é detectada pelo aparelho sequenciador, que decodifica o sinal. 
Cada corrida pode ter milhões de clusters diferentes, o que nos gera uma 
quantidade gigantesca de dados (Figura 8). 
Figura 
8. Esquema do sequenciamento Illumina. 
Atenção 
Talvez esta tenha sido a maior vantagem dos sequenciamentos de nova 
geração: a introdução de métodos de alto rendimento, o que significa um 
sequenciamento de um número gigantesco de bases, de forma muitomais 
rápida do que o Sequenciamento Sanger. 
Contudo, as NGS possuem desvantagens, como perda de precisão quando as 
sequências são muito repetitivas em um único nucleotídeo, pois é difícil para o 
aparelho saber quantas bases idênticas foram adicionadas em um ciclo apenas, 
já que o pico de luz fica bem mais extenso ou mais longo. Nesses casos, 
podemos usar o Sequenciamento Sanger, que é mais confiável para 
determinação de sequências repetitivas por também separar as moléculas de 
DNA por tamanho. 
Outra desvantagem do NGS é o tamanho máximo das sequências lidas: 
enquanto no Sequenciamento Sanger lemos cerca de 900 pb, nos primeiros 
NGSs, as leituras eram bem mais curtas – inicialmente, apenas 30 a 40 bases 
eram lidas por fragmento. 
Atualmente, na terceira geração de NGS, existem equipamentos capazes de ler 
sequências maiores, de 200 a 300 pb. Novas tecnologias capazes de sequenciar 
até 50 kbp em uma leitura contínua, assim como técnicas para sequenciamento 
em tempo real, também foram desenvolvidas e estão constantemente sendo 
aprimoradas. 
Toda essa capacidade de sequenciamento introduziu outra questão importante: 
como unir esses pequenos fragmentos e reconstituir a sequência contínua 
original de milhões de pares de base, como as que existem nos organismos 
vivos? 
Com o desenvolvimento tecnológico que permitiu os sequenciamentos de alto 
rendimento, vimos o desenvolvimento de softwares e algoritmos especializados 
na resolução do quebra-cabeças gerado ao produzirmos centenas de milhões de 
sequências. Com o estudo da genômica e da transcriptômica, um campo novo 
de intercessão entre biologia e informática cresceu muito: a bioinformática. 
Neste vídeo, você conhecerá um pouco sobre os métodos de NGS de terceira 
geração. 
Para aprender sobre como o quebra-cabeças do genoma é montado em maiores 
detalhes, acesse nossa seção Explore +. 
VERIFICANDO O APRENDIZADO 
1. O sequenciamento do DNA permitiu grande quantidade de 
conhecimento sobre o genoma de diversas espécies. Sobre os 
métodos de sequenciamento, é correto afirmar que: 
 
O método mais antigo, conhecido como pirosequenciamento, utiliza a liberação 
de um pirofosfato terminador de cadeia para revelar qual nucleotídeo foi 
adicionado. 
 
Um dos métodos mais confiáveis de sequenciamento é o pirosequenciamento, 
pois consegue identificar regiões com nucleotídeos repetitivos com alta 
resolução. 
 
Os sequenciamentos de nova geração (NGS) não são tão confiáveis quanto o 
Sequenciamento Sanger, porém produzem grande quantidade de informação em 
um intervalo de tempo muito curto. 
 
O sequenciamento Illumina e o pirosequenciamento não fornecem muita 
informação, pois sequenciam apenas algumas dezenas de pares de base por 
corrida. 
 
Com a chegada de NGS, o Sequenciamento Sanger se tornou obsoleto e não 
tem mais utilidade para a maioria das aplicações em ciência, saúde e 
biotecnologia. 
Responder 
Comentário 
2. Sobre o Sequenciamento Sanger, é correto afirmar que: 
 
Utiliza a terminação da cadeia em ribonucleotídeos marcados com radioisótopos, 
o que limita a aplicação do método. 
 
Utiliza didesoxirribonucleotídeos marcados com fluoróforos, que são 
identificados ao longo da cadeia durante a síntese. 
 
Parte do princípio de separação das moléculas de DNA em gel de agarose e 
revelação dos nucleotídeos por emissão de luz ultravioleta. 
 
Foi automatizado, de forma que a terminação da cadeia por nucleotídeos 
modificados e marcados possa ser identificada mais rapidamente. 
 
Depende da leitura de lasers, que excitam os radioisótopos a emitirem 
radiotividade no comprimento de onda a ser detectado. 
Responder 
Comentário 
MÓDULO 2 
 
Reconhecer as principais técnicas de clonagem molecular, suas formas de 
uso e suas vantagens e desvantagens 
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 
A tecnologia do DNA recombinante é uma ferramenta com grande aplicação em 
biotecnologia. É usada para transferir uma informação genética de um 
organismo para outro, pela união de duas fitas de DNA de origens diferentes e 
sua inserção em um organismo hospedeiro (Figura 9). 
A 
tecnologia do DNA recombinante consiste na união de duas fitas de DNA. 
Também é conhecido como clonagem molecular, pois nesse processo temos a 
expansão de organismos hospedeiros idênticos geneticamente, ou clones, todos 
contendo o DNA recombinante. 
Com o uso da tecnologia do DNA recombinante, conseguimos produzir proteínas 
humanas em larga escala, para terapia, diagnóstico e até prevenção de 
doenças. 
Exemplo 
Por exemplo, a clonagem molecular permite: que bactérias sintetizem insulina 
humana, usada no tratamento de diabetes mellitus tipo I; usar genes inseridos 
em plasmídeos como forma de amplificarmos o gene e usá-los como curva de 
quantificação em uma qPCR; fabricar vacinas contra o papilomavírus humano 
(HPV) usando apenas a proteína externa do vírus produzida em levedura. 
Além disso, podemos alterar geneticamente organismos complexos, como 
plantas e animais, ao introduzirmos genes de outras origens – os transgenes, 
gerando os organismos transgênicos – ou modificando genes que já existem 
em determinado organismo. Criamos, assim, os chamados organismos 
modificados geneticamente (GMO, genetically modified organisms). Entretanto, 
com essa capacidade, vieram muito questionamentos éticos sobre o que 
podemos e devemos modificar nos organismos. 
Para dominarmos essa poderosa ferramenta, precisamos conhecer alguns 
pontos-chave sobre a informação que queremos transferir, sobre as formas de 
transferência e sobre o sistema para onde estamos transferindo a informação 
genética. 
A informação que queremos transferir, nesse caso, é uma sequência de DNA de 
interesse, que pode ser tanto um gene, uma região regulatória, ou pequenas 
sequências que determinam epítopos antigênicos que não serão expressos, 
que chamamos de inserto. A forma de transferência dessa sequência é o que 
chamamos de vetor. 
Assim como uma encomenda precisa ser transportada por caminhão, moto, 
navio ou avião para chegar até seu destino, a sequência genética precisa de 
uma forma de transporte até o organismo-alvo. O sistema de utilização é o nosso 
organismo final, que apresente a capacidade de expressar determinado gene ou 
seja modificado geneticamente, o qual chamamos de hospedeiro (Figura 10). 
Figura 
10. Esquema das partes essenciais da clonagem molecular: sequência de interesse (ou inserto), vetor 
(plasmídeo) e hospedeiro (bactéria). 
Vamos conhecer cada etapa da clonagem molecular passo a passo: 
Passo 1: Isolamento do fragmento de interesse 
O primeiro passo para clonagem molecular é a identificação do gene ou da 
sequência de DNA que queremos clonar, que, como já aprendemos, é chamada 
de inserto. 
Para isso, podemos partir de uma sequência já conhecida. Nas últimas duas 
décadas, uma quantidade gigantesca de informação genética foi produzida, e 
existem diversas ferramentas de informática disponíveis na internet para 
conhecermos a sequência exata de genes e regiões não codificantes de diversos 
organismos. A maior plataforma pública e gratuita que armazena sequências de 
DNA (e cDNA, caso estejamos interessados em RNA) e mais conhecida é 
o GenBank (ou banco de genes, em tradução livre), do Instituto Nacional de 
Saúde dos Estados Unidos da América (NIH – National Health Institute). 
Atenção 
Caso seu gene de interesse não esteja entre as sequências armazenadas e 
disponíveis ao público, você poderá sequenciar a região. Nesse caso, basta 
amplificarmos a sequência ou a região próxima que a flanqueie (ou seja, as 
regiões que estão antes e depois de determinada sequência) por PCR. Após a 
amplificação, iremos separar as sequências obtidas na PCR por eletroforese em 
gel de agarose e observar se existem vários produtos ou apenas um. 
 
 
Caso tenhamos apenas um produto, podemos purificar a PCR e extrair apenas o 
DNA amplificado – ou seja, remover todo tampão, enzima Taq e os iniciadores, 
que poderiam interferir no sequenciamento. Caso maisde uma banda esteja 
visível no gel de agarose, precisaremos cortar a banda de tamanho desejado e 
purificá-la a partir do gel. Assim, eliminamos produtos de PCR inespecíficos e 
impedimos que eles influenciem nosso Sequenciamento Sanger, o que será feito 
a seguir. 
Mas o que fazer caso não haja informação suficiente sobre o organismo 
estudado sequer para desenhar iniciadores para a PCR? 
Nesse caso, pode-se usar novas tecnologias de sequenciamento, conhecidas 
como sequenciamento de nova geração, que usam adaptadores para 
amplificar o genoma. 
Uma vez que tenhamos nosso inserto amplificado e sua sequência conhecida, 
podemos colocá-lo (ou inseri-lo) no nosso vetor. 
Passo 2: Escolha do vetor e estratégia de inserção 
Uma vez determinada com exatidão a composição da sequência, precisamos 
observar seu tamanho. Assim como usamos meios de transporte diversos para 
diferentes tamanhos de encomendas, precisamos escolher qual o melhor vetor 
para transportar a sequência. 
Os vetores são pequenos DNAs autorreplicantes e circulares que conseguem 
ser transferidos para dentro das células. Existem diversos tipos de vetores, 
baseados em seu tamanho total, no tamanho da sequência de DNA 
recombinante que pode transportar e organismos em que podem ser usados. 
Os vetores mais conhecidos são os plasmídeos, que são pequenos DNAs 
circulares autorreplicantes, de origem bacteriana, que podem ser transportados 
para dentro e para fora da célula. Eles ocorrem na natureza e acredita-se que 
sejam originados de restos de genomas bacterianos que mantêm todos os 
elementos necessários à sua própria replicação e que foram absorvidos por 
outra bactéria. Assim, os plasmídeos são considerados elementos genéticos 
móveis, ou seja, eles podem ser transferidos (ou transportados) de uma célula a 
outra, ou adquiridos a partir do ambiente. 
Normalmente, as bactérias conseguem sobreviver sem plasmídeos – por isso, 
são considerados como extracromossomais –, mas, por vezes, a informação 
codificada neles oferece vantagem em ambientes seletivos. 
 
Exemplo 
Por exemplo, um plasmídeo pode ter uma sequência de DNA que codifique uma 
proteína de canal, que, por sua vez, confere resistência a certo antibiótico. Ao 
entrar em uma célula que esteja sob pressão seletiva pelo tal antibiótico – ou 
seja, uma célula que esteja lutando para sobreviver ao antibiótico –, a aquisição 
desse plasmídeo conferirá resistência, e a bactéria poderá sobreviver facilmente. 
Como comentamos anteriormente, os plasmídeos são autônomos em sua 
replicação e, por isso, precisam ter determinados elementos que permitam sua 
duplicação e expressão independentemente do momento em que a célula se 
encontre. 
Um plasmídeo criado em laboratório com o mínimo de informação 
necessária para ser funcional contém três regiões: 
1 
A origem de replicação, que a DNA-polimerase da sua célula-hospedeira 
bacteriana reconhece e onde todos os fatores necessários à abertura da 
forquilha de replicação se ligam. 
 
2 
Um gene de resistência a antibiótico, que auxilia na seleção das bactérias que 
contêm o plasmídeo. 
 
3 
O sítio múltiplo de clonagem (multiple cloning site – MCS), que deve incluir 
um promotor gênico, diversos sítios de restrição por diferentes enzimas e 
um terminador (Figura 11). 
Figura 
11. Representação esquemática de um vetor comum, o plasmídeo. 
Atenção 
Lembre-se de que essas são as regiões mínimas à replicação em uma bactéria e 
que seu organismo hospedeiro pode ser um eucarioto (leveduras, células 
animais e vegetais), que pode requerer outras regiões para replicação do 
plasmídeo e sua expressão. Por exemplo, devemos sempre priorizar o uso de 
promotores gênicos derivados de leveduras, caso nosso sistema hospedeiro seja 
a levedura, e de usar promotores e potenciadores preferencialmente virais para 
células de mamífero, em adição à origem de replicação e um marcador de 
seleção de eucariotos. 
Os plasmídeos são amplamente usados em biotecnologia e em clonagem 
molecular, por serem resistentes ao ambiente, facilmente inseridos dentro de 
células procarióticas (bactérias) e eucarióticas (como leveduras, células animais 
e vegetais) e de fácil manipulação. Os plasmídeos podem ter tamanho total entre 
alguns milhares a dezenas de milhares de pares de base e podem conter 
insertos de tamanhos variados, desde que o tamanho total do plasmídeo 
permaneça inferior a 10 mil pares de base (10 kb), muito embora alguns 
plasmídeos permitam insertos de até 15 kb. 
Existem situações em que pode ser necessário usar insertos maiores, e, nesses 
casos, outros sistemas podem ser usados. Por exemplo, o sistema de 
cosmídeos permite insertos de até 50 kb, pois sua composição genética é uma 
mistura entre plasmídeos e bacteriófagos. Entretanto, cosmídeos exigem que 
seu genoma seja empacotado, ou seja, que uma camada de proteína chamada 
capsídeo viral recubra o DNA do cosmídeo, para protegê-lo e para que haja 
infecção de novas células. Outras opções são os cromossomos artificiais 
bacterianos (Bacterial Artificial Chromosome – BAC) ou de levedura (Yeast 
Artificial Chromosome – YAC), para insertos de tamanho superior a 100 kb. 
Passo 3: Estratégias de clonagem 
Uma vez que conheçamos a sequência do nosso inserto, e tenhamos escolhido 
o vetor que melhor se adeque às nossas necessidades, podemos começar a 
clonagem. Para isso, vamos explorar duas estratégias principais. A primeira 
baseia-se na digestão do DNA e utiliza as chamadas enzimas de restrição. A 
segunda, mais recente, utiliza apenas PCR. Vamos explorá-las com detalhes a 
seguir. 
Clonagem por restrição 
As enzimas de restrição são capazes de reconhecer sequências internas e muito 
especificas do DNA fita dupla e cortá-lo ao clivarem a ligação fosfodiéster entre 
dois nucleotídeos, e, por isso, são classificadas como endonucleases − endo = 
interno; nucle = núcleo (relativo ao DNA); ase = enzimas. Elas são encontradas 
na natureza em bactérias e funcionam como um sistema de defesa bacteriano 
contra DNA invasores potencialmente perigosos, como o DNA de bacteriófagos 
(vírus que infectam e matam as bactérias). 
Existem dois tipos de enzimas de restrição, baseado em como o corte, ou 
clivagem, do DNA é feito: 
Clique nas barras para ver as informações. 
BLUNT END (EM TRADUÇÃO LIVRE, “EXTREMIDADE PLANA” OU 
“LISA”). 
A endonuclease pode reconhecer o seu sítio de clivagem e cortar as duas fitas 
de DNA no mesmo ponto. 
STICKY END (EM TRADUÇÃO LIVRE, “EXTREMIDADE 
GRUDENTA, PEGAJOSA”). 
A enzima pode cortar o DNA fita dupla com uma diferença de poucos 
nucleotídeos entre as fitas complementares, deixando esses poucos 
nucleotídeos em fita simples, o que torna muito mais fácil o pareamento 
por complementariedade entre as bases nitrogenadas. Esse método é 
preferível ao primeiro (Figura 12). 
Figura 
12. Ilustração representando clivagem por enzima de restrição “sticky” ou “pegajoso” e clivagem “blunt”, ou 
“plano”. 
Para usar o método de clonagem por enzimas de restrição, tanto nosso inserto 
quanto nosso vetor precisam ter sítios de clivagem pela enzima de restrição de 
nossa escolha. É de extrema importância que o sítio de restrição (ou clivagem) 
no vetor seja único, caso contrário ele será digerido em diversos fragmentos não 
funcionais, e nossa clonagem não funcionará (Figura 13). 
Figura 
13. Ilustração exemplificando sítio de clivagem para enzimas de restrição “sticky” (esquerda) 
e “blunt” (direita). Na foto, são exemplificadas enzimas de restrição. 
Caso nosso inserto não possua o sítio de restrição naturalmente em suas 
extremidades, podemos colocar a sequência que a enzima reconhece nas 
extremidades durante a amplificação por PCR. Para isso, basta acrescentarmos 
o sítio de restrição às extremidades dos iniciadores. Em seguida, faremos 
a digestão do inserto e do vetor pela mesma enzima de restrição em microtubos 
separados. A reação de digestão é normalmente feita a 37°C por uma hora, 
muito embora a reação possa ser deixada de um dia para o outro para aumentara digestão. 
Uma vez que a restrição tenha acontecido, veremos se o vetor foi linearizado – 
lembre-se de que ele era circular – pela eletroforese em gel de agarose. 
Esperamos ver apenas uma banda, mais abaixo que a banda do plasmídeo não 
digerido, pois o DNA linear migra mais rapidamente que o circular. Se virmos 
mais de uma banda no gel, será porque nossa enzima de restrição encontrou 
mais de um sítio de clivagem no vetor. Isso pode ser o que você deseja, caso 
queira remover uma sequência primeiro para, depois, colocar seu inserto no 
local. 
Para evitar que o vetor digerido volte a ser um círculo (já que as extremidades 
digeridas são complementares entre si, especialmente se uma única enzima de 
restrição para as duas extremidades estiver sendo usada), devemos usar 
fosfatases, para remover o fosfato nas extremidades 5’, o que impede a 
circularização espontânea. 
Atenção 
Lembre-se de usar a fosfatase apenas no tubo do vetor, e não no do inserto. 
Essa é uma boa forma de controle de qualidade da nossa digestão e para 
assegurar que nossa clonagem será bem-sucedida. 
Em seguida, precisamos fazer a ligação entre as extremidades do nosso inserto 
e as do vetor linearizado – ou seja, precisamos colocar o inserto no vetor. As 
“pontas grudentas”, em que há alguns poucos nucleotídeos com bases 
nitrogenadas livres, conseguem parear por complementariedade. Assim, a 
extremidade 5’ do inserto pareará com a extremidade 3’ do vetor e a 
extremidade 3’ do inserto com a 5’ do vetor. 
No entanto, o pareamento das bases não será suficiente para que uma ligação 
estável aconteça, pois a complementariedade das bases se dá por pontes de 
hidrogênio facilmente desfeitas pelo calor. Para termos uma ligação estável, 
precisamos que ela seja covalente, o que significa que precisamos fazer a 
ligação fosfodiéster entre as extremidades 5’ e 3’ das duas fitas pareadas. Para 
isso, usamos uma enzima chamada DNA ligase (Figura 14). 
Figura 
14. DNA ligase que forma ligação fosfdiéster entre as fitas complementares do vetor e do inserto, após 
digestão por enzimas de restrição. 
Clonagem livre de restrição 
A segunda estratégia que podemos usar é chamada de clonagem livre de 
restrição (restriction free cloning – RFC). 
Clique nas informações a seguir. 
1 
2 
3 
Atenção 
Na prática, é importante que as duas regiões dos iniciadores senso e antissenso 
tenham aproximadamente a mesma temperatura de anelamento para que a PCR 
funcione. Usaremos esses oligonucleotídeos para amplificar o inserto e, ao 
mesmo tempo, adicionar a ele uma região de complementariedade ao vetor. 
Existe ainda a possibilidade de seu inserto ser pequeno o suficiente para estar 
contido dentro de iniciadores um pouco mais longos, o que reduz a RFC a 
apenas uma PCR. 
A ciclagem da PCR em si é praticamente a mesma que qualquer outra, com 
temperaturas de desnaturação, anelamento e extensão padrões – lembrando 
que o tempo de extensão depende do tamanho do amplicon a ser gerado. 
Como queremos amplificar um vetor de clonagem com milhares de pares de 
base, cada extensão deverá ter 1 minuto por kb – ou seja, para um plasmídeo de 
7 kb, serão 7 minutos de extensão por ciclo. Como em uma PCR convencional, 
validaremos a reação vendo o amplicon de tamanho desejado na eletroforese 
em gel de agarose. 
Clique nas informações a seguir. 
1 
2 
3 
4 
Figura 15. Representação esquemática da clonagem livre de restrição. 
A partir da Figura 15, podemos ver que os iniciadores usados na primeira PCR 
(amplificação de inserto) possuem regiões sobrepostas para posterior 
anelamento ao vetor (2º PCR). 
Uma vez que tenhamos inserido nossa sequência de interesse em um vetor, 
quer usando enzimas de restrição, quer não, precisamos verificar se nosso 
inserto está presente. Para isso, fazemos uma PCR com um iniciador senso que 
se anele próximo ao sítio de clonagem e um iniciador antissenso que se anele à 
sequência do inserto. 
Esperamos que essa PCR de detecção do DNA recombinante funcione e nos dê 
uma banda única, do tamanho esperado para o intervalo entre os primers. Esse 
é o controle de qualidade da clonagem, que vamos repetir mais à frente. 
Estamos prontos, então, para colocar esse vetor recombinante dentro de uma 
bactéria. Essa etapa é necessária para que mais vetores sejam produzidos, 
mesmo que nosso hospedeiro final não seja a bactéria. Assim, conseguiremos 
quantidade de vetores suficientes para outros hospedeiros. 
Passo 4: Transformação, seleção dos clones recombinantes e 
multiplicação 
Para colocar nosso vetor recombinante dentro de uma célula, usamos uma 
técnica chamada de transformação − processo de aquisição horizontal de DNA 
exógeno do meio ambiente que algumas bactérias possuem. A principal bactéria 
usada em clonagem molecular é a Escherichia coli, um bacilo Gram-negativo 
com fácil multiplicação e manutenção em cultura, alta eficiência de 
transformação e que possui cepas usadas em laboratório que não são 
patogênicas. No entanto, a E. coli não é naturalmente capaz de adquirir DNA a 
partir do meio. 
Para ser passível de transformação, precisamos fazer como que a E. coli seja 
competente. Conseguimos isso ao congelarmos instantaneamente as células, 
usando nitrogênio líquido e na presença de tampão rico em cálcio, que fará com 
que a parede celular da E. coli fique permeável e apresente pequenos orifícios 
para a entrada do DNA durante a transformação. 
Após tornarmos a E. coli competente para a entrada do DNA exógeno na célula, 
podemos transformar nosso vetor recombinante. A transformação bacteriana 
mais comumente usada é a de choque térmico. As células que estão congeladas 
serão descongeladas e misturadas com o DNA do vetor plasmidial. Tudo isso 
deve ser feito em gelo; caso contrário, a célula perderá sua competência. 
Após curta incubação em gelo, fazemos o choque térmico ao colocarmos as 
bactérias na temperatura de 42°C por menos de 1 minuto, seguido de banho de 
gelo por mais uns poucos minutos. Então, fazemos a semeadura das bactérias 
transformadas em placa de cultivo bacteriano seletivo. No dia seguinte, após 
deixarmos nossa placa em incubadora de 37°C, veremos o surgimento de 
colônias, cada uma correspondendo à expansão clonal de um 
único transformante − bactéria que foi transformada (Figura 16). 
Figura 
16. Representação da transformação bacteriana. 
Ao analisarmos a Figura 16, vemos que, após congelamento instantâneo de 
bactéria sensível a antibiótico (1), a parede celular fica permeável (2). Assim, o 
plasmídeo é incubado com a bactéria e pode entrar mediante o choque térmico 
(3). Os clones que tiveram uma transformação bem-sucedida são capazes de 
crescer sob seleção, ou seja, tornam-se resistentes ao antibiótico presente na 
placa pela aquisição do plasmídeo (4). 
A transformação é diretamente proporcional à quantidade de DNA plasmidial: 
quanto mais DNA, maior o número de colônias no final. Por isso, tenha em 
mente que DNA em excesso pode ser tão prejudicial quanto em escassez, pois 
pode não ser possível diferenciar as colônias bacterianas no final nem separar 
seus clones. 
Entretanto, é importante sabermos que a transformação para clonagem tem 
eficiência muito mais baixa do que a transformação apenas para expansão do 
vetor (ou seja, apenas para aumentarmos a quantidade que temos de 
determinado plasmídeo). Por isso, normalmente tentamos obter e usar o máximo 
de DNA para a transformação durante a clonagem. 
A entrada do vetor na E. coli competente precisa distinguir a célula na qual a 
transformação foi bem-sucedida da que não foi. Portanto, usamos 
alguns marcadores de seleção que estão presentes nos vetores e que farão a 
distinção entre as bactérias. O marcador de seleção mais usado é o antibiótico 
ampicilina. A ampicilina é um antibiótico derivado da penicilina, capaz de matar 
bactérias e usado em infecções bacterianas comuns. As espécies de E. 
coli são sensíveis à ampicilina, o que significa que essas bactérias morrem na 
presença do antibiótico. 
Vamos aprendermais sobre esse assunto no tópico a seguir. 
Clique nas barras para ver as informações. 
SELEÇÃO POR ANTIBIÓTICO 
A maioria dos plasmídeos usados em clonagem molecular possuem o gene que 
codifica resistência ao antibiótico ampicilina. Dessa forma, apenas as E. coli que 
adquiriram o vetor serão resistentes à ampicilina e capazes de crescer em 
cultura. Portanto, usamos as colônias de clones bacterianos que cresceram em 
ampicilina, pois apenas estes apresentam o vetor (rever Figura 16). Entretanto, 
precisamos, ainda, checar se nosso vetor está vazio ou se contém nosso inserto. 
Para isso, selecionaremos várias colônias para verificarmos mais uma vez se a 
clonagem molecular funcionou, usando a PCR de detecção do DNA 
recombinante. Apenas os clones cuja banda do vetor-inserto estiver presente 
serão usados para purificação do plasmídeo. 
A purificação do plasmídeo recombinante é uma extração de DNA por coluna, a 
partir de bactérias, podendo ser feita rapidamente com uso de kits. Uma vez 
purificado, um bom controle de qualidade é enviar o plasmídeo para 
Sequenciamento Sanger, a fim de verificarmos se nosso inserto está incorporado 
de forma correta no vetor e se nenhuma mutação indesejada ocorreu durante a 
duplicação bacteriana. 
SELEÇÃO AZUL-BRANCA 
Neste método de clonagem, é possível distinguir visualmente não apenas quais 
colônias de clones bacterianos tiveram o plasmídeo transformado com sucesso 
(com o uso de antibióticos), mas também quais clones tiveram 
o inserto integrado ao vetor com sucesso. 
Para entender como isso funciona, vamos conhecer alguns detalhes. 
Clique nas informações a seguir. 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
Figura 
17. Esquema simplificado da seleção azul-branca. As colônias cujo inserto foi integrado ao plasmídeo 
crescem na cor branca. 
Saiba mais 
A purificação do plasmídeo recombinante poderá ser feita e, apesar de não ser 
absolutamente necessária, é recomendável fazer o sequenciamento do inserto. 
Neste vídeo, você conhecerá um pouco sobre a clonagem molecular. 
VERIFICANDO O APRENDIZADO 
1. A tecnologia do DNA recombinante possui muitas aplicações em 
medicina, agronegócios e biotecnologia. Sobre DNA recombinante, 
é incorreto afirmar que: 
 
As bactérias podem ser usadas como fábricas para proteínas de origens 
exógenas. 
 
O DNA recombinante consiste na união de sequências de DNA de duas ou mais 
origens diferentes. 
 
Podemos produzir vacinas seguras e eficazes a partir de leveduras, por meio da 
recombinação de DNA. 
 
A diabetes mellitus do tipo I pode ser controlada pelo o do uso de insulina 
produzida por tecnologia do DNA recombinante. 
 
A clonagem molecular não é útil na modificação de organismos pluricelulares, 
pois não gera organismos estáveis. 
Responder 
Comentário 
2. Para a clonagem molecular, precisamos de um inserto, um vetor e 
um hospedeiro. Sobre a clonagem molecular, é correto afirmar que: 
 
Os plasmídeos são vetores autorreplicativos nos quais inserimos um DNA 
exógeno a ser clonado. 
 
Chamamos de transformação o processo de transformar organismo selvagem 
em geneticamente modificado. 
 
Bactérias não são bons organismos hospedeiros, pois são incapazes de fazer 
transformação. 
 
As enzimas de restrição são usadas na clonagem para sintetizar novas 
sequências de DNA, pela sua capacidade sintetase. 
 
Os clones são selecionados baseados em sua semelhança fenotípica em 
microscopia ótica. 
Responder 
Comentário 
MÓDULO 3 
 
Identificar os métodos de hibridização de ácidos nucleicos, suas 
diferenças e aplicações na rotina do biologista molecular 
TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO 
As técnicas de hibridização consistem na identificação de sequências de DNA 
fita simples ou RNA específicas por meio de seu pareamento por 
complementariedade – ou hibridização – com sequências sintéticas. O termo 
hibridização pode ser, por vezes, equivalente ao pareamento por 
complementariedade. Assim, pode-se dizer que os oligonucleotídeos iniciadores 
hibridizam com o DNA-alvo em uma PCR. Para definirmos melhor o conteúdo a 
ser abordado neste módulo, vamos falar de técnicas de hibridização que não se 
baseiam na amplificação do DNA pela Taq polimerase. 
Para detectar o DNA fita simples ou RNA nesse grupo de técnicas, usamos 
oligonucleotídeos marcados, chamados de sondas. 
Na maioria das aplicações de técnicas de hibridização, desenhamos sondas que 
cubram a maior extensão possível de nosso gene, sequência ou mensageiro de 
interesse. 
Tais sondas podem ser curtas ou longas, e são normalmente marcadas com 
isótopos radioativos, enzimas, anticorpos, substratos ou com fluoróforos, 
dependendo da técnica em questão. 
Dessa forma, podemos classificar os métodos de revelação em métodos diretos 
e indiretos: 
Clique nas barras para ver as informações. 
DIRETOS 
Em métodos diretos, as sondas são marcadas diretamente com o emissor de 
sinal (por exemplo, radioisótopos ou fluoróforos) e são, portanto, proporcionais à 
quantidade de moléculas existentes na amostra analisada. 
INDIRETOS 
Em indiretos, as sondas estão marcadas com agentes intermediários que são 
usados para aumentar o sinal emitido (como enzimas, substratos e anticorpos). 
Técnicas de transferência (blottings) 
Existe um grupo de três técnicas de hibridização chamadas blots (manchas, em 
inglês), que são baseadas na separação das macromoléculasalvo (DNA, RNA 
ou proteínas), desnaturação e transferência para uma membrana porosa que 
permitirá a hibridização com as sondas para revelação. 
Vamos conhecer cada uma dessas técnicas em detalhes a seguir. 
Southern blotting 
Criada pelo bioquímico britânico Edwin Southern, em 1975, recebe o seu nome. 
Nessa técnica, identificamos sequências específicas de DNA. 
Clique nas informações a seguir. 
1 
2 
3 
Atenção 
Lembre-se de que a eletroforese separa as moléculas de DNA de acordo com o 
tamanho através da sua migração pelo gel em direção ao polo positivo (ou 
cátodo), que acontece quando ele é submetido à corrente elétrica em tampão 
aquoso. 
Após a separação por eletroforese e leitura em transiluminador ultravioleta, o 
DNA é desnaturado (em fitas simples) em solução alcalina por cerca de meia 
hora, e então é neutralizado de volta a pH 7. Então, podemos proceder para a 
transferência do DNA do gel para a membrana porosa, feita de nitrocelulose ou 
nylon. 
Para isso, precisamos montar uma espécie de sanduíche, no qual as duas “fatias 
de pão” são placas de vidro, cada uma acompanhada por papel absorvente do 
lado de dentro, e o gel em contato com a membrana porosa como “recheio”. O 
sanduíche deve sempre ser montado dentro de uma cuba contendo o tampão de 
transferência, de forma que todos os componentes fiquem encharcados e 
nenhuma bolha de ar fique presa. Isso porque as bolhas de ar impedem a 
transferência, formadas quando o tampão aquoso é submetido a corrente 
elétrica – por isso, usamos papel absorvente para manter a membrana e o gel 
em contato com o tampão durante todo o período de transferência, que pode 
levar mais de três horas dependendo do tamanho dos fragmentos digeridos. 
Após a transferência, o DNA fica fixado na membrana, que pode ter seus sítios 
de ligação inespecífica bloqueados e pode ser armazenada por longos períodos 
em geladeira. 
Atenção 
Para a etapa de hibridização propriamente dita, usamos sequências 
conhecidas, as sondas. As sondas são complementares às sequências-alvo e se 
anelam a elas, fazendo parte do sistema de detecção do sinal. Tanto as 
sequências-alvo quanto as sondas podem ser feitas de DNA ou de RNA. 
Originalmente, eram usadas sequências de RNA produzidas em células a partir 
de DNA recombinante e tratadas momentaneamente com radioisótopos – por 
isso, a técnica era chamada de hibridização, pelo uso de híbridos de DNA-RNA. 
Com o uso de oligonucleotídeos sintéticos, as sondas de DNA têm substituído as 
de RNA, pois são mais estáveis que as últimas. 
A membrana deve ficar imersa em solução contendo a sonda, em agitação, por 
pelo menos uma hora. Após essa incubação,a membrana é lavada, e todas as 
sondas que não se ligaram por complementariedade ao DNA desnaturado em 
fita simples serão removidas do sistema, restando apenas aquelas que se 
anelaram ao DNA. 
Figura 
18. Etapas de separação, transferência e hibridização do Southern Blotting, para identificação de DNA. 
A leitura da hibridização dependerá da forma como as sondas foram marcadas. 
Caso tenhamos usado radioisótopos, precisamos revelar usando filmes de raios 
X, em que a radioatividade marcará uma impressão. 
Caso decidamos usar sondas fluorescentes, colorimétricas ou 
quimioluminescentes, precisamos revelá-las de acordo. Essas últimas opções 
são preferíveis à primeira, por serem mais seguras para o manipulador e o meio 
ambiente. 
Na revelação colorimétrica, a sonda está marcada com um substrato que é 
usado por uma enzima, em uma etapa adicional, para produção de um composto 
colorido. Assim, a posição da sonda pode ser visualizada a olho nu. As sondas 
fluorescentes precisarão de leitura em aparelho especializado, que excitará o 
fluoróforo e permitirá a identificação do local onde a sonda está. 
No método quimioluminescente, temos uma enzima que catalisa uma reação, 
cujo produto emite luz em determinado comprimento de onda (dependendo de 
qual enzima reveladora for usada) e, por isso, também precisamos de aparelho 
para leitura da reação. 
Neste vídeo, você conhecerá um pouco sobre as técnicas de hibridização. 
Northern blotting 
O Northern blotting é uma técnica de hibridização para identificação de 
sequências específicas de RNA, dentre uma mistura complexa de ácidos 
nucleicos, cujo nome é derivado da técnica desenvolvida para DNA (Southern 
blotting). 
O Northern blotting pode ser usado para avaliar a presença e a quantidade da 
expressão de determinado gene, assim como avaliar se o mRNA está associado 
a proteínas, após a purificação das últimas. 
Os mesmos princípios da técnica de Southern blotting são usados para 
o Northern blotting. Conheça: 
1 
Iremos desnaturar e separar o RNA total extraído por eletroforese em gel de 
agarose contendo formaldeído − um composto químico que usamos para fixação 
e preservação da amostra, que é especialmente útil quando trabalhamos com 
RNA. 
 
2 
Em seguida, iremos transferi-lo do gel para a membrana de nitrocelulose ou 
nylon. Para isso, montamos o mesmo sanduíche, contendo a membrana e o gel 
no meio, dentro de folhas de papel absorvente e com as placas de vidro como 
“pão”. 
 
3 
Após a transferência ocorrer e fixarmos o RNA, passamos à etapa de 
hibridização das sondas e revelação do resultado, de acordo com a marcação 
das sondas usadas (Figura 19). 
Figura 
19. Esquema ilustrando a técnica de Northern blot. 
HIBRIDIZAÇÃO IN SITU 
A hibridização in situ (in situ hybridization – ISH) foi uma das primeiras técnicas 
de biologia molecular a ser aplicada ao diagnóstico clínico de doenças. 
Ela permite a detecção e a quantificação de ácidos nucleicos em cortes 
histológicos especiais e cultivos celulares e nos informa onde o ácido nucleico 
investigado está localizado dentro da célula e do tecido. 
A ISH tem sido usada para diagnóstico citogenético e de doenças infecciosas, 
como no caso da infecção pelo papilomavírus humano (HPV), causador do 
câncer do colo do útero, em cérvice uterina. Outros exemplos de aplicação da 
ISH incluem a detecção de cromossomos aberrantes, com alterações como 
duplicações, deleções e inserções genômicas que não deveriam existir e que 
podem causar doenças, como ocorre na distrofia muscular de Duchenne, na 
fibrose cística e em alguns tipos de câncer. 
 
A ISH originalmente usava isótopos radioativos para marcação das sondas. 
Porém, com o desenvolvimento de marcadores fluorescentes mais seguros, a 
ISH evoluiu para FISH (fluorescent in situ hybridization, ou hibridização in 
situ fluorescente). As outras abordagens de leitura do sinal vistas nos blottings, 
como quimioluminescência e colorimetria, também podem ser usadas em ISH, 
porém são menos difundidas que a FISH. 
Já que trabalhamos com tecidos ou células em cultivo, a leitura dos resultados 
normalmente é feita em microscopia. Para isso, precisamos ter um microscópio 
de fluorescência, capaz de excitar os fluoróforos e detectar o local de emissão 
da fluorescência com a precisão necessária ao sistema. 
Nesse caso, podemos usar microscópio com precisão na casa de nanômetros, 
ou seja, na casa de bilionésimo de um metro, algo em torno de 0,000000001 
metro (Figura 20). 
Figura 
20. Representação esquemática das etapas da hibridização in situ fluorescente. 
O primeiro ponto que avaliamos em uma IHS ou FISH é o desenho da sonda. 
Caso queiramos identificar uma sequência, um gene ou um mRNA longo, 
podemos usar dezenas de sondas curtas, de cerca de 20 pb cada uma, que se 
anelem ao longo da sequência-alvo. Isso dá grande especificidade ao método, 
além da ótima sensibilidade dada pelo aumento do sinal emitido, já que todas 
estarão marcadas. 
Caso desejemos detectar uma região muito curta, na qual não poderemos 
sintetizar e anelar dezenas de sondas diferentes, podemos usar uma técnica 
chamada de branched-FISH (ou FISH ramificado). 
Nessa técnica, usamos oligonucleotídeos que tenham duas regiões: 
1 
A primeira é complementar à sequência-alvo, presente no tecido ou na célula. 
2 
E a segunda região, mais longa, é usada como alvo para as sondas marcadas 
se anelarem. 
Com isso, conseguimos aumentar o sinal de detecção da sequência-alvo. 
Como em outras técnicas de hibridização, na ISH ou FISH, precisamos 
desnaturar o DNA fita dupla em fitas simples. Como agora estamos trabalhando 
com tecidos ou células fixados e aderidos a uma lamínula de microscopia, não 
podemos usar agentes que destruam o tecido, como acontece se tratarmos ele 
com tampões extremamente alcalinos. 
Atenção 
Por isso, a desnaturação do DNA normalmente é feita por calor controlado, de 
forma a não destruirmos a célula ou o tecido. Se nosso ácido nucleico-alvo for 
RNA, não poderemos usar calor, então utilizamos um composto químico 
chamado de formamida para desnaturação de proteínas que possam estar 
ligadas ao RNA, liberando-o para a hibridização. 
Precisamos ainda considerar como as sondas entrarão nas células, e isso 
depende diretamente do material que estamos usando e da natureza das 
células. Se estivermos fazendo FISH para células ou tecidos de mamíferos, 
permeabilizamos as membranas plasmáticas usando álcool (etanol) e 
detergentes suaves (Triton 0.1%). Caso trabalhemos com leveduras, precisamos 
permeabilizar uma estrutura mais resistente, a parede celular, o que fazemos 
usando digestão enzimática da parede. 
Finalmente, podemos fazer a hibridização, ao incubar nossa amostra fixada, 
desnaturada e permeabilizada com as sondas marcadas. Após lavagens para 
remover o excesso de sondas, podemos montar nossa lâmina de microscópio e 
observar a presença de nosso DNA ou RNA-alvo ao excitarmos os fluoróforos 
das sondas e detectarmos o sinal emitido por eles. Em muitos casos, vamos 
querer obter imagens e salvá-las, para não somente detectar a presença ou 
ausência do sequência-alvo, mas também quantificar o sinal e sua intensidade, 
determinar sua localização, analisar os dados e emitir os resultados (Figura 21). 
Figura 
21. Esquema ilustrando a FISH usando como agente desnaturante a formamida e um sistema de revelação 
pelo método indireto (com a utilização de um anticorpo). 
VERIFICANDO O APRENDIZADO 
1. As técnicas de hibridização de DNA e RNA foram umas das 
primeiras a serem usadas e aplicadas em biologia molecular. Sobre 
hibridização, selecione a opção correta: 
 
As técnicas de blotting baseiam-se na separação de DNA ou RNA 
amplificados in vitro e na transferência para membranas de nitrocelulose. 
 
O northern blot foi desenvolvido para separação e identificação de proteínas, 
DNA e RNA, podendo ser usado igualmente para as três moléculas. 
 
As amostras usadas em técnicas de hibridização devem estar frescas e as 
células, vivas,senão a técnica não irá funcionar. 
 
As moléculas-alvo de hibridização precisam estar fixadas em suporte de vidro, 
encharcadas em tampão, para que a hibridização aconteça. 
 
A hibridização corresponde ao anelamento por complementariedade entre uma 
sonda marcada e o ácido nucleico da amostra. 
Responder 
Comentário 
2. A hibridização in situ (ISH) é usada no diagnóstico de diversas 
doenças genéticas e infecciosas. A respeito da ISH e suas 
variações, é incorreto afirmar que: 
 
As sondas são desenhadas de forma a cobrirem a menor área possível do gene 
ou sequência-alvo. 
 
As sondas são marcadas com radioisótopos, enzimas, substratos ou fluoróforos 
para posterior identificação. 
 
As ISH são úteis para a detecção, localização e quantificação da sequência-alvo. 
 
A hibridização in situ fluorescente (FISH) exige leitura em microscópio de 
fluorescência para obtenção dos resultados. 
 
Na FISH, usamos agentes desnaturantes dos ácidos nucleicos, como o calor, e 
fixadores, como o formaldeído. 
Responder 
Comentário 
CONCLUSÃO 
CONSIDERAÇÕES FINAIS 
Neste tema, aprendemos como as grandes contribuições do conhecimento do 
genoma humano e de outros organismos foram feitas pelas técnicas 
moleculares. Vimos também o sequenciamento, um conjunto de diferentes 
técnicas que visam descobrir a sequência de nucleotídeos presentes no DNA. 
Dentre esse conjunto de técnicas, exploramos o sequenciamento Sanger e o 
sequenciamento de nova geração. 
Visitamos também a tecnologia do DNA recombinante, aprendendo todas as 
etapas da clonagem molecular, a escolha do segmento de interesse, do vetor, da 
estratégia de inserção e de clonagem (por restrição ou livre de restrição), a 
transformação, seleção dos clones recombinantes e sua multiplicação. Por fim, 
entendemos as técnicas de hibridização, que consistem na identificação de 
sequências de DNA fita simples ou RNA específicas pelo pareamento por 
complementariedade com sequências sintéticas, abordando as técnicas de 
transferências, Southern blotting e Northern blotting. Além disso, conhecemos a 
técnica de hibridização in situ. 
Ao longo desta jornada, vimos como o sequenciamento, a clonagem e a 
hibridização de ácidos nucleicos permitiram avanços importantes na ciência e 
como esses conhecimentos são aplicados em saúde, agropecuária e 
biotecnologia. 
PODCAST 
Entrevista da conteudista com o especialista André Lima e Camila Cunha. 
0:00 
18:03 
REFERÊNCIAS 
ADDGENE. Plasmids 101: A Desktop Resource (3rd Edition). Consultado em 
meio eletrônico em: 30 out. 2020. 
BAJPAI, B. High Capacity Vectors. Advances in Biotechnology. 1-10. 2013. 
CRONAN, J.E. Escherichia coli as an Experimental Organism. In: eLS, John 
Wiley & Sons, Ltd., 2014. 
FARACK, L.; ITZKOVITZ, S. Protocol for Single-Molecule Fluorescence In 
Situ Hybridization for Intact Pancreatic Tissue. STAR Protocols (1)1, 2020. 
GRIFFITHS, JAF. Recombinant DNA. Encyclopædia Britannica. 2020. 
Consultado em meio eletrônico em: 28 out. 2020. 
HEATHER, J. M.; CHAIN, B. The sequence of sequencers: The history of 
sequencing DNA. Genomics. 1(107),p 1-8. 2013. 
HUBER, D. et al. Fuorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations 
and what to expect from micro-scale FISH? Micro and Nano Engineering: 1 
(2018) 15–24. 
LIAO, Y. et al. RNA Isolation and Northern Blot Analysis. Bio-protocol 4(6), 
2014 Consultado em meio eletrônico em: 6 nov. 2020. 
SACRAMENTO STATE. Southern blotting: Probe labeling & Detection. 
Consultado em meio eletrônico em: 6 nov. 2020. 
SCITABLE BY NATURE EDUCATION. Plasmid definition. Consultado em meio 
eletrônico em: 30 out. 2020. 
SOUTHERN, E. Southern blotting. Nat Protoc 1, 518–525 (2006). 
VAN DEN ENT, F.; LOWE., J. RF cloning: A restriction-free method for inserting 
target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67 (2006) 67–74. 
 
EXPLORE+ 
Para saber mais sobre os assuntos tratados neste tema, assista ao vídeo: 
 Aulas sobre sequenciamento, no canal de Siomar Soares, da Universidade 
Federal do Triângulo Mineiro (UFTM). 
Pesquise na internet: 
 O tópico de Biotecnologia e Clonagem de DNA, em conteúdo de biologia, no 
site da Khan Academy. 
 
CONTEUDISTA 
Camila Freze Baez 
Currículo Lattes 
Ao clicar nesse botão, uma nova aba se abrirá com o material preparado para impressão. Nela, 
acesse o menu do seu navegador e clique em imprimir ou se preferir, utilize o atalho Ctrl + P. 
Nessa nova janela, na opção destino, direcione o arquivo para sua impressora ou escolha a 
opção: Salvar como PDF. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Amplificação in Vitro de Dna 
 APRESENTAÇÃO 
 MÓDULO 1 
 MÓDULO 2 
 MÓDULO 3 
 CONCLUSÃO 
DESCRIÇÃO 
Técnicas de amplificação e detecção de ácidos nucleicos in vitro e introdução de 
suas aplicações em rotina laboratorial. 
PROPÓSITO 
Compreender a teoria por trás da amplificação de ácidos nucleicos in vitro em 
suas diferentes formas e entender quais são suas vantagens, desvantagens e 
aplicações em contextos diversos é importante para o profissional de laboratório, 
pois lhe fornecerá poderosa ferramenta de trabalho. 
OBJETIVOS 
Módulo 1 
Reconhecer elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos in vitro 
Módulo 2 
Diferenciar as variações entre cada técnica de PCR 
Módulo 3 
Identificar aplicações apropriadas ao uso de cada método 
INTRODUÇÃO 
Os ácidos nucleicos são as estruturas fundamentais que carregam informações 
genéticas. Você já parou para pensar como certas características físicas passam 
dos pais para os filhos? Traços físicos como formato do rosto, altura, cor da pele 
e dos olhos são traduções de informações transmitidas às gerações futuras dos 
ácidos nucleicos. No corpo humano e na maioria dos seres vivos, encontramos 
dois tipos de ácidos nucleicos: o ácido desoxirribonucleico (ADN – também 
conhecido pela sigla em inglês, DNA), e o ácido ribonucleico (ARN, ou RNA, em 
inglês). 
Cada uma dessas moléculas – DNA e RNA – tem funções diferentes dentro da 
menor unidade viva conhecida, a célula. O DNA possui fita dupla, sendo mais 
estável e resistente que o RNA. Por isso, a célula utiliza o DNA para armazenar 
as informações genéticas em longo prazo. Já o RNA, normalmente, em fita 
simples e mais instável, tem como principal função intermediar a informação 
entre o DNA e as unidades efetoras da maioria das funções celulares, as 
proteínas. 
Formato do rosto e altura, por exemplo, são decorrentes da estrutura óssea que, 
em grande parte, é feita de proteínas. O papel das proteínas não se limita 
apenas em traços físicos, mas também em funcionais. 
Dogma central da Biologia Molecular: DNA replica-se em DNA e é transcrito em RNA, que é traduzido em 
proteína. 
Você deve estar se perguntando: o que isso tem a ver com a amplificação 
de ácidos nucleicos? 
Em uma célula viva e saudável, as enzimas fazem toda a amplificação do DNA 
por conta própria em um ambiente extremamente complexo e controlado – do pH 
e nível de oxigênio disponível, ao momento que a célula está em seu ciclo de 
vida. São dezenas de enzimas envolvidas na síntese de novas moléculas de 
DNA, tantas que os cientistas ainda não compreendem completamente todas as 
etapas envolvidas nesse processo. Apesar de toda a complexidade da 
duplicação do DNA in vivo, já somos capazes de sintetizar pequenos trechos do 
DNA em um tubo de ensaio. Incrível, não? Vamos ver com detalhes como isso é 
possível neste material. 
MÓDULO 1 
 
Reconhecer elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos in 
vitro 
PRINCÍPIOS DA PCR CONVENCIONAL 
Para entendermos como funciona a amplificação de DNA in vitro, devemos 
primeiro relembrar algumas informações sobre o DNA e o RNA: suas funções, 
composições, similaridades e diferenças. Tanto o DNA quanto o RNA são 
formados por nucleotídeos, que são como os tijolos dos ácidos nucleicos e, 
consequentemente, do material genético. A partir da junção de tais tijolos, 
formamos as estruturas de DNA e RNA. Mas como são esses tijolos? 
Em primeiro lugar, os nucleotídeoscontêm um açúcar chamado ribose. Essa 
ribose é uma das formas mais simples dos carboidratos – a forma mais 
conhecida de um açúcar simples é a glicose. É na ribose que reside a principal 
diferença entre DNA e RNA: o RNA possui uma molécula de oxigênio ligada ao 
segundo carbono da ribose que o DNA não possui – por isso, o DNA é chamado 
de desoxirribonucleico. 
O segundo componente são as bases nitrogenadas. Para o DNA, existem quatro 
tipos diferentes de bases nitrogenadas: 
Adenina (A) 
Citosina (C) 
Guanina (G) 
Timina (T) 
Para o RNA, as bases nitrogenadas A, C e G são as mesmas, mas, em vez de 
T, existe uma Uracila (U). Essas bases são as responsáveis pela informação 
genética. 
Imagine escrever um texto codificado, tão complexo quanto um ser humano, 
usando apenas uma das letras do teclado do computador. Como seria possível 
entender a informação que você quis codificar? Agora, se você escrever um 
texto com pelo menos duas letras (ou números) do teclado, usará um código 
binário. Isso também acontece com a informação genética: a célula utiliza essas 
cinco bases nitrogenadas para codificar, em sequência, uma informação 
preciosa. 
Finalmente, os nucleotídeos possuem grupamentos fosfatos no quinto carbono 
da (desoxir)ribose, que são capazes de interagir com a hidroxila (álcool orgânico) 
presente no terceiro carbono da (desoxir)ribose, fazendo a ligação entre um 
nucleotídeo com o próximo. Essa ligação é conhecida como fosfodiéster, sendo 
considerada o “cimento” dos nossos “tijolos”: a partir dela, longas sequências de 
DNA ou RNA são formadas. É importante manter em mente que o grupamento 
fosfato confere carga negativa à molécula de DNA (Figura 1) – vamos voltar a 
falar a respeito disso mais à frente. 
Figura 1: Esquema da estrutura básica dos desoxirribonucleotideos, compostos por fosfato, desoxirribose e 
base nitrogenada. 
A interação entre a hidroxila no carbono 3 da (desoxir)ribose e o fosfato de outro 
nucleotídeo no carbono 5 deixam as bases nitrogenadas livres para interação 
com outras bases nitrogenadas, normalmente, do tipo oposto. As principais 
bases nitrogenadas (A, T, C, G, U) são divididas em dois grupos químicos, de 
acordo com o número de anéis aromáticos que possuem: 
Clique nas informações a seguir. 
Pirimidinas 
Purinas 
As bases interagem entre si, mas entre grupos opostos: ou seja, Pirimidinas 
pareiam com Purinas, de acordo com as cargas livres de cada base. Desse 
modo, A interage com T, pois ambas têm duas cargas livres para interação, e C 
interage com G através de três cargas. Essas interações são chamadas 
de pontes de hidrogênio e são consideradas fracas por serem facilmente 
quebradas por agentes físicos, como a temperatura, e químicos, como o pH 
(Figura 2). 
Veja o esquema mostrando a estrutura do DNA e o pareamento das bases por 
complementariedade. Note as pontes de hidrogênio duplas (seta verde) entre 
Adenina e Timina, e as triplas (seta preta) entre Citosina e Guanina. 
Figura 2: Pareamento de bases nitrogenadas. 
No entanto, essas pontes de hidrogênio são importantes para manter a 
sequência de DNA livre de erros e garantem à molécula uma de suas 
características fundamentais: a complementariedade. É a partir dessa 
complementariedade que as enzimas responsáveis pela síntese do DNA e do 
RNA, as polimerases, sabem qual nucleotídeo adicionar para manter a mesma 
mensagem na hora de duplicar o DNA. Ao mesmo tempo, é a característica que 
dá ao DNA seu formato em fita dupla. Chamamos essa característica de 
replicação semiconservada. 
Importante 
Se olharmos para essa fita dupla em um sentido único, da esquerda para a 
direita, por exemplo, veremos que uma das fitas se encontra com o carbono 5 da 
desoxirribose livre na extremidade à esquerda, enquanto a outra fita tem o 
carbono 3 da desoxirribose livre à esquerda. Isso acontece porque, para 
interagirem, as duas fitas precisam estar em sentidos opostos – por isso, nós as 
chamamos de fitas antiparalelas. Esse sentido de interação por 
complementariedade traz à tona outra característica do DNA: sua replicação 
deve ser feita de forma semidescontínua. 
Reação em cadeia pela polimerase: amplificando 
DNA in vitro 
Em uma célula viva, as enzimas polimerases têm ao seu dispor todos os itens 
necessários para duplicar o DNA, de nucleotídeos a todas as enzimas (Figura 3). 
Figura 3: Representação do complexo de replicação do DNA em uma célula. 
Imagine quão complexo seria reproduzir o ambiente celular em um tubo de 
ensaio! Precisamos utilizar os conhecimentos da físico-química do DNA e os 
princípios básicos de sua replicação para simplificação e adaptação da técnica in 
vitro. 
 
A primeira característica do DNA que é importante na sua replicação in vitro é 
a complementariedade entre fitas antiparalelas: as bases nitrogenadas de 
uma fita interagem especificamente com as bases correspondentes da outra fita 
(A-T, C-G) por meio de interações frágeis que podem ser desfeitas pelo calor. Ao 
aquecermos a solução acima de 90 oC, podemos desfazer essas interações e 
abrir a fita dupla em duas fitas simples. Isso deixa as bases nitrogenadas 
expostas para interagirem e, ao abaixarmos a temperatura, conseguimos fazer 
com que a fita dupla se refaça e a informação seja mantida. Vamos ver como 
esse processo funciona passo a passo mais à frente. 
 
A segunda característica importante para a replicação do DNA in vitro é a 
síntese enzimática pela polimerase. Essa enzima lê cada base nitrogenada da 
fita simples como se fosse um molde, e adiciona a base nitrogenada 
complementar na fita que está sendo sintetizada através da ligação 
fosfodiéster. In vivo, a polimerase inicia a duplicação do DNA sozinha, pois ela 
não consegue abrir a fita dupla em fitas simples, identificar o local certo de início 
de replicação ou adicionar os primeiros nucleotídeos. A célula utiliza enzimas 
para abrir a fita dupla, as helicases, e adição dos primeiros nucleotídeos é feita 
por outra enzima, chamada primase. 
Na amplificação do DNA in vitro, chamada de reação em cadeia da 
polimerase (em inglês, polymerase chain reaction – PCR), a abertura do DNA 
em fitas simples é feita através de calor. Para isso, utilizamos uma enzima 
termorresistente chamada de Taq polimerase. Além disso, usamos pequenas 
sequências de nucleotídeos em fitas simples e complementares à sequência-
alvo do DNA a ser amplificado. Essas sequências sintéticas são chamadas 
de iniciadores ou oligonucleotídeos (oligo = poucos), algo em torno de 20 
nucleotídeos, que, em inglês, são chamados de primers. Normalmente, são 
usados dois oligonucleotídeos por reação: um chamado senso, que se liga 
ao DNA molde fita simples no sentido 3’→5’; e um antissenso, que se liga à 
fita no sentido 5’→3’. 
Lembre-se de que o sentido de duplicação contínua do DNA ocorre apenas no 
sentido 5’→3’, pois o trifosfato (na posição 5) do nucleotídeo livre dará a energia 
necessária à ligação fosfodiéster com o carbono 3 da ribose do nucleotídeo que 
já estará na fita. Isso acontece em ambas as fitas (paralela 5’→3’ e antiparalela 
3’→5’), e ambos os oligonucleotídeos são sintetizados em laboratório no sentido 
5’→3’. Os oligonucleotídeos iniciadores irão demarcar a região do genoma a ser 
amplificada. Essa informação é importante para dar especificidade à PCR! 
Etapas da reação em cadeia da polimerase 
Agora, já compreendemos que a fita dupla de DNA se abre em duas fitas 
simples quando aquecida próximo a 100 oC, e sabemos que a reação de síntese 
de novas fitas de DNA é feita por meio de uma enzima termorresistente 
chamada Taq polimerase. Também descobrimos que a enzima precisa de 
oligonucleotídeos iniciadores que se ligam por complementariedade ao DNA-alvo 
desnaturado em uma fita simples. Agora, podemos entender como essa última 
se desenvolve. Assim como em qualquer receita de bolo, uma PCR precisa de 
seus ingredientes básicos – ou reagentes mínimos – para a síntese de DNA 
acontecer. Desse modo, adicionamos esses ingredientes a um microtubo.Os 
reagentes mínimos necessários para a amplificação são: 
O DNA molde, dupla fita, extraído a partir de amostras biológicas. 
Os oligonucleotídeos sintéticos que são complementares à região do DNA molde a ser amplificado. 
A Taq polimerase, termorresistente. 
Cátions de magnésio (Mg2+), cofator necessário ao funcionamento eficaz da polimerase. 
Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs – dATP, dGTP, dCTP, dTTP) – lembre-se de que os três
que a reação fosfodiéster catalisada pela Taq polimerase aconteça. 
A água ultrapura, livre de contaminantes de DNA, RNA e de nucleases. (Figura 4). 
Figura 4: Esquema dos reagentes necessários a uma reação em cadeia da polimerase (PCR). 
O microtubo com esses poucos reagentes é, então, submetido a diversos ciclos 
de elevação e redução da temperatura do qual a PCR consiste. 
A primeira etapa de qualquer PCR consiste na abertura da fita dupla de DNA em 
suas fitas simples pelo aquecimento da reação a, pelo menos, 95 oC, por um 
tempo prolongado – algo em torno de 5 a 10 minutos. Esse tempo é necessário 
para abrir por completo as fitas de DNA que podem estar muito concentradas, 
superenoveladas e ser muito longas. 
Em seguida, começam os ciclos. Cada ciclo contém, pelo menos, 3 
etapas: desnaturação, anelamento e extensão (Figura 5). 
Note na ilustração a desnaturação das fitas duplas de DNA em fitas simples, o 
anelamento dos iniciadores à sequência-alvo por complementariedade e a 
extensão pela Taq polimerase. 
Figura 5: Ilustração das 
etapas da PCR. 
Clique nas barras para ver as informações. 
DESNATURAÇÃO 
É a primeira etapa de cada ciclo em que a temperatura é aquecida a 95 oC por 
cerca de 1 minuto. O tempo de desnaturação pode variar de acordo com cada 
reação e genoma. Por exemplo, genomas ricos em CG precisam de tempo e 
temperatura maiores para desnaturar, pois C faz pontes triplas com G, enquanto 
genomas ricos em AT precisam de tempos menores por possuírem ligações 
duplas. 
ANELAMENTO 
A segunda etapa de cada ciclo é o anelamento. A temperatura será reduzida 
para cerca de 50 a 65 oC por, aproximadamente, 30 segundos. Essa redução da 
temperatura deve ser feita com exatidão para que os iniciadores se liguem 
especificamente à fita simples de DNA. Se a temperatura for baixa demais, a fita 
se renatura e a PCR não acontece, ou ainda outros fragmentos do DNA extraído 
podem se ligar inespecificamente e sua reação não funcionará 
apropriadamente. Se for alta demais, os oligonucleotídeos se ligarão apenas 
parcialmente, ou até mesmo não se ligarão, e a eficiência da sua reação será 
gravemente comprometida. Você pode estar se perguntando como saber 
exatamente a temperatura a ser usada. A resposta certa dependerá de vários 
fatores, como o tamanho do seu oligonucleotídeo, seu conteúdo de CG, e a 
concentração de sais no tampão de PCR. De modo geral, quanto maior o 
tamanho e o conteúdo de CG, maior será a temperatura de anelamento. 
Uma vez que os oligonucleotídeos tenham se anelado à fita de DNA molde, 
a Taq polimerase reconhecerá esse local e fará a extensão da fita dupla. Como 
a Taq polimerase é termorresistente, a elevação da temperatura a 95 oC não a 
destrói – na realidade, ela funciona melhor em temperaturas mais elevadas. No 
caso da maioria das polimerases disponíveis comercialmente, a melhor 
temperatura de adição de nucleotídeos em uma PCR é, em torno, de 70 oC a 
72 oC. 
Atenção 
O tempo de extensão depende da velocidade da polimerase usada e do 
tamanho da sequência entre os oligonucleotídeos. Uma reação para amplificar 
menos de 500 pares de bases que utilize uma polimerase com uma velocidade 
de incorporação de nucleotídeos mediana deve ter um tempo de extensão de 
30 a 40 segundos. 
Após o término da extensão, a reação é aquecida novamente a > 95 oC, para 
que as fitas duplas recém-sintetizadas sejam separadas, e o ciclo desnaturação-
anelamento-extensão se repita de 30 a 40 vezes. No final, é recomendável ter 
um ciclo final de extensão maior para garantir que a síntese de todas as fitas 
seja concluída. Após o término, a reação deve ser mantida refrigerada para 
preservar o material amplificado. 
A PCR acontece em equipamentos que, como um ferro de passar, aquecem e 
resfriam rapidamente: os termocicladores. Esses aparelhos foram um grande 
avanço para as ciências biológicas e permitiram a grande difusão da PCR em 
diversas áreas. Graças a eles, uma PCR convencional média dura de 1 hora e 
meia a 2h. 
A cada ciclo, a quantidade de sequência-alvo – aquela contida entre os 
iniciadores senso e antissenso, conhecida como amplicon – dobra. Dessa forma, 
se, no primeiro ciclo, tínhamos apenas uma cópia de tal sequência (limite teórico 
da PCR), ao final do primeiro ciclo, teremos 2 cópias; no final do terceiro ciclo, 4; 
depois, 8, e então 16, e assim sucessivamente. 
A cada ciclo, vemos um aumento exponencial do número de cópias da 
sequência-alvo. Assim, no final de 30 ciclos, teremos algo na ordem de 1 bilhão 
de cópias da mesma sequência! Um número tão grande de uma mesma 
sequência vai ser muito mais facilmente identificado posteriormente (Figura 6). 
Figura 6: Esquema da 
amplificação exponencial do DNA-alvo por ciclo a partir de uma cópia, em aparelho termociclador. 
Via de regra, podemos subdividir a PCR em duas categorias: 
PCR qualitativa, em que todos os ciclos ocorrem em um termociclador comum, 
precisa de etapas posteriores para revelar o resultado. Nesse tipo, o resultado se 
dá pela constatação da presença ou ausência do produto alvo da amplificação. 
Abordaremos alguns outros tipos de PCR que se encaixam nessa categoria. 
PCR quantitativa, também conhecida como em tempo real, em que os ciclos se 
dão em um aparelho capaz de ler automaticamente a amplificação e, assim, é 
capaz de quantificar em tempo real. Existem dois métodos que são mais comuns 
para a quantificação. Nesse caso, não há necessidade de revelação posterior à 
reação, o que a torna mais rápida. 
Eletroforese em gel de agarose: separando e revelando 
o resultado 
Após a amplificação da sequência-alvo pela polimerase, temos um microtubo 
com nosso DNA amplificado em um tampão de reação que é transparente como 
a água. Naturalmente, não podemos observar a olho nu o resultado da reação: é 
necessário revelá-la. Para isso, precisamos manter em mente que, após uma 
PCR bem-sucedida, temos uma sequência de DNA em um tamanho exato 
graças ao anelamento específico dos oligonucleotídeos à sequência-alvo. 
Portanto, precisamos separar as sequências por tamanho para verificarmos 
se o tamanho corresponde ao do nosso produto. Também vamos precisar de 
algo que revele a localização do DNA, ou um agente revelador especial. 
Dica 
Para separar o DNA de acordo com seu tamanho, usamos uma espécie de 
malha gelatinosa chamada de matriz ou gel de agarose. 
Você deve estar familiarizado com a gelatina que fazemos na cozinha, certo? A 
agarose funciona de maneira semelhante: é um polissacarídeo que se dissolve 
em líquido aquoso quando aquecido e, quando resfriado, se solidifica, ou 
polimeriza. Ao polimerizar, a agarose forma uma malha com pequenos orifícios 
que permitirão a passagem do DNA, de forma que moléculas menores de DNA 
passarão com maior facilidade e mais rapidamente, enquanto moléculas maiores 
de DNA terão maior dificuldade de passar e, por isso, demorarão mais tempo 
para viajarem pela malha. Assim, podemos separar as moléculas de DNA de 
acordo com tamanho. Dependendo do tamanho do nosso DNA amplificado, 
poderemos usar uma malha mais fechada ou mais aberta simplesmente 
variando a concentração da agarose que usamos para fazer o gel. 
O DNA será inserido no gel de agarose através de pequenos orifícios chamados 
de poços, feitos com um pente com pequenos dentes largos. Para podermos 
visualizar a passagem do tampão da PCR pelo gel de agarose, usamos corantes 
como o azul de bromofenol, o qual é mais denso do que o tampão de corrida e 
faz com que o DNA se assente no fundo do poço, o que é necessário para que a 
separação funcioneadequadamente. 
Montagem de gel de 
agarose e uso de pentes para formação de poços para aplicação do produto de PCR. 
Uma vez que o gel de agarose esteja pronto e que o DNA tenha sido pipetado 
nos poços do gel com o corante azul, podemos começar a eletroforese. Para a 
eletroforese, precisaremos ainda de uma cuba, ou recipiente que contenha 
entradas para corrente elétrica, uma fonte elétrica e um tampão ionizável. A 
eletroforese parte do princípio de que um tampão, quando submetido a uma 
corrente elétrica, tem suas moléculas ionizadas migrando em direção a um dos 
polos: as moléculas negativas migram para o polo oposto, o cátodo, e as 
moléculas positivas migram para o polo negativo, o ânodo. 
No caso do DNA, seu grupamento fosfato lhe dá carga negativa, fazendo que o 
DNA migre para o polo positivo (cátodo) quando em solução submetida à 
corrente elétrica. Como o DNA está no fundo do gel de agarose graças ao 
corante mais pesado que o tampão eletroforético, ele passa por dentro da 
agarose e, assim, será separado de acordo com seu tamanho pela trama do gel. 
Por sua vez, o corante azul, também de carga negativa e de tamanho muito 
inferior à complexa molécula de DNA, migrará pelo gel mais rapidamente, 
servindo apenas como marcador da velocidade de migração, e não da posição 
do DNA. 
Representação 
esquemática de uma eletroforese em gel de agarose. 
Para sabermos o tamanho e a posição do DNA, precisaremos de um marcador 
de tamanho molecular do DNA que consiste em sequências de DNA de 
tamanhos conhecidos, como se fosse uma escada cujos degraus representam 
os tamanhos. Ele é um parâmetro para estimarmos o tamanho das sequências 
de DNA que amplificamos – coloquialmente, chamamos essas sequências em 
gel de agarose de bandas. 
Também precisamos de um revelador da localização do nosso 
produto amplificado no gel de agarose. Esse reagente, chamado de fluoróforo, 
é uma molécula capaz de fluorescer quando excitada no comprimento de onda 
correto. Em gel de agarose, usamos fluoróforo que intercale especificamente 
com o DNA. A molécula mais comumente utilizada é o brometo de etídio, que é 
capaz de se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Sua capacidade de se 
ligar ao DNA o torna potencialmente tóxico, carcinogênico e teratogênico, e 
precisamos manter nossa segurança e as boas práticas laboratoriais para evitar 
de nos contaminarmos com ele. 
Existem diversas formas de se utilizar brometo na revelação do gel, podendo ser 
adicionado antes da solidificação do gel (antes da eletroforese) ou depois da 
eletroforese, com uma incubação extra. Finalmente, o brometo de etídio é 
excitado no comprimento de onda ultravioleta em um equipamento chamado 
transiluminador. Ao ser excitado, o fluoróforo emite fluorescência e dá a 
localização das bandas de DNA amplificado de acordo com o marcador de 
tamanho molecular. 
Imagem de um gel de agarose e sua revelação por fluorescência do brometo de etídio em luz ultravioleta. 
Dependendo da técnica de PCR utilizada, assim como do objetivo da PCR, seu 
resultado pode ser uma única banda de DNA no gel de agarose ou múltiplas 
bandas. Algumas vezes, resultados inesperados também podem aparecer, como 
múltiplas bandas de DNA, onde apenas uma banda única era esperada. Cada 
situação demandará a experiência e o conhecimento do profissional para 
interpretação e resolução de possíveis problemas. Existem alternativas ao 
uso do gel de agarose para separação de ácidos nucleicos. Um exemplo é o gel 
de acrilamida/bisacrilamida, usado para separar sequências de DNA com alta 
resolução, de forma que bandas com até um nucleotídeo de diferença em 
tamanho possam ser diferenciadas. O gel de acrilamida/bisacrilamida também 
permite a separação de RNA e proteínas. No entanto, exige revelação por 
sistemas diferentes, mais complexos, que nem todos os laboratórios possuem 
estrutura para execução. Além de mais tóxica que a agarose, a montagem do gel 
e sua corrida eletroforética também são mais trabalhosas. Desse modo, o gel de 
agarose corado por brometo de etídio é a técnica de revelação de PCR 
mais utilizada. 
PCR E ELETROFORESE 
VERIFICANDO O APRENDIZADO 
1. Vimos que a PCR é uma ferramenta molecular para amplificação 
do DNA in vitro. Sobre a PCR, é correto afirmar que: 
 
A polimerase utilizada é capaz de adicionar todos os nucleotídeos necessários, 
de maneira inespecífica. 
 
A especificidade da reação é por oligonucleotídeos iniciadores para demarcar a 
sequência e permitir que a polimerase inicie a síntese. 
 
A PCR ocorre de forma linear, ou seja, nenhuma etapa de variação de 
temperatura se repete. 
 
A Taq polimerase é uma enzima sensível ao calor e deve ser adicionada a cada 
novo ciclo. 
 
Apenas nucleotídeos com hidroxilas no terceiro carbono da ribose são 
adicionados pela Taq polimerase. 
Responder 
Comentário 
2. A PCR contém diversas etapas, desde pipetagem da reação até 
sua leitura. Considerando as etapas, é incorreto afirmar que: 
 
A temperatura de desnaturação deve ser alta o suficiente para separar as fitas 
duplas de DNA em fitas simples. 
 
A Taq polimerase é termorresistente e sua temperatura ótima de síntese de DNA 
é próxima a 70oC. 
 
Após a amplificação, podemos facilmente visualizar o resultado, pois se trata de 
reação colorimétrica. 
 
Para identificarmos se nossa sequência-alvo foi amplificada, devemos separar 
as moléculas de acordo com o tamanho, através de eletroforese em gel de 
agarose, e depois revelar, usando intercalantes de DNA fluorescentes em 
ultravioleta. 
 
A eletroforese usa a carga negativa do DNA para fazê-lo migrar através do gel e 
em direção ao cátodo, quando submetido à corrente elétrica. 
Responder 
Comentário 
MÓDULO 2 
 
Diferenciar as variações entre cada técnica de PCR 
VARIAÇÕES DA TÉCNICA DE PCR 
Existem situações em que a PCR qualitativa e convencional pode não ser a 
técnica ideal para o nosso objetivo. Podemos nos deparar com casos em que a 
concentração do DNA total da amostra é muito baixa, o que pode limitar o uso do 
produto amplificado em outras aplicações, como o sequenciamento. Em 
determinadas ocasiões, queremos saber o quanto de determinada sequência 
temos em nossas amostras. Em outras situações, podemos estar interessados 
no produto da expressão de um determinado gene, e precisamos olhar para o 
RNA mensageiro ao invés do DNA, já que os níveis de DNA de uma célula são 
mantidos constantes, salvo raras exceções. 
Dica 
Como você pode ver, existem diversos outros interesses, e uma PCR 
convencional dará apenas a base para que variações mais complexas, 
específicas e úteis sejam desenvolvidas, validadas e usadas. 
Reação de transcrição reversa 
Como já sabemos, a DNA polimerase é capaz de sintetizar uma nova fita de 
DNA a partir de uma fita de DNA molde. Afinal, ela é uma DNA polimerase DNA-
dependente. Mas, em muitas ocasiões, é necessário investigar a expressão de 
um gene, ou até mesmo diagnosticar doenças causadas por vírus que não têm 
material genético feito por DNA. Nesses casos, a molécula a ser detectada e 
quantificada indiretamente é o RNA. A Taq polimerase, no entanto, não é capaz 
de reconhecer ou de adicionar nucleotídeos a riboses; ela só trabalha 
com desoxirriboses. 
Como conseguimos resolver esse problema? 
Resposta 
Pelos organismos que conseguem sintetizar DNA a partir de RNA! 
Assim como o SARS-CoV2, coronavírus causador da COVID-19, existem outros 
vírus de genoma RNA. Os primeiros vírus a serem estudados pela humanidade 
foram os de genoma RNA chamados de retrovírus. Esses vírus têm algo de 
especial: a capacidade de inverter a ordem DNA → RNA → proteína do dogma 
central da Biologia Molecular, usando uma enzima para sintetizar um DNA 
complementar (cDNA) ao seu genoma RNA. Isso mesmo, os retrovírus usam o 
RNA de seu genoma como molde para síntese de DNA. 
Os retrovírus possuem uma enzima capaz de sintetizar DNA a partir de RNA 
cujo nome oficial é DNA polimerase RNA-dependente. Corriqueiramente, ela é 
chamada de transcriptasereversa, ou TR, pois faz o reverso da transcrição: 
sintetiza DNA a partir do RNA. Uma vez que os pesquisadores conseguiram 
isolar a TR, ela passou a ser usada para reações in vitro. Na maioria dos casos, 
é usada uma TR purificada a partir de vírus aviários, de forma que as TR não 
representam nenhum risco de infecção ao manipulador e são seguras para 
diagnóstico e pesquisa. 
 
Assim como uma reação pela polimerase, a reação de transcrição reversa (RT) 
precisa de alguns fatores elementares. O primeiro fator necessário é o RNA de 
polaridade positiva (RNA+) de qualidade, o que requer muito cuidado na 
manipulação e extração do material. Esse RNA é assim chamado por possuir o 
mesmo sentido de transcrição e tradução que um RNA mensageiro (mRNA), 
mas expande o entendimento para vírus que nem sempre tem seu RNA+ 
diretamente traduzido na célula, como, por exemplo, os próprios retrovírus. Além 
do RNA+, a RT também precisará da enzima transcriptase reversa para fazer a 
síntese de cDNA a partir do RNA+. 
Assim como as primeiras DNA-polimerases usadas na PCR mais rudimentar, a 
TR não é resistente à temperatura. Dessa forma, a reação de transcrição reversa 
deve preceder a PCR, pois a TR é inativada pelas temperaturas de 
desnaturação. Da junção de reação de transcrição reversa (RT) seguida por 
PCR, vem o termo RT-PCR. A TR precisará de pequenos oligonucleotídeos, 
menores ainda que os usados em uma PCR convencional, para iniciar a 
transcrição. Esses oligonucleotídeos têm, em média, apenas 6 bases e, por isso, 
são chamados de hexâmeros. Eles podem ser específicos para uma 
determinada sequência de RNA, ou podem ser uma sequência curta rica 
em timinas (poli-T) que se anelará à cauda poli-A do mRNA, ou podem ser 
aleatorizados, sendo este último o mais usado por permitir a síntese e o 
armazenamento do cDNA derivado de diversas sequências diferentes. 
Clique nas informações a seguir. 
Primeiro caso 
Segundo caso 
Terceiro caso 
Ao contrário da PCR, que contém ciclos que se repetem várias vezes para a 
amplificação de determinada sequência, a RT é linear: cada etapa acontece 
apenas uma vez, o que não permite amplificação de sinal. Primeiro, a reação 
começa com o anelamento dos hexâmeros ao RNA+ por poucos minutos. Na 
maioria dos casos, não há necessidade de temperaturas altas de desnaturação, 
pois o RNA+ já é uma fita simples. Contudo, podem ocorrer estruturas 
secundárias no RNA que precisam de temperaturas moderadas para 
desnaturação. (Figura 7) 
Veja na imagem a desnaturação de eventuais estruturas secundárias do RNA, 
seguido por anelamento dos hexâmeros iniciadores à sequência-alvo por 
complementariedade e síntese de cDNA pela transcriptase reversa. 
Figura 7: Ilustração das etapas da reação de transcrição reversa (RT). 
Em seguida, o tubo será aquecido ou resfriado até a temperatura de extensão 
pela TR. Diferentemente da PCR convencional, a RT possui diversas TR de 
origens diferentes que podem ser usadas. Assim, os protocolos variam entre 
diferentes marcas de enzimas. Em alguns casos, a RT pode ter apenas essas 
duas temperaturas, de anelamento e extensão, de 25 e 37 oC, respectivamente. 
O cDNA produzido pode ser armazenado por meses a anos em geladeira (4 oC) 
ou freezer (-20 oC), ou usado imediatamente como molde em uma PCR – a 
chamada RT-PCR. (Figura 8) 
Figura 8: Resumo 
esquemático dos reagentes necessários, das etapas e da amplificação do cDNA em uma RT-PCR. 
Nested-PCR 
A PCR convencional é muito útil, mas, às vezes, não consegue amplificar uma 
determinada sequência que esteja presente em pouquíssima quantidade. 
Quando há dificuldade em se amplificar o DNA alvo na PCR convencional, o gel 
de agarose pode não ter capacidade suficiente para evidenciar o amplicon. Nós 
chamamos essa capacidade de o resultado representar a realidade 
de sensibilidade. Em outras palavras, a sensibilidade da PCR reflete a 
capacidade de detecção do sinal do DNA-alvo, em amostras que possuem o 
DNA-alvo na realidade. Normalmente, a PCR tem ótima sensibilidade por 
aumentar exponencialmente a sequência-alvo. No entanto, em alguns casos, a 
sensibilidade da PCR convencional pode não ser suficiente, pois existe uma 
saturação da reação por volta do 35º ciclo: atingimos um platô em que não há 
aumento do número de fitas devido ao esgotamento dos reagentes. Então, ter 
mais de 40 ciclos em uma PCR não oferecerá nenhum benefício, porém, pode 
aumentar as chances de produtos inespecíficos que atrapalharão a 
interpretação. (Figura 9). 
Observe no gráfico que a quantidade de DNA, detectada por fluorescência, 
aumenta exponencialmente até chegar a um platô, em que não há mais aumento 
significativo de DNA a cada ciclo. 
Figura 9: Gráfico representativo das qPCR. 
A solução para PCR com baixa sensibilidade é relativamente simples: usar uma 
fração da primeira reação como molde para uma segunda PCR, em uma técnica 
conhecida como nested-PCR. Para isso, utilizamos dois pares de iniciadores, 
sendo o par de primers para a primeira reação chamado de 
iniciadores externos, e os primers usados na segunda PCR conhecidos 
como internos. Dessa maneira, a segunda PCR sempre gera um produto menor 
que a primeira reação, e conseguimos aumentar o número de ciclos de 
amplificação de, no máximo, 40 (na PCR convencional) para entre 60 e 80 ciclos 
no total de ciclos combinados nas duas reações subsequentes. 
Consequentemente, aumentamos a quantidade de DNA amplificado obtido ao 
final da segunda PCR. Caso seja utilizada corretamente, a adição de 
etapa nested pode melhorar muito a sensibilidade e a especificidade da PCR. 
Para isso, são necessários alguns cuidados especiais. O primeiro deles está no 
desenho da reação, que deve ser pensada como um conjunto. A primeira PCR 
deve possuir oligonucleotídeos que, ao se anelarem a uma determinada região, 
permitam que a polimerase produza um amplicon longo e específico o suficiente 
para ser usado como DNA-molde na segunda reação. 
Saiba mais 
Isso significa que, caso desejemos amplificar sequências altamente repetitivas, 
precisaremos levar em consideração uma primeira PCR cujo amplicon contenha 
regiões específicas ao redor das repetições para que haja uma boa reação 
secundária. Isso porque, essa última precisa de iniciadores que se anelem 
especificamente à região que foi amplificada anteriormente. 
Contudo, devemos evitar o uso dos mesmos oligonucleotídeos da primeira 
reação, já que podem reduzir a eficácia da segunda reação, além de gerar 
produtos inespecíficos. Outro cuidado recomendável para a segunda reação é 
a purificação do produto da primeira reação antes de utilizá-lo na segunda, o 
que evita contaminações entre amostras, reduz o risco de inespecificidade e 
aumenta a eficácia da segunda PCR (Figura 10). Note o uso de iniciadores 
externos na primeira reação, amplificando um produto que será usado como 
molde de amplificação na segunda reação, que usa iniciadores internos. 
Figura 10: Representação 
esquemática de uma nested-PCR. 
PCR quantitativo em tempo real – qPCR 
Até agora, todas as técnicas que discutimos precisam da eletroforese em gel de 
agarose para separação dos produtos da PCR e posterior revelação das bandas 
através de agentes intercalantes do DNA que emitem fluorescência; por 
exemplo, o brometo de etídio, quando submetido à luz ultravioleta. Esses tipos 
de PCR são categorizados como qualitativos e podem ser muito úteis, 
especialmente, quando o DNA amplificado for utilizado em outra técnica 
subsequente. Entretanto, existem situações em que a PCR qualitativa se torna 
pouco informativa. 
Exemplo 
Quando queremos determinar se um tratamento está surtindo efeito na redução 
de um marcador genético específico. Nesse caso, a PCR convencional e suas 
variações vistas até agora não informam o suficiente para tomada de decisões. 
Precisamos, assim, de técnicas que revelem a quantidade de certa sequência 
específica de DNA com o máximo de precisão possível. Entra em cena a PCR 
quantitativa (qPCR). 
A qPCR tem acapacidade de quantificação da sequência-alvo e de leitura em 
tempo real dos resultados, sem necessidade de revelação posterior. Isso porque, 
ela possui dois fatores adicionais a uma PCR qualitativa: a adição de fluoróforos 
à própria reação e o uso de um termociclador capaz de detectar o sinal 
fluorescente. Dessa forma, a cada novo ciclo de desnaturação-anelamento-
amplificação, ocorre aumento da quantidade de DNA-alvo e da emissão de 
fluorescência proporcional à quantidade de DNA sendo sintetizada naquele ciclo. 
Para que a fluorescência seja detectada, a qPCR exige a utilização de 
termocicladores que contenham lasers para excitação do fluoróforo e detectores 
da fluorescência. Esse aparelho é mais sofisticado, mais caro e mais complexo 
do que um termociclador convencional, porém, seus resultados podem ser 
igualmente mais informativos e precisos. Outra diferença da qPCR é que, em 
alguns casos, podemos ter uma temperatura única para anelamento e extensão: 
todas as duas acontecem a 60 oC (Figura 11). 
Figura 11: Exemplo dos ciclos de temperatura usados em SYBR qPCR contendo a fase de amplificação e a 
fase de curva de dissociação. 
Existem duas técnicas de qPCR largamente usadas: SYBR Green e TaqMan. 
Elas diferem especialmente na forma como a fluorescência é emitida e na 
especificidade do sinal fluorescente. As formas de quantificação são, por 
outro lado, semelhantes. Vamos explorar as duas em mais detalhes? 
SYBR Green 
O SYBR é fluoróforo que, como o brometo de etídio, é capaz de intercalar em 
fitas duplas de DNA. Quando está associado ao DNA, o SYBR pode ser excitado 
em comprimento de onda azul, e então emite fluorescência verde. Quando não 
está ligado ao DNA fita dupla, o SYBR tem sua fluorescência drasticamente 
reduzida. Por sua capacidade de fluorescer quando ligado ao DNA fita dupla, ele 
também é usado como um sistema alternativo na revelação da PCR 
convencional em gel de agarose, já que é menos tóxico que o brometo de etídio. 
Quando adicionado à qPCR, o SYBR emitirá o máximo de fluorescência na fase 
de extensão, pois esse é o momento em que há maior número de bases 
pareadas em fitas duplas. O aparelho termociclador irá incidir um laser, 
excitando o SYBR a emitir fluorescência verde. Essa fluorescência será 
detectada pelo aparelho, que mostrará a quantidade de fluorescência por ciclo. A 
cada novo ciclo, maior será a fluorescência emitida, pois maior será a 
quantidade de DNA fita dupla sendo sintetizada. Desse modo, a progressão de 
fluorescência será proporcional à quantidade de DNA amplificado a cada ciclo, 
até que a reação atinja sua saturação, e um platô após a curva de crescimento 
exponencial será observado (Figura 12). Repare que, quando não está ligado ao 
DNA dupla fita, devido à sua desnaturação, o SYBR não emite fluorescência. Ao 
ligar-se à fita dupla de DNA, durante a sua extensão, a fluorescência é emitida. 
Figura 12: Esquema ilustrando a teoria por trás da 
fluorescência do SYBR. 
É importante considerarmos que essa interação entre o SYBR e a fita dupla de 
DNA não é controlada – o SYBR irá se intercalar com qualquer fita dupla de 
DNA. Isso faz com que a emissão de fluorescência seja menos específica: como 
em uma reação convencional, apenas os oligonucleotídeos iniciadores são 
responsáveis pela especificidade. Assim, outras formas de controle da reação 
foram criadas para garantirmos que o sinal fluorescente usado na quantificação 
corresponde apenas ao produto desejado. 
Portanto, adicionamos um passo a mais a qPCR: a curva de dissociação 
(melting curve). Nessa etapa, o termociclador aquecerá a PCR lentamente, para 
medir em qual temperatura 50% das fitas duplas de DNA sintetizadas se 
dissociam. Essa dissociação será medida, mais uma vez, através da 
fluorescência pelo SYBR. Essa temperatura dependerá de dois fatores 
principais: o conteúdo CG e o tamanho da sequência. Por isso, reações de 
SYBR tem amplicons com tamanho limitado em cerca de 100 nucleotídeos em 
média. Em uma curva de dissociação boa e específica, todas as moléculas 
amplificadas irão se dissociar na mesma temperatura e, assim, só um pico é 
observado no gráfico. Em uma qPCR por SYBR sem especificidade, mais de um 
pico será visto na curva de dissociação, e a reação precisará ser ajustada. Esse 
é um importante nível de controle de qualidade da reação que não deverá ser 
ignorado. 
Note na figura a seguir, a existência de um único pico (a 76,49 °C) indica que há 
apenas um produto amplificado, o que confirma a especificidade da qPCR. 
Figura ilustrativa: Exemplo de resultado de uma curva de 
dissociação dos produtos de uma qPCR por SYBR Green. 
QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA POR SYBR 
TaqMan 
Outra forma bastante comum de qPCR é chamada de TaqMan, cujo nome vem 
da referência ao jogo de videogame dos anos 1980, PacMan. Assim como na 
técnica SYBR, a quantificação em tempo real na TaqMan ocorre através da 
emissão e detecção de fluorescência a cada ciclo de amplificação. Entretanto, a 
TaqMan difere do SYBR na forma como a emissão da fluorescência acontece. 
No TaqMan, além de todos os reagentes que uma PCR convencional possui, 
temos a presença de uma sequência extra, complementar à região interna dos 
iniciadores. Essa sequência extra é conhecida como sonda e é curta, com 
tamanho aproximadamente igual ao dos oligonucleotídeos iniciadores, e possui 
temperatura de anelamento pouco superior à deles. A sonda contém uma 
molécula fluorescente na extremidade 5’, e uma outra molécula na extremidade 
3’, que bloqueia a emissão de fluorescência. 
A existência de uma sonda que se anela à região alvo a ser amplificada não 
representa muito, se a molécula fluorescente não for liberada de seu bloqueador. 
Para isso, a enzima Taq polimerase usada na TaqMan é diferente das 
outras Taq polimerases. Ela adiciona nucleotídeos (polimerização), como as 
demais polimerases, e remove nucleotídeos (função exonuclease). 
A remoção de nucleotídeos é fundamental para a detecção da 
fluorescência, pois, quando a enzima chega ao nucleotídeo da sonda que 
contém o fluoróforo e o remove da sequência, o fluoróforo estará livre de seu 
bloqueador e poderá emitir fluorescência detectável (Figura 13). A cada novo 
ciclo da PCR, as fitas duplas serão desnaturadas, os iniciadores e a sonda 
se anelarão, e a TaqMan polimerase fará síntese do DNA. Com remoção dos 
nucleotídeos da sonda, o fluoróforo nela contida é liberado para emitir 
fluorescência proporcional a cada nova sequência-alvo sintetizada. 
Repare na ilustração que a sonda anelada entre os dois iniciadores é clivada 
pela TaqMan polimerase durante a extensão do DNA, permitindo a emissão de 
fluorescência. 
Figura 13: 
Representação esquemática da qPCR pelo método de TaqMan. 
Saiba mais 
A TaqMan apresenta uma vantagem extra para especificidade da reação: o 
anelamento da sonda é específico para a região alvo a ser amplificada. A 
especificidade dada pela sonda é tamanha que diferenças de apenas um 
nucleotídeo podem ser detectadas – essas mutações são conhecidas 
como single nucleotide polymorphism (SNP). 
Assim sendo, a TaqMan dispensa técnica complementar para avaliação da 
especificidade, como a curva de dissociação, o que a faz mais rápida do que a 
técnica de SYBR. Entretanto, as sondas tornam a reação mais cara. Outra 
vantagem que a TaqMan traz em relação ao SYBR é a capacidade de múltiplas 
detecções na mesma reação com maior precisão e confiabilidade. Veremos isso 
em mais detalhes à frente. 
Tanto a técnica de SYBR quanto a TaqMan são capazes de quantificar o DNA 
ou cDNA. A técnica como a quantificação é obtida varia, mas a maioria das 
análises posteriores podem ser usadas igualmente – uma vez que resultados 
confiáveis tenham sido obtidos através de rigoroso controle de qualidade. 
Quantificação 
Na qPCR, cada ciclo desnaturação-anelamento-extensão produzirá 
fluorescência, que será detectada pelo aparelho. 
Primeiro, deve-se ajustar o programa do aparelho para que ele saiba qual laser e 
quais filtros usarpara a excitação de cada fluoróforo e em qual espectro da 
emissão ele deverá buscar o sinal para detecção. Em outras palavras, você é o 
responsável em dizer ao aparelho o que ele deve fazer. 
 
Em seguida, o aparelho determinará, nos ciclos iniciais de amplificação, qual é o 
nível em que o sinal obtido é superior ao sinal de ruído. Como a qPCR utiliza 
fluoróforos para a quantificação, por vezes existe um “vazamento” de 
fluorescência no início da reação que não está relacionada com a amplificação 
da sequência-alvo em si. Esse sinal inespecífico, geralmente, obtido nos 
primeiros ciclos, chamamos de sinal de ruído, ou background, em inglês. O 
ruído vai ser utilizado para determinar o limiar de detecção. 
 
O primeiro ciclo em que a fluorescência de uma determinada amostra ultrapassa 
o limiar de detecção acima do ruído é chamado de valor de Ct. Esse valor é 
importante por estar diretamente relacionado à quantidade inicial de DNA-alvo 
da amostra amplificada. A relação entre concentração inicial de DNA-alvo na 
amostra e Ct é inversamente proporcional, o que significa que, quanto menor 
for o Ct de uma amostra, maior a quantidade de DNA que ela originalmente 
continha. 
 
Outros dois parâmetros usados pelo aparelho para ajustar a reação 
internamente são a ROX, um fluoróforo passivo usado como referência, e o 
Rn, que representa um ajuste entre o sinal do fluoróforo de escolha (SYBR ou da 
sonda TaqMan) e a referência ROX. A maioria dos reagentes para qPCR já 
possuem ROX adicionados ao tampão, cabendo a nós apenas a observação 
para eventual detecção de anomalias que podem invalidar a reação. Mais uma 
vez, a qPCR tem que manter padrões rígidos de controle de qualidade para que 
diferenças mínimas na quantidade sejam confiáveis. 
 
Com todos esses fatores ajustados corretamente, os aparelhos mais modernos 
detectarão o sinal emitido a cada ciclo e darão, em tempo real, o resultado na 
tela do computador ao qual ele precisa estar ligado para funcionar, em um 
gráfico chamado de curva de amplificação. 
Veja o exemplo de gráfico de amplificação para o gene Suc2 da Saccharomyces 
cerevisae. Note a reta paralela ao eixo x (horizontal), que representa o valor de 
limiar de detecção / quantificação. Abaixo dela, temos o ruído da reação. As 
curvas amarelas e vermelhas representam a quantificação das amostras e, como 
você pode observar, existem 4 amostras em duplicata; a com maior quantidade 
de DNA é a mais à esquerda no gráfico, com menor Ct. 
Você consegue dizer qual é o Ct da amostra mais 
concentrada? 
Figura 14: Gráfico de amplificação. 
Existem duas formas de se quantificar o produto amplificado: 
Pela curva padrão 
Em muitos casos, a quantificação absoluta do DNA alvo na amostra é 
necessária. Para isso, devemos ter em mãos uma curva padrão, com 
concentrações conhecidas do DNA alvo. Essa curva pode ser comprada de 
laboratórios especializados em sua fabricação ou produzida por nós mesmos, 
através de clonagens e purificação. A partir da concentração mais alta, faremos 
uma diluição seriada. Para isso, colocamos uma fração da solução de maior 
concentração em um tubo contendo apenas água, e depois deste tubo para 
outro com apenas água, e assim sucessivamente até termos pelo menos 5 
pontos de curva. 
Diluição 
seriada usando a escala em mililitro (mL) para a nossa metodologia é utilizado em microlitro (µL). 
Em seguida, informamos ao aparelho em quais posições cada concentração da 
curva está, de forma que o próprio computador calcule os parâmetros de 
qualidade da curva. Com esses valores, o computador calcula a quantidade de 
DNA existente nas nossas amostras de concentração desconhecida. Alguns dos 
principais valores dados pela curva padrão que usamos para determinar a 
concentração da amostra-teste são a linearidade da curva e a eficiência de 
amplificação. 
Repare na imagem a seguir que existem 5 quantidades diferentes da curva 
padrão (em vermelho), obtidas pela diluição seriada, e três amostras 
desconhecidas (em azul) cuja quantidade de DNA foi calculada a partir de seus 
Cts e com base na linearidade da curva padrão. 
Exemplo de 
curva padrão para quantificação absoluta do DNA. 
Linearidade da curva 
Matematicamente conhecida como R2,, deve ser superior a 0.985 para que a 
reação seja aceitável, e a quantificação de sua amostra-teste seja calculada com 
máximo de precisão. Usando fórmulas de linearidade, calculamos o valor preciso 
de DNA-alvo na amostra antes da amplificação começar, baseado no Ct de cada 
uma. 
Eficiência de amplificação 
Com ela, a cada ciclo, espera-se que a quantidade de DNA-alvo amplificado 
dobre, o que significaria uma eficiência de 100% da reação. Porém, devido a 
pequenos erros, podemos considerar aceitáveis eficiências que variem entre 90 
e 110%. Esses parâmetros serão mais robustos com uso de replicatas. 
Por quantificação relativa, ou método de delta-delta-CT (ou 
ΔΔCt) 
Nesse método, você precisará quantificar dois DNA-alvos diferentes: o DNA de 
interesse, cuja quantidade é desconhecida na amostra, e o DNA de referência. 
A determinação da quantidade de um DNA-alvo de interesse é feita a partir da 
subtração (ou seja, o delta) do Ct (ciclo em que a amostra ultrapassou o limiar) 
pelo Ct do outro DNA quantificado na amostra, o de referência. Isso porque, a 
quantidade do gene de interesse pode variar de acordo com diversos fatores 
biológicos, mas também pode ser devido à quantidade de material usado na 
extração. 
Nesse caso, o ideal é fazer uma normalização pela quantidade de cDNA total e, 
para isso, usamos um cDNA de referência, que, geralmente, é um gene 
constitutivo expresso em níveis estáveis nas células. O segundo delta, ou a 
segunda subtração, é feita entre a diferença da primeira subtração na amostra-
teste e uma amostra controle, usada como calibradora. A amostra calibradora 
também precisará ter passado pela primeira subtração; ou seja, também terá 
sido normalizada. Dessa forma, temos: 
êΔCt = Ctgene alvo – Ctgene de referência 
Seguido por 
êêΔΔCt = (Ctgene alvo – Ctgene de referência)calibrador – (Ctge
ne alvo – Ctgene de referência)amostra 
Essas subtrações são possíveis apenas quando as curvas de quantificação dos 
dois DNAs-alvo têm eficiência entre 90-110%, e não devem diferir em mais de 
10% entre si. Por isso, curvas padrão iniciais para cada gene devem ser 
construídas para se verificar as eficiências da reação, antes de procedermos 
para a técnica de quantificação relativa. 
Se quisermos comparar a expressão de dois genes entre uma amostra e um 
calibrador, usamos um método especial. Você consegue identificar qual? A pista 
mais importante é: você está investigando a expressão gênica, e não a 
existência do gene em si. Portanto, você não está olhando diretamente o 
genoma, mas um produto dele. Qual produto do DNA podemos detectar via 
PCR? 
Resposta 
Se você respondeu RNA, acertou! Nesse caso, o nome correto e completo da 
técnica utilizada é RT-qPCR: uma reação de transcrição reversa acoplada a uma 
reação em cadeia da polimerase quantitativa. 
PCR em multiplex 
Até agora, falamos sobre detectar apenas um DNA-alvo por reação, seja de PCR 
convencional, nested-PCR, RT-PCR ou qPCR. Contudo, podemos detectar mais 
de um alvo por reação. Precisaremos ajustar as reações separadamente, 
utilizando pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos para cada produto 
desejado, e depois fundir as duas PCRs em uma. Esse tipo de PCR em que 
mais de um produto alvo é identificado chamamos de multiplex – múltiplos 
produtos são detectados, e até quantificados. 
Em uma PCR convencional, vamos utilizar todos os reagentes que já 
conversamos e, é claro, os quatro (ou mais) oligonucleotídeos necessários, 
sendo cada par correspondente à sua sequência-alvo. O mais importante para 
fazermos um multiplex em uma PCR convencional é que os amplicons tenham 
tamanhos distintos o suficiente para serem separados pelo gel de agarose 
para que os sinais de ultravioleta não sejam confundidos. Normalmente, os 
produtosmenores de 1000 pares de base (pb) devem ter mais de 200 pb de 
diferença. Para produtos maiores de 1000 pb, a diferença entre os produtos 
também deve ser maior. 
Atenção 
Lembre-se de que você deverá levar em consideração o tamanho do maior 
produto para o tempo de extensão. Outro fator ao qual você deverá estar atento 
é a temperatura de anelamento dos múltiplos pares de iniciadores, que devem 
ter temperaturas o mais próximas possível. 
Em uma qPCR por TaqMan, a amplificação e quantificação de diferentes 
sequências na mesma reação é possível ao utilizarmos duas (ou mais) sondas 
distintas, cada uma capaz de hibridizar especificamente a sua sequência-alvo, e 
ambas marcadas com fluoróforos que se excitem e emitam fluorescência em 
comprimentos de onda diferentes. 
Exemplo 
Você poderá usar um fluoróforo que seja excitado no comprimento de onda azul 
e emita fluorescência no espectro verde, e outro fluoróforo que seja excitado e 
floresça no comprimento vermelho, e assim por diante. 
Por outro lado, reações multiplex quantitativas usando o sistema SYBR são mais 
difíceis. Isso porque a emissão de fluorescência pelo SYBR é inespecífica e 
ocorre sempre que o fluoróforo intercala com fitas duplas do DNA. Assim, a 
reação multiplex fica limitada e, muitas vezes, não é possível distinguirmos entre 
os sinais dos diferentes produtos. Em alguns casos, entretanto, a distinção é 
possível graças à curva de dissociação. Isso ocorre quando os produtos distintos 
têm sequências diferentes o suficiente para terem temperaturas de dissociação 
de 50%. Então, observamos dois picos na curva de dissociação, em 
temperaturas diferentes. No entanto, sequências distintas sem diferença 
suficiente em seus conteúdos CG não poderão ser multiplexadas, pois não 
veremos diferenças em suas curvas de dissociação. 
VERIFICANDO O APRENDIZADO 
1. A PCR é uma técnica muito útil, especialmente, por ter variações 
que podem ser ainda mais informativas. Sobre as variações da PCR, 
assinale a alternativa correta: 
 
Na nested-PCR, fazemos duas reações em um único tubo, amplificando regiões 
diferentes que geram produtos de tamanhos distintos. 
 
O SYBR é um fluoróforo presente em PCR multiplex que dá maior estabilidade à 
reação. 
 
Na RT-PCR, ocorrem duas reações subsequentes: uma de síntese de cDNA a 
partir de RNA, e outra de amplificação da sequência-alvo presente no cDNA. 
 
Uma PCR multiplex consiste em utilizar duas reações subsequentes, sendo que 
o produto amplificado da primeira serve como molde para amplificação na 
segunda. 
 
A reação de transcrição reversa utiliza uma polimerase especial, capaz de 
sintetizar RNA a partir de DNA. 
Responder 
Comentário 
2. Vimos que podemos quantificar uma ou mais sequências de DNA-
alvo através de qPCR. Considerando o material estudado, escolha a 
alternativa correta: 
 
A quantificação do DNA ou cDNA na amostra se dá através da intensidade do 
sinal total, detectado pelo aparelho, dependendo apenas da fluorescência de 
ROX. 
 
O SYBR e um fluoróforo que se liga de forma inespecífica ao DNA dupla hélice 
e, com isso, a curva de dissociação informa qual é a quantidade de DNA para 
cada amostra. 
 
A quantificação na técnica TaqMan é proporcional à fluorescência emitida na 
remoção de nucleotídeos da sonda marcados com fluoróforos, o que permite a 
realização de reações quantitativas multiplex. 
 
A quantificação do DNA alvo pode ser feita pelo uso de curva padrão, em que as 
diferenças entre Cts de dois genes é subtraída da diferença entre amostras-teste 
e amostra de calibração. 
 
A quantificação de uma sequência em amostra-teste, de concentração 
desconhecida, é feita por ΔΔCt, a partir da linearidade da diluição seriada. 
Responder 
Comentário 
MÓDULO 3 
 
Identificar aplicações apropriadas ao uso de cada método 
APLICAÇÕES DA PCR 
Até agora, vimos os reagentes necessários à amplificação exponencial de uma 
sequência específica de DNA até termos milhões e bilhões de cópias da mesma 
exata sequência, ou amplicon, que pode ser visualizada a partir de técnicas 
especiais. Também vimos algumas variações da PCR que a tornam ainda mais 
relevante e útil em diversos contextos. 
Mas, afinal, para que precisamos de tantas sequências idênticas? Quais são as 
aplicações disso? Vamos ver um pouco sobre alguns exemplos delas para 
ilustrar melhor o quão útil a PCR é. 
A PCR e as suas variantes em ciências forenses 
A primeira, e talvez uma das mais famosas para o grande público, é a aplicação 
forense. Você já deve ter entrado em contato com a identificação de um 
criminoso a partir do seu DNA deixado na cena do crime, seja por ter assistido a 
alguma série policial seja por ter lido alguma reportagem da vida real. Isso só é 
possível porque cada ser humano possui um genoma completamente único, 
exceto de gêmeos idênticos. 
Em nosso genoma, temos regiões especiais nas quais um cientista forense pode 
olhar para confirmar a origem do DNA. Chamadas de marcadores moleculares, 
elas são conhecidas pela alta frequência de polimorfismos genéticos – regiões 
com grande variação na sequência de DNA entre indivíduos sem causar nenhum 
tipo de interferência funcional, pois são mais frequentes em regiões não 
codificantes. 
 
Atenção 
Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são 
as repetições curtas em tandem (ou STRs – short tandem repeats, em inglês). 
As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre as pessoas e oferecem 
grande precisão na identificação de indivíduos se a detecção de várias STRs for 
usada em conjunto. 
As regiões de interesse são amplificadas por PCR e, em seguida, o perfil 
genético pode ser visualizado por separação das bandas em gel de agarose e 
coloração por brometo de etídio. 
Existem casos em que é necessário aumentar o material genético a ser usado 
para, assim, aumentarmos o sinal durante a revelação. Nesse caso, o perito 
pode optar pelo uso de uma nested-PCR, lembrando que os primers externos e 
interno precisam de regiões não repetidas para se anelarem. Um cientista 
forense, além de fazer a extração do DNA e sua amplificação por PCR, fará a 
identificação de indivíduos através do seu perfil genético. 
Ilustração de um gel de agarose 
mostrando múltiplas bandas e representando os marcadores moleculares. 
A PCR e as variações usadas no diagnóstico de 
doenças genéticas 
Existe uma gama de aplicações de PCR e suas variações na Medicina, de 
prevenção ao diagnóstico, acompanhamento e prognóstico, ou evolução, de 
doenças. Ao amplificarmos certas regiões do DNA, podemos identificar a 
presença ou ausência de sequências que deveriam ou não existir em 
determinado contexto. Seu uso pode auxiliar, ou até mesmo determinar, o 
diagnóstico de diversas doenças que variam desde genéticas a infecciosas. As 
doenças genéticas podem ser muito complexas em sua apresentação e possuir 
diferentes perfis – autossômico dominante ou recessivo, ligado ao cromossomo 
X, multifatoriais e multigênicas. O uso da PCR no diagnóstico dessas doenças 
pode ser feito de diversas maneiras, dependendo de qual é a doença e de seu 
perfil genético. 
 
O PCR multiplex pode ser utilizado para verificar qual alelo está sendo expresso, 
dentre dois alelos distintos, em uma mesma reação e assim ajudar no 
reconhecimento de pequenas mutações que levariam ao desenvolvimento de 
uma doença genética. Mas temos outras aplicações, usando PCR convencional. 
Vamos usar a doença de Huntington como exemplo. Nessa doença genética 
autossômica dominante, ocorre um excesso de repetição de três nucleotídeos 
(CAG) do DNA que codifica uma proteína chamada Huntingtina. Esse excesso 
leva a uma doença neurodegenerativa sem cura que causa perdas motoras, 
cognitivas e psiquiátricas ainda na idade adulta, apesar de poder aparecer em 
forma juvenil também. A PCR torna-se uma importante ferramenta diagnóstica, 
pois, ao amplificar sequências próximas da região de repetição, pode nos dizer 
seu tamanho e, assim, informar o risco e até o prognósticoda doença em si. 
Em um gene saudável, é normal ter cerca de 20 repetições (CAG); em pessoas 
portadoras de Huntington, o número de repetições aumenta para 35 ou mais. De 
modo geral, quanto maior o número de repetições, maior o risco de 
aparecimento e de progressão da doença. Essa gradação de fenótipo – no caso 
da doença de Huntington, de sintomas – é algo conhecido em genética como 
penetrância. 
Atenção 
Lembre-se de que, para regiões repetitivas, é necessário usar iniciadores que se 
anelem próximo a STRs, mas não nas STRs em si, pois isso geraria 
inespecificidade e muitas bandas em um gel de agarose. 
A PCR e as variações usadas no diagnóstico de 
doenças infecciosas 
Outro exemplo diagnóstico que você já pode ter ouvido falar é o uso da PCR 
para diagnóstico de doenças infecciosas. Ao utilizar a técnica para amplificar 
o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso, podemos diagnosticar uma 
infecção, já que o material genético de tal agente não deveria estar presente 
naquela amostra biológica. Sua simples presença pode indicar o agente 
etiológico e, assim, descobrir a causa da doença. A PCR é especialmente útil no 
diagnóstico de organismos fastidiosos, que não crescem bem em cultivo, como 
o Mycobacterium tuberculosis, por possuir alta sensibilidade e especificidade. 
Em outros casos, a presença do material genético de um determinado 
microrganismo não é suficiente para seu diagnóstico como agente causador da 
doença, e testes complementares a PCR podem ser necessários, assim como 
técnicas de PCR mais elaboradas que darão maiores informações. 
 
Temos, como exemplo, o diagnóstico molecular de COVID-19. O SARS-CoV2, 
assim como os demais coronavírus, tem RNA fita simples como material 
genético. Dessa forma, usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um 
cDNA viral, e o utilizamos em qPCR – ou seja, fazemos uma RT-qPCR. Esse é 
considerado o melhor teste, ou padrão-ouro, para a identificação de casos ativos 
de infecção pelo SARS-CoV2. Isso porque, o material genético viral é 
identificado de forma relativamente rápida – entre coleta, extração, RT e qPCR, 
o resultado pode sair em algumas horas. Além disso, esse método é muito 
sensível e específico, conseguindo detectar nas amostras pequenas 
concentrações do vírus (carga viral). 
 
A RT-qPCR também é utilizada no diagnóstico e acompanhamento de outras 
infecções virais. A efetividade do tratamento para HIV pode ser monitorada 
através de RT-qPCR, sendo esperadas reduções drásticas na carga viral após 
introdução da terapia. O mesmo princípio de quantificação de cDNA obtido por 
transcrição reversa também é aplicado em tratamentos oncológicos, 
especialmente, em leucemias e linfomas: o oncologista pode requerer uma 
RT-qPCR para acompanhamento de determinado marcador gênico do 
câncer em questão. Nos dois casos, a redução (ou não) das sequências alvo 
na RT-qPCR ao longo do tempo podem ser cruciais no tratamento e evolução do 
paciente. A PCR convencional multiplex também pode ser utilizada no 
diagnóstico diferencial entre dois patógenos que possam causar os mesmos 
sintomas, mas que exigem abordagens clínicas diferentes. 
Exemplo 
Um paciente transplantado renal pode apresentar alteração em exames 
bioquímicos que levem o nefrologista a pensar em duas possibilidades: na 
primeira, uma infecção por um vírus sem gravidade pode estar acontecendo no 
órgão, e nenhum tratamento seria necessário; na segunda, pode estar 
acontecendo uma infecção viral grave no rim transplantado que poderia 
rapidamente levar à perda do órgão e até mesmo ao óbito do paciente. 
Nesse último caso, seria necessário reduzir as drogas que suprimem o sistema 
imunológico e impedem que o paciente rejeite o rim novo, para que o próprio 
sistema imunológico consiga combater a infecção viral – o que leva ao risco de o 
paciente rejeitar o órgão enxertado. Uma PCR multiplex poderia identificar a 
presença ou ausência de dois ou mais tipos de genomas virais na urina ou 
sangue do paciente, acelerando o diagnóstico e a tomada de decisão por parte 
do médico nefrologista. 
A PCR e as suas variantes em pesquisa científica 
Outro campo que utiliza a PCR é a pesquisa científica. Em diversas ocasiões, a 
PCR pode ser utilizada para manipulação genética de organismos simples, como 
bactérias, leveduras e células em cultivo. Nesse contexto, podemos usar a PCR 
para, por exemplo, clonarmos um gene. Fazemos isso ao amplificarmos a 
sequência gênica que desejamos clonar usando oligonucleotídeos longos que 
têm duas regiões distintas. A primeira região liga-se ao gene que queremos 
manipular – deletar, adicionar ou mutar – no organismo alvo; a segunda é a 
região que se liga ao DNA molde do vetor dentro do qual queremos colocar 
nosso gene clonado. 
O vetor é, em muitos casos, uma sequência independente do genoma do 
organismo alvo, mas que é capaz de se replicar autonomamente quando 
inserido na célula. Um exemplo de vetores muito usados são os plasmídeos, 
pequenos DNA circulares autorreplicantes e transferíveis de uma célula a outra, 
comuns em bactérias. 
Figura 14: Representação esquemática de uma 
técnica de clonagem por restrição, com a inserção (ou clonagem) de um gene de origem diferente, que foi 
amplificado por PCR, ao vetor original. 
Normalmente, usamos a clonagem por PCR em duas etapas: uma para 
amplificarmos o gene alvo que queremos clonar; na segunda etapa, usamos o 
produto amplificado, juntamente com o vetor, para inserirmos o gene clonado no 
vetor. Outra forma de clonagem inclui o uso de enzimas de restrição para cortar 
o DNA em pontos específicos, após amplificação por PCR. 
Saiba mais 
A pesquisa científica é uma área de atuação muito grande e, por vezes, ela está 
interessada em entender mecanismos complexos de regulação genética sob 
diversas condições. A RT-qPCR é uma ferramenta muito útil nesse caso, para 
a avaliação dos níveis de expressão de genes em células submetidas a 
diversas condições diferentes. 
É comum utilizarmos a quantificação relativa (em que comparamos a quantidade 
de um gene de interesse com um gene constitutivo de expressão estável) para 
avaliarmos como o metabolismo celular pode mudar mediante o meio que se 
encontra. Em geral, você pode considerar que qualquer aplicação que 
determinado método ou técnica tenha em rotinas laboratoriais das mais diversas 
áreas não apenas é usada em pesquisa científica, como, provavelmente, foi 
originada de uma. 
QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE GENES POR 
RT-qPCR E SEU USO EM PESQUISA 
VERIFICANDO O APRENDIZADO 
1. A respeito da aplicação da PCR e de suas variações em ciências 
forenses, é correto afirmar que: 
 
A nested-PCR não é útil, uma vez que o material genético é encontrado em 
abundância em situações forenses. 
 
A PCR pode nos dar informações importantes, mas não pode determinar a 
identidade de indivíduos. 
 
As STRs são regiões cuja variabilidade as tornam úteis para distinguir indivíduos 
geneticamente. 
 
A qPCR é uma ferramenta necessária para amplificação do material genético de 
uma amostra antes de seu sequenciamento. 
 
O sequenciamento do genoma não é uma ferramenta viável para a identificação 
de indivíduos, além de ser trabalhoso e caro. 
Responder 
Comentário 
2. Escolha a alternativa incorreta: 
 
A RT-qPCR é a técnica considerada ideal para diagnóstico do SARS-CoV2. 
 
Podemos usar PCR convencional para amplificar um gene e cloná-lo em um 
vetor, e modificarmos geneticamente um organismo simples. 
 
Pelo uso de diferentes sondas marcadas com sinais diferentes, a qPCR-TaqMan 
pode ser usada na identificação e quantificação de mutações em diferentes 
alelos. 
 
As técnicas moleculares são de pouca importância na rotina clínica, pois são 
demoradas e de aplicações muito restritas. 
 
O tamanho de STRs é relevante no diagnóstico de doenças genéticas, pois as 
STRs sempre estão localizadas em regiões não-codificantes. 
Responder 
Comentário 
CONCLUSÃO 
CONSIDERAÇÕES FINAIS 
Vimos que a amplificação de DNA in vitro é feita pela reaçãoem cadeia da 
polimerase, em que a variação cíclica de temperatura permite a desnaturação, o 
anelamento e a extensão de sequências-alvo específicas, de acordo com 
aquelas que desejamos detectar. Como estudado, os oligonucleotídeos 
iniciadores se ligam à fita simples de DNA que foi aberta por desnaturação por 
complementariedade entre as bases nitrogenadas. Essas últimas são elementos 
fundamentais dos nucleotídeos por conterem a informação genética. 
As variações da PCR são úteis de diferentes formas, e devemos conhecê-las 
para podermos escolher qual a melhor técnica para cada caso: para aumentar a 
quantidade final de DNA-alvo amplificado, para síntese de cDNA a partir de RNA 
polaridade positiva, para quantificação de DNA ou cDNA e para diferenciação 
rápida entre diferentes produtos de amplificação. 
Além disso, aprendemos algumas das diversas aplicações que a PCR e as suas 
variações têm em áreas da ciência, como na forense, na pesquisa e na clínica, 
participando do diagnóstico, acompanhamento e prognóstico. 
Agora você está pronto para continuar progredindo no conhecimento da Biologia 
Molecular, uma área empolgante e que se torna, a cada dia, mais importante 
para diversas áreas das ciências biológicas. 
PODCAST 
0:00 
11:29 
REFERÊNCIAS 
ASSOCIAÇÃO BRASIL HUNTINGTON. O que é a Doença de Huntington. In: 
ABH. Consultado em meio eletrônico em: 18 out. 2020. 
CABELLO, G. M. K. Genética Clínica: Métodos de diagnóstico. In: DBBM 
FIOCRUZ. Consultado em meio eletrônico em: 18 out. 2020. 
DOLINSKY, L. C.; PEREIRA, L. M. C. V. DNA forense: Artigo de revisão. In: 
Saúde & Ambiente em Revista, 2(2), p11-22, 2007. 
NELSON, D. L. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 
2014. 
NEW ENGLAND BIOLABS’ FEATURE ARTICLES. Polymerase Fidelity: What 
is it, and what does it mean for your PCR? In: NEB. Consultado em meio 
eletrônico em: 18 out. 2020. 
REAL-TIME PCR BASICS. TaqMan vs. SYBR Chemistry for Real-Time 
PCR. In: ThermoFisher Scientific website. Consultado em meio eletrônico em: 18 
out. 2020. 
VANDESOMPELE, J. Q. PCR Guide por Eurogentec – plataforma GenEx. In: 
Gene Quantification. Consultado em meio eletrônico em: 18 out. 2020. 
ZHAO, M.; et al. Improved high sensitivity screen for Huntington disease 
using a one-step tripletprimed PCR and melting curve assay. In: PLoS ONE. 
Consultado em meio eletrônico em: 18 out. 2020. 
 
EXPLORE+ 
Para aprofundar os seus conhecimentos no assunto deste tema: 
 Acesse o conteúdo de Biologia (DNA como o material genético: Replicação 
do DNA) no portal da Khan Academy para maiores detalhes e vídeos sobre 
replicação do DNA. 
 Assista ao vídeo “4. Teste de Paternidade”, no canal do Youtube de Carlos 
Simeão, material produzido pela USP-UNIVEST. Você aprenderá mais sobre 
a variabilidade genética estudada em análises forenses e em testes de 
paternidade. 
 Assista ao vídeo “Técnicas de Biologia Molecular – PCR- Animação 3D”, no 
canal do Youtube de Carlos Simeão, material produzido pela USP-UNIVEST. 
Você irá conhecer o passo a passo da técnica de PCR. 
 Aprendemos a tão famosa técnica de PCR, para conhecer mais sobre a 
história do PCR leia o texto O desenvolvimento da reação em cadeia pela 
polimerase (PCR). 
 Conhecemos algumas técnicas de PCR, para apreender um pouco mais 
sobre esse assunto leia Outras aplicações da PCR e as suas variações. 
 
CONTEUDISTA 
Camila Freze Baez 
Currículo Lattes 
Ao clicar nesse botão, uma nova aba se abrirá com o material preparado para impressão. Nela, 
acesse o menu do seu navegador e clique em imprimir ou se preferir, utilize o atalho Ctrl + P. 
Nessa nova janela, na opção destino, direcione o arquivo para sua impressora ou escolha a 
opção: Salvar como PDF. 
 
 
 
 
 
 
 
Farmacogenética 
 
 
 
 MÓDULO 0 
 MÓDULO 1 
 CONCLUSÃO 
DESCRIÇÃO 
Apresentação da farmacogenética como a ciência das respostas distintas a 
fármacos e suas implicações e aplicações clínicas. 
PROPÓSITO 
Conhecer as bases da genética aplicadas à farmacologia e reconhecer o 
impacto de sua aplicação em distúrbios genéticos da cinética e na ação dos 
fármacos, como bagagem fundamental para os profissionais atuantes, direta ou 
indiretamente, na elaboração de novos fármacos e nos estudos de aplicações da 
medicina moderna e personalizada. 
OBJETIVOS 
Módulo 1 
Identificar os principais eventos genéticos e as implicações éticas da 
farmacogenética 
Módulo 2 
Reconhecer as principais relações genes-fármacos em farmacogenética 
INTRODUÇÃO 
A humanidade é composta por bilhões de indivíduos, cada um de nós diferente 
dos demais. Nossas características culturais, sociais, afetivas e físicas nos dão a 
ideia de indivíduos e, ao mesmo tempo, de coletividade. 
Uma das principais fontes das diferenças entre nós está profundamente 
conectada ao nosso organismo: a informação genética. Literalmente, cada 
pessoa se difere da outra em nível genético, com a exceção de gêmeos 
idênticos (sendo talvez a única). 
Sociedades e culturas sempre se desenvolveram por meio das trocas comerciais 
e genéticas, o que causou nossa variabilidade genética e permitiu nossa 
evolução. Cada indivíduo possui, dessa forma, uma miríade de genes que 
podem ser muito semelhantes ou distintos do seu vizinho, e isso pode afetar 
diretamente como a saúde de cada um funciona e nossas respostas a diferentes 
medicamentos. 
A seguir, exploraremos como o ramo que estuda a relação entre a genética e a 
farmacologia surgiu, suas ideias e técnicas principais, e suas aplicações clínicas 
e científicas. 
MÓDULO 1 
 
Identificar os principais eventos genéticos e as implicações éticas da 
farmacogenética 
HISTÓRIA DA FARMACOGENÉTICA E 
CONCEITOS BÁSICOS 
A farmacogenética é uma ciência recente que busca explicar variações na 
resposta a medicamentos e drogas de caráter hereditário e populacional. 
O entendimento de que indivíduos diferentes podem apresentar respostas 
variáveis ao mesmo medicamento, por outro lado, não é novo. Remonta à Grécia 
Antiga e seus filósofos, precursores de muitos conceitos-chave que temos hoje 
na filosofia e medicina ocidentais. 
Saiba mais 
Na época, já se reconhecia que a ingestão de determinados alimentos, como o 
feijão-fava, poderia causar o adoecimento e ser potencialmente fatal para 
algumas pessoas, enquanto para outras não apresentava qualquer problema 
após a ingestão. 
Por milênios, a exata causa de certas pessoas reagirem diferentemente a 
determinados compostos químicos permaneceu oculta. Foi apenas no início do 
século passado que começamos a desvendar a explicação para tal fenômeno, 
com a redescoberta dos trabalhos de Gregor Mendel (século XIX) sobre a 
herança genética. 
Gregor Mendel. 
Mendel observou que fatores hereditários eram transmitidos às gerações futuras 
por meio dos gametas (células reprodutivas maduras) e postulou três leis 
principais: 
Clique nas barras para ver as informações. 
LEI DA DOMINÂNCIA 
Explica o porquê de certa característica física predominar sobre outra, após 
cruzamento de dois indivíduos com características discordantes ou após 
cruzamento de indivíduos com característica dominante, porém híbridos 
geneticamente (também chamados de heterozigotos). A característica que se 
manifesta mais frequentemente é chamada de dominante, e a que se manifesta 
menos frequentemente é chamada de recessiva. 
LEI DA SEGREGAÇÃO 
Definida pela existência de pares de informações hereditárias (ou alelos) para 
cada característica, que são separadas durante a produção de gametas, de 
forma que cada gameta apresente apenas uma cópia de informação para cada 
característica. 
LEI DA SEGREGAÇÃO INDEPENDENTE 
Explica que cada par de alelos é segregado de forma independente de outros 
alelos, tornando os fenótipos independentes. 
Herança Mendeliana. 
Seus achados foram tão fundamentais para o campo, que Mendel é considerado 
o pai da genética. 
Após a redescoberta dos trabalhos de Mendel, no início do século XX, foram 
criados os termos: 
Clique nas informaçõesa seguir. 
Gene 
Genótipo 
Fenótipo 
Genética 
Posteriormente, características hereditárias mais complexas, como a existência 
de níveis de dominância e penetração, fenótipos determinados por múltiplos 
alelos, além da existência de regulações genéticas em diversos níveis, entre 
muitos outros tópicos de estudo, enriqueceram nossa compreensão da genética. 
Por outro lado, a ideia de que fármacos e outros compostos químicos têm efeitos 
distintos entre indivíduos de acordo com sua herança genética começou a ser 
formulada. 
Em 1931, o médico britânico Archibald Garrod postulou a “química individual”, 
conceito sobre o qual escreveu em seu livro Os Erros Inatos do Metabolismo 
(The Inborn Errors of Metabolism, em tradução livre). Em sua obra, ele elabora a 
ideia de que todas as doenças são fruto de erros em alguma etapa dos 
processos químicos do corpo, hipótese derivada de seus estudos de 
hereditariedade dos processos bioquímicos. Essa seria a explicação para a 
observação de que “uma dose que é inócua para a maioria das pessoas, pode 
apresentar efeitos tóxicos em alguns indivíduos, enquanto outros demonstram 
tolerância excepcional à mesma droga’”. 
 
Após a publicação do livro de Garrod, outros dados começaram a dar forma e 
vislumbrar como a genética está ligada às doenças e às diferentes reações a 
drogas. Larry Snyder foi um dos primeiros a associar uma reação adversa a um 
composto orgânico com uma condição genética: algumas pessoas 
apresentavam inabilidade de sentir o gosto amargo de feniltiocarbamida 
(phenylthiocarbamide — PTC) em padrão autossômico recessivo. 
 
Em 1937, foi descrita a indução farmacológica de porfiria (uma doença de 
manifestação cutânea), que hoje sabemos que pode ser induzida por vários 
medicamentos. Durante a Segunda Guerra Mundial, foi visto que a primaquina, 
um antimalárico, era capaz de induzir doença hemolítica de soldados 
americanos afrodescendentes. Anos depois, a hemólise desencadeada pela 
primaquina foi elucidada como uma alteração metabólica das hemácias devido à 
deficiência de uma enzima (glicose-6-fosfato desidrogenase — G6FD) que 
protege as hemácias contra danos oxidativos e destruição prematura. 
A farmacogenética começou a se tornar uma ciência independente e a ganhar 
foco na década de 1950, quando várias observações sobre a interação entre 
drogas e alterações genéticas foram feitas. 
Exemplo 
Por exemplo, em 1953, cientistas observaram que a isoniazida, um antibiótico 
usado no tratamento da tuberculose, poderia sofrer metabolização por acetilação 
(e inativação) de forma mais rápida ou lenta em diferentes pacientes, alterando a 
efetividade da terapia. Muitos outros relatos de reações distintas a fármacos 
foram feitos, de diferentes velocidades de metabolização a reações fatais a 
anestésicos. 
Na mesma época, houve uma revolução no conhecimento da genética, com as 
descobertas de que a hereditariedade dos organismos está contida no DNA 
(ácido desoxirribonucleico), sua estrutura e como a informação nele contida 
(genótipo) se converte — ou se traduz — em uma função ou estrutura 
responsável pelo fenótipo. 
Fita de DNA em frasco de medicamento. 
No final da década de 1950, o médico russo Arno Motulsky refinou o conceito de 
que fatores genéticos que controlam as enzimas estariam por trás da 
variabilidade de respostas aos fármacos. Seu trabalho em genética humana e 
médica levou à sua indicação pelo Conselho sobre Drogas da Associação 
Médica Americana para resumir os dados da época sobre genética e fármacos. 
Ele foi o primeiro a formular o entendimento de que variações genéticas devem 
levar à seleção de drogas de acordo com as necessidades pessoais, conceito 
base para o desenvolvimento da medicina personalizada (MP). O termo 
farmacogenética foi cunhado por ele e por Friedrich Vogel, com quem escreveu 
o livro Genética Humana: Problemas e Abordagens (Human Genetics: Problems 
and Approaches). 
Um dos marcos históricos foi a identificação de alterações no metabolismo da 
debrisoquina (um anti-hipertensivo) e da esparteína (um “cardiotônico” e 
antiarrítmico), a característica genética associada a essas alterações e, 
principalmente, do gene que a causava: o da enzima citocromo P450 família 2 
(cytochrome P450, ou CYP), subfamília D, polipeptídeo 6 (ou apenas CYP2D6), 
entre a década de 1970 e 1980. Posteriormente, ficaria provado que o CYP2D6 
estaria envolvido no metabolismo de mais de 60 fármacos. 
Outro grande marco foi atingido nessa época, com os estudos populacionais. 
Pesquisadores demonstraram que uma parte de indivíduos pertencentes a 
determinado grupo étnico poderia ter maior ou menor sensibilidade, diferentes 
taxas de metabolização e distintas reações a fármacos. Tomando como exemplo 
o estudo que viu doença hemolítica em afro-americanos após uso de 
antimalárico, outros estudos surgiram mostrando que populações do leste 
asiático apresentam metabolismo alterado de barbitúricos, e que populações de 
origens africanas e chinesas diferem das de origem europeia na velocidade de 
metabolização de debrisoquina, dentre muitos outros. 
 
Como podemos ver, as primeiras relações entre fármacos e genética foram 
determinadas principalmente por meio da variabilidade de parâmetros 
farmacocinéticos. Os pesquisadores olhavam respostas distintas à determinada 
droga e avaliavam as velocidades de absorção, eliminação e as concentrações 
plasmáticas do fármaco ativo de pessoas com respostas “normais”, em 
comparação com aquelas que apresentavam resposta clínica alterada. Em 
seguida, os cientistas relacionavam a observação farmacocinética com uma 
alteração metabólica determinada geneticamente que alterasse esses 
parâmetros. 
Já no final da década de 1980, pesquisadores identificaram que variações 
genéticas em proteínas-alvo de determinados fármacos poderiam reduzir sua 
eficácia, sem, contudo, alterar parâmetros farmacocinéticos. 
Um dos primeiros relatos de alterações genéticas afetando 
a farmacodinâmica (ou seja, o mecanismo de ação de um determinado 
fármaco) surgiu com a observação de que determinados indivíduos 
apresentavam resistência hereditária a certos anticoagulantes, especialmente à 
varfarina. No entanto, foi apenas no século XXI que o gene em si foi identificado. 
Outros medicamentos que possuem efeitos adversos promovidos por alteração 
genética na farmacodinâmica incluem anti-hipertensivos, anticoagulantes, 
antidepressivos e muitos outros. 
Assim, considerando os mecanismos farmacocinéticos e farmacodinâmicos de 
variação genética afetando a resposta aos fármacos, podemos classificar o uso 
da farmacogenética em três categorias: 
Predição da dosagem de fármacos de forma individual, baseada nas 
características metabólicas de cada pessoa. 
Predição de ausência completa de resposta ao medicamento. 
Predição de risco de toxicidade caso o fármaco seja usado. 
Com o passar das décadas, mais e mais evidências comprovavam que as 
diferentes respostas a medicamentos seriam decorrentes não só de alterações 
genéticas pontuais, mas sim de múltiplos fatores genéticos que interagem entre 
si, além de fatores ambientais como a nutrição e idade. 
Em 2002, foi criado um projeto ambicioso para catalogar as variações genéticas 
mais comuns. O chamado HapMap foi concluído em 2009 e gerou um banco de 
dados extenso, gratuito e de acesso livre para cientistas do mundo inteiro. 
Apesar de seu principal objetivo ter sido a identificação de variantes genéticas 
envolvidas em doenças humanas, o HapMap também é útil na predição da 
resposta farmacogenética. 
O HapMap, somado aos estudos de genômica que têm sido desenvolvidos 
desde o início do século XXI, permitiu que a farmacogenética ganhasse contorno 
mais holístico (global) com o desenvolvimento da farmacogenômica. 
E qual é a diferença entre farmacogenética e farmacogenômica? 
Por vezes, os termos farmacogenética e farmacogenômica são usados de 
forma intercambiável. 
Farmacogenética 
Remete a como um gene específico influencia a resposta a um fármaco.Farmacogenômica 
Enquanto a farmacogenômica explora como um conjunto de genes pode 
influenciar a resposta a um ou vários fármacos da mesma classe. 
A farmacogenômica trouxe novos níveis de compreensão de como fármacos e 
drogas interagem com organismos vivos complexos. As interações entre 
variantes genéticas e fatores externos têm sido objeto de estudos em um campo 
novo e particularmente promissor da Medicina, a chamada medicina 
personalizada. Mas, para entendermos com profundidade como fatores 
hereditários influenciam na resposta aos fármacos, precisamos primeiro 
conhecer alguns princípios básicos da genética molecular. 
DESCOBRINDO E ENTENDENDO A 
FARMACOGENÔMICA 
A especialista Camila Baez abordará o histórico da farmacogenômica, sua 
importância e aplicações e as perspectivas futuras. 
CONCEITOS EM GENÉTICA MOLECULAR 
Como sabemos, os seres vivos apresentam padrões de hereditariedade. Existem 
características físicas (e metabólicas) que são passadas de geração em 
geração. Para entendermos a existência de variações genéticas em nível 
molecular que afetam a farmacocinética e a farmacodinâmica, precisamos 
revisar alguns conceitos básicos de genética molecular. 
Apesar dos grandes avanços em genética feitos por Mendel e outros cientistas, o 
meio bioquímico pelo qual os fatores hereditários existiam permaneceu um 
mistério até meados do século XX, quando o ácido desoxirribonucleico foi 
identificado como o responsável pela informação genética. 
O que é DNA? 
Clique na figura abaixo. 
 
Representação da estrutura genética do DNA 
 
Os humanos possuem duas cópias da maioria dos genes presentes em 
cromossomos homólogos (ou seja, que apresentam estruturas genéticas e 
físicas muito semelhantes), e, por isso, somos chamados diploides — em 
contraste, nossos gametas têm apenas uma cópia de cada cromossomo e, por 
isso, são chamados haploides. A cópia que cada cromossomo homólogo tem de 
um determinado gene é chamada de alelo. Portanto, alelos são versões 
alternativas de sequências genéticas localizadas no mesmo lócus em 
cromossomos homólogos. Geralmente, um alelo contém uma versão — ou um 
genótipo — que predomina sobre o outro alelo, determinando, assim, o fenótipo, 
ou seja, é dominante sobre outro alelo, o recessivo. 
Ploidia e alelos. 
POLIMORFISMOS GENÉTICOS 
Um dos momentos cruciais para a variabilidade genética é a duplicação do DNA. 
Quando a célula está no momento certo para a multiplicação, o DNA é duplicado 
pela DNA polimerase em um processo conhecido por replicação e que pode ser 
dividido em três etapas: 
Representação do complexo de 
replicação do DNA em uma célula. 
Clique nas informações a seguir. 
Helicase 
Primase 
DNA polimerase 
Atenção 
De certa forma, a DNA polimerase lê o DNA fita simples e duplica sua 
informação em uma nova fita. Por vezes, no entanto, a DNA polimerase adiciona 
nucleotídeos errados à fita nascente de DNA, gerando o que chamamos 
de mutações. 
O que são mutações? 
Clique na figura abaixo. 
 
As mutações gênicas podem ser categorizadas em mutações pontuais por 
substituição de bases (com ou sem alteração na sequência de proteínas), 
inserções e deleções de pequenos trechos do genoma. Ainda, as mutações 
podem acontecer tanto em células somáticas quanto em células germinativas 
(ou gametas). 
Exemplos de tipos de mutações. 
Algumas mutações são prejudiciais às células e estão associadas a doenças 
genéticas que, de forma geral, são raras. Por outro lado, as demais mutações 
podem permanecer na composição genética das populações, alterando a 
sequência de DNA original de alelos, e constituindo uma variante. Conforme um 
alelo variante é passado através das gerações e sua proporção na população 
aumenta, passamos a ter o chamado polimorfismo genético. Por outro lado, 
chamamos de “alelo selvagem” ou “comum” o alelo polimórfico que corresponde 
à maioria populacional, e que normalmente não está envolvido com nenhum 
fenótipo farmacogenético. 
ATIVIDADE DE REFLEXÃO DISCURSIVA 
Como ocorre o polimorfismo genético? 
 
RESPOSTA 
A vasta maioria dos polimorfismos é do tipo mutações gênicas pontuais 
sinônimas (ou silenciosas, que não trocam aminoácidos nas proteínas) ou não 
sinônimas (que resultam na alteração da sequência da proteína), ambas 
conhecidas como SNPs (single nucleotide polymorphisms — polimorfismos de 
nucleotídeos simples). Atualmente, mais de 14 milhões de SNPs são 
conhecidos, o que representa mais de 0,3% de bases trocadas de um total de 3 
bilhões de pares de base presentes no genoma humano. No entanto, a maior 
parte dessas mutações não têm efeito conhecido. Em farmacogenética, estamos 
particularmente interessados em polimorfismos que alterem a sequência de 
aminoácidos de proteínas, o que pode resultar em alterações na interação com 
fármacos, porém há exemplos de SNPs que não alteram a proteína e 
influenciam na resposta das proteínas. 
SNP não-sinônimos. 
Ainda assim, mutações em regiões não codificadoras, como promotores 
e íntrons (regiões não codificadoras intercaladas no meio das regiões 
codificadoras de um gene — os éxons), também podem influenciar na 
expressão da proteína e são alvo da farmacogenética — apesar de serem 
consideravelmente mais raras e de interpretação mais difícil. 
Por serem largamente frequentes nas diversas populações humanas sem, na 
maioria das vezes, causar nenhum fenótipo prejudicial, os polimorfismos podem 
permanecer indetectáveis clinicamente até que determinada droga seja utilizada. 
Na maioria dos casos, no entanto, os polimorfismos não correspondem a 
nenhuma alteração. Pelo contrário, eles são, de certa forma, o que nos dá a 
beleza da diversidade genética. 
Junto com nossa capacidade técnica de conhecer o genoma humano em 
profundidade para estudarmos a farmacogenética e farmacogenômica de forma 
mais detalhada, vimos surgir desafios éticos importantes, como discutiremos a 
seguir. 
QUESTÕES ÉTICAS DA 
FARMACOGENÉTICA 
A descoberta dos fenômenos biológicos relacionados às interações entre o perfil 
genético de indivíduos a medicamentos específicos que hoje conhecemos como 
farmacogenética foi possível graças ao progresso científico. 
O surgimento de ferramentas para exploração em detalhes dos mecanismos de 
funcionamento das drogas (para além dos efeitos observados pelos pacientes ou 
usuários), a capacidade de identificar variações genéticas nas populações, e, é 
claro, a observação de que diferentes grupos ou indivíduos reagem de formas 
distintas a um mesmo medicamento ou droga foram fundamentais. Tais 
ferramentas têm sido continuamente melhoradas e substituídas por técnicas 
ainda mais eficazes na identificação dos eventos genéticos que possam 
contribuir para um efeito farmacológico adverso. A contínua evolução científica, 
logicamente, veio com alguns ônus, especialmente trazendo à tona questões 
éticas relevantes. 
Quais seriam essas questões éticas? 
Um dos principais pontos éticos que levam ao questionamento do uso da 
farmacogenética em rotina clínica é sua acessibilidade. 
Décadas de investimento em pesquisa e desenvolvimento de fármacos melhores 
para cada grupo genético representaram um custo que, em última instância, é 
frequentemente repassado ao paciente. 
O que vemos na prática é que os pacientes e familiares de maior renda 
conseguem acesso às terapias mais personalizadas, enquanto aqueles de 
menor renda não possuem qualquer amparo. 
 
Tal desigualdade é vista, inclusive, no nível das nações: países com Índice de 
Desenvolvimento Humano elevado apresentam muito mais oportunidades de 
terapia por farmacogenética do que os de IDH inferiores. De fato, os países de 
IDH alto também possuem número muito maior de pesquisas genéticas voltadas 
à farmacologia do que os demais. Isso em si induz a um viés: a maior parte das 
doenças investigadas pela farmacogenética são doenças prevalentes em 
países ricos, pouco se conhecendo sobre variações farmacogenéticas em 
países empobrecidos, com especial ausência de estudos em minorias 
étnicas.No mapa-múndi podemos observar as diferenças entre os IDH ao redor do 
mundo. 
IDH ao 
redor do mundo. 
Contudo, é entendido pela Organização Mundial da Saúde que o acesso à saúde 
e sua promoção sejam universais. Esse assunto leva a alguns questionamentos: 
Como podemos garantir que pessoas localizadas em países com IDH desiguais 
tenham o mesmo acesso a terapias personalizadas e de alta performance, como 
a farmacogenética e farmacogenômica prometem? 
Como dizer que buscamos a igualdade na medicina se nem ao menos 
investimos o mesmo tempo e dinheiro em investigar doenças genéticas e 
farmacogenéticas que acometem apenas populações empobrecidas — e, é 
lógico, oferecer-lhes a mesma dedicação no desenvolvimento de medicamentos 
eficazes? 
Como podemos resolver essa desigualdade tão grave, quando não conseguimos 
nem garantir que pacientes oriundos do mesmo país de altíssimo IDH tenham o 
mesmo direito e acesso à farmacogenética independentemente de sua condição 
financeira? 
Infelizmente, não há resposta clara e objetiva para solução dessas questões, 
uma vez que a farmacogenética em si exige uma gama de recursos altamente 
especializados, como exames de diagnóstico, clínicas e hospitais para aplicação 
e acompanhamento de terapias mais complexas, institutos de pesquisa para 
conhecimento das doenças e desenvolvimento de medicamentos, e pessoal 
médico e de saúde altamente treinados. 
Mesmo que consideremos aquele seleto grupo que tem acesso à 
farmacogenética, outras questões fundamentais surgem quando pensamos no 
conteúdo da informação que clínicas e institutos têm a respeito da genética de 
uma grande população: o que eles podem fazer com tamanha informação? 
 
Mesmo em países de alto IDH, questionamentos quanto à confidencialidade e 
privacidade da informação genética dos usuários e pacientes têm sido 
levantados. Uma das principais preocupações quanto à informação genética é a 
de quebra da confidencialidade e privacidade por empresas de seguro ou planos 
de saúde, empregadores e outras instituições e indivíduos que possam levar à 
discriminação contra alguém que possua uma condição genética. 
Exemplo 
Planos e seguros de saúde podem aumentar os valores de mensalidade e 
coparticipação de exames e terapias, ou até mesmo se recusarem a oferecer 
cobertura e serviços a pacientes baseados em perfis genéticos mais 
“dispendiosos”. 
Seria um futuro perturbador se não fizesse parte do passado: na década de 
1970, populações afro-americanas em alguns estados dos EUA foram 
compelidas a fazerem triagens para doenças genéticas e posteriormente 
discriminadas por empregadores e seguradoras de saúde caso apresentassem 
doença ou fossem portadoras do gene para a doença. 
Foi apenas em 2008, após diretrizes internacionais terem sido estabelecidas, 
que o congresso americano aprovou a lei-ato de não discriminação quanto à 
informação genética (Genetic Information Nondiscrimination Act — GINA). O 
objetivo do ato é coibir os estados de requererem testagens genéticas, proibir os 
seguros de saúde de cometerem discriminação genética (como critério de 
elegibilidade para o seguro ou para determinação do preço do prêmio), e 
protegendo funcionários contra exigências de empregadores (como 
requerimento de testes genéticos) ou de usar informações genéticas em 
tomadas de decisão (contratações, demissões e promoções). 
Os esforços internacionais contra a discriminação genética, entretanto, haviam 
começado cerca de uma década antes da GINA ser aprovada nos EUA. Com o 
progresso no conhecimento da genética de diversas populações humanas obtido 
pelo Projeto Genoma Humano, e a produção de quantidades gigantescas de 
dados genéticos, discussões internacionais foram iniciadas para disposição de 
mecanismos que impedissem a discriminação genética. Na virada do milênio, a 
Organização das Nações Unidas para a Educação, Ciência e Cultura (UNESCO) 
aprovou a Declaração Universal sobre o Genoma Humano e os Direitos 
Humanos (1997), complementada pela Declaração Internacional sobre os 
Dados Genéticos Humanos (2004). 
A redução de um indivíduo à sua condição genética, seja ela considerada 
favorável ou desfavorável em qualquer ângulo, é eticamente reprovável e 
cientificamente errada. Ainda mais que, atualmente, é reconhecido que a maioria 
das doenças genéticas têm influência multifatorial em diferentes níveis. 
Resumindo 
Em outras palavras, a mera presença de um determinado genótipo associado a 
uma condição considerada hereditária nem sempre é determinante para que ela 
ocorra, pois outros vários fatores podem influenciar sua ocorrência. Reduzir 
indivíduos à sua informação genética pode não só acentuar racismo e 
preconceitos que precisam ser removidos das sociedades, como gerar outras 
marginalizações. 
VERIFICANDO O APRENDIZADO 
1. Gregor Mendel é considerado o pai da genética, porém, apenas décadas 
após a publicação de seus trabalhos, desvendamos como a herança genética 
é codificada. Sobre variabilidade genética, é correto afirmar que: 
 
Erros da helicase ao abrir a forquilha de replicação são a principal fonte de 
mutações, uma vez que há incorporação de nucleotídeos fora da ordem original. 
 
Polimorfismos são alterações genéticas graves, frequentemente manifestadas 
como doenças genéticas e incompatibilidade com a vida. 
 
A incorporação errada de nucleotídeos pontuais pela DNA polimerase é a 
principal fonte de mutações e, consequentemente, de polimorfismos do tipo 
SNP. 
 
A incorporação errada de nucleotídeos pontuais pela primase é a principal fonte 
de mutações e, consequentemente, de polimorfismos do tipo SNP. 
 
Mutações são extremamente comuns no genoma humano e normalmente são 
benéficas à saúde humana. 
Responder 
Comentário 
2. Leia o fragmento retirado do 6º Artigo da Declaração Internacional sobre 
os Dados Genéticos Humanos (UNESCO): 
“(a) Do ponto de vista ético, é imperativo que os dados 
genéticos humanos e os dados proteômicos humanos 
sejam recolhidos, tratados, utilizados e conservados com 
base em procedimentos transparentes e eticamente 
aceitáveis. (...)” 
Com base em nossos estudos, é considerado ético: 
 
Usar informações genéticas para cálculo do valor de seguros ou planos de 
saúde. 
 
Garantir a contratação de um potencial funcionário baseado em dados 
genômicos. 
 
Garantir que candidatos a emprego ou a seguros ou planos de saúde façam 
exames genéticos. 
 
Garantir que estudos e dados genéticos estejam disponíveis para as diferentes 
populações. 
 
Permitir a divulgação de informações genéticas individuais e coletivas, contanto 
que sejam negociadas financeiramente. 
Responder 
Comentário 
MÓDULO 2 
 
Reconhecer as principais relações genes-fármacos em farmacogenética 
Com as evidências acumuladas de que polimorfismos genéticos frequentemente 
afetam a resposta a fármacos em diferentes populações, a farmacogenética e 
farmacogenômica vêm crescendo em conhecimento e atenção. Respostas 
inadequadas a medicamentos levaram a graves distúrbios e à morte de 
pacientes no passado, o que seria completamente inaceitável nos dias de 
hoje, com as ferramentas e o conhecimento disponíveis. 
Atenção 
Ainda assim, estimam-se milhares de mortes ao ano por reações adversas a 
medicamentos, potencialmente preveníveis com o uso da farmacogenética. 
Somado a isso, anos ou décadas de estudos no desenvolvimento farmacológico 
são, por vezes, desperdiçados ao não contemplarem os perfis genéticos 
populacionais. 
Múltiplos fatores têm influenciado a decisão sobre diferentes tratamentos, dentre 
ambientais, nutricionais, idade, gênero, e genéticos, e, se usados em conjunto, 
podemos maximizar a eficácia das terapias e ao mesmo tempo reduzir os riscos 
de reações adversas. Nesse sentido, a farmacogenética e a farmacogenômica 
enriquecem grandemente o processo de tomada de decisão clínica a respeito do 
melhor tratamento individual. Hoje, vemos começar um novo e excitante campo 
de intercessão entre clínica, diagnóstico genético, fatores ambientais efarmacologia: a medicina personalizada. 
MEDICINA PERSONALIZADA 
A medicina personalizada, também conhecida como medicina de precisão, 
baseia-se na ideia de utilizarmos a informação genética e o uso de 
biomarcadores como preditores para a melhor decisão terapêutica para cada 
paciente. 
Como a medicina personalizada pode ajudar? 
Clique na figura abaixo. 
 
Em alguns setores da medicina, essa revolução já começou. A MP já mostra 
impacto na medicina preventiva, com o diagnóstico de predisposições 
genéticas a doenças que pode auxiliar na prevenção ou no tratamento precoce 
de enfermidades. Além disso, a MP tem se desenvolvido simultaneamente 
às técnicas de diagnóstico molecular de polimorfismos mais rápidas, precisas 
e baratas, que permitem a determinação de fatores genéticos com a agilidade 
necessária, “da bancada à beira-do-leito”. 
Pacientes com doenças graves e com risco de morte também têm sido 
beneficiados com uma abordagem personalizada de seu tratamento. Em muitos 
casos, a ideia de usarmos um mesmo tratamento na mesma dosagem para 
todos, no estilo “tamanho único”, tem prejudicado o prognóstico e, em pacientes 
terminais, a sobrevida e a qualidade de vida após um diagnóstico sombrio. 
 
Uma das áreas que mais se desenvolveu da MP e que exemplifica bem como 
ela pode melhorar diversos aspectos da terapia e bem-estar do paciente é o 
tratamento oncológico, em que a susceptibilidade de diversos tumores a drogas 
começa a ser diagnosticada a partir das alterações moleculares específicas de 
cada paciente. 
A imagem a seguir ilustra como a farmacogenética pode ajudar a definir o melhor 
fármaco, dosagem e interações de acordo com as características genéticas da 
população. 
Tamanho único. 
A MP tem enfrentado dificuldades em sua universalização. 
ATIVIDADE DE REFLEXÃO DISCURSIVA 
E quais seriam os desafios da medicina personalizada? 
 
RESPOSTA 
Aliadas à abordagem multifatorial da MP, a farmacogenética e a 
farmacogenômica contribuem grandemente ao apontarem genes relevantes ao 
funcionamento de medicamentos. A variação na resposta a fármacos devido a 
polimorfismos genéticos, apesar de não ser completamente absoluta, causa 
perdas econômicas e sociais enormes. 
Aprendemos que as variações genéticas podem influenciar na dosagem, na 
susceptibilidade e na toxicidade de fármacos. Nesse contexto, existem diversas 
formas em que a genética pode induzir a respostas distintas a medicamentos, 
como alterações no metabolismo, no transporte, e no alvo de fármacos, que 
podem ser enzimas, receptores, transportadores e outras moléculas efetoras. 
Assim, podemos classificar o uso da farmacogenética relacionado à 
farmacocinética e à farmacodinâmica. 
FARMACOGENÉTICA E 
FARMACOCINÉTICA 
A maioria dos fármacos ingeridos passa por etapas até sua eliminação: 
Primeiro são absorvidos 
Distribuídos 
Metabolizados (antes ou depois de agirem em seus alvos farmacológicos) 
Por fim, excretados 
Apesar de todas as etapas serem potencialmente variáveis entre indivíduos, 
a metabolização é um dos processos mais complexos e mais frequentemente 
observado em associação com alterações farmacológicas. 
O metabolismo de drogas e fármacos pode ocorrer antes ou depois da ação 
farmacológica. Alguns medicamentos são ministrados na forma de pró-
fármacos, formas inativas de medicamentos que são metabolizados em 
fármacos ativos por meio da bioativação. Outros medicamentos são 
processados de forma a perderem a atividade, aumentarem a solubilidade e 
serem mais facilmente excretados. Entre as principais alterações sofridas pelos 
fármacos durante seu metabolismo, temos a oxidação, redução, hidrólise 
(também conhecidas como reações de fase I), e os de conjugação (ou de fase II, 
como acetilação, glicuronidação, sulfatação, metilação, entre outros). 
A maioria dos processos de biotransformações ocorre no fígado, o grande centro 
metabólico do nosso organismo, embora outros órgãos também metabolizem 
drogas, como os rins e os pulmões. O metabolismo de fármacos pelo fígado 
acontece em grande parte pela superfamília de enzimas citocromo P450, ainda 
que outras enzimas metabólicas também sejam relevantes em farmacogenética. 
Para estudarmos em detalhes as aplicações das enzimas, precisamos primeiro 
entender como polimorfismos podem influenciar o metabolismo de fármacos e 
drogas. 
Como aprendemos, a maioria dos genes presentes no genoma humano 
apresentam dois alelos, um em cada cromossomo homólogo. Podemos 
considerar que, de acordo com o tipo e a quantidade de alelos afetados por 
polimorfismos, teremos diferentes fenótipos. Dessa forma, podemos classificar 
os fenótipos de metabolização de fármacos em 4 tipos: 
Clique nas informações a seguir. 
Metabolizadores pobres (MP) 
Metabolizadores intermediários (MI) 
Metabolizadores normais (MN) 
Metabolizadores rápidos (MR) 
Tipos de metabolizadores. 
Cada tipo de metabolizador terá um risco diferente: em metabolizadores mais 
lentos (como MP ou MI), existe um risco aumentado de efeitos adversos em 
decorrência do acúmulo de fármacos que, em doses padrões, não causariam 
dano. Os MR, por outro lado, podem não experimentar os efeitos terapêuticos da 
dose-padrão porque o medicamento está sendo metabolizado e excretado muito 
rapidamente. 
No caso da administração de pró-fármacos, os MR correm risco de efeitos 
adversos e superdosagem, por produzirem o fármaco ativo mais rápido sem, 
contudo, eliminá-lo rapidamente, enquanto os MP não observam os efeitos 
terapêuticos desejados. 
Por isso, a investigação farmacogenética do metabolismo de drogas e fármacos 
pode orientar a prescrição de dosagens adequadas para cada caso, de acordo 
com o perfil metabolizador. 
FARMACOGENÉTICA E SUPERFAMÍLIA 
CYP 
As CYP são enzimas que contêm o grupamento químico heme (que contém ferro 
em seu interior) presente em diversos tecidos e que catalisam a oxidação de 
compostos. 
As CYP são classificadas de acordo com as similaridades genéticas em famílias 
(denominadas por números) e subfamílias (denominadas por letras). 
Clique nas setas para ver o conteúdo. 
Classificação das CYP. 
Apesar de termos mais de 50 enzimas CYP, apenas 6 delas metabolizam cerca 
de 90% dos fármacos, e são importantes porque possuem diversos 
polimorfismos descritos, sendo o grupo de enzimas mais bem estudado quanto 
às aplicações em farmacogenética. 
 
Representação da CYP2D6. 
Uma das primeiras descrições da farmacogenética se deu com a identificação da 
CYP2D6 como responsável pela divergência no metabolismo da debrisoquina e 
esparteína. Hoje, conhecemos mais de 80 alelos polimórficos diferentes para 
CYP2D6, com fenótipos que variam de MP a MR. Os polimorfismos em CYP2D6 
afetam o metabolismo de mais de 60 medicamentos, e perfis MP podem ser 
identificados geneticamente com quase 100% de precisão. 
Dentre as diversas drogas metabolizadas por CYP2D6, a metabolização 
ultrarrápida da codeína aumenta em até 30 vezes a quantidade de morfina. O 
relato do falecimento de um bebê após superdosagem por morfina ingerida por 
meio do leite de sua mãe metabolizadora ultrarrápida mostra quão grave perfis 
MR podem ser. 
Outras drogas metabolizadas por CYP2D6 incluem anti-hipertensivos como o 
metoprolol, antidepressivos tricíclicos e inibidores seletivos da recaptação da 
serotonina, e medicamentos contra o câncer. 
 
Representação da CYP3A4. 
Uma das enzimas CYP mais abundantes no fígado, a CYP3A4 é responsável 
pelo metabolismo de mais de 50% dos medicamentos usados atualmente. Cerca 
de 20 alelos polimórficos foram identificados para CYP3A4, a maioria deles 
relacionados à redução da atividade enzimática e mais frequentes em 
caucasianos do que em asiáticos e africanos. 
CYP3A5, por outro lado, é extremamente variável. Os fenótipos dos 
polimorfismos de CYP3A4 e CYP3A5 são mais extensos quando há combinação 
de alelos variantes das duas enzimas. Isso é devido ao fato de ambas 
metabolizarem alguns dos mesmos substratos, o que faz com que sejam 
frequentemente referidas como CYP3A4/5.Portanto, apesar de muitas classes de fármacos serem metabolizados por essas 
enzimas, os fenótipos de polimorfismos isolados não estão claros em muitos 
casos, o que reflete a importância da farmacogenômica na integração gênica das 
diferentes combinações de polimorfismos. 
Outras enzimas da superfamília CYP com importantes aplicações 
farmacogenéticas incluem a CYP2C9 e a CYP2C19. 
Clique nas barras para ver as informações. 
CYP2C9 
Possui mais de 60 alelos polimórficos, alguns deles mais frequentes em 
populações europeias, enquanto outros são mais comuns em populações de 
origem africana. A CYP2C9 corresponde a cerca de 20% das enzimas citocromo 
hepáticas e metaboliza aproximadamente 10% dos fármacos comercializados, 
dentre os quais se destacam os anti-inflamatórios não esteroidais, antidiabéticos, 
antiepiléticos e anticoagulantes. Um dos anticoagulantes metabolizados pela 
CYP2C9, a varfarina, possui janela terapêutica estreita. Isso traz risco de 
hemorragias graves e potencialmente fatais em função das diferenças na 
velocidade de metabolismo da varfarina pela CYP2C9. Portanto, o diagnóstico 
farmacogenético é fundamental no uso desse anticoagulante. 
CYP2C19 
A enzima CYP2C19, por outro lado, não possui tantos alelos polimórficos, nem 
afeta o metabolismo de tantas drogas quanto a CYP2D6 e CYP2C9. No entanto, 
polimorfismos nessa enzima, que reduzem sua atividade, afetam o metabolismo 
de inibidores da bomba de prótons, usados no tratamento de úlceras pépticas e 
distúrbios gástricos. 
Além disso, polimorfismos em CYP2C19 afetam a bioativação de um 
antiplaquetário, Clopidogrel, em sua forma ativa. Outros fármacos que podem ter 
seu metabolismo alterado por variações em CYP2C19 incluem medicamentos 
neurotrópicos, antifúngicos e anticâncer. 
Enzimas CYP e suas funções no corpo humano 
 
FARMACOGENÉTICA E ENZIMAS DE FASE 
II 
Vimos duas das primeiras enzimas descritas como responsáveis pela alteração 
da resposta a fármacos: a deficiência da glicose-6-fosfato desidrogenase ligada 
à hemólise após administração de primaquina e a velocidade de metabolização 
da isoniazida por acetilação. 
Hoje, sabemos que a primaquina é metabolizada pelas enzimas CYP e resulta 
em um metabólito tóxico que provoca estresse oxidativo e, em pacientes com 
deficiência funcional da G6FD, as hemácias estão mais vulneráveis à lise por 
estresse oxidativo. A velocidade de metabolização da isoniazida, por outro lado, 
é determinada por enzimas chamadas de N- acetiltransferases (NATs). 
Pacientes com alelos polimórficos da enzima NAT2 podem ser classificados em 
acetiladores rápidos (AR) ou lentos (AL). Pelo menos três polimorfismos por SNP 
estão associadas a AL, que são muito mais frequentes na população árabe do 
que na caucasiana e asiática. Complicações decorrentes das altas 
concentrações plasmáticas de isoniazida e outros medicamentos acetilados 
como a hidralazina (vasodilatador e anti-hipertensivo) e a procainamida (um 
antiarrítmico) em AL incluem síndromes autoimunes induzidas por 
medicamentos, hepatotoxicidade e neuropatia. 
Outro grupo de enzimas envolvido no metabolismo e eliminação de drogas e que 
foram mais bem estudadas do ponto de vista farmacogenético são as 
metiltransferases. Dentre elas, a tiopurina metiltransferase (TPMT) possui 
polimorfismos que alteram sua capacidade de metilar tiopurinas, uma classe de 
nucleotídeos modificados com função pró-fármaco. 
Estrutura química de fármacos 
tiopurinas. 
Quando bioativadas, as tiopurinas são convertidas em compostos tóxicos e, por 
isso, são usadas na supressão de células imunológicas em leucemias, linfomas 
e terapias imunossupressoras em transplante e doenças autoimunes. Existem 
apenas 3 alelos principais associados a mais de 90% dos metabolizadores 
pobres (MP) da TPMT, que ocorrem em menos de 1% da população caucasiana. 
MPs podem sofrer de toxicidade à medula óssea (toxicidade hematopoiética) por 
acúmulo de tiopurinas, reduzindo o número total de células sanguíneas, tanto 
hemácias quanto leucócitos. O paciente sofre de cansaço extremo, falta de 
ar, e risco aumentado a infecções que podem levá-lo rapidamente ao óbito. 
Atenção 
Por isso, a recomendação é que pacientes com distúrbios imunológicos que 
necessitem de tiopurinas sejam testados geneticamente e, caso tenham fenótipo 
MP para TPMT, tomem apenas uma fração da dose padrão do fármaco. 
FARMACOGENÉTICA E 
TRANSPORTADORES 
As variações genéticas envolvidas na farmacocinética não se restringem a 
polimorfismos em enzimas. Os processos de absorção e eliminação de 
substâncias afetam diretamente sua concentração, aumentando ou diminuindo-
a. As principais proteínas envolvidas nesse processo são as transportadoras, 
presentes em grande número nos epitélios intestinais, endoteliais e renais, e nas 
células hepáticas. Essas proteínas presentes nas membranas plasmáticas 
medeiam o transporte de solutos através das membranas biológicas e são 
grandes reguladoras da homeostase celular, tecidual e do organismo. 
Entre as principais famílias de transportadores, está a dos transportadores de 
efluxo ABC (adenosine-triphosphate binding cassete (ABC), um dos 
responsáveis pelo fenótipo de resistência a múltiplas drogas — multiple drugs 
resistence (ou MDR)). 
Transportadores de efluxo ABC. 
O gene ABCB1 é um dos mais polimórficos dentre os transportadores, com mais 
de 50 SNPs e ao menos 3 eventos de inserção ou deleção descritos. 
Polimorfismos em ABCB1 que reduzam sua capacidade transportadora de efluxo 
(ou seja, de saída das células) podem causar aumento da concentração 
plasmática de digoxina (um digitálico e glicosídeo cardiotônico usado no 
tratamento de insuficiência cardíaca) por redução da eliminação renal. O uso 
desse digitálico com janela terapêutica muito estreita, aliado a polimorfismos em 
ABCB1, está associado a risco aumentado de morte súbita por doença cardíaca 
durante tratamento com digoxina. Outros medicamentos com eliminação 
reduzida incluem inibidores da protease viral (usados na terapia antirretroviral 
contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV)), e estatinas (usadas no 
controle da hipercolesterolemia). Por outro lado, variações genéticas em 
ABCC1/2 têm sido associadas com alteração da excreção biliar de estatinas e 
quimioterápicos de diferentes ações (como tamoxifeno — um análogo de 
estrogênio usado na terapia do câncer de mama; e metotrexato, um antifolato 
usado na quimioterapia de leucemia). 
Os transportadores conhecidos como SLC (solute carriers, ou carreadores de 
soluto, em português) compreendem mais de 300 transportadores de membrana 
que movimentam íons que não podem passar pela membrana livremente por 
serem hidrossolúveis. Envolvidos na entrada de moléculas nas células (influxo), 
os alelos polimórficos de SLCs têm sido associados à redução da entrada de 
fármacos nos hepatócitos, gerando acúmulo plasmático. Um exemplo de 
medicamento afetado por variações genéticas em SLCs é o acúmulo de 
pravastatina plasmática, com redução de sua função farmacológica, que ocorre 
nos hepatócitos. 
Representação ilustrando exemplos 
de carreadores de solutos SLC. 
FARMACOGENÉTICA E 
FARMACODINÂMICA 
O estudo da farmacodinâmica se propõe a explorar os mecanismos de ação 
moleculares, bioquímicos e fisiológicos de drogas nas células e no organismo. 
Os fármacos podem ter diversos alvos terapêuticos, sendo mais frequentes as 
proteínas que atuam como receptores celulares de membrana, enzimas e canais 
iônicos. Variações genéticas que resultem na alteração dessas proteínas, ou até 
mesmo em outras proteínas que interagem com elas, podem levar a alterações 
farmacológicas. Portanto, as diferenças na farmacodinâmica também são objeto 
de estudo da farmacogenética. 
Farmacogenética e polimorfismos de receptores e 
transportadores 
Os receptores de membrana plasmática correspondem a cerca de 50% dos 
alvos farmacológicos. Presentes na superfície das células e expressos de forma 
específica para cada tecido e tipo celular, os receptoressão a interface de 
contato entre o meio extracelular e o interior da célula. Quando interagem com 
seus ligantes, os receptores promovem respostas intracelulares específicas, 
conhecidas como transdução de sinais. Receptores podem alterar muitos 
aspectos do metabolismo celular, incluindo a vida ou a morte da célula. Portanto, 
têm sido amplamente usados como alvos farmacológicos para modulação da 
resposta celular, seja para amplificação, redução, ativação, inativação ou 
diferenciação. Para entendermos melhor os efeitos dos polimorfismos em 
receptores, precisamos observar seu funcionamento. 
Representação do funcionamento de receptores de membrana plasmática. 
Um dos receptores mais estudados quanto à variabilidade genotípica são os 
adrenorreceptores do tipo β (ou receptores β-adrenérgicos), responsivos às 
catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) quando a resposta simpática de 
“luta-ou-fuga” é desencadeada. 
A ação dos adrenorreceptores β envolve diversos tecidos e atua no aumento da 
frequência cardíaca, aumento da força de contração cardíaca e relaxamento de 
musculatura lisa (vascular e respiratória), com o intuito de aumentar a velocidade 
e força da resposta muscular esquelética (seja para luta, seja para fuga). 
A principal categoria de fármacos que agem em receptores β são antagonistas, 
os chamados β-bloqueadores, que são usados no tratamento de doenças 
cardiovasculares e respiratórias como hipertensão, insuficiência cardíaca e 
asma. 
Exemplo 
Metoprolol, atenolol e carvedilol, são exemplo comuns de fármacos β-
bloqueadores. 
O gene do receptor adrenérgico β1 (ADRB1) possui polimorfismos que afetam a 
ação farmacológica dos β-bloqueadores. Dois polimorfismos SNP são 
frequentemente vistos em conjunto formando um haplótipo (S49-R389) em 
ADBR1: um localizado na porção extracelular do receptor, e outro na porção 
intracelular. O haplótipo produz maior resposta a agonistas que o alelo 
selvagem, o que leva a um risco de morte três vezes maior em pacientes 
portadores de doenças cardíacas. Esses dois SNP de ADBR1 também 
apresentam maior resposta a β-bloqueadores, e têm sido associados a menor 
risco de morte em portadores do haplótipo com doenças cardíacas ― ou seja, os 
β-bloqueadores promovem um efeito protetivo contra o haplótipo. 
Outro grande ramo da farmacogenética compreende medicamentos 
psiquiátricos, e, em especial, os receptores de serotonina. A serotonina, também 
conhecida como 5-HT (sigla em inglês para 5-hidroxitriptamina), é um 
neurotransmissor envolvido em diversos processos cognitivos, como na 
regulação do humor e emoções. 
 
Processos que envolvam a inibição da serotonina têm sido associados a quadros 
como a depressão, ansiedade, e outros transtornos relacionados. Por isso, 
existem medicamentos antidepressivos cujo objetivo é evitar que a serotonina 
seja recapturada, de forma que ela permaneça na sinapse, local entre os 
neurônios em que ela exerce seus efeitos; outros fármacos funcionarão como 
antagonistas ou agonistas seletivos, dependendo do receptor de serotonina em 
questão. 
Uma das classes de fármacos importantes do ponto de vista farmacogenético 
são os inibidores seletivos de recaptação da serotonina (ISRS): em certas 
situações, para que a concentração sináptica da serotonina seja mantida 
elevada, bloqueamos a recaptura da serotonina no neurônio pré-sináptico, 
permitindo que ela aja no neurônio pós-sináptico. No entanto, o principal 
transportador de serotonina (da sigla em inglês, SERT) é codificado pelo gene 
polimórfico SLC6A4. Uma inserção-deleção polimórfica no promotor desse gene, 
conhecida como 5-HTTLPR-L, tem maior resposta a ISRS, já que sua expressão 
é duas vezes maior do que a outra variante (5-HTTLPR-S). 
Farmacogenética e variações em enzimas-alvo 
Já estudamos como polimorfismos em enzimas podem alterar a forma e a 
velocidade de metabolização de fármacos. No entanto, as enzimas também são 
alvos farmacológicos, sendo seu antagonismo (ou bloqueio) o principal 
mecanismo farmacológico. 
Conheça dois exemplos de enzimas que podem ter sua susceptibilidade a 
drogas alterada devido a polimorfismos: 
Clique nas informações a seguir. 
Exemplo 1 
Exemplo 2 
É interessante notarmos que, mesmo sendo raro, mutações em regiões não 
codificadoras também podem influenciar a expressão de genes, a 
farmacodinâmica e a farmacogenética. Além disso, a varfarina se torna um 
excelente exemplo de como a farmacogenômica é fundamental na predição de 
doses, pois combina alterações genéticas importantes tanto no metabolismo 
quanto no alvo terapêutico. 
FARMACOGENÉTICA NA ONCOLOGIA 
A especialista Camila Baez falará sobre a importância da farmacogenética na 
terapia oncológica. 
VERIFICANDO O APRENDIZADO 
1. Um dos objetivos em se estudar interações entre genes e respostas a 
fármacos é para tentar personalizar a abordagem terapêutica de acordo com 
a necessidade. Sobre a farmacogenética, é incorreto afirmar que: 
 
Visa identificar polimorfismos que alterem a capacidade de metabolização de 
fármacos. 
 
A variação na concentração de enzimas pode afetar a biodisponibilidade de 
fármacos. 
 
Os principais polimorfismos observados são os SNP (polimorfismos de 
nucleotídeos simples). 
 
A velocidade de eliminação de fármacos é irrelevante para a farmacogenética. 
 
Polimorfismos em proteínas-alvo farmacológicos são um dos mecanismos 
estudados pela farmacogenética. 
Responder 
Comentário 
2. Polimorfismos em diferentes genes podem ter efeitos distintos no 
metabolismo e resposta de fármacos. Baseado nisso, assinale a afirmação 
correta: 
 
As enzimas CYP são um dos principais alvos farmacológicos que podem ter 
respostas alteradas devido a SNPs. 
 
A acetilação e metilação são etapas da eliminação de compostos que podem 
sofrer alterações devido a polimorfismos. 
 
Os transportadores são alvos farmacológicos normalmente afetados por 
polimorfismos. 
 
Os polimorfismos em enzimas só são relevantes caso alterem a capacidade de 
metabolização e eliminação de fármacos. 
 
A farmacogenética da varfarina se restringe a alterações no nível de algesia do 
paciente, sem relação com gravidade. 
Responder 
Comentário 
CONCLUSÃO 
CONSIDERAÇÕES FINAIS 
A farmacogenética surgiu com a observação de que indivíduos têm reações 
distintas a compostos químicos, como drogas e medicamentos. Após décadas 
de estudo e o desenvolvimento de técnicas de biologia molecular eficazes, 
descobrimos que a variabilidade genética entre indivíduos e populações afeta 
como cada organismo absorve, metaboliza e excreta fármacos. A ação dos 
fármacos em cada organismo também pode variar de acordo a genética. Do 
conhecimento acumulado sobre as interações entre polimorfismos e respostas 
distintas a drogas emerge uma prática mais personalizada da medicina e a 
prevenção de reações adversas graves e até fatais. 
PODCAST 
Agora, a especialista Camila Freze Baez encerra o tema falando um pouco mais 
sobre a prática da farmacogenética. 
0:00 
14:15 
REFERÊNCIAS 
ALTMAN, R.; FLOCKHART, D.; GOLDSTEIN, D. Principles of 
Pharmacogenetics and Pharmacogenomics. Cambridge: Cambridge 
University Press, 2012. 
DNA FROM THE BEGINNING. Concept 13: Mendelian laws apply to human 
beings. Consultado na Internet em: 5 abr. 2021. 
EL SHAMIEH, S.; ZGHEIB, N.K. Pharmacogenetics in developing countries 
and low resource environments. Hum Genetics. Publicado em: 9 fev. 2021. 
Consultado na Internet em: 15 jun. 2021. 
GONG, L. et al. The Role of Pharmacogenetics in Precision Medicine. 
Pharmacy Times, n. 7. vol. 82, jul. 2016. 
HEDIGER, M. A.; CLEMENÇON, B.; BURRIER, R. E.; BRUFORD, E. A. The 
ABCs of membrane transporters in health and disease (SLC series): 
introduction. Mol Aspects Med. abr. – jun. 2013. 
IRIART. Medicina de precisão/medicina personalizada: análise crítica dos 
movimentos de transformação da biomedicina no início do século XXI. Cad. 
Saúde Pública, 2019; 35(3):e00153118. 
JARVIK, G. P. Arno G. Motulsky, MD (1923–2018): Holocaust survivorwho 
cofounded the field of medical genetics. Genet Med. 20, 477–479 (2018). 
KALOW, W. Pharmacogenetics and pharmacogenomics: origin, status, and 
the hope for personalized medicine. Pharmacogenomics J., 6, 162–165 (2006). 
KHOURY M. J. et al. A population approach to precision medicine. Am. J. 
Prev. Med. 2012;42(6):639-645. doi:10.1016/j.amepre.2012.02.012. 
LAM, Y. W. F. Principles of Pharmacogenomics: Pharmacokinetic, 
Pharmacodynamic, and Clinical Implications. In: Pharmacogenomics. 2. ed. (s.l): 
Academic Press, 2019. 
LIN, L. et al. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. 
Nat. Rev. Drug. Discov., n. 14. 2015. 
LUNDSTROM, K. An overview on GPCRs and drug discovery: structure-
based drug design and structural biology on GPCRs. G Protein-Coupled 
Receptors in Drug Discovery. Methods in Molecular Biology, 552, 51–66, 2009. 
MEDLINE PLUS WEBSITE. What is the International HapMap Project. 
Consultado na Internet em: 7 abr. 2021. 
MEDLINE PLUS WEBSITE. Thiopurine S-methyltransferase deficiency. 
Consultado na Internet em: 10 abr. 2021. 
MORAIS, L. S. et al. Perspectivas internacionais e nacionais sobre a 
privacidade do uso e acesso de Informações Genéticas. In: XI Semana de 
Extensão, Pesquisa e Pós-Graduação ‒ SEPesq Centro Universitário Ritter dos 
Reis, 2015. 
NATIONAL HUMAN GENOME RESEARCH INSTITUTE. Genetic Discrimination . 
Consultado na Internet em: 9 abr. 2021. 
NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (US). Understanding Human Genetic 
Variation. National Institutes of Health (US), 2007. Consultado na Internet em: 
15 jun. 2021. 
NIEMEIJER, M. N. et al. ABCB1 gene variants, digoxin and risk of sudden 
cardiac death in a general population. Heart, n. 101, dez. 2015. 
NUSSBAUM, R. L. et al. Thompson & Thompson – Genética Médica. 7. ed. Rio 
de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. 
OWEN R. P. et al. VKORC1 pharmacogenomics summary. Pharmacogenet. 
Genomics, out. 2010. 
PALLASCH, T. J. Principles of pharmacotherapy: VI. Pharmacogenetics. 
Anesth. Prog. 1989;36(6):249-251. 
POLYMORPHISM. In: Britannica, 2021. Consultado na Internet em: 15 jun. 2021. 
SCITABLE – NATURE EDUCATION. Cells Can Replicate Their DNA 
Precisely. Consultado na Internet em: 6 abr. 2021. 
US FOOD & DRUG ASSOCIATION. Personalized medicine: a biological 
approach to patient treatment. Consultado na Internet em: 10 abr. 2021. 
VOGENBERG F. R. et al. Personalized medicine part 1: evolution and 
development into theranostics. P&T. 2010;35(10):560-576. Consultado na 
Internet em: 15 jun. 2021. 
 
EXPLORE+ 
Para saber mais sobre os assuntos tratados neste conteúdo, leia: 
Sobre ética e a farmacogenética, “Declaração Internacional sobre os Dados 
Genéticos Humanos”, da UNESCO. 
Sobre a medicina personalizada, farmacogenética e farmacogenômica: 
 “Farmacogenética e a Medicina Personalizada”, de Miguel Brito, na revista 
Saúde & Tecnologia. 
 “Farmacogenética e farmacogenômica: evidências de como a genética pode 
influenciar a eficácia de fármacos e a busca por novos alvos farmacológicos”, 
de Renata F. Pessôa, Flávio E. Nácul e François Noël, Infarma. 
 
CONTEUDISTA 
Camila Freze Baez 
Currículo Lattes 
Ao clicar nesse botão, uma nova aba se abrirá com o material preparado para impressão. Nela, 
acesse o menu do seu navegador e clique em imprimir ou se preferir, utilize o atalho Ctrl + P. 
Nessa nova janela, na opção destino, direcione o arquivo para sua impressora ou escolha a 
opção: Salvar como PDF. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Teste de 
Conheciment
o 
 avalie sua aprendizagem 
 
 
 
 
BIOLOGIA MOLECULAR E FARMACOGENÉTICA 
 
Lupa Calc.
 
 
 
 
 
ARA0482_202208870961_TEMAS 
 
 
Aluno: EDUARDO ANTONIO VIEIRA Matr.: 202208870961
Disc.: BIO MOL E FARMAC 2022.2 (G) / EX
 
Prezado (a) Aluno(a), 
 
Você fará agora seu TESTE DE CONHECIMENTO! Lembre-se que este exercício é opcional, mas não valerá ponto para sua 
avaliação. O mesmo será composto de questões de múltipla escolha. 
Após responde cada questão, você terá acesso ao gabarito comentado e/ou à explicação da mesma. Aproveite para se 
familiarizar com este modelo de questões que será usado na sua AV e AVS. 
 
 
 
 
AMPLIFICAÇÃO IN VITRO DE DNA 
 
1. 
 
Em algumas situações, a obtenção de DNA a partir de RNA transcrito é importante, como, por
exemplo, na construção de bibliotecas. 
 
Considerando os conceitos relacionados a essa estratégia e a figura acima, que mostra uma
das possíveis estratégias para síntese de DNA a partir de RNA, assinale a opção correta. 
 
 
 
 A reação mostrada na etapa demonstra a desnaturação da fita de mRNA. 
 
 A reação mostrada na etapa 3 ilustra a atividade da enzima transcriptase reversa.
 A reação mostrada na etapa 4 ilustra a atividade da enzima DNA polimerase. 
 
 
Na etapa 4, para que ocorra a reação, é suficiente a adição dos nucleosídios
representados por A, U, C, G. 
 
 O DNA obtido pelo método ilustrado é denominado tDNA. 
Data Resp.: 01/10/2022 13:29:00
 
Explicação: 
A resposta correta é: A reação mostrada na etapa 4 ilustra a atividade da enzima 
DNA polimerase. 
 
 
 
 
2. 
 
SNPs são empregados amplamente para a identificação humana e possuem diferenças
relevantes. A análise dos SNPs também pode estar associada aos fenótipos individuais,
havendo uma possibilidade futura de identificação de traços físicos como, por exemplo, a cor
da íris. Os SNPs são: 
 
 
 Heterozigotos 
 
 Elementos repetitivos do genoma nuclear 
 
 Homozigotos 
 
 Sequências presentes somente no DNA mitocondrial 
 Polimorfismos de nucleotídeo único; uma variação na sequência de DNA 
Data Resp.: 01/10/2022 13:39:01
 
Explicação: 
A resposta correta é: Polimorfismos de nucleotídeo único; uma variação na 
sequência de DNA. 
 
 
 
 
 
INTRODUÇÃO À BIOLOGIA MOLECULAR 
 
3. 
 
 
A origem da vida é uma das questões mais polêmicas e que intrigam a humanidade. Como a vida originou-se na Terra? Na 
tentativa de responder essa questão, surgiram várias hipóteses. 
(Origem da Vida. Disponível em:https://www.biologianet.com/origem-universo-vida. Acessado em 21/09/2022). 
Uma das hipóteses se baseia na ideia da formação espontânea. Assinale a alternativa que contém o nome dessa teoria. 
 
 
 
Lamarckismo. 
 
 
Criacionismo. 
 
 
Darwinismo. 
 
Teoria de Oparin e Haldane 
 
 
Teoria da panspermia. 
Data Resp.: 01/10/2022 13:51:32
 
Explicação: 
Dentre as teorias existentes, uma delas, a teoria de Oparin e Haldane, era justamente a ideia da formação 
espontânea de pequenas moléculas orgânicas, as quais, com o tempo, passaram a se organizar de maneira cada vez 
mais complexa até se replicarem e evoluírem, formando as células primitivas. A teoria da panspermia surgiu a partir 
da observação de compostos orgânicos presentes em meteoritos e ganhou força a partir de 1997 com a análise do 
Meteorito de Muchinson. Os pesquisadores encontraram diversos aminoácidos e adenina, presente no nosso DNA, 
que datavam de aproximadamente 7 bilhões de anos, sendo assim mais antigos que nosso próprio planeta, que 
possui cerca de 4,5 bilhões de anos. Apesar de muito interessante, essa teoria não possui evidências científicas 
suficientes para explicar a origem da vida no nosso planeta, diferente da teoria de Oparin e Haldane.O criacionismo é 
uma hipótese defendida por religiosos que afirmam que Deus criou o Universo e todos os seres nele viventes, a partir 
do nada, conforme está descrito no ¿Gênesis¿, livro presente na Bíblia. Essa hipótese é comumente ligada à crença 
religiosa, não sendo aceita pela comunidade acadêmica. O Darwinismo e o Lamarckismo são teorias da evolução das 
espécies. 
 
 
 
 
4. 
 
Os organismo mais antigos da Terra são unicelulares e não possuem um núcleo organizado. Esse organismos são chamados de 
 
 
 
eucariotos. 
 
 
carioteca. 
 
procariotos. 
 
 
cromossomo. 
 
 
gene. 
Data Resp.: 01/10/2022 13:53:04
 
Explicação: 
Os procariotos são os organismos mais antigos da Terra. Todos são unicelulares e não possuem um núcleo 
organizado, ouseja, o seu material genético, o DNA, não é separado por uma membrana nuclear, chamada 
de carioteca, muito parecido com as primeiras células encontradas no nosso planeta. Esses organismos são os mais 
simples e toda a sua expressão gênica é diferente da nossa. O gene é um segmento codificante do DNA e o 
cromossomo é uma estrutura formada por uma molécula de DNA altamente compactada e associada a proteínas 
auxiliadoras, que ajudam a compactar e descompactar o DNA para facilitar o acesso de outras proteínas a essa região
 
 
 
 
 
ISOLAMENTO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS 
 
5. 
 
Para selecionar uma amostra aleatória de tamanho n de uma população formada por N 
unidades, que são numeradas de 1 a N segundo uma certa ordem, escolhe-se aleatoriamente 
uma unidade entre as k primeiras unidades da população, onde k = N / n e seleciona-se cada 
k-ésima unidade da população em sequência. Esta técnica de amostragem denomina-se 
amostragem: 
 
 
 Probabilística 
 
 Por etapas 
 Sistemática 
 
 Aleatória simples 
 
 Não-probabilística 
Data Resp.: 01/10/2022 13:54:43
 
Explicação: 
A resposta correta é: Sistemática 
 
 
 
 
6. 
 
Após completar a extração do DNA de uma amostra de sangue não há como saber se a
extração foi devidamente realizada a não ser que se faça um controle de qualidade do material 
extraído. Com relação ao controle de qualidade podemos afirmar que: 
 
 
A espectrofotometria mede a quantidade de luz, na faixa de 260 nm, absorvida 
pelo DNA e RNA, desta forma é capaz de quantificar e identificar a pureza da 
amostra. 
 
 É composto por três etapas: quantificação, coloração e validação. 
 
 
Deve ser realizado a partir da observação, estabelecimento de hipóteses, 
análise, conclusões e divulgação de um relatório final. 
 
 
A etapa de quantificação apenas pode ser realizada com o uso da técnica de 
fluorometria. 
 
 
A eletroforese é feita para medir a integridade do extraído e tem como princípio 
diferenciar a solubilidade de cada componente. 
Data Resp.: 01/10/2022 14:03:07
 
Explicação: 
A resposta correta é: A espectrofotometria mede a quantidade de luz, na faixa de 
260 nm, absorvida pelo DNA e RNA, desta forma é capaz de quantificar e identificar 
a pureza da amostra. 
 
 
 
 
 
SEQUENCIAMENTO, CLONAGEM E TÉCNICAS DE HIBRIDIZAÇÃO 
 
7. 
 
 
O desenvolvimento da engenharia genética permitiu a retirada de genes de uma espécie e a
posterior introdução deles em outro indivíduo de espécie diferente. Com essa ferramenta em 
mãos, o homem foi capaz de reproduzir genes de interesse. 
COSTA, Marco Antônio F.; COSTA, Maria de Fátima B. Biossegurança de OGM: uma visão integrada. Rio de Janeiro: Publit, 2009, p. 154, com adaptações. 
Com base nos conceitos de organismos geneticamente modificados (OGMs), assinale a 
alternativa correta. 
 
 
 
Organismos que tiveram genes alterados apenas quanto à respectiva posição ou 
expressão são transgênicos 
 
 
O setor da saúde não apresenta qualquer tipo de questionamento em relação ao 
uso dos OGMs, considerando os inúmeros benefícios trazidos por eles para o 
setor. 
 
 Os OGMs, na respectiva totalidade, são considerados transgênicos. 
 
Os OGMs são organismos cujo material genético (RNA ou DNA) tenha sido 
modificado por qualquer técnica. 
 
 
Os transgênicos são produzidos através da alteração de genes em organismos 
adultos, sendo a modificação genética transmitida de uma célula a outra através 
de transformação. 
Data Resp.: 01/10/2022 14:04:54
 
Explicação: 
A resposta correta é: Os OGMs são organismos cujo material genético (RNA ou 
DNA) tenha sido modificado por qualquer técnica. 
 
 
 
 
8. 
 
 A hibridização in situ é uma ferramenta diagnóstica de doenças genéticas, como a 
distrofia muscular de Duchenne, e infecciosas, como a infecção por papilomavírus humano 
(HPV) em colo uterino. Sobre as técnicas de hibridização in situ, é incorreto afirmar que: 
 
 
 
Permite a identificação com precisão do local na célula ou tecido em que a 
sequência-alvo está; 
 
 Exigem leitura através de microscópios especializados. 
 
 
São feitas em tecidos e células fixadas e permeabilizadas, para preservação das 
estruturas celulares e entrada das sondas, respectivamente; 
 
 As sondas podem ser marcadas com enzimas, fluoróforos e radioatividade; 
 Utilizam sondas de anticorpos, capazes de reconhecer a sequência-alvo; 
Data Resp.: 01/10/2022 14:04:58
 
Explicação: 
A resposta correta é: Utilizam sondas de anticorpos, capazes de reconhecer a 
sequência-alvo; 
 
 
 
 
 
EM2120427FARMACOGENÉTICA 
 
9. 
 
Questões éticas envolvendo a farmacogenética e farmacogenômica incluem os pontos abaixo, exceto: 
 
 
A existência de resolução que proíbe a aplicação da farmacogenética. 
 
 
A redução de indivíduos ao seu mero perfil genético. 
 
 
A discriminação genética de portadores de doenças e polimorfismos farmacogenéticos. 
 
 
A inequidade no acesso a tratamento farmacogenético. 
 
 
A inequidade nas populações-alvo de pesquisa em farmacogenética. 
Data Resp.: 01/10/2022 14:05:01
 
Explicação: 
A resposta certa é:A existência de resolução que proíbe a aplicação da farmacogenética. 
 
 
 
 
10. 
 
Assinale a opção de fármaco que apresenta tanto alteração farmacogenética por metabolismo e polimorfismo de proteína alvo: 
 
 
 
Omeprazol. 
 
 
Clopidogrel. 
 
Varfarina. 
 
 
Carvedilol. 
 
 
Digoxina. 
Data Resp.: 01/10/2022 14:05:20
 
Explicação: 
A resposta certa é:Varfarina. 
 
 
 
 
 
 
 Não Respondida Não Gravada Gravada
 
 
 
Exercício inciado em 01/10/2022 13:20:54. 
 
 
 
	1 - Introdução à Biologia Molecular
	2 - Isolamento de Ácidos Nucléicos
	3 - Sequenciamento
	4 - Amplificação in Vitro de Dna
	5 - Farmacogenética
	Teste de Conhecimento de BIOLOGIA MOLECULAR E FARMACOGENÉTICA