Replicação de DNA_AES2

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Replicação de DNA
Isabela Diniz
2015
Medicina
AES2
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Replicação de DNA
Poucos erros de incorporação nucleotídica
Aprox. 1/109 nucleotídeos
Replicação
semiconservativa
Replicação
bidirecional	
A replicação deve ser um processo rápido (incorporação de 3mil a 30mil nucleotídeos por min.), mas, acima de tudo, deve ser um processo preciso com pouquíssimos erros de incorporação (média de 1 erro por bilhão de nucleotídeos).
A replicação semiconservativa foi sugerida por Watson e Crick com base na estrutura do DNA, mas foi um experimento de Meselson e Stahl que permitiu a demonstração de que esse tipo de replicação era o correto.
Além disso, a replicação é também bidirecional, como será melhor visualizado a seguir.
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Replicação de DNA
Origem de replicação
Única / Múltiplas
Réplicons
oriC (Escherichia coli)
A replicação tem início em sítios específicos chamados “origens de replicação”. De modo geral, procariotos apresentam apenas uma origem de replicação no cromossomo. Já eucariotos apresentam diversas origens por cromossomo. Cada unidade de DNA replicada a partir de uma origem de replicação é chamada “réplicon”.
A origem de replicação do cromossomo de E. coli é chamada “oriC”, possui 245pb e apresenta duas sequências repetidas. A primeira (3 repetições de 13pb in tandem) é rica em A:T, o que facilita a separação dos filamentos, originando a “bolha de replicação” (zona localizada de desnaturação). A segunda (4 repetições de 9pb intercaladas) serve de sítio de ligação para uma proteína que participa da formação da bolha de replicação.
Em eucariotos multicelulares, a caracterização dessas origens de replicação ainda não teve êxito.
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Replicação de DNA
Como citado anteriormente, a replicação do cromossomo de E. coli é bidirecional a partir da origem única de replicação. Cada estrutura em forma de “Y” é uma “forquilha de replicação” e as duas forquilhas movem-se em direções opostas. Cada forquilha faz a replicação de ambas as fitas da dupla hélice.
Como isso é possível se a síntese da nova cadeia só ocorre no sentido 5’ – 3’? Se é necessário uma extremidade 3’-OH livre pra adição de novos nucleotídeos, como se inicia a cadeia nascente?
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Replicação de DNA
Replicação semidescontínua
A síntese dos filamentos complementares ocorre em direções físicas opostas, mas na mesma direção química (5’ – 3’). Desse modo, a replicação ocorre de forma semidescontínua, ou seja, a síntese de um dos filamentos de DNA nascentes é contínua (líder/leading) e a do outro é descontínua (atrasado/lagging). Os fragmentos de DNA constituintes da síntese descontínua são chamados “fragmentos de Okazaki”.
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Replicação de DNA
Fases da replicação de DNA
Iniciação
Alongamento 
Finalização
Complexo
aparelho
de replicação
A replicação do DNA é didaticamente dividida em 3 fases: iniciação, alongamento e finalização da cadeia. É também um processo complexo que requer a ação conjunta de um grande número de proteínas.
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Replicação de DNA
oriC
Proteínas iniciadoras
Helicases
Proteínas SSB
Bolha de replicação
Proteínas iniciadoras reconhecem a sequência específica de oriC e se ligam a região das 4 repetições de 9pb, resultando um na deselicoidização e desnaturação da sequência de DNA rica em A:T contida nas 3 repetições in tandem de 13pb. Nesse momento ligam-se as helicases (responsável pela deselicoidização da dupla fita de DNA e exposição do molde para pareamento de bases) e as proteínas SSB ou de ligação ao DNA unifilamentar (que protegem a fita simples de DNA evitando que haja a renaturação em dupla fita). Desse modo há a formação da bolha de replicação.
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Replicação de DNA
DNA primase
Uma vez exposto o DNA molde, a síntese da nova fita de DNA só pode ser iniciada se houver uma extremidade 3’-OH livre. A enzima responsável por gerar essa sequência iniciadora é a DNA primase. Ela é capaz de sintetizar um iniciador de RNA ao qual poderão ser adicionados nucleotídeos para a constituição das novas cadeias de DNA.
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Replicação de DNA
DNA polimerase III
DNA polimerase I
A adição de nucleotídeos para a constituição das novas cadeias de DNA é feita pela enzima DNA polimerase. Existem diversas DNA polimerases. Em E. coli, a adição de nucleotídeos é feita pela DNA polimerase III. Na fita descontínua, a DNA pol III catalisa o acréscimo de desoxirribonucleotídeos desde o primer de RNA com a extremidade 3’-OH livre até colidir com o iniciador de RNA do fragmento de Okazaki anterior. Nesse momento, a DNA pol I excisa o iniciador de RNA e o substitui por cadeia de DNA. Observa-se que qualquer DNA polimerase só é ativa na presença de DNA molde e um iniciador.
As DNA polimerases têm atividades de polimerização, excisão e reparo.
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Replicação de DNA
DNA ligase
Após a ação da DNA pol I, a enzima DNA ligase catalisa o fechamento covalente de cortes na molécula de DNA unindo os fragmentos de Okazaki. Ela produz uma ligação fosfodiéster entre o primeiro nucleotídeo de um fragmento de Okazaki e o último do próximo fragmento. Essa enzima não tem ação caso haja alguma falha (gap), ou seja, perda nucleotídica na sequência!
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Replicação de DNA
DNA topoisomerase
DNA girase
As enzimas DNA topoisomerase permitem que o DNA a frente da forquilha de replicação gire em seu próprio eixo prevenindo assim o entrelaçamento da molécula. As DNA topoisomerases I catalisam cortes unifilamentares na molécula de DNA e as DNA topoisomerases II catalisam quebras bifilamentares transitórias. A DNA girasse é a DNA topoisomerase II mais bem caracterizada em E. coli.
Na fita descontínua, a DNA helicase e a DNA primase formam um complexo proteico conhecido como primossomo. Já ao aparelho completo de replicação que se move ao longo da molécula de DNA em uma forquilha de replicação dá-se o nome de replissomo.
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Replicação de DNA
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Replicação de DNA
Replicação em eucariotos
Semiconservativa
Bidirecional
Semidescontínua
Múltiplas origens de replicação
Iniciadores de RNA mais curtos
Fragmentos de Okazaki mais curtos
Duplicação de nucleossomos
Terminações cromossômicas
A maioria das informações sobre replicação de DNA resulta de estudos es procariotos, principalmente E. coli, e sabe-se que os mecanismos são basicamente os mesmos na replicação de DNA procariótico e eucariótico. Algumas diferenças, contudo, devem ser notadas. Entre elas o fato de a síntese de DNA nos eucariotos ocorrer dentro de uma fase do ciclo celular, e não continuamente como nos procariotos. As múltiplas origens de replicação permitem que o DNA seja duplicado no intervalo de tempo específico da fase do ciclo celular.
A observação de nucleossomos no DNA pré-replicativo e pós-replicativo demonstra que a replicação de DNA e a montagem de nucleossomos são processos acoplados. Histonas são sintetizadas durante todo o ciclo celular, mas o pico ocorre durante a fase S para a duplicação da cromatina.
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Replicação de DNA
Replicação telomérica
Em cromossomos lineares eucarióticos, as extremidades cromossômicas (telômeros) representam um problema durante a replicação por não haver extremidade 3’-OH livre na fita descontínua após a excisão do iniciador de RNA do fragmento de Okazaki terminal. Desse modo, a DNA polimerase não pode finalizar a síntese do filamento descontínuo. Para tanto, é necessária a atuação de outra enzima: a telomerase.
Os telômeros são constituídos por sequências repetidas consecutivas. A telomerase reconhece essas sequências na extremidade 3’ (fita molde parental) e a estende no sentido 5’ – 3’. Ela é capaz de fazer isso por possuir um molde intrínseco de RNA. Após a adição de várias unidades de repetição, a DNA primase e a DNA polimerase podem finalizar o filamento descontínuo utilizando a extensão do filamento contínuo como molde.
As telomerases não atuam em células somáticas (a não ser alguns cânceres).
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Replicação de DNA
Telômeros e envelhecimento
As telomerases não tem atividade detectável em células somáticas (a não ser alguns cânceres). Por causa do encurtamento progressivo dos telômeros ao longo de mitoses consecutivas, é possível relacionar o comprimento dessas estruturas e o número de divisões celulares antes da senescência e morte. Indivíduos com progérias, distúrbios caracterizados por envelhecimento prematuro, apresentam células somáticas com telômeros curtos, observação compatível com a hipótese de que o encurtamento telomérico contribui para o envelhecimento.
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