(4) Microscopia

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MICROSCOPIA
O surgimento do microscópio
Zacharias Jansen e um microscópio 
que, acredita-se, tenha sido fabricado 
por ele. O modelo foi encontrado na 
Holanda, no século XVII 
As "células" de Hooke
O microscópio utilizado por Robert Hooke 
em suas pesquisas sobre a cortiça foi 
construído pelo microscopista inglês 
Christopher Cock 
Microscópios de uma lente
Microscópio de uma lente datado de 1700. Esse tipo de 
instrumento foi popularizado por Leeuwenhoek no final do 
século XVII 
Microscópios no século XIX
Microscópio com espelhos e conjunto de 
acessórios. Modelo construído pelo 
italiano Giovan Battista em 1813 
O Microscópio na atualidade
Microscópio óptico
Os microscópios eletrônicos permitem um fator de 
aumento da ordem de centenas de milhares de vezes. 
Microscópio Óptico
-Parte Mecânica
-Parte Óptica
-Condensador
-Objetiva
-Ocular
A ampliação total dada por 
um microscópio é igual ao 
aumento da objetiva 
multiplicado pelo aumento 
da ocular
Chama-se poder de resolução de um sistema 
óptico a sua capacidade de separar detalhes, ou 
seja a capacidade para distinguir um objeto de 
outro.
Poder de resolução do microscópio óptico é 0,2µm 
(ou 200nm)
..
Teoricamente é impossível construir um microscópio 
que supere esse poder de resolução, já que o fator 
limitante é a longitude de onda da luz.
D: distancia minima entre dois objetos
α: abertura angular (mitade do angulo do cono de luz)
N: índice de refração (ar=1,0 / oleo de inmersão=1,5)
λ: longitude da onda de luz
k: constante=0,61
D= k*λ/N*sen α
 
α
Limite de resolução de um microscópio de Luz 
D= k*λ/N*sen α
Objeto
Luz
α: abertura angular (depende do 
largo da objetiva e da distancia 
ate a amostra) mitade do angulo 
do cono de luz
N: índice de refração 
(ar=1,0/oleo inmersão=1,5)
λ: longitude da onda de luz
k: constante=0,61
D= 0,61*450nm = 194nm=0,2μm
 1,5*0,94
Objetiva
ObjetoObjeto
 
100 x óleo de imersão
40 x
Óleo
Objeto
Objetiva Objetiva
Limite de resolução é a menor distancia que deve existir entre 
dois pontos para que eles apareçam individualizados.
Ex. duas partículas separadas por 0,3 µm aparecem individualizadas 
quando examinadas em um sistema óptico com limite resolutivo de 
0,2 µm, porem aparecem como uma partícula única quando o limite 
resolutivo é de 0,5 µm.
Métodos para estudar a célula
b) Estudo das células vivas (in vivo)
Limitações 
→ transparência do material
→ componentes celulares constituídos 
de substancias qcas. de baixo peso 
atomico (C, O, H e N)
Utilidade
→movimentos celulares
→ Div. Celular
→ Ação de drogas ou condições físicas
→secreção, etc.
células isoladas (sim)
Tecidos (não)
Não há contraste 
suficiente
Coloração supravital
Técnicas de estudo da célula
b) Estudo da célula em cultura (in vitro)
Meios de cultura (nutrientes, temperatura, pH, etc)
Utilidade
→diferenciação celular
→transformação de células normais em cancerosas
→metabolismo celular
→citogenética, etc.
c) Estudo das células em preparações permanentes
Fixadas e coradas em laminas (células estão mortas)
Inconvenientes → introduzem modificações → artefatos
Fixar: matar a célula de maneira a que ela conserve o mais possível a 
mesma estrutura que tinha quando viva.
→agentes físicos (calor)
→agentes químicos (drogas)
 
•Congelamento
•Fixação: estabilização do material, preservando a sua 
estrutura.
•pode ser usado calor, solventes orgânicos (álcool), 
ácidos e aldeídos
Processamento de material biológico
•Desidratação: substituiçao da água por soluções miscíveis 
no meio de inclusão: álcool e acetona
 Inclusão: Endurecimento do material biológico, parafina e 
resinas plásticas
Microtomia: Seccionamento em aparelho denominado 
micrótomo: cortes de 1 a 10 μM
Corantes 
Ácido (grupamento qco. Anion)
Base (grupamento qco. Cátion)
Moléculas celulares de natureza ácida
basófilas
Corantes básicos
Ex. 
Azul de metileno
Azul de toluidina
Hematoxilina
Corantes básicos
Moléculas celulares de natureza básica
acidófilas
Corantes ácidos
Ex. 
Eosina
Orange G
Corantes ácidos
d) Citoquímica
Compreende técnicas diversas para a identificação e localização das 
moléculas que constituem as células.
Pode ser aplicada em nível de microscopia:
-óptica: o produto da reação citoquímica deve ser corado
-eletrônica: o produto da reação citoquímica deve dispersar os elétrons.
Auxilia= histofotômetro ou citofotômetro: determina a intensidade de 
cor produzida dosando a quantidade da substancia analisada.
Exemplo:
O DNA → reação de Feulgen
 Permite o estudo quantitativo
Fluorescência → alaranjado de acridina (afinidade com ácidos 
nucléicos)
Consiste:
-Mergulha-se a lâmina em sn aquecida 
HCl (promove a hidrolise das bases 
púricas)
-reativo de Shiff (cor vermelha)
Bos indicus
FISH= hibridization in situ fluorescence. A utilização de 
técnicas de hibridação in situ permite a localização de 
seqüências especificas de DNA nos cromossomos alvos.
 
Filtro 1
Condensadora
Objeto
Objetiva
Filtro 2
Imagem
Microscópio de Fluorescência 
 
Proteínas fluorescentes
• Proteínas que emitem na faixa do 
laranja e vermelho foram obtidas a 
partir da anemona do mar Discosoma 
striata e de corais pertencentes à 
classe Anthozoa. Proteína fluorescente 
verde isolada da agua viva Aequorea 
victoria 
 
Proteínas fluorescentes
Inmunocitoquimica: permitem o estudo da localização intracelular de 
proteínas específicas. Se baseia na reação antígeno-anticorpo.
e) Radioautografia
Empregada para estudar os lugares de síntese e o destino de 
macromoléculas.
Baseia-se na sensibilidade das emulsões fotográficas ás radiações 
ionizantes.
Ex. moléculas radioativas mais usadas: H3, C14, S35, P32, etc.
f) Fracionamento Celular: As organelas se separam de um 
homogeneizado de células em que as membranas são rompidas.
Esquema da técnica de 
centrifugação fracionada. 
O sobrenadante de cada tubo 
é centrifugado novamente, 
cada vez com maior força 
centrifuga. 
Os desenhos mostram os 
componentes celulares do 
sedimento de cada tubo. 
A força centrifuga é 
representada por G; 1000G 
significa 1000 vezes a força 
da gravidade.
O microscópio eletrônico foi inventado 
no início dos anos 30, pelo alemão 
Ernest Ruska. 
Esses instrumentos utilizam feixes de 
elétrons e lentes eletromagnéticas, no 
lugar da luz e das lentes de vidro, 
permitindo ampliações de até um 
milhão de vezes. 
Há 3 tipos básicos de microscópio 
eletrônico: transmissão (para 
observação de cortes ultrafinos), 
varredura (para observação de 
superfícies) e tunelamento (para 
visualização de átomos). 
Microscópio eletrônico de 
varredura 
Filamento de 
tungsteno (cátodo)
Ânodo
Condensador
Feixe de elétrons
Objetiva 
electromagnética
Lente projetora
Tela de 
visualização (ou 
filme fotográfico)
1º Avaliação
Segunda feira dia 25 de junho às 13,30h