conceitos iniciais de histologia

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É o estudo das células e dos tecidos do corpo e de como essas
estruturas se organizam para constituir os órgãos.
Estudo é realizado com auxílio de microscópios.
HISTOLOGIA
É a área da Biologia que estuda a estrutura e o
metabolismo da célula.
CITOLOGIA
Unidades estruturais e funcionais dos seres vivos.
A célula é a menor unidade dos seres vivos com formas e
funções definidas.
Com exceção dos vírus, todos os organismos vivos possuem
células.
A célula tem todo o material necessário para realizar
processos vitais, como nutrição, liberação de energia e
reprodução.
 CÉLULA
https://mundoeducacao.uol.com.br/biologia/virus.htm
Processo realizado logo após a remoção das células ou fragmentos de
tecidos e órgãos.
Um grande fragmento deve ser cortado em outros menores antes de
ser imerso no fixador.
O material coletado deve ser imerso o mais 
 rapidamente possível na solução fixadora;
FIXAÇÃO
Pode ser feita por métodos químicos ou, menos frequentemente,
por métodos físicos.
Fixação química: os tecidos são imersos em soluções de agentes
desnaturantes ou de agentes que estabilizem as moléculas ao formar
pontes com moléculas adjacentes (fixadores).
Fixação física: como por aquecimento ou resfriamento
FIXAÇÃO
 evitar a digestão dos tecidos por enzimas existentes nas
próprias células (autólise) ou em bactérias; 
 endurecer os fragmentos; 
 preservar em grande parte a estrutura e a composição
molecular dos tecidos.
A fixação tem várias finalidades: 
1.
2.
3.
FIXAÇÃO
INCLUSÃO
Para obter secções delgadas, os fragmentos de tecidos e
órgãos devem, após a fixação, ser infiltrados com substâncias
que lhes proporcionem uma consistência rígida.
As substancias mais utilizadas são a parafina e algumas enzimas
de plástico.
O processo de impregnar os tecidos com parafina é chamado
inclusão ou embebição em parafina.
INCLUSÃO
Geralmente é precedido por duas etapas: 
Desidratação: A água contida nos tecidos é inicialmente extraída
pela passagem dos fragmentos por diversos banhos de soluções
de concentrações crescentes de etanol.
Clareamento: Para a inclusão em parafina, as substâncias
intermediárias mais comumente usadas são o xilol e o toluol.
Quando os fragmentos de tecidos são embebidos no solvente
orgânico, eles ficam transparentes ou translúcidos.
INCLUSÃO
Em seguida, são colocados em parafina derretida.
O calor causa a evaporação do solvente orgânico, e os espaços
existentes dentro dos tecidos tornam-se preenchidos com
parafina.
Depois de os fragmentos serem retirados da estufa, a parafina
solidifica e eles se tornam rígidos.
MICROTOMIA
Para se obter cortes do material incluído em parafina ou
congelado, é necessário um instrumento especial: o micrótomo.
O equipamento tem como fundamento duas peças principais: o
suporte ou mandril (onde é fixada a peça a cortar) e a navalha,
que realiza os cortes.
MICROTOMIA
Após serem seccionados, os cortes são colocados para flutuar
sobre uma superfície de água aquecida e, depois, sobre lâminas
de vidro, onde aderem e serão, em seguida, corados.
COLORAÇÃO
A seletividade dos corantes com os componentes dos tecidos
pode ser maior ou menor.
Muitos corantes se comportam como substâncias de caráter
ácido ou básico e tendem a formar ligações eletrostáticas
(salinas) com componentes ionizados dos tecidos.
COLORAÇÃO
Corantes básicos reagem com tecidos que possuem ácidos na
sua composição – ácidos nucleicos, glicosaminoglicanos e
glicoproteínas ácidas. --> basófilos.
Corantes ácidos coram principalmente os componentes
acidófilos dos tecidos, como, por exemplo, mitocôndrias,
grânulos de secreção, proteínas citoplasmáticas e colágeno. 
 --> acidófilos.
COLORAÇÃO
Corantes mais utilizados: 
Hematoxilina cora em azul ou violeta o núcleo das células e
outras estruturas ácidas.
 Eosina cora o citoplasma e o colágeno em cor-de-rosa.
Tricrômicos, além de mostrarem muito bem o núcleo e o
citoplasma, ajudam a diferenciar colágeno de músculo liso.
1.
2.
3.
Bacilos álcool-ácido-resistentes corados
em roxo no centro da imagem.
COLORAÇÃO
 usado quando as células e os seus limites não são visíveis. 
Trata-se de um corante aplicado a um corte apenas para tornar
possível a visualização das células ou dos núcleos.
Outra maneira de evidenciar componentes de células e tecidos é
a sua impregnação por metais, como prata e ouro, método
muito usado para estudar tecido nervoso
Contracorante
Esses termos são usados para indicar métodos que
identificam e localizam substâncias em células e matriz
extracelular, seja em cortes histológicos ou em células
cultivadas.
Há vários procedimentos para obter essas informações, a
maioria baseada em reações químicas específicas ou em
interações de alta afinidade entre moléculas.
O fracionamento celular
possibilita o isolamento de
componentes da célula por meio
de centrifugação diferencial.
 A coluna de desenhos à direita
da figura mostra as organelas
celulares obtidas ao fundo de
cada tubo após cada
centrifugação.
 
Interação altamente específica entre moléculas: entre uma
molécula e um anticorpo que a reconhece.
A imunocitoquímica é a metodologia que possibilita identificar,
por meio de anticorpos, moléculas em cortes ou em células
cultivadas, como proteínas e glicoproteínas.
Células que possam conter uma determinada proteína são
incubados em uma solução que contém um anticorpo que
reconhece essa proteína.
IMUNOCITOQUÍMICA
Como o anticorpo não é visível por microscopia, suas moléculas
devem ser inicialmente acopladas a um marcador.
Ao se ligar a proteína, sua localização pode então ser
evidenciada por microscopia de luz ou eletrônica.
A proteína deve ser previamente purificada e isolada de modo
que anticorpos possam ser produzidos contra ela.
IMUNOCITOQUÍMICA
Fotomicrografia de um corte de intestino delgado no qual um
anticorpo foi aplicado contra a enzima lisozima para demonstrar lisossomos em
macrófagos e em células de Paneth. 
Para entender o funcionamento das células em seus detalhes
moleculares é preciso de técnicas que viabilizem a análise das
moléculas envolvidas no processo de fluxo de informação do DNA
para proteína e no controle desse fluxo.
Muitas técnicas são baseadas em hibridização (ou hibridação).
HIBRIDIZAÇÃO
Hibridização é a ligação entre duas moléculas de cadeia única de
ácidos nucleicos (DNA com DNA, RNA com RNA ou RNA com DNA) que
se reconhecem um ao outro se suas sequências forem
complementares, formando moléculas de cadeia dupla.
A hibridização possibilita a identificação de sequências específicas de
DNA ou RNA
HIBRIDIZAÇÃO
Ao microscópio de luz (também chamado microscópio óptico), as
preparações coradas são examinadas por iluminação que
atravessa o espécime (transiluminação).
O microscópio de luz é composto de partes mecânicas e
ópticas.
COMPONENTES
O componente óptico consiste em três sistemas de lentes: 
 - O condensador concentra a luz de uma lâmpada e projeta um
feixe luminoso sobre o espécime.
 - A objetiva recebe a luz que atravessou o espécime e projeta uma
imagem aumentada do espécime em direção à ocular.
 - A ocular amplia novamente a imagem e a projeta na retina, em
uma tela, em uma câmera fotográfica ou em um detector eletrônico.
COMPONENTES
O fator mais crítico para a obtenção de uma imagem
aumentada e com muitos detalhes é o parâmetro chamado:
 poder de resolução - a menor distância entre duas partículas ou
entre duas linhas, distância essa que possibilita que elas sejam
vistas como dois objetos separados
RESOLUÇÃO
O poder de resolução máximo do microscópio de luz é de
aproximadamente 0,2 μm;
essa resolução torna possível a obtenção de boas imagens
aumentadas até 1.000 a 1.500 vezes.
Dois objetos serão vistos como um só se eles estiverem
separados por menos de 0,2 μm.
RESOLUÇÃO
O que determina a riqueza de detalhes da imagem é o limite de
resolução de um sistema óptico, e não seupoder de aumento.O
aumento só tem valor prático se for acompanhado de resolução.
A resolução depende essencialmente da objetiva, pois a lente
ocular apenas aumenta a imagem nela projetada pela objetiva.
RESOLUÇÃO
O microscópio de contraste de fase usa um sistema de lentes
que produz imagens visíveis de objetos quase transparentes, de
células e cortes não corados.
MICROSCOPIA DE 
CONTRASTE DE FASE
Outra metodologia utilizada para observar células ou secções
de tecidos não corados é a microscopia de contraste diferencial
(microscopia de Nomarski), que produz uma imagem
aparentemente tridimensional.
Essas imagens são sempre vistas em preto, branco e tons de
cinza.
MICROSCOPIA DE 
CONTRASTE DIFERENCIAL
DE INTERFERÊNCIA
Células da crista neural foram cultivadas e examinadas por meio
de três sistemas ópticos diferentes. 
O preparado não está corado 
A. Microscopia de luz convencional. 
B. Microscopia de contraste de fase. 
C. Microscopia de diferencial de interferencia
a b c
Geralmente, ocorre há superposição de vários planos na
imagem, os quais aparecem em foco simultaneamente, causando
certo grau de deterioração da imagem.
Para resolver esse problema, foi desenvolvido o microscópio
confocal, que torna possível focalizar um plano muito delgado do
espécime.
MICROSCOPIA CONFOCAL
O espécime é iluminado por um feixe de luz muito estreito
A imagem coletada do espécime deve passar por um orifício
muito pequeno.
A consequência desse arranjo é que só a imagem originada do
plano focalizado alcança o detector, enquanto as imagens de
planos anteriores e posteriores são bloqueadas
Os fundamentos desse microscópio :
MICROSCOPIA CONFOCAL
A luz proveniente de fora do plano de foco é, em grande parte,
eliminada, a definição do objeto focalizado torna-se melhor e a
localização de componentes do espécime pode ser feita com
muito mais precisão que ao microscópio de luz.
MICROSCOPIA CONFOCAL
Princípio da microscopia confocal. 
 
 A iluminação de uma fonte de laser alcança o espécime e é 
 refletida.
Um espelho dirige a luz refletida a um obstáculo que tem um
pequeno orifício
Esquema do funcionamento de um microscópio confocal.
1.
2.
MICROSCOPIA CONFOCAL
3. A luz proveniente de planos do espécime que estão à
frente ou atrás do plano focalizado é bloqueada pelo obstáculo. 
4. O laser varre o espécime para que uma área maior do
corte seja observada
MICROSCOPIA CONFOCAL
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
DE TRANSMISSÃO
O microscópio eletrônico de transmissão é um sistema de produção de
imagens que teoricamente possibilita altíssima resolução (0,1 nm).
Na prática, porém, a resolução obtida pela maioria dos bons
instrumentos se situa em torno de 3 nm, resolução que torna possível
que espécimes ampliados até cerca de 400 mil vezes sejam vistos com
detalhes.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
DE TRANSMISSÃO
Esse grande nível de ampliação só pode ser usado para analisar partículas
ou moléculas isoladas, pois cortes delgados de células e tecidos podem ser
observados com detalhes em aumentos de até cerca de 120 mil vezes.
Para haver boa interação entre o espécime e os elétrons e para a
formação de uma boa imagem, o microscópio eletrônico utiliza
cortes muito mais delgados que os de microscopia de luz (40 a 90
nm de espessura).
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
DE TRANSMISSÃO
Para conseguir esses cortes, os tecidos são incluídos em resinas
plásticas, como as do tipo epóxi.
Os blocos de tecidos são seccionados com navalhas de vidro ou
de diamante, e os cortes são coletados sobre pequenas grades
de metal (de cerca de 3 mm de diâmetro).
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
TRANSMISSÃO
elétrons podem ser desviados por campos eletromagnéticos de
maneira semelhante ao desvio produzido na luz por lentes de
vidro (refração).
Elétrons são liberados pelo aquecimento de um delicado
filamento metálico (chamado catodo, geralmente feito de
tungstênio) em vácuo. 
O funcionamento desse microscópio se baseia no seguinte
princípio: 
1.
2.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
TRANSMISSÃO 
3. Os elétrons libertados no catodo são submetidos a uma
diferença de voltagem de 60 a 120 kV existente entre o catodo e
o anodo, que é um prato metálico com um orifício no centro
4. Dessa maneira, os elétrons são atraídos pelo anodo e
acelerados, alcançando altas velocidades.
5. Após passarem pelo orifício do anodo, eles formam um feixe de
elétrons que percorre o tubo do microscópio.
 
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE
TRANSMISSÃO
 
6. No tubo, o feixe de elétrons passa pelo interior de bobinas
elétricas que produzem um campo magnético e é desviado de
maneira análoga ao que acontece com um feixe luminoso em
lentes de vidro.
7. Por essa razão, as bobinas dos microscópios eletrônicos são
chamadas de lentes eletromagnéticas.
 
Desenho esquemático de um microscópio eletrônico de
transmissão com seus principais componentes.
vesículas citoplasmáticas
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
DE VARREDURA
Fornece imagens pseudotridimensionais das superfícies de células,
tecidos e órgãos.
Um feixe de elétrons de diâmetro muito pequeno é focalizado
sobre o espécime, percorrendo sequencialmente sua superfície.
Ao contrário do microscópio eletrônico de transmissão, no
microscópio de varredura os elétrons não atravessam o espécime .
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
DE VARREDURA
Os elétrons varrem uma delgada camada de metal previamente
aplicada ao espécime e são refletidos pelos átomos do metal.
Esses elétrons são capturados por um detector e transmitidos a
amplificadores e outros componentes eletrônicos que geram um
sinal, o qual resulta em uma imagem em preto e branco que
pode ser observada em um monitor, gravada ou fotografada.
MICROSCOPIA ELETRÔNICA
DE VARREDURA
As imagens são de fácil interpretação, pois os objetos parecem
ser iluminados e apresentam locais sombreados, fornecendo
uma ideia de três dimensões.
Estes grãos de pólen tomados em um MEV mostram a característica de profundidade de campo das micrografias de MEV.
MICROSCOPIA DE FORÇA
ATÔMICA
O microscópio de varredura por sonda revolucionou a ciência,
possibilitando a visualização e manipulação da matéria em escala
atômica. Sendo o mais popular, omicroscópio de força atômica.
O equipamento funciona a partir de uma “agulha” (ponta) muito fina
que “tateia” a superfície da amostra, podendo ser deslocada nos
três eixos (x, y, z) através de um scanner de alta resolução. 
MICROSCOPIA DE FORÇA
ATÔMICA
 Um laser é direcionado à extremidade da sonda e refletido para
um sistema de fotodetectores que enviam a informação para
um computador, onde a imagem topográfica é formada. 
Pode ser operado tanto em temperatura ambiente ou em
condições especiais como, por exemplo, atmosfera inerte e
aquecimento. 
MICROSCOPIA DE FORÇA
ATÔMICA
 Um outro fator importante é a possibilidade de obtenção de
imagens de fase (através do modo intermitente), no qual é
possível distinguir materiais com propriedades mecânicas
distintas (como dureza e elasticidade) na superfície da amostra. 
O AFM é bastante utilizado também para determinação da
rugosidade superficial (em escala nanométrica).
Luciano Paulino da Silva, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 
conquistou o segundo lugar na primeira edição do 
Prêmio Internacional de Imagens de Microscopia de Força Atômica.
A microscopia virtual integra a microscopia de luz convencional
com as tecnologias digitais. 
Usando sistemas de obtenção de imagem óptica com foco
automático, as imagens contidas em lâminas de vidro são
capturadas para criar arquivos digitais bidimensionais, que são
armazenados em servidores destinados para microscopia
virtual.
MICROSCOPIA VIRTUAL
A lâmina virtual é uma representação digital de uma lâmina
histológica comum, que pode ser observada remotamente sem
um microscópio de luz. 
As lâminas são digitalizadas em um único plano focal, mas elas
também podem ser capturadas em múltiplos planos focais e emdiferentes graus de magnitude.
MICROSCOPIA VIRTUAL
O termo cultura significa manter vivo e crescer em um meio
apropriado que simula as condições naturais.
São técnicas que envolvem a distribuição e isolamento de células
em um ambiente artificial (in vitro) com o objetivo de estudar a sua
fisiologia e bioquímica.
 Dessa forma, um grupo particular de células pode ser cultivado
em grandes quantidades para estudar suas atividades,
diferenciações e proliferações.
Diferentes tipos de células podem crescer em cultura.
Sua aplicação compreende desde pesquisas sobre o câncer até a
fabricação de vacinas, produção de proteína recombinante,
seleção e melhoria de medicamentos, terapia genética, biologia
de células-tronco e tecnologia de fertilização in vitro.
TIPOS DE CULTURA CELULAR
As células retiradas de animais ou vegetais e cultivadas
diretamente constituem as culturas primárias. 
Essas células possuem as características do tecido de
origem e, em geral, morrem após certo número de divisão
celular.
Cultura celular primária
TIPOS DE CULTURA CELULAR
As células secundárias derivam de subculturas de células
primárias. 
Essa subcultura refere-se à transferência de células de um
frasco de cultura para outro.
Periodicamente é necessário fornecer nutrientes frescos e
espaço. 
Cultura celular secundária
TIPOS DE CULTURA CELULAR
São células que ainda não perderam as características do tecido
de origem, mas possuem alta proliferação. 
Elas possuem esse nome porque podem dividir-se indefinidamente.
Muito utilizada em pesquisa, uma vez que pode ser mantida em
cultura por um grande período de tempo e ainda guarda grande
parte das características do tecido original.
Linhagem Celular Contínua
As células HeLa foram a
primeira linhagem celular
imortal cultivada com sucesso
em laboratório.
Desde os anos 50 do século
passado elas são utilizadas
amplamente por laboratórios,
pesquisadores e cientistas no
mundo todo.
Henrietta era uma mulher negra
americana, mãe de 5 filhos, que
aos 31 anos foi diagnosticada
com um tumor maligno no útero.
Ao invés de morrer, as células
se multiplicavam e seu número
dobrava a cada 24 horas. 
As células HeLa foram as
primeiras células humanas a
sobreviver in vitro.
TÉCNICA BÁSICA DE
CULTURA CELULAR
O ambiente artificial em que as células são cultivadas
invariavelmente consiste em um frasco adequado contendo um
substrato ou meio que fornece os nutrientes essenciais
(aminoácidos, carboidratos, vitaminas, minerais), fatores de
crescimento, hormônios e gases (oxigênio, gás carbônico) e controle
o físico-químico (pH, pressão osmótica, temperatura).
As células que requerem uma ligação para crescimento e dependem
de ancoragem podem ser cultivadas fixas a um substrato sólido ou
semi-sólido, chamadas de cultura aderente ou monocamada.
TÉCNICA BÁSICA DE
CULTURA CELULAR
Já as células que não necessitam de fixação podem ser
cultivadas flutuando na cultura, são chamadas de cultura em
suspensão.
As culturas de células são normalmente fornecidas como
culturas puras, contendo apenas uma única linhagem. 
Para isso, é importante trabalhar num ambiente livre de
contaminação e com produtos que forneçam as melhores
condições de crescimento e reprodução celular.
DISTORÇÕES E ARTEFATOS
PROVOCADOS PELO
PROCESSAMENTO DOS TECIDOS
As várias etapas desse procedimento podem distorcer os
tecidos, fornecendo uma imagem que pode diferir da que os
tecidos apresentavam quando vivos.
Uma causa de distorção é a retração produzida pelo fixador,
pelo etanol e pelo calor da parafina usada para inclusão.
DISTORÇÕES E ARTEFATOS
PROVOCADOS PELO
PROCESSAMENTO DOS TECIDOS
A retração é atenuada quando os tecidos são incluídos em
resina.
Uma consequência da retração é o aparecimento de espaços
artificiais nas células e entre as células e outros componentes
de tecido.
DISTORÇÕES E ARTEFATOS
PROVOCADOS PELO
PROCESSAMENTO DOS TECIDOS
Outra fonte de espaços artificiais é a perda de moléculas que
não foram mantidas corretamente nos tecidos pelo fixador ou
que foram retiradas pelas soluções de desidratação e
clareamento.
DISTORÇÕES E ARTEFATOS
PROVOCADOS PELO
PROCESSAMENTO DOS TECIDOS
Exemplos de moléculas não preservadas são o glicogênio e lipídios.
Todos esses espaços artificiais e outras distorções causadas pelo
procedimento de preparação dos cortes são chamados artefatos
de técnica.
Os estudantes devem estar atentos para a existência de artefatos e
precisam tentar reconhecê-los para não serem enganados por eles.
TOTALIDADE DO TECIDO
Uma grande dificuldade apresentada por cortes de microscopia
de luz é a impossibilidade de se corar diferencialmente todos os
componentes das células e tecidos em um só preparado.
É quase impossível, observar células por um microscópio de luz e
enxergar todas as suas organelas e membranas.
Para se conseguir essa imagem, é necessário examinar várias
preparações diferentes.
TOTALIDADE DO TECIDO
Por outro lado, o microscópio eletrônico de transmissão torna
possível a observação de células com todas as suas organelas e
inclusões, envolvidas pela membrana e pelos componentes da
matriz extracelular.
DUAS DIMENSÕES E TRÊS
DIMENSÔES
Quando uma estrutura tridimensional é cortada em secções
muito delgadas, as secções parecem ter somente duas
dimensões: comprimento e largura
Isso conduz o observador a erros se ele não se conscientizar
de que uma esfera seccionada é vista como um círculo e que
um tubo seccionado é visto como um anel.
DUAS DIMENSÕES E TRÊS
DIMENSÔES
Quando um corte é observado ao microscópio, o estudante
sempre deve imaginar que algo pode estar faltando à frente
ou atrás daquele corte, uma vez que muitas estruturas são
mais espessas que o corte.
Deve lembrar-se também de que os componentes de um tecido
ou órgão são geralmente seccionados ao acaso.
DUAS DIMENSÕES E TRÊS
DIMENSÔES
Para entender a arquitetura de um órgão, é necessário
estudar secções feitas em planos diferentes.
Às vezes, somente a análise de secções consecutivas e a sua
reconstrução em um volume tridimensional tornam possível
compreender a organização de um órgão complexo.